KR20210125206A - 세포외소포체를 포함한 살충제 검출용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

세포외소포체를 포함한 살충제 검출용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포외소포체(extracellular vesicle)를 포함한 살충제 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase; AChE)가 내재된 자연발생 세포외소포체를 포함하는 살충제 검출용 조성물, 이를 이용한 살충제 검출 방법 및 살충제 검출 키트에 관한 것이다.
본 발명에서는 세포외소포체 내의 고유한 아세틸콜린에스테라아제를 사용하여 살충제를 간단하고 정확하게 검출하는 것을 확인하였으며, AChE의 발현 리포좀의 형성 및 리포좀으로의 AChE 캡슐화 등을 포함한 다수의 복잡한 단계가 EV 기반 살충제 검출에서는 전혀 필요가 없기 때문에, 본 발명의 방법은 효소의 안정성을 향상시키면서 종래의 분석법의 전체 비용과 환경 위험을 줄일 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명에서는 EV에 포함된 AChE의 안정성이 유리 AChE보다 우수함을 확인하였으며, 여러가지 잠재적 간섭제를 함유한 혈청에 첨가된 유기인계 살충제 또는 카바메이트계 살충제를 성공적으로 검출할 수 있는 것을 확인하였으므로, 농작물, 물 또는 인체 등 다양한 시료 속에 포함된 잔류 살충제를 효과적으로 검출할 수 있다.

Description

세포외소포체를 포함한 살충제 검출용 조성물 및 이의 용도{Composition for detecting pesticide including extracellular vesicle and use thereof}
본 발명은 세포외소포체(extracellular vesicle)를 포함한 살충제 검출용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase; AChE)가 내재된 자연발생 세포외소포체를 포함하는 살충제 검출용 조성물, 이를 이용한 살충제 검출 방법 및 살충제 검출 키트에 관한 것이다.
유기인계 살충제(Organophosphorus pesticide; OP) 또는 카바메이트계 살충제(Carbamate pesticide)는 특히 농업관행에서 곤충을 근절하고 작물 성능을 개선시키기 위해 광범위하게 적용되어왔다 (W. Aktar et al., Interdiscip Toxicol ., 2:1-12, 2009). 파라옥손(paraoxon), 말라티온(malathion) 및 디클로로보스(dichlorvos)와 같은 일부 유기인계 살충제는 자연 습도 및 온도 조건에서 낮은 환경 지속성으로 인해 쉽게 제거될 수 있기 때문에, 식품 공급원을 유지하기 위한 노력으로 수백만 톤의 살충제가 사용되고 있다 (A. Guerrieri et al., Analyst, 127:5-7, 2002).
그러나, 살충제가 높은 급성 신경 독성을 나타내며, 호흡부전, 마비 및 심지어 사망과 같은 심각한 건강문제를 일으킬 수 있기 때문에, 농업 농산물 및 물에 유기인계 살충제 잔류물이 존재하는 경우 인간 건강에 미치는 잠재적 영향에 대해 관심이 높아지고 있다. 유기인계 살충제 또는 카바메이트계 살충제 독성의 주요 메커니즘은 신경자극전달의 핵심요소인 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase; AChE)의 활성을 억제시키는 것이다. 이러한 우려로 인해 환경과 식품 공급원에서 살충제의 존재를 빠르고 민감하게 검출하는 방법의 개발이 요구되고 있다.
다양한 환경시료(예를 들어, 물, 토양 및 식품)에서 살충제를 검출하기 위해 많은 노력이 이루어졌으며, 크로마토그래피 및 질량분석법과 같은 표준분석 기술이 일반적으로 사용되고 있다.
비록 상기 방법들이 다른 유형의 유기인계 살충제 또는 카바메이트계 살충제를 높은 정확도로 구별할 수 있지만, 정교한 기기, 고도로 숙련된 기술자 및 고비용이 필요하며, 시간이 많이 걸리는 샘플 전처리 단계는 실제 샘플의 현장검출 적용이 크게 제한되는 단점이 있다. 따라서, 살충제의 검출 및 정량화를 위해 비슷한 감도를 가진 보다 빠르고 저렴한 바이오 센서가 활발하게 연구되고 있다 (N. Jaffrezic-Renault, Sensors, 1:60-74, 2001; S. Liu et al., Adv Powder Technol., 19:419-441, 2008).
다양한 검출방법 중에서 유기인계 살충제 또는 카바메이트계 살충제 유도 AChE 억제 및 발색 검출은 상대적 단순성으로 인해 주목을 받았으며, 상기 방법은 AChE 촉매로 처리된 기질의 변환에 의존하므로, 고가의 추가 장비 없이도 살충제를 시각적으로 감지할 수 있다 (C. S. Pundir et al., Anal. Biochem ., 429:19-31., 2012).
하지만, 상기 방법은 AChE의 효소활성이 불안정한 문제점이 있으며, AChE 효소 활성의 안정화를 위해 다양한 접근법이 제안되었다. 예를 들어, Guan 등은(H. Guan, et al., Food Res Int ., 49:15-21, 2012) 화학적으로 합성된 구형소포체인 리포좀을 사용하여 AChE를 캡슐화하여 살충제 검출 시스템의 안정성을 향상시켰다. 다만, 상기 방법은 합성 리포좀의 준비와 AChE의 캡슐화에 시간이 많이 소요되며 클로로포름과 같은 환경적으로 위험한 유기용매를 사용하는 문제점이 있다.
본 발명에서는 보다 간편하게 살충제를 검출하는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 리포좀에 대한 대안으로 AChE를 함유하는 세포외소포체(extracellular vesicle; EV) 기반 살충제 발색 검출 방법을 개발하였다.
세포외소포체는 자연적으로 무수한 세포 유형에 의해 분비되고, AChE이 풍부하기 때문에, 자연발생 EV를 유기인계 살충제 또는 카바메이트계 살충제 발색 검출에 직접적으로 사용할 수 있으며, AChE의 발현 리포좀의 형성 및 리포좀으로의 AChE 캡슐화 등을 포함한 다수의 복잡한 단계가 EV-기반 분석에서는 전혀 필요가 없기 때문에, 본 발명의 방법은 효소의 안정성을 향상시키면서 종래의 분석법의 전체비용과 환경위험을 줄일 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명에서는 EV에 포함된 AChE(EV AChE)의 안정성이 유리 AChE(free AChE)보다 우수함을 확인하였으며, 살충제 분석을 위한 최적의 조건을 확립하였을 뿐만 아니라, 여러가지 잠재적 간섭제를 함유한 혈청에 첨가된 유기인계 살충제 또는 카바메이트계 살충제를 성공적으로 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세포외소포체를 포함한 살충제 검출용 조성물 및 이를 이용한 살충제 검출 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 세포외소포체를 포함한 살충제 검출 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포외소포체를 포함한 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase; AChE) 억제제 또는 활성화제 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 세포외소포체를 포함한 살충제 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 세포외소포체는 아세틸콜린에스테라아제가 내재되어있을 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예 있어서, 상기 세포외소포체는 동물 유래 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예 있어서, 상기 살충제는 유기인계 살충제 또는 카바메이트계 살충제일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 유기인계 살충제는 파라옥손(Paraoxon), 나레드(Naled), 다이아지논(Diazinon), 말라티온(Malathion), 디클로르보스(dichlorvos), 시아노포스(Cyanophos), 아자메치포즈(Azamethiphos), 클로르펜빈포스(Chlorofenvinphos), 클로로피리포스(Chloropyrifos), 클로로피리포스메칠(Chloropyrifos-methyl), 테메포스(Temephos), 트리클로로폰(Trichlorofon), 페니트로치온(Fenitrothion), 펜소에이트(Phenthoate), 펜치온(Fenthion), 프로치오포스(Prothiofos), 프로페노포스(Profenofos), 프로페탐포스(Propetamphos), 피라크로포스(Pyraclofos), 피리타펜치온(Pyrida[henthion), 피리미포스메칠(Pirimiphos-methyl) 및 테트라 에틸 피로 포스페이트(tetraethyl pyrophosphate)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 카바메이트계 살충제는 알디카브(aldicarb), 메티오카브(methiocarb), 벤디오카브(bendiocarb), 메토밀(methomyl), 카바릴 (carbaryl), 옥사밀(oxamyl), 카르보푸란(carbofuran), 피리미카브(pirimicarb), 이소프로카브(isoprocarb), 프로폭서(propoxur) 및 티오벤카브(thiobencarb)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 시료를 상기 세포외소포체를 포함하는 살충제 검출용 조성물과 혼합하는 단계;
(b) 상기 혼합물에 아세틸콜린에스테라아제 반응기질 및 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 반응액의 아세틸콜린에스테라아제의 저해 활성을 측정하는 단계;를 포함하는 살충제 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질은 아세틸티오콜린 클로라이드(acetylthiocholine chloride)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 세포외소포체에 내재된 아세틸콜린에스테라아제 및 아세틸콜린에스테라아제 반응기질의 반응에 의해 생성된 생성물과 반응하는 발색 물질(colorimetric probe), 형광 물질(fluorescence probe), 화학발광 물질(chemiluminescence probe) 또는 전기화학 신호 발생 물질(electrochemical probe)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 DTNB(5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 콜린 옥시다아제(Choline oxidase); HRP(horseradish peroxidase); 및 HRP와 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질;을 포함하는 조성물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (c) 단계의 아세틸콜린에스테라아제의 저해 활성 측정은 발색, 형광, 화학발광 또는 전기신호 발생 여부를 관찰하거나 흡광도 측정을 통해 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (c) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성은 하기 수학식 1로 측정할 수 있다.
[수학식 1]
Figure pat00001
상기 I는 저해활성, I0는 살충제 부재시 측정된 흡광도 값, I1은 살충제 존재시 측정된 흡광도 값을 의미한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 시료를 포함하지 않은 대조군과 비교하여 발색, 형광, 화학발광 또는 전기신호가 약하거나 흡광도가 감소하면 시료 중에 살충제 물질이 존재하는 것으로 판정할 수 있다.
다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 상기 세포외소포체를 포함하는 살충제 검출용 조성물을 포함하는 살충제 검출 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 키트는 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질 및 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질은 아세틸티오콜린 클로라이드(acetylthiocholine chloride)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 세포외소포체에 내재된 아세틸콜린에스테라아제 및 아세틸콜린에스테라아제 반응기질과의 반응에 의해 생성된 생성물과 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 발색 물질은 DTNB(5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 키트는 콜린 옥시다아제(Choline oxidase); HRP(horseradish peroxidase); 및 HRP와 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질;을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 세포외소포체를 포함한 아세틸콜린에스테라아제 억제제 또는 활성화제 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 세포외소포체는 아세틸콜린에스테라아제를 포함할 수 있다.
본 발명이 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 세포외소포체는 동물 유래 일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 시료를 아세틸콜린에스테라아제가 내재된 세포외소포체와 혼합하는 단계;
(b) 상기 혼합물에 아세틸콜린에스테라아제 반응기질 및 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 반응액의 아세틸콜린에스테라아제의 저해 활성을 측정하는 단계;를 포함하는 아세틸콜린에스테라아제 억제제 또는 활성화제 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질은 아세틸티오콜린 클로라이드(acetylthiocholine chloride)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 세포외소포체에 내재된 아세틸콜린에스테라아제 및 아세틸콜린에스테라아제 반응기질의 반응에 의해 생성된 생성물과 반응하는 발색 물질(colorimetric probe), 형광 물질(fluorescence probe), 화학발광 물질(chemiluminescence probe) 또는 전기화학 신호 발생 물질(electrochemical probe)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 DTNB(5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 콜린 옥시다아제(Choline oxidase); HRP(horseradish peroxidase); 및 HRP와 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질;을 포함하는 조성물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 (c) 단계의 아세틸콜린에스테라아제의 저해 활성 측정은 발색, 형광, 화학발광 또는 전기신호 발생 여부를 관찰하거나 흡광도 측정을 통해 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 방법은 시료가 첨가되지 않은 대조군과 비교하여 발색, 형광, 화학발광 또는 전기신호가 약하거나 흡광도가 감소하면 시료 중에 아세틸콜린에스테라아제 억제제가 존재한다고 판정할 수 있으며,
시료가 첨가되지 않은 대조군과 비교하여 발색, 형광, 화학발광 또는 전기신호가 증가하거나 흡광도가 증가하면 시료 중에 아세틸콜린에스테라아제 활성화제가 존재한다고 판정할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 세포외소포체를 포함하는 아세틸콜린에스테라아제 억제제 또는 활성화제 검출용 조성물을 포함하는 아세틸콜린에스테라아제 억제제 또는 활성화제 검출 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 키트는 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질 및 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질은 아세틸티오콜린 클로라이드(acetylthiocholine chloride)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 세포외소포체에 내재된 아세틸콜린에스테라아제 및 아세틸콜린에스테라아제 반응기질과의 반응에 의해 생성된 생성물과 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 발색 물질은 DTNB(5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 키트는 콜린 옥시다아제(Choline oxidase); HRP(horseradish peroxidase); 및 HRP와 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질;을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서는 세포외소포체 내의 고유한 아세틸콜린에스테라아제를 사용하여 살충제를 간단하고 정확하게 검출하는 것을 확인하였으며, AChE의 발현 리포좀의 형성 및 리포좀으로의 AChE 캡슐화 등을 포함한 다수의 복잡한 단계가 EV 기반 살충제 검출에서는 전혀 필요가 없기 때문에, 본 발명의 방법은 효소의 안정성을 향상시키면서 종래의 분석법의 전체 비용과 환경 위험을 줄일 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에서는 EV에 포함된 AChE(EV AChE)의 안정성이 유리 AChE(free AChE)보다 우수함을 확인하였으며, 여러가지 잠재적 간섭제를 함유한 혈청에 첨가된 유기인계 살충제 또는 카바메이트계 살충제를 성공적으로 검출할 수 있는 것을 확인하였으므로, 농작물, 물 또는 인체 등 다양한 시료 속에 포함된 잔류 살충제를 효과적으로 검출할 수 있다.
도 1은 살충제 검출을 위한 세포외소포체 기반 발색 검출에 대한 개략적인 모식도이다.
도 2는 세포외소포체의 특성을 나타낸 데이터이다. (A)는 EV의 크기 분포 및 농도에 대한 나노입자추적분석(적색 그림자는 평균의 표준편차를 나타냄; 103배 희석) 데이터 및 FE-SEM 이미지(스케일바 100 ㎚)이다. (B)는 간접 ELISA에 의한 EV에서 AChE의 특성을 관찰한 데이터이다 (+: 성분 첨가, -: 성분 부재, Anti-AChE Ab: anti-AChE antibody, ns: not significant(p > 0.05)).
도 3은 엘만 어세이의 원리를 이용한 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정 반응(발색 반응)을 나타낸 모식도이다.
도 4는 콜린 옥시다아제(Choline oxidase) 및 HRP(horseradish peroxidase)을 이용한 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정 반응을 나타낸 모식도로, 도 4의 프로브(probe)는 발색 물질(colorimetric probe), 형광 물질(fluorescence probe), 화학발광 물질(chemiluminescence probe) 또는 전기화학 신호 발생 물질(electrochemical probe)일 수 있다.
도 5는 세포외소포체 기반 바이오센서의 타당성을 확인한 데이터이다. (A)는 EV의 존재(적색) 및 부재(흑색)에서 자외선-가시적 흡수 스펙트럼을 확인한 데이터이며, (B)는 파라옥손의 존재(1) 및 부재(2)일 때 412 ㎚에서 흡광도 값을 막대그래프로 나타낸 데이터이다.
도 6은 37℃에서 세포외소포체의 AChE(적색) 및 유리 AChE(흑색)의 안정성을 나타낸 데이터이다. 활성(remaining activity, %)은 [초기활성(0일) - 최종활성(5일마다 측정)]/초기활성 (0일) X 100으로 계산하였다.
도 7은 용해효과에 따른 AChE 활성을 나타낸 데이터로, 온전한 EV(1), 용해된 EV(2)의 AChE 활성을 측정하였다. EV 존재하에 412 ㎚ 흡광도(A)를 EV 부재시 412 ㎚ 흡광도(A0)로 나눔으로써 상대흡광도(A/A0)를 계산하였다.
도 8을 반응조건의 최적화를 나타낸 데이터로, (A)는 세포외소포체(EV)의 존재(적색) 및 부재(흑색)에 따른 반응 시간, (B)는 ATCh 농도에 따른 412 ㎚ 흡광도, (C)는 DTNB 농도에 따른 412 ㎚ 흡광도를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 EV 기반 OP 검출 센서를 이용하여 파라옥손을 정량적으로 측정한 데이터이다.
도 10은 본 발명의 EV 기반 OP 검출 센서를 이용하여 인간혈청에 첨가된 파라옥손을 정량적으로 측정한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 일관점에서 세포외소포체(extracellular vesicle; EV)를 포함한 살충제 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기 세포외소포체(extracellular vesicle, 이하 "EV"로 혼용 표기함)는 자연적으로 무수한 세포 유형에 의해 분비되며, 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase, 이하 "AChE"로 혼용 표기함)를 풍부하게 포함하고 있기 때문에, 자연발생 세포외소포체를 살충제 검출에 적용할 수 있다.
상기 세포외소포체는 바람직하게 동물 유래일 수 있으나, 아세틸콜린에스테라아제가 내재된 세포외소포체를 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 살충제는 유기인계 살충제 또는 카바메이트계 살충제인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 유기인계 살충제는 파라옥손(Paraoxon), 나레드(Naled), 다이아지논(Diazinon), 말라티온(Malathion), 디클로르보스(dichlorvos), 시아노포스(Cyanophos), 아자메치포즈(Azamethiphos), 클로르펜빈포스(Chlorofenvinphos), 클로로피리포스(Chloropyrifos), 클로로피리포스메칠(Chloropyrifos-methyl), 테메포스(Temephos), 트리클로로폰(Trichlorofon), 페니트로치온(Fenitrothion), 펜소에이트(Phenthoate), 펜치온(Fenthion), 프로치오포스(Prothiofos), 프로페노포스(Profenofos), 프로페탐포스(Propetamphos), 피라크로포스(Pyraclofos), 피리타펜치온(Pyrida[henthion), 피리미포스메칠(Pirimiphos-methyl) 및 테트라 에틸 피로 포스페이트(tetraethyl pyrophosphate)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 카바메이트계 살충제는 알디카브(aldicarb), 메티오카브(methiocarb), 벤디오카브(bendiocarb), 메토밀(methomyl), 카바릴 (carbaryl), 옥사밀(oxamyl), 카르보푸란(carbofuran), 피리미카브(pirimicarb), 이소프로카브(isoprocarb), 프로폭서(propoxur) 및 티오벤카브(thiobencarb)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 시료를 상기 세포외소포체를 포함하는 살충제 검출용 조성물과 혼합하는 단계;
(b) 상기 혼합물에 아세틸콜린에스테라아제 반응기질 및 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 반응액의 아세틸콜린에스테라아제의 저해 활성을 측정하는 단계;를 포함하는 살충제 검출 방법에 관한 것이다.
상기 (a) 단계의 시료는 예를 들면, 물, 토양, 농산물 또는 식품 등이나, 이에 한정되지 않고 잔류 살충제가 있을 것으로 예상되는 물질을 시료로 사용할 수 있다.
또한, 목적에 따라 동물 또는 인체 내 포함된 살충제를 측정하기 위해 생물학적 시료를 이용할 수 있으며, 상기 "생물학적 시료(biological sample)"란 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청을 의미한다.
상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질은 아세틸티오콜린 클로라이드(acetylthiocholine chloride)일 수 있으며, 바람직하게 0.5 ~ 5 mM, 더 바람직하게는 0.5 ~ 1 mM 농도로 첨가될 수 있으나, 살충제의 존재 유무를 검출할 수 있는 농도를 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 세포외소포체에 내재된 아세틸콜린에스테라아제 및 아세틸콜린에스테라아제 반응기질과의 반응에 의해 생성된 생성물과 반응하는 발색 물질(colorimetric probe), 형광 물질(fluorescence probe), 화학발광 물질(chemiluminescence probe) 또는 전기화학 신호 발생 물질(electrochemical probe)일 수 있다.
본 발명의 살충제 검출 방법에서 엘만 어세이(Ellman's assay) 방법을 이용한 발색 반응으로 살충제를 검출하는 경우, 상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 DTNB(5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)일 수 있다. 상기 DTNB는 바람직하게 0.5 ~ 5 mM, 더 바람직하게는 0.5 ~ 1 mM 농도로 첨가될 수 있으나, 살충제의 존재 유무를 검출할 수 있는 농도를 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 살충제 검출 방법에서 콜린 옥시다아제(Choline oxidase) 및 HRP(horseradish peroxidase)를 이용한 반응으로 살충제를 검출하는 경우, 상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 콜린 옥시다아제(Choline oxidase); HRP(horseradish peroxidase); 및 HRP와 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질;을 포함하는 조성물일 수 있다. 또한, 상기 HRP는 필요에 따라 HRP 단독으로 사용하거나 HRP가 결합된 항체를 사용할 수도 있다.
상기 (c) 단계의 아세틸콜린에스테라아제의 저해 활성 측정은 발색, 형광, 화학발광 또는 전기신호 발생 여부를 관찰하거나 흡광도 측정을 통해 수행할 수 있다.
엘만 어세이(Ellman's assay) 방법을 이용하는 경우 흡광도는 400 ~ 450 ㎚에서 측정할 수 있으며, 콜린 옥시다아제 및 HRP를 이용하는 경우 흡광도는 540 ~ 570 ㎚에서 측정할 수 있으나, 이에 한정되지 않고 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브 종류에 따라 흡광도 범위를 설정할 수 있다.
또한, 측정된 흡광도 값을 이용하여 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성을 하기 수학식 1을 이용하여 측정할 수 있다.
[수학식 1]
Figure pat00002
상기 I는 저해활성, I0는 살충제 부재시 측정된 흡광도 값, I1은 살충제 존재시 측정된 흡광도 값을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 시료를 포함하지 않은 대조군과 비교하여 발색, 형광, 화학발광 또는 전기신호가 약하거나 흡광도가 감소하면 시료 중에 살충제 물질이 존재하는 것으로 판정할 수 있다.
도 1은 EV 기반 살충제 검출 시스템의 기본 원리를 나타낸 모식도이다. 천연 공급원으로부터 유도된 EV의 AChE는 기질인 아세틸티오콜린(acetylthiocholine; ATCh)을 생성물인 티오콜린(thiocholine; TCh)으로의 전환을 촉매화하고, 생성된 TCh는 이어서 5,5-디티오비스(2-니트로벤조산)(5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid; DTNB)과 반응하여, 진한 황색의 생성물인 5-티오-2-니트로벤조산(5-thio-2-nitrobenzoic acid; TNB)을 생성한다. 반대로, 살충제가 존재하는 경우, AChE의 촉매활성이 상당히 억제되어 발색 반응이 감소하게 된다. 이러한 발색차이는 육안으로도 쉽게 감지할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일실시예에서, EV의 크기 분포와 농도를 측정하여 특성화하였다. 소혈청으로부터 분리된 EV의 크기 및 농도는 각각 114.9 ± 2.5 ㎚ 및 3.58 ± 0.073 × 1011 particles/㎖이며, FE-SEM로 분석한 결과, 구형의 EV는 평균 직경이 105.3 × 6.4 ㎚인 것으로 확인되었다 (도 2A).
또한, 간접 ELISA에 의한 EV에서 AChE의 특성을 관찰한 결과, 항-AChE 항체를 사용한 ELISA는 EV의 존재하에서만 높은 형광신호가 관찰되었다 (도 2B). 즉, 다량의 AChE가 자연발생 EV 내에 존재하는 것을 확인하였다.
도 3은 엘만 어세이(Ellman's assay)의 원리를 나타낸 모식도로, EV AChE는 기질 ATCh를 TCh로 가수분해하고, DTNB와의 복합체를 형성하여 DTNB의 축소된 형태인 TNB를 생성한다. 결과적으로 412 ㎚의 최대 흡수에서 진한 황색이 관찰된다. DTNB는 가시광선 스펙트럼(~320 ㎚)를 초과하여 최대 흡수를 나타내기 때문에, 엘먼의 분석 결과는 육안으로도 색도 반응을 측정함으로써 쉽게 해석할 수 있다.
EV에 내재된 AChE의 활성측정 방법은 엘만 어세이 방법에 한정되지 않고, EV에 내재된 AChE 및 아세틸콜린에스테라아제 반응기질과의 반응에 의해서 생성된 생성물과 반응하는 발색 물질(colorimetric probe), 형광 물질(fluorescence probe), 화학발광 물질(chemiluminescence probe) 또는 전기화학 신호 발생 물질(electrochemical probe)을 이용하여 측정할 수 있다.
구체적으로, 도 4에 나타난 바와 같이, EV AChE에 의해 기질 ATCh이 가수분해되어 생성된 콜린(Choline)과 콜린 옥시다아제(Choline oxidase)가 반응하여 과산화수소(H2O2) 및 베타인알데히드(betaine aldehyde)가 생성되며, 생성된 과산화수소와 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브가 HRP(horseradish peroxidase)에 의해 반응하여 발색, 형광, 화학발광 또는 전기신호 반응이 발생하게 된다.
본 발명의 구체적인 다른 일실시예에서는, 자연발생 EV의 특성 분석 후, EV에 내재된 AChE의 활성을 엘만 어세이로 측정하였다. 412 ㎚에서 흡광도를 측정한 결과(도 5A), 샘플 내 EV의 유무를 구별될 수 있음을 분명히 보여주었으며, 이를 통해 EV에서 AChE의 존재를 추가적으로 입증하였다.
또한, 유기인계 살충제인 파라옥손의 존재하에 421 ㎚에서 현저하게 감소된 발색 신호를 관찰함으로써(도 5B), 파라옥손에 의해 AChE 효소 활성이 현저하게 억제하는 것을 확인하였다.
즉, 살충제의 발색 검출을 위한 도구로서 EV의 적용 가능성을 확인하였다.
종래의 기술에서 AChE를 캡슐화하는데 사용하는 리포좀은 프로테아제에 의한 분해 및 소수성 상호작용에 의해 효소를 효과적으로 보호하여 효소 안정성을 향상시키는 것으로 보고되었다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에서는 자연발생 EV에서 리포좀과 유사하거나 더 우수한 AChE 효소활성 안정성을 보이는지 확인하고자 하였다. 5일 마다 효소 활성을 측정한 결과, EV AChE는 최대 30일 동안 안정하게 활성이 유지된 반면, 유리 AChE는 활성이 현저하게 감소된 것을 확인하였다 (도 6). 구체적으로 저장기간 30일 후 EV AChE 및 유리 AChE의 활성은 각각 81% 및 40%였다.
본 발명에서는 EV가 제공하는 소포환경이 AChE 활성의 안정성을 약 2배 이상 향상시키는 것을 확인하였으며, 이는 AChE가 내재된 EV는 안정적인 살충제 검출 바이오센서 개발에 효과적으로 적용가능한 것을 의미한다.
AChE는 EV 내 존재하기 때문에 OP 검출은 EV 인지질 이중층에 의해 방해받을 수밖에 없다. 본 발명에서는 EV 용해가 AChE에 대한 기질 접근성을 용이하게 할 것이라고 가정하고, 효소활성의 EV-기반 발색 검출에 대한 용해의 효과를 측정하였다.
그 결과, 용해된 EV는 온전한 EV에 비해 412 ㎚에서 오히려 더 낮은 흡광도를 보이는 것을 확인하였으며(도 7), 이는 별도의 용해 과정 없이도 AChE 기질인 ATCh는 EV로 자유롭게 확산되어 고유 AChE와 반응할 수 있는 것을 의미한다. 즉, EV는 전처리 과정 없이 자연 발생원으로부터 분리시 즉시 사용할 수 있으며, 이를 통해 본 발명의 EV 기반 살충제 검출 방법은 간편하게 살충제를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에서, EV 기반 OP 검출을 위한 최적 조건을 결정하기 위해, 반응시간 ATCh 및 DTNB의 농도, 및 용해 효과를 포함한 기본 파라미터를 측정하였다. ATCh 및 DTNB 사이의 반응을 위한 최적 시간을 확인한 결과, EV(적색)의 존재하에서, 412 ㎚에서의 흡광도는 반응시간의 증가에 따라 점차 증가하고, 8분 후에 일정하게 되는 경향이 관찰되었으며, 이는 EV-free 용액(흑색)에서 관찰된 패턴과 분명하게 상이한 것으로 확인되었다 (도 8A).
또한, EV AChE에 의해 ATCh 가수분해 반응시간을 10분으로 설정하여 AChE-촉매된 발색반응에 대한 ATCh 및 DTNB의 농도에 따른 검출능을 확인한 결과, ATCh 및 DTNB의 농도가 각각 1mM 및 0.9 mM까지 증가함에 따라 412 ㎚에서의 흡광도가 향상되었으나, 그 후에는 감소하는 경향이 관찰되어, ATCh 및 DTNB의 최적 농도를 각각 1mM 및 0.9 mM로 설정하였다 (도 8B 및 도 8C).
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에서, 본 발명의 EV 기반 살충제 검출 시스템이 파라옥손의 정량적 결정에 적용 가능한지 여부를 최적화된 조건하에서 평가한 결과, 고농도의 파라옥손을 처리한 경우, ATCh에 대한 가수분해 반응이 억제되고, 더 적은 TCh를 생성하였으며, 412 ㎚ 흡광도가 감소한 것을 확인하였다. 반대로, 더 낮은 파라옥손 농도에서는 ATCh의 가수분해가 향상되어 더 많은 TNB 분자가 생생되어 412 ㎚에서 흡광도가 증가한 것을 확인하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, 억제도 (%)는 -log [억제제 농도]의 관점에서 적합하였고, 상관관계식은 10-12 ~ 10-4 M의 넓은 동적 범위에서 y = -10.52x + 131.8(R2 = 0.95)이었다. 검출 한계는 53.8 pM으로 측정되었으며 이는 다른 검출 시스템을 사용하여 얻은 종래에 보고된 값과 비슷하거나 훨씬 우수한 것으로 확인되었다 (T. Yu, et al., RSC Advances, 4:8321-8327, 2004; J. Sun, et al., Biosens . Bioelectron ., 28:152-157, 2011).
나아가, 본 발명에서 효소 활성을 방해할 수 있는 많은 불순물이 포함된 실제 샘플에 대해 EV 기반 살충제 검출 시스템의 적용 가능성을 평가하였다. 인간 혈청을 임상 샘플로 사용하여 분석한 결과, 인간혈청에서 첨가된 상이한 농도의 파라옥손이 정확하게 측정되는 것을 확인하였다 (도 10 및 표 1).
즉, 본 발명의 EV 기반 살충제 검출 시스템은 실제 시료에서 살충제 검출을 간단하고 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 추가의 리포좀 형성과정 없이 자연적으로 발생된 EV를 그대로 사용할 수 있기 때문에 종래의 분석법에 비해 간편하고 저비용으로 잔류 살충제 검출을 수행할 수 있는 장점이 있으며, EV에 포함된 AChE(EV AChE)의 안정성이 우수할 뿐만 아니라, 여러가지 잠재적 간섭제를 함유한 혈청에 첨가된 유기인계 살충제를 성공적으로 검출할 수 있는 것을 확인하였으므로, 농작물, 물 또는 인체 등 다양한 시료 속에 포함된 잔류 살충제를 검출하기 위한 키트 또는 바이오센서로의 활용이 가능하다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 세포외소포체를 포함하는 살충제 검출용 조성물을 포함하는 살충제 검출 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질 및 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질은 아세틸티오콜린 클로라이드(acetylthiocholine chloride)일 수 있다.
상기 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 세포외소포체에 내재된 아세틸콜린에스테라아제 및 아세틸콜린에스테라아제 반응기질의 반응에 의해 생성된 생성물과 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질일 수 있으며, 구체적인 내용은 상술한 바와 같다.
엘만 어세이 발색 반응 기반 키트인 경우, 상기 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 바람직하게 DTNB 및 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)가 포함된 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer)로 제조된 엘먼 반응 버퍼일 수 있으며,
콜린 옥시다아제(Choline oxidase) 및 HRP(horseradish peroxidase) 반응 기반 키트인 경우, 상기 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 콜린 옥시다아제(Choline oxidase); HRP(horseradish peroxidase); 및 HRP와 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질;을 포함하는 조성물일 수 있다. 상기 HRP는 필요에 따라 HRP 단독으로 사용하거나 HRP가 결합된 항체를 사용할 수도 있다.
또한, 상기 키트는 본 발명의 EV 기반 살충제 검출 방법이 기재된 매뉴얼을 추가로 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, 자연 발생된 세포외소포체(extracellular vesicle; EV)에는 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase; AChE)를 풍부하게 포함하고 있기 때문에, 살충제뿐만 아니라, 아세틸콜린에스테라아제의 활성을 억제시키거나 활성화시키는 물질 또는 아세틸콜린에스테라아제 기질 물질 검출에 용이하게 적용시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 세포외소포체를 포함한 아세틸콜린에스테라아제 억제제 또는 활성화제 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기 세포외소포체는 아세틸콜린에스테라아제를 포함할 수 있으며, 구체적인 내용은 상술한 바와 같다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 시료를 아세틸콜린에스테라아제가 내재된 세포외소포체와 혼합하는 단계;
(b) 상기 혼합물에 아세틸콜린에스테라아제 반응기질 및 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 반응액의 아세틸콜린에스테라아제의 저해 활성을 측정하는 단계;를 포함하는 아세틸콜린에스테라아제 억제제 또는 활성화제 검출 방법에 관한 것이다.
상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질은 아세틸티오콜린 클로라이드(acetylthiocholine chloride)일 수 있다.
상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 세포외소포체에 내재된 아세틸콜린에스테라아제 및 아세틸콜린에스테라아제 반응기질과의 반응에 의해 생성된 생성물과 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질일 수 있으며, 구체적인 내용은 상술한 바와 같다.
상기 방법은 시료가 첨가되지 않은 대조군과 비교하여 발색, 형광, 화학발광 또는 전기신호가 약하거나 흡광도가 감소하면 시료 중에 아세틸콜린에스테라아제 억제제가 존재한다고 판정할 수 있으며, 시료가 첨가되지 않은 대조군과 비교하여 발색, 형광, 화학발광 또는 전기신호가 증가하거나 흡광도가 증가하면 시료 중에 아세틸콜린에스테라아제 활성화제가 존재한다고 판정할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 세포외소포체를 포함하는 아세틸콜린에스테라아제 억제제 또는 활성화제 검출용 조성물을 포함하는 아세틸콜린에스테라아제 억제제 또는 활성화제 검출 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질 및 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질은 아세틸티오콜린 클로라이드(acetylthiocholine chloride)일 수 있다.
상기 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 세포외소포체에 내재된 아세틸콜린에스테라아제 및 아세틸콜린에스테라아제 반응기질과의 반응에 의해 생성된 생성물과 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질일 수 있으며, 구체적인 내용은 상술한 바와 같다.
엘만 어세이 발색 반응 기반 키트인 경우, 상기 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 바람직하게 DTNB 및 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)가 포함된 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer)로 제조된 엘먼 반응 버퍼일 수 있으며,
콜린 옥시다아제(Choline oxidase) 및 HRP(horseradish peroxidase) 기반 키트인 경우, 상기 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 콜린 옥시다아제(Choline oxidase); HRP(horseradish peroxidase); 및 HRP와 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질;을 포함하는 조성물일 수 있다. 상기 HRP는 필요에 따라 HRP 단독으로 사용하거나 HRP가 결합된 항체를 사용할 수도 있다.
또한, 상기 키트는 본 발명의 EV 기반 아세틸콜린에스테라아제 억제제 또는 활성화제 검출 방법이 기재된 매뉴얼을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
세포외소포체 ( extracellular vesicle; EV) 특성 확인
1-1 : 세포외소포체 분리
EV 분리는 제조사의 프로토콜에 따라 ExoQuick-TC 시약(SBI, 미국)을 사용하여 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Sigma-Aldrich, 미국)으로부터 분리하였다.
간단하게, FBS는 30-kDa 필터(Pall Corporation, 미국)을 사용하여 원심분리기 디바이스(Macrosep Advance Centrifugal Device)로 3000 ×g 에서 15분 동안 원심분리하였다. 농축된 EV를 함유하는 잔류물을 새로운 멸균 튜브로 옮긴 다음, 1/5 부피의 ExoQuick-TC 시약과 혼합하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음, 혼합물을 1500 ×g에서 30분 동안 원심분리한 후, 상청액을 제거하여 튜브의 바닥에 형성된 펠렛을 수득하였다. EV를 함유하는 펠렛은 PBS로 2회 세척하고 PBS로 재현탁시킨 다음, 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
1-2 : 크기 및 분포 확인
분리된 EV의 입자 크기 및 농도를 측정하기 위해 나노입자 추적 분석(Nanoparticle tracking analysis; NTA)을 수행하였다.
먼저, NanoSight NS300 장치(Malvern-Panalytical, 영국) 및 488 ㎚로 설정된 단색 레이저빔을 사용하여 분석되었으며, 30초의 비디오는 카메라 레벨 14의 25프레임/초로 촬영하였다. 각 시야에서 약 30 ~ 50개의 입자를 분석하고, NanoSight 소프트웨어를 사용하여 입자의 브라운 운동을 평가하였다. NTA 설정이 샘플간에 최적화되고 일관되게 유지하였다. 기록된 비디오를 분석하여 입자 크기 및 농도를 측정하였다.
또한, 분리된 EV를 관찰하기 위해, FE-SEM(Field-emission scanning electron microscopy) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 분리된 EV를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 수용액을 함유하는 고정완충액(fixation buffer, Biolegend, 미국)에 고정시키고 15분 동안 얼음 위에서 반응시켰다. 실리콘 웨이퍼를 먼저 에탄올 및 탈이온수에서 5분 동안 초음파 처리하여 세정한 다음, 샘플을 세정된 웨이퍼상에 떨어뜨리고 환기 후드하에서 건조시킨 후 진공펌프로 처리하였다. 이미징 하기 전에 스퍼터링에 의해 백금 코팅을 수행한 다음, 10.0 kV의 빔에너지에서 작동하는 FE-SEM(SU8010, Hitachi, 일본)을 사용하여 분석하였다.
모든 통계분석은 GraphPad Prism 8 software (GraphPad software, Inc., 미국)을 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균± 표준편차(SD)로 표시하였으며, 관찰된 샘플들 사이의 차이는 Mann-Whitney 테스트에 의해 통계적으로 평가되었다. P-value < 0.05은 유의한 것으로 간주되었으며, 모든 실험은 3회 반복 수행하였다.
그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, 소혈청으로부터 분리된 EV의 크기 및 농도는 각각 114.9 ± 2.5 ㎚ 및 3.58 ± 0.073 × 1011 particles/㎖로 확인되었다. 또한, 도 2A에 표시된 FE-SEM 데이터는 구형 EV의 평균 직경이 105.3 × 6.4 ㎚인 것으로 확인되었다.
1-3 : EV 내 AChE 확인
EV에서 AChE의 존재는 간접 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 평가하였다.
먼저, 상기 EV 용해과정으로 제조된 EV 용해물(20 ㎎/㎖)을 면역플레이트(immunoplate, SPL Life Sciences, 한국)의 웰에 코팅한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 세척버퍼(0.5% Triton X-100이 포함된 PBS)로 3회 세척하고, 블로킹 버퍼(2% bovine serum albumin 및 0.1% Triton X-100이 포함된 PBS)로 37℃에서 2시간 동안 블로킹하였다.
항-AChE 폴리클로날 항체(Anti-AChE polyclonal antibody; 2.4 ㎎/㎖; A2806, ABclonal, 미국)를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 결합되지 않은 항체를 세척버퍼로 3회 세척한 다음, HRP(Horseradish peroxidase)가 접합된 IgG(0.4 ㎎/㎖; 406401, Biolegend, 미국)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 추가로 반응시켰다.
세척버퍼로 세척한 후, TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 용액(Sigma-Aldrich, 미국)을 각 웰에 첨가하고 10분 동안 반응시킨 다음, 마이크로플레이트 리더(Spectramax iD5 Multi-Mode Microplate Reader; Molecular Devices, 미국)를 이용하여 650 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이, 항-AChE 항체를 사용한 ELISA는 EV의 존재하에서만 높은 형광신호가 관찰된 것으로 보아, 다량의 AChE가 자연발생 EV 내에 존재하는 것을 확인하였다.
EV를 이용한 파라옥손 검출
본 발명의 EV 기반 살충제 검출 시스템을 이용하여 유기인계 살충제인 파라옥손(Paraoxon)을 검출하고자 하였다. 자연발생 EV에 내재된 AChE의 활성은 엘만 어세이(Ellman's assay)로 측정하였다 (도 3).
먼저, 분리된 EV(7 × 109 particles)를 DTNB(1 mM 5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid; Sigma-Aldrich, 미국) 및 1 mM EDTA(1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, Biosesang, 한국)이 포함된 0.1 M 인산나트륨 버퍼(0.1 M sodium phosphate buffer; pH 7.4, Samchun Chemical Co., Ltd., 한국)으로 제조된 엘만(Ellman) 반응 버퍼와 혼합하였다.
그 다음, 20 mM 아세틸티오콜린 클로라이드(acetylthiocholine chloride; Sigma-Aldrich, 미국)을 첨가하여 AChE 촉매 전환을 개시한 후, 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용에서 412 ㎚에서 측정하였다.
[수학식 1]
Figure pat00003
상기 I는 저해활성, I0는 살충제 부재시 측정된 흡광도 값, I1은 살충제 존재시 측정된 흡광도 값을 의미한다.
그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, 412 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써 EV에서 AChE의 존재를 추가적으로 입증하였으며, 도 5B에 나타난 바와 같이, 유기인계 살충제인 파라옥손의 존재하에 421 ㎚에서 현저하게 감소된 발색 신호가 관찰되었다. 이는 파라옥손에 의해 AChE 효소 활성이 현저하게 억제된 것을 의미하며, 본 발명의 EV 기반 살충제 검출 시스템이 살충제의 발색 검출을 위한 도구로서 적용가능함을 확인하였다.
EV에서 AChE의 안정성 확인
본 발명의 구체적인 또 다른 일실시예에서는 자연발생 EV에서 리포좀과 유사하거나 더 우수한 AChE 효소활성 안정성을 보이는지 확인하고자 하였으며, 상기 실시예 2의 방법으로 5일 마다 효소 활성을 측정함으로써 자연발생 EV에서 AChE의 안정성을 조사하였다.
유리 AChE는 5000 U/㎖ AChE 저장용액(Sigma-Aldrich, C3389, 미국)을 PBS로 희석하여 사용하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, EV AChE는 최대 30일 동안 안정하게 활성이 유지된 반면, 유리 AChE는 활성이 현저하게 감소된 것을 확인하였다. 구체적으로 저장기간 30일 후 EV AChE 및 유리 AChE의 활성은 각각 81% 및 40%였다.
종래의 합성 리포좀에 캡슐화된 AChE의 활성은 36℃에서 60시간 동안 90%의 활성을 유지하였으며, 상이한 시간 및 온도를 고려하면, 효소안정성에 대한 EV의 안정화 효과는 인공 리포좀의 효과와 유사할 것으로 예상된다.
EV 용해에 의한 EV AChE 활성 확인
AChE는 EV 내 존재하기 때문에 살충제 검출은 EV 인지질 이중층에 의해 방해 받을 수 있으므로, 본 발명에서는 EV 용해가 AChE에 대한 기질 접근성을 용이하게 할 것이라고 가정하고, 효소활성의 EV 기반 살충제 발색 검출에 대한 용해의 효과를 측정하였다.
EV의 용해를 위해 동일한 부피의 분리된 EV를 HaltTM 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Fisher Scientific)을 포함하는 동일한 부피의 PierceTM RIPA 버퍼와 혼합한 다음, 얼음 위에서 15분 동안 반응시켰으며, 상기 혼합물을 용해된 EV로 사용하였다.
또한, 추가 처리 없이 분리된 EV를 온전한 EV로 사용하였으며, AChE 활성은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 용해된 EV는 온전한 EV에 비해 412 ㎚에서 오히려 더 낮은 흡광도를 보이는 것을 확인하였으며, 이는 별도의 용해 과정 없이도 AChE 기질인 ATCh는 EV로 자유롭게 확산되어 고유 AChE와 반응할 수 있는 것을 의미한다. 즉, EV는 전처리 과정 없이 자연 발생원으로부터 분리시 즉시 사용할 수 있으며, 이를 통해 본 발명의 EV 기반 살충제 검출 방법은 간편하게 살충제를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
EV 기반 살충제 검출 시스템의 최적화
5-1 : ATCh 및 DTNB 반응시간 측정
본 발명의 EV 기반 살충제 검출 시스템을 위한 최적 조건을 결정하기 위해, 반응시간 ATCh 및 DTNB의 농도, 및 용해 효과를 포함한 기본 파라미터를 측정하였다.
먼저, ATCh 및 DTNB 사이의 반응을 위한 최적 시간을 확인하였다. AChE 활성은 상기 실시예 2의 방법으로 측정하였으며, 10분 동안 30초 간격으로 AChE 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 8A에 나타난 바와 같이, EV(적색)의 존재하에서, 412 ㎚에서의 흡광도는 반응시간의 증가에 따라 점차 증가하였으며, 8분 후에 일정하게 되는 경향이 관찰되었다.
5-2 : ATCh 및 DTNB 최적 반응 농도 확인
EV AChE에 의해 ATCh 가수분해 반응시간을 10분으로 설정하여 AChE-촉매된 발색반응에 대한 ATCh 및 DTNB의 농도에 따른 검출능을 확인하였다.
ATCh 및 DTNB의 농도는 0 ~ 5 mM 범위가 되도록 첨가하였으며, AChE 활성은 상기 실시예 2의 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 8B 및 도 8C에 나타난 바와 같이, ATCh 및 DTNB의 농도가 각각 1 mM 및 0.9 mM까지 증가함에 따라 412 ㎚에서의 흡광도가 향상되었으나, 그 후에는 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서, ATCh 및 DTNB의 최적 농도는 각각 1mM 및 0.9 mM으로 설정하였다.
EV를 이용한 파라옥손 정량적 측정
본 발명의 EV 기반 살충제 검출 시스템이 파라옥손을 정략적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위해 상기 실시예 5에서 최적화된 조건을 이용하여 수행하였다.
상이한 농도의 표준 파라옥손(10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 및 10-9 M)을 5분 동안 EV와 함께 배양한 후, 0.9 mM DTNB 및 1 mM EDTA가 포함된 0.1 M 인산나트륨 버퍼로 제조된 엘만 반응 버퍼와 혼합하였다.
그 다음, 1 mM ATCh를 첨가하여 AChE 촉매 전환을 개시한 후, 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 사용에서 412 ㎚에서 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 억제도(%)는 -log[억제제 농도]의 관점에서 적합하였고, 10-12 ~ 10-4 M의 넓은 동적 범위에서 상관관계식은 y = -10.52x + 131.8(R2 = 0.95), 검출 한계는 53.8 pM으로 확인되었다.
실제 샘플에 대한 EV 기반 검출의 적용
본 발명에서는 효소 활성을 방해할 수 있는 많은 불순물이 포함된 실제 샘플에 대해 본 발명의 EV 기반 살충제 검출 시스템의 적용 가능성을 평가하였다.
인간 혈청을 임상 샘플로 사용하였으며, EV 기반 살충제 검출 시스템의 평가를 위해 스파이크 및 복구 실험(spike-and-recovery test)를 수행하였다.
상이한 농도의 파라옥손(5 × 10-6 및 5 × 10-7 M)이 첨가된 인간 혈청에 포함된 파라옥손의 농도는 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 측정하였으며, 이들의 억제 정도는 상기 수학식 1을 이용하여 계산하였다. 희석된 인간 혈청의 최종 농도는 5%로 확인되었다.
인간 혈청 내 파라옥손 검출
Added paraoxon concentration (M) Theoretical paraoxon inhibitiona (%) Measured paraoxon inhibitionb (%) SDc CVd (%) Recoverye (%)
5 × 10-6 70.1 79.0 1.09 1.38 112.6
5 × 10-7 51.0 50.8 6.46 12.7 99.6
a) 도 10의 상관관계식으로 계산.
b) 3회 반복 측정.
c)3회 측정의 표준 편차(Standard deviation).
d) 변동계수(Coefficient of variation, CV) = (SD/mean) Х 100 (%).
e) 회수율(Recovery) = (measured mean/added inhibition) Х 100 (%).
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 인간 혈청에서 파라옥손은 10-9 ~ 10-4 M 범위에서 수득되었으며, 상관관계식은 y = -19.14x + 171.6(R2 = 0.97)으로 확인되었다. 또한, 표 1에 나타난 바와 같이, 변동계수 1.38% 및 12.7%, 회수율 112.6% 및 99.6%로 확인되었다.

Claims (10)

  1. 세포외소포체(extracellular vesicle)를 포함한 살충제 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포외소포체는 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase)가 내재되어 있는 것을 특징으로 하는 살충제 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포외소포체는 동물 유래인 것을 특징으로 하는 살충제 검출용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 살충제는 유기인계 살충제 또는 카바메이트계 살충제인 것을 특징으로 하는 살충제 검출용 조성물.
  5. (a) 시료를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 살충제 검출용 조성물과 혼합하는 단계;
    (b) 상기 혼합물에 아세틸콜린에스테라아제 반응기질 및 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
    (c) 상기 반응액의 아세틸콜린에스테라아제의 저해 활성을 측정하는 단계;를 포함하는 살충제 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (b) 단계의 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질은 아세틸티오콜린 클로라이드(acetylthiocholine chloride)이며,
    상기 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 세포외소포체에 내재된 아세틸콜린에스테라아제 및 아세틸콜린에스테라아제 반응기질과의 반응에 의해 생성된 생성물과 반응하는 발색 물질(colorimetric probe), 형광 물질(fluorescence probe), 화학발광 물질(chemiluminescence probe) 또는 전기화학 신호 발생 물질(electrochemical probe)인 것을 특징으로 하는 살충제 검출 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 (c) 단계의 아세틸콜린에스테라아제의 저해 활성 측정은 발색, 형광, 화학발광 또는 전기신호 발생 여부를 관찰하거나 흡광도 측정을 통해 수행할 수 있으며,
    시료를 포함하지 않은 대조군과 비교하여 발색, 형광, 화학발광 또는 전기신호가 약하거나 흡광도가 감소하면 시료 중에 살충제 물질이 존재하는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 살충제 검출 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 살충제 검출용 조성물을 포함하는 살충제 검출 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 키트는 아세틸콜린에스테라아제 반응 기질 및 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브를 추가로 포함하며,
    상기 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정용 프로브는 세포외소포체에 내재된 아세틸콜린에스테라아제 및 아세틸콜린에스테라아제 반응기질의 반응에 의해 생성된 생성물과 반응하는 발색 물질, 형광 물질, 화학발광 물질 또는 전기화학 신호 발생 물질인 것을 특징으로 하는 살충제 검출 키트.
  10. 세포외소포체를 포함한 아세틸콜린에스테라아제 억제제 또는 활성화제 검출용 조성물.
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