KR20090046466A

KR20090046466A - 아세틸콜린에스테라제를 이용한 잔류 농약 검출용 키트 및이를 이용한 잔류농약 검출방법

Info

Publication number: KR20090046466A
Application number: KR1020070112639A
Authority: KR
Inventors: 이혜성; 이용태; 노화영; 김영아
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2007-11-06
Filing date: 2007-11-06
Publication date: 2009-05-11

Abstract

본 발명은 농작물의 잔류 농약을 검출하기 위한 키트 및 이를 이용한 잔류 농약을 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아세틸콜린에스테라제(AChE)로 코팅된 막을 가지는 스트립과 잔류 농약 검출반응을 확인하기 위한 발색용 효소 기질을 포함하는 잔류 농약 검출용 키트 및 이를 이용한 잔류 농약 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 유기인계 및 카바메이트 계 농약의 검출에 특이적이고, 육안의 검출한계가 10-3㎍/mL에 불과하여 육안으로도 감도 높게 농약의 검출이 가능하고 검출의 단계가 간단하여 보다 간편하게 농작물의 잔류 농약을 검출할 수 있는 분석법을 제공할 수 있다.

콜린에스테라제, 아세틸콜린에스테라제, 농약, 유기인계, 카바메이트계, 딥스틱 분석

Description

아세틸콜린에스테라제를 이용한 잔류 농약 검출용 키트 및 이를 이용한 잔류농약 검출방법{A Kit for Detecting Pesticide residues in Crops and the Detecting Method Thereof}

농약으로 인한 식품 오염 및 환경 오염에 대한 대중적인 관심은 증가하여 왔고, 이는 농약을 보다 폭넓고 엄격하게 규제하고자 하는 요구를 증대시켰다. 규제당국은 크로마토그래피법을 통함 검사법의 시료 준비 절차가 검사비용이 높고, 복잡하며 시간 소비를 많이 하기 때문에 너무 적은 수의 시료를 검사하여 왔는데, 이는 비판의 대상이 되어왔다. 크로마토그래피법에 비해 특정 농약 군에 특이적인 검사법은 폭넓은 농약 검사를 위한 매력있는 접근일 수 있다. 만약 시료 내 특정 농약 군의 양이 측정가능하고, 그 양이 해당 농약 군의 특정 농약의 최대 잔류 허용 치보다 적다면 그 시료는 해당 농약의 검사에 앞서 배제할 수도 있다. 대부분의 식품과 환경 시료가 농약의 최대 잔류 허용치보다 적은 것으로 밝혀지기 때문에 많은 시간과 비용이 이러한 접근법으로 절약될 수 있다.

유기인계 및 카바메이트 농약과 같은 주요 농약 군의 경우 이러한 절약이 보다 클 수 있다. 최근 콜린에스테라제의 저해에 기반을 둔 유기인계 및 카바메이트 농약의 군 특이적 측정법의 개발에 대한 연구가 다수 보고되고 있다. 이러한 모든 측정법의 원리는 콜린에스테라제의 활성이 상기 농약들에 의해 저해되고 저해 정도는 농약의 농도에 따라 달라진다는 사실에 기초하고 있다.

이러한 방법은 포토미터(photometer)를 이용한 효소분석법 또는 전기화학적 바이오센서의 형태로 개발되어왔다. 양 방법의 경우에 효소 저해의 검출은 장비를 이용하여 실험실에서 수행되어야 하고, 이러한 이유 때문에 현장 감시에는 적합하지 않았다. 원리적으로는, 막을 가지는 효소 지지체 및 발색 효소 기질을 이용하여 육안으로 발색정도를 확인함으로써 효소 저해를 검사하는 딥스틱 분석법은 정량 및 반정량 현장 농약 검사법이라 할 수 있다. 그러나 딥스틱형 콜린에스테라제 기반 농약 검출법은 지금까지 개발된 바가 거의 없다. Weetall et al. 은 막을 이용하는 콜린에스테라제 기반 분석법을 개발하였는데, 발색은 막 위에서 나타나는 것이 아니고, 막 위의 용액에서 나타나는 것이었다. 상업적으로 구입이 가능한 콜린에스테라제 기반 키트인 유기인계 스틱 센서(Protein-Biosensor: Toulouse cedex, France)는 효소 기질과 더불어 발색 측정이 가능한 기질을 이용한다. 그러나 이 키트는 비색용 물질(colorimetric substrate)을 따로 사용해야 하는 등 사용상의 단 점이 있었다.

이에 본 발명자들은 여러 가지 타입의 막과 발색 콜린에스테라제 기질을 테스트하여 가장 적합한 것을 선택함으로써 유기인계 및 카바메이트계 농약의 검출에 더욱 특이적이고 간편한 분석법을 개발하였다.

결국 본 발명의 목적은 보다 간편하게 농약 시료를 분석할 수 있는 아세틸콜린에스테라제 및 발색 효소 기질을 이용한 잔류 농약 검출용 키트 및 잔류 농약 검출 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 아세틸콜린에스테라제(AChE)로 코팅된 막을 가지는 스트립 및 잔류 농약 검출반응을 확인하기 위한 발색용 효소 기질을 포함하는 잔류 농약 검출용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 농약이 함유되어 있는 농작물 시료를 준비하는 단계; (b) 상기 농작물 시료에 아세틸콜린에스테라제(AChE)로 코팅된 막을 가지는 스트립을 넣고 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 스트립을 발색용 효소기질 용액에서 반응시키고 발색 강도를 측정하는 단계를 포함하는 농작물 잔류 농약의 검출방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 효소 코팅을 위한 막은 양전하로 하전된 나일론 막이 가 장 적정하고, 본 발명에서 특히 사용한 막은 Hybond N+막이었다.

본 발명에 있어서, 상기 발색용 효소기질은 인도페닐 아세테이트 또는 인독실 아세테이트를 사용할 수 있고, 상기 효소기질의 사용 농도는 인도페닐 아세테이트가 2mM이고, 인독실 아세테이트가 1mM가 바람직하다. 또한, 상기 효소기질이 인도페닐 아세테이트인 경우 아세틸콜린에스테라제의 농도는 1000unit/mL이고, 인독실 아세테이트인 경우 500unit/mL가 바람직하다.

상기 농약 검출을 위한 농작물 시료는 유기용매를 이용하여 시료를 추출하고 용매를 증발시킨 후 잔류물을 재추출한 것을 사용한다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 발색강도의 측정은 육안 측정 또는 반사계를 이용하여 측정할 수 있고, 상기 반사계를 이용한 측정시 인도페닐 아세테이트의 검출을 위한 파장은 560nm이고, 인독실 아세테이트의 검출을 위한 파장은 657nm을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 농약 검출용 키트 및 검출법에서 검출에 적합한 농약은 파라티온, 클로르피리포스(chlorpyrifos) 및 말라티온 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기인계 농약 또는 카르보퓨란(carbofuran), 카바릴(carbaryl) 및 벤디오카브(bendiocarb) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 카바메이트계 농약 등이 있다.

본 발명에 따르면 유기인계 및 카바메이트 계 농약의 검출에 특이적이고, 육안의 검출한계가 10-3㎍/mL에 불과하여 육안으로도 감도 높게 농약의 검출이 가능 하고 검출의 단계가 간단하여 보다 간편하게 농작물의 잔류 농약을 검출할 수 있는 분석법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 잔류농약 검출법은 검출을 위해 효소 지지체로서 막을 사용하고 막 위에서 발색되는 원리를 채용한다는 점에서 시판되고 있는 유기인계 스틱 센서와 유사하나, 비색용 물질(colorimetric substrate)을 배제하는 등, 효소기질만을 이용하여 절차적으로 보다 간단한 방법을 제공할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 따른 잔류 농약 검출법은 유기인계(organophosphat) 및 카바메이트계(CM) 농약의 검출에 특이적인 콜린에스테라제(ChE)-기반 딥스틱(dipstick) 타입 분석법이다.

본 발명에 따른 분석법의 원리는 두 가지 군의 농약이 클린에스테라제의 활성을 저해하는 것에 기초를 두고 있는데, 그 저해는 농약의 농도에 따라 다르다. 본 발명에 따른 농약 검출용 키트는 아세틸콜린에스테라제(AChE)로 코팅된 막을 가지는 테스트 스트립(strip)과 효소 기질 용액으로 이루어져 있다.

분석 프로토콜은 농약 시료 용액 내에 효소 코팅된 스트립을 넣고 인큐베이션하는 단계 및 발색 효소 기질 용액 내에 시료 처리된 스트립을 넣고 반응시키는 단계를 포함한다. 육안 또는 반사계(reflectometer)를 통해 측정하고, 효소 지지체로서 사용하는 막으로서는 Hybond N+이 가장 적합하다. 효소 기질로 사용하는 화합물로는 인도페닐 아세테이트가 가장 적합하다.

본 발명에 따른 농약 검출법에서 검출가능한 유기인계 및 카바메이트계 농약의 농도범위는 각각 10-6~10-2과 10-6~100㎍/mL이었다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예로써 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해 제공되는 것으로 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

시료 및 장비의 준비

아세틸콜린에스테라제(EC 3.1.1.7, V-S type from electric eel, 1000-2000 units mg-1 protein) (AchE), 인도페닐 아세테이트, 2,6-디클로로인도페닐 아세테이트, 인독시 아세테이트, N-메틸인독실 아세테이트, BSA(bovine serum albumin), 카제인, 젤라틴 및 치킨 OVA( egg albumin)는 Sigma (St. Louis, USA)로부터 구입하였다.

유기인계 농약 파라티온, 클로르피리포스(chlorpyrifos) 및 말라티온(malathion)은 Dr. Ehrenstorfer GmbH(Augsburg, Germany)로부터 구입하였고, 카바메이트계 농약 카바릴(carbaryl), 카보퓨란(carbofuran) 및 벤디오카브(bendiocarb)는 Chem Service (West Chester, U.S.A.)로부터 구입하였다.

Biodyne B (pore size, 0.45 ㎛)와 Immunodyne ABC membrane (pore size, 0.45 ㎛)은 Pall (Pall Filtrationstechnik GmbH, Dreieich, Germany)로부터 구입하였다. Ultrabind membrane (pore size, 0.8 ㎛)은 Pall (Germany Gelman Sciences GmbH, Rossdorf, Germany)로부터 구입하였다. 양전하로 하전된(charged) 나일론 막, Hybond N+은 Amersham Int. Plc. (Buckinghamshire, UK)로부터 구입하였고, Nitrocellulose (pore size, 0.22 ㎛) 및 Immobilon membrane (pore size, 0.45㎛)은 Millipore (Billerica, USA)로부터 구입하였다.

반사율은 Merck (Darmstadt, Germany)로부터 구입한 RQflex reflectometer로 측정하였다.

농약 분석을 위하여 사용한 방법

아세틸콜린에스테라제 효소로 코팅된 스트립을 10% 메탄올-PBS(10 mM)에 녹인 표준물 또는 시료에 넣고 상온에서 적정시간동안 인큐베이트한 스트립을 세척하고 건조시킨 후에 막을 포함하는 바닥 부분을 효소 기질 용액에서 적정시간 동안 인큐베이트한 포지티브 시료에서는 발색이 감소되거나 완전히 저해된다.

스팟의 발색 강도는 육안 또는 반사율을 측정하여 평가한다. 육안 검사법에서는 여섯 명의 평가단에 의해 다섯 번 테스트를 하고 “포지티브”로 기록된 가장 낮은 농도 레벨을 최소 검출 한계로 정의하였다.

반사계를 이용한 검출에서 반사율은 인도페닐 아세테이트 또는 인독실 아세테이트를 기질로 이용할 때 각각 560 또는 657 nm에서 측정하는데, 그 이유는 반응 생성물의 λmax가 각각 540 및 650 nm이기 때문이다. 직접 측정 및 상대 흡광도의 보정을 위해 Merck (Darmstadt, Germany)로부터 구입한 “Test Routine”이라는 바코드를 이용하였다. 평균 반사율값은 두 개의 반사계 측정값을 이용하여 각 시료에 대한 측정값을 두 배 곱하여 계산하였다.

농약 첨가 농작물 시료의 준비

쌀과 상추 시료에 첨가하기 위해 메탄올에 용해된 농약 용액을 10-3~102 ug/mL로 준비한다. 무농약 상추 잎 또는 쌀 1g에 상기 농약 용액 1mL을 첨가한다. 상기 농약 첨가 시료 용액을 24시간 동안 둔 후, 상기 상추 또는 쌀을 10분동안 10mL의 메탄올에 넣고 세차게 쉐이킹을 하면서 인큐베이트하고, Whatman No. 1 filter paper로 여과한다.

용기와 용기에 남은 잔류물은 5mL의 메탄올로 씻어내고 씻어낸 메탄올을 다시 여과한 후 이렇게 여과한 용액을 먼저 여과한 여과물과 혼합한다. 사용된 메탄올은 감압하에서 증발시켜 건조하고, 잔류물은 10% 메탄올-PBS 10mL로 추출한다. 시험해 본 농약은 파라티온 및 카바릴(carbaryl)이었다.

실시예 1: 테스트 스트립의 제조

정사각 조각(0.7 cm×0.7 cm)으로 잘라낸 막을 양면 접착테이프(핫 멜트 아크릴)를 이용해 폴리스티렌 플라스틱에 부착시킨다. 희석된 효소의 적정량을 막의 중앙에 찍는다. 상기 효소로 코팅한 막을 30분 동안 건조시킨다.

실시예 2: 농약 검출 시스템 최적화

사용하는 막의 타입, 효소의 농도 및 부피, 기질의 종류 및 농도, 효소 기질 을 녹이기 위해 사용하는 유기 용매의 종류 및 농도, 발색을 위한 시간 및 저해반응의 온도 등에 대해서 최적화할 수 있었다. 상기 실험들을 위해, 효소 저해가 없는 발색을 대조군으로 하였다.

아세틸콜린에스테라제가 코팅된 스트립은 농약을 함유하는 시료 용액 내에서 인큐베이션하고 효소 기질 용액에서 다시 인큐베이션한다. 발색강도는 농약농도에 비례한다. 상기 분석은 여러 가지 타입의 막과 발색성 콜린에스테라제 기질을 포함하는 분석 조건을 최적화시킴으로써 개발할 수 있었다.

가. 분석에 적합한 막(membrane)

효소의 고정을 위해 테스트해 본 막은 니트로셀룰로스, Immobilon (PVDF), Biodyne B, Hybond N+, Immunodyne ABC, 및 Ultrabind membrane이었다. 상기 막 중 니트로셀룰로스와 Immobilon (PVDF)은 메탄올에 15초동안 세척하고, 5분동안 증류수로 세 번 세척한 후, PBS 버퍼로 20분 동안 순차적으로 세척하였다. 다른 막들은 구입했을 때의 상태로 사용하였다.

효소 지지체로서 여섯가지 타입의 막과 효소기질로서 인도페닐 아세테이트와 인독실 아세테이트를 이용하여 측정한 발색도는 도 1에 나타내었다. 여섯 가지의 막은 단백질 부착에 좋다고 알려져 있는 것들로서 매우 다른 발색정도를 보여준다. Biodyne B (D) 및 Hybond N+ (F) 막은 다른 막들에 비해 강한 발색을 보이고 적은 블롯팅을 보인다. 상기 두 막들은 다른 막들과 달리 나일론 막에 양전하로 하전되어 있고, 이로 인해 음전하로 하전된 효소반응 생성물(인독실레이트 또는 인도페녹 사이드 이온)과 강하게 결합한다. 이와 같은 결합반응은 발색된 반점이 적게 퍼지도록 해준다. 상기 두 가지 막 중에 Hybond N+membrane은 색 퍼짐이 가장 적게 일어나므로 가장 적합한 것으로 평가되었다.

나. 발색 효소 기질의 선택 및 적정 농도

발색 아세틸콜린에스테라제 효소 기질로서 인도페닐 아세테이트, 2,6-디클로로인도페닐 아세테이트, 인독실 아세테이트 및 N-메틸인독실 아세테이트를 시험해 보앗다. 상기 여섯 가지의 막 모두를 각 기질의 테스트를 위하여 사용하였다.

네 가지 아세틸콜린에스테라제 기질을 테스트한 결과 2,6-디클로로인도페닐 아세테이트 및 N-메틸인독실 아세테이트는 색변화가 전혀 없거나 거의 없어 기질로서 적합하지 않아 사용 가능한 기질 리스트에서 제외하였다.

인도페닐 아세테이트 및 인독실 아세테이트는 상대적으로 분명한 보라색 및 푸른색의 색을 보였는데, 인도페닐 아세테이트의 색은 인독실 아세테이트의 색보다 옅은 색을 보였다. 상기 두 가지 기질의 사용 농도는 인독실 아세테이트는 1, 2, 5, 10 및 100 mM이었고, 인도페닐 아세테이트는 0.5, 1, 2, 5, 및 10 mM이었다.

효소기질의 농도가 증가되면 반점의 발색강도가 증가하였지만, 색 퍼짐도 역시 증가하여 반점의 색 투명도가 감소하였다. 절충적으로 선택된 가장 적합한 농도는 인독실 아세테이트 1 mM 및 인도페닐 아세테이트 2 mM이었다.

다. 아세틸콜린에스테라제 용액의 농도

막에 스팟을 찍는데 사용한 아세틸콜린에스테라제 용액의 농도는 500, 1000, 1500, 및 2000 units/mL이었고, 효소 용액의 부피는 1, 2, 3, 및 5 uL이었다.

막위에 스팟팅하는 아세틸콜린 용액(500-2000 unit/mL)의 농도 및 부피를 증가시키면, 반점의 사이즈와 발색강도는 증가한다. 그러나 색의 퍼짐 정도 또한 증가한다. 절충적으로 선택된 가장 적합한 아세틸콜린에스테라제 용액은 인독실 아세테이트를 사용할 경우에 500 unit/mL, 3㎕용액이었고, 인도페닐 아세테이트를 사용할 경우에 1000 unit/mL, 3㎕용액이었다.

라. 효소기질 용해용 유기용매

비극성 효소기질을 용해시키는 분석 용액에 유기용매를 첨가하여야 하는데, 이 를 위해 시험해 본 유기 용매로는 10% 메탄올, 아세토니트릴 및 아세톤이었다. 세 가지의 용매를 시험한 결과, 발색 강도가 가장 큰 메탄올이 가장 적합한 것으로 판단되었다. 시험해 본 유기 용매(메탄올의 경우)의 농도는 인독실 아세테이트를 녹이는 경우 5, 10, 20, 30, 50, 70 및 100%이었고, 인도페닐 아세테이트를 녹이는 경우 5, 10, 20, 30, 및 50%이었다.

발색 강도 및 반점의 선명도를 기초로 판단하여 메탄올 농도는 5%를 선택하였다.

마. 효소기질의 발색을 위한 필요시간

인독실 아세테이트의 발색을 위해 시험해 본 시간은 10, 20, 40, 60, 및 80 분 이었고, 인도페닐 아세테이트의 발색을 위해 시험해 본 시간은 5, 10, 15, 20, 및 30분이었다. 저해 반응을 위한 온도는 30분이건 60분이건 각각 20, 30, 35, 37 및 40℃이었다.

발색 시간을 증가시키면 반점의 발색강도가 증가하지만, 색 퍼짐도 역시 증가하였다. 발색을 위해 가장 적합한 시간은 인독실 아세테이트 및 인도페닐 아세테이트 모두에 대해 10분~15분이었다.

바. 효소 저해에 적합한 온도

유기인계 농약 파라티온 또는 카바메이트계 농약 카르보퓨란에 대해 효소 저해 온도로 20~40℃를 선택하여 시험해 보았다. 온도를 증가시킴에 따라 농도의 변화에 의한 발색강도의 변화가 감소되었다. 따라서 상온(25℃)을 효소 저해에 가장적합한 온도로 선택하였다.

실시예 3: 시료의 잔류 농약 측정 및 결과 확인

상기 최적화 실험 후에 최적 조건 및 여러 가지 농약 농도에서 행한 분석의 최종 결과를 얻고, 반사계 측정을 통하여 경쟁곡선을 얻었다.

가. 농약 시료에 대한 육안 검출

파라티온 표준용액을 사용한 분석 결과는 도 2a에 나타내었다. 파라티온 농도 10-3㎍/mL는 네거티브 대조군과 비교하여 확실히 구별이 가능한 차이를 보였다. 그러므로 육안 검출법을 사용하는 파라티온의 검출 한계는 10-3㎍/mL으로 판단할 수 있다. 다른 두 가지 유기인계 농약, 클로르피리포스 및 말라티온(chlorpyrifos and malathion)에 대한 육안 검출한계 또한 10-3㎍/mL이었다. 상기 세 가지 유기인계 농약에 대한 반사율 검출에 근거한 표준 곡선은 도 2b에 나타내었다.

카바릴(carbaryl) 표준 용액을 사용한 분석 결과는 도 3a에 나타내었다. 카바릴 및 다른 두 카바메이트 농약, 카르보퓨란 및 벤디오카브(carbofuran and bendiocarb)에 대한 육안 검출한계는 10-3㎍/mL이었다.

나. 반사계를 이용한 검출

상기 세 가지 카바메이트계 농약에 대한 반사계 검출에 근거한 표준곡선은 도 3b에 나타내었다. 상기 세 가지 유기인계 농약에 대한 표준 곡선은 두 말단 근처 농도에서 플래토(plateau)를 보이지 않았다. 따라서 상기 유기인계 농약들에 대한 동적 농도 범위는 테스트된 전체 농도 범위(10-6 ~ 102㎍/mL)인 것으로 보인다. 상기 카바메이트계 농약에 대한 표준 곡선은 좀더 높은 농도(100 ~ 102㎍/mL)에서 플래토를 보인다. 따라서 상기 카바메이트계 농약에 대한 동적 범위는 10-6 ~ 100㎍/mL이다.

그러므로 본 발명에 따른 농약 검출법에서 검출가능한 유기인계 및 카바메이트계 농약의 농도범위는 각각 10-6~10-2과 10-6~100㎍/mL로 볼 수 있다.

카바메이트계 농약의 표준 곡선에서 높은 농도에서의 플래토(100 ~ 102㎍/mL)의 존재는 높은 농도의 카바메이트계 농약에 의해 효소가 완전히 저해된다는 것을 나타내는 것이다. 따라서 보다 높은 농도에서의 감도는 카바메이트계 농약이 유기인계 농약보다 좋은 편이다.

파라옥손 표준곡선을 이용한 분석의 결과는 도 4a에 나타내었다. 파라옥손에 대한 육안검출의 검출한계는 10-3㎍/mL 정도였는데, 이는 파라티온에 대한 것과 동일하였다. 그러나 파라티온과 달리 파라옥손은 그 표준 곡선에서 플래토를 보였다(도 4b). 그러므로 유기인계 농약을 산화시키면 보다 높은 농약 농도에서 더 좋은 감도를 보이므로 분석에서의 감도를 강화시키는데 도움이 된다는 것을 알 수 있다.

파라티온 및 카바릴이 첨가된 시료로부터의 추출물의 반사율값은 도 5 및 도 6에 각각 나타내었다. 쌀 시료로부터의 추출물은 작은 매트릭스 효과를 보이는 반면 상추 시료에서는 높은 매트릭스 효과를 보였는데, 매트릭스 효과가 높으면 회수를 어렵게 만든다. 상추시료에서 높은 매트릭스 효과는 스트립을 인큐베이션 하는 동안 막에 상추의 녹색 색소가 흡수되는 것에 기인한 것으로 보인다. 따라서 발색된 매트릭스로부터 농약의 회수율을 정확하게 측정하기 위하여 정제과정을 거쳐 색소를 제거하는 것이 필수적일 것으로 보인다.

다. 시판 테스트 키트의 분석 검출한계

최근 시판되고 있는 테스트 키트로는 Envirologix EP-014 (Portland, U.S.A.), Organophosphate/Carbamate Screen Kit (Abraxis, Warminster, U.S.A.), Neuro-IQ Tox Test Kit (Aqua Survey Inc., Flemington, U.S.A.), GT Pesticide Test Kit (gttestkit@gttestkit.com), OP Stick Sensor (Protein-Biosensor, Toulouse cedex, France), 및 EcloxTM-Pesticide Strips (Severn Trent Services, Colmar, USA) 등이 있다. 상기 키트 중 앞에 나열한 네 가지 키트는 용액 내의 발색 또는 pH 변화에 근거를 둔 것이고, 뒤의 두 가지 키트는 막 위에 발색이 되는 원리에 근거를 둔 것이다. 상기 여섯 가지 키트들 중 실행결과를 고려하였을 때 적절한 데이터를 보이는 것으로는 Envirologix EP-014 및 Organophosphate/Carbamate Screen Kit가 있다. 상기 두 키트들 및 세 가지 유기인계 및 두 가지 카바메이트계 농약에 대한 본 분석에서 검출 한계들을 표 1에 나타내었다.

[표 1]

	Envorioogix EP 014	유기인계 농약/카바메이트계 농약 스크린 키트	최근 분석법
파라티온	500	1.0	0.28
클로로피리포스	0.5	1.3	0.27
말라티온	100	1.4	0.30
카르보퓨란	100	1.2	5.6
카바릴	1000	160	0.20

* 유기인계 농약/카바메이트계 농약 스크린 키트에서는 20%의 저해를 보이는 농도를 검출한계로 정하고, Envorioogix EP 014 및 최근 분석법에서는 15%의 저해를 보이는 농도를 검출한계로 정하였음.

본 분석법의 감도는 상단히 높은 편이다. 농약에 대한 본 분석에서 더 균일한 반응을 보이는 점은 이 점이 농약의 군 특이적 검출에 매우 중요하다는 것을 고려하면 주목할 만하다.

실시예 4: 스트립에 고정된 효소의 저장 안정성

테스트 스트립 위에 고정된 효소 활성의 감소는 4℃ 및 상온 양쪽의 온도에서 10주동안 2주 간격으로 측정하였다. 저장된 스트립의 활성은 파라티온 및 카바릴을 이용하여 검사하였다. 분석 조건은 상기 실시예 2에서 서술한 바와 동일하다.

4℃ 또는 상온에 저장된 스트립에 고정화된 효소의 10주간 활성 변화를 표 2에 나타내었다. 4℃에서 효소 활성이 감소하는 것은 상온에서의 감소보다 적다. 그러므로 낮은 온도에서 효소가 고정된 스트립을 저장할 필요가 있음을 알 수 있다. 효소 활성의 감소가 눈에 띌 정도이기는 하나, 처음 4주 동안의 효소 활성은 감소하였으나, 그 이후로부터 10주까지는 거의 비슷한 활성도를 보였다(표 2). 그러므로 상당기간 저장된 스트립은 사용 전에 보정을 해주어야 사용이 가능하다.

[표 2]

저장 온도	효소 상태	저장 기간(주)
저장 온도	효소 상태	0	2	4	6	8	10
4℃	비저해 상태의 효소	100	87	72	69	71	65
	파라티온으로 저해된 효소	49	36	52	44	42	54
	카바릴로 저해된 효소	57	52	51	51	53	43
상온	비저해 상태의 효소	100	68	55	50	45	43
	파라티온으로 저해된 효소	49	53	46	41	44	36
	카바릴로 저해된 효소	57	47	47	42	49	41

*효소활성의 분석조건은 AChE, 1000unit, 3㎕; 막은 HybondN+; 상온에서 30분동안 효소저해; 5% 메탄올-PBS에 용해되어 있는 2mM의 인도페닐 아세테이트; 상온에서 20분 동안 인큐베이션

*저장 효소의 활성은 저장 전 효소의 활성과 비교하였다.

*10-1㎍/mL 농도의 농약으로 저해된 저장 효소의 활성은 비저해상태의 저장 효소와 비교하였다.

도 1은 각기 다른 막을 사용한 발색 정도의 비교이다. 분석조건은 AChE, 1000unit, 1.5㎕;막은 (A) nitrocellulose,(B) Immobilon, (C) Immunodyne ABC, (D) Biodyne B, (E) Ultrabind, 및 (F) HybondN+; 기질은 2 mM의 (a) 인독실 아세테이트 및 (b) 인도페닐 아세테이트; 온도는 상온

도 2는 각기 다른 농도에서의 유기인계 농약의 분석결과이다. 분석조건은 AChE, 1000 unit, 3 ㎕; 막은 HybondN+; 상온에서 30분동안 효소저해; 5% 메탄올-PBS에 용해되어 있는 2 mM의 인도페닐 아세테이트; 상온에서 20분동안 인큐베이션

도 3은 각기 다른 농도에서 카바메이트계 농약을 분석한 결과이다. 분석조건은 AChE, 1000 unit, 3㎕; 막은 HybondN+; 상온에서 30분 동안 효소저해; 5% 메탄올-PBS에 용해되어 있는 2 mM의 인도페닐 아세테이트; 상온에서 20분 동안 인큐베이션

도 4는 각기 다른 농도에서 파라옥손을 분석한 결과이다. 분석조건은 AChE, 1000 unit, 3 ㎕; 막은 HybondN+; 상온에서 30분 동안 효소저해; 5% 메탄올-PBS에 용해되어 있는 2 mM의 인도페닐 아세테이트; 상온에서 20분 동안 인큐베이션

도 5는 파라티온에 대한 분석결과이다. 분석조건은 AChE, 1000 unit, 3㎕; 막은 HybondN+; 상온에서 30분동안 효소저해; 5% 메탄올-PBS에 용해되어 있는 2 mM의 인도페닐 아세테이트; 상온에서 20분 동안 인큐베이션

도 6은 카바릴에 대한 분석결과이다. 분석조건은 AChE, 1000 unit, 3 ㎕; 막은 HybondN+; 상온에서 30분동안 효소저해; 5% 메탄올-PBS에 용해되어 있는 2 mM의 인도페닐 아세테이트; 상온에서 20분 동안 인큐베이션

Claims

다음을 포함하는 잔류 농약 검출용 키트:

아세틸콜린에스테라제(AChE)로 코팅된 막을 가지는 스트립; 및

잔류 농약 검출반응을 확인하기 위한 발색용 효소 기질.
제1항에 있어서,

상기 효소 코팅을 위한 막은 양전하로 하전된 나일론 막임을 특징으로 하는 잔류 농약 검출용 키트
제1항에 있어서,

상기 발색용 효소기질은 인도페닐 아세테이트 또는 인독실 아세테이트인 것을 특징으로 하는 잔류 농약 검출용 키트.
제3항에 있어서,

상기 효소기질의 사용 농도는 인도페닐 아세테이트가 2mM이고, 인독실 아세테이트가 1mM임을 특징으로 하는 잔류 농약 검출용 키트.
제3항에 있어서,

상기 효소기질이 인도페닐 아세테이트인 경우 아세틸콜린에스테라제의 농도 는 1000 unit/mL이고, 인독실 아세테이트인 경우 500 unit/mL임을 특징으로 하는 잔류 농약 검출용 키트.
제1항에 있어서,

상기 검출을 위한 농약은 파라티온, 클로르피리포스(chlorpyrifos) 및 말라티온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기인계 농약 또는 카르보퓨란(carbofuran), 카바릴(carbaryl) 및 벤디오카브(bendiocarb)로 이루어진 군으로부터 선택되는 카바메이트계 농약임을 특징으로 하는 잔류 농약 검출용 키트.
다음의 단계를 포함하는 농작물 잔류 농약의 검출방법:

(a) 농약이 함유되어 있는 농작물 시료를 준비하는 단계;

(b) 상기 농작물 시료에 아세틸콜린에스테라제(AChE)로 코팅된 막을 가지는 스트립을 넣고 반응시키는 단계; 및

(c) 상기 스트립을 발색용 효소기질 용액에서 반응시키고 발색 강도를 측정하는 단계.
제7항에 있어서,

상기 효소 코팅을 위한 막은 양전하로 하전된 나일론 막임을 특징으로 하는 농작물 잔류 농약의 검출방법.
제7항에 있어서,

상기 농작물 시료는 유기용매를 이용하여 시료를 추출하고 용매를 증발시킨 후 잔류물을 재추출한 것임을 특징으로 하는 농작물 잔류 농약의 검출방법.
제7항에 있어서,

상기 발색용 효소기질은 인도페닐 아세테이트 또는 인독실 아세테이트인 것을 특징으로 하는 농작물 잔류 농약의 검출방법.
제10항에 있어서,

상기 효소기질의 사용 농도는 인도페닐 아세테이트가 2mM이고, 인독실 아세테이트가 1mM임을 특징으로 하는 농작물 잔류 농약의 검출방법.
제10항에 있어서,

상기 효소기질이 인도페닐 아세테이트인 경우 아세틸콜린에스테라제의 농도는 1000 unit/mL이고, 인독실 아세테이트인 경우 500 unit/mL임을 특징으로 하는 농작물 잔류 농약의 검출 방법.
제7항에 있어서,

상기 검출을 위한 농약은 파라티온, 클로르피리포스(chlorpyrifos) 및 말라티온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기인계 농약 또는 카르보퓨 란(carbofuran), 카바릴(carbaryl) 및 벤디오카브(bendiocarb)로 이루어진 군으로부터 선택되는 카바메이트계 농약임을 특징으로 하는 농작물 잔류 농약의 검출방법.
제7항에 있어서,

상기 (c) 단계의 발색강도의 측정은 육안 측정 또는 반사계를 이용한 측정임을 특징으로 하는 농작물 잔류 농약의 검출방법.
제14항에 있어서,

상기 반사계를 이용한 측정시 인도페닐 아세테이트의 검출을 위한 파장은 560 nm이고, 인독실 아세테이트의 검출을 위한 파장은 657 nm임을 특징으로 하는 농작물 잔류 농약의 검출방법.