CN106546693A - 一种便携式成像法检测磺胺类药物残留的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明为解决现有技术中磺胺类药物检测中存在的问题，提出了一种新的通过测定磺胺类药物成像的光强度并建立工作曲线从而快速检测和计算磺胺含量的方法。本发明的方法可以准确、经济的测定动物性食品中磺胺类药物的含量，尤其是适用于测定磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶及磺胺甲基嘧啶四种磺胺类药物含量，因此本发明同时也提供了一种准确、经济、高效、快捷、便携式测定动物性食品中以上四种磺胺类药物残留的用途。

Description

一种便携式成像法检测磺胺类药物残留的方法及其用途

技术领域

本发明涉及动物性食品药物残留分析技术领域，特别涉及一种磺胺类药物残留的快速测定方法。

背景技术

磺胺类药物是一类具有广谱抗菌活性的人工合成药物,广泛应用于预防和治疗动物感染性疾病。磺胺类兽药具有服药简便，可以口服或注射，吸收迅速，疗效高，抗菌谱广，价格低等特点。磺胺类兽药在食品中残留半衰期长，有较强的毒副作用。

现行磺胺类药物残留的主要测定方法是高效液相色谱法、液-质联用法等。这些方法具有高的准确度与精密度，但所需样品前处理繁琐、冗长，且需昂贵的仪器设备，不适合现场快速检验。薄层色谱具有分离效率高，操作简单的特点，薄层色谱成像技术，目前在生物物质分离、鉴定中得到较为广泛的应用，但尚未见用于动物性食品药物残留的快速测定。

发明内容

本发明为解决现有技术中磺胺类药物检测中存在的问题，提出了一种新的通过测定磺胺类药物成像的光强度并建立工作曲线从而快速检测和计算磺胺含量的方法。本发明的方法可以准确、经济的测定动物性食品中磺胺类药物的含量，尤其是适用于测定磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶及磺胺甲基嘧啶四种磺胺类药物含量，因此本发明同时也提供了一种准确、经济、高效、快捷、便携式测定动物性食品中以上四种磺胺类药物残留的用途。

技术方案如下，

一种便携式成像法检测磺胺类药物残留的方法，包括以下步骤：

步骤A，建立工作曲线方程和工作曲线，

步骤A1，选取磺胺类药物标准品，然后用乙腈溶解摇匀并定容制取磺胺标准溶液，然后用吸量管精确吸取不同量的磺胺标准溶液制取梯度浓度的磺胺标准溶液；

步骤A2，选取无污染的空白样品，并对空白样品进行匀质化处理，然后准确称取若干份1.0g匀质化的样品分别置于10mL聚四氟乙烯管中，然后向各所述的10mL聚四氟乙烯管中加入步骤A1制取的不同浓度的磺胺标准溶液，制成梯度的不同质量浓度的加标样品；

然后将每份制备的不同质量浓度的加标样品混匀静置30min后分别加入浓度为70％的乙腈水溶液，然后分别再加入1.0g无水硫酸铵，震荡、涡旋混匀10min后，再按5000r·min^-1离心处理10min，最后取每份的上层有机层溶液1.5mL，得到供试品溶液；

步骤A3，用微量进样器分别抽取步骤A2制备的各浓度的供试品溶液20μL在硅胶薄层色谱G板上点样，在展开剂中展开并吹干，其中，三氯甲烷与水饱和正丁醇按照体积比3-5：1.5-0.5比例配制为展开剂，使用浓度为0.005-0.02％荧光胺作为显色剂，均匀喷涂在薄层色谱板上，吹干，然后将硅胶薄层色谱G板置于365nm紫外灯箱下检视，并使用相机拍摄黑白照片；

步骤A4，使用ImageJ2x软件测定步骤A3中拍摄的黑白照片上的显色斑点的平均光强度，然后以供试品溶液浓度为纵坐标，平均光强度为横坐标，计算工作曲线方程，从而建立工作曲线；

步骤B，待测品的磺胺定性检测，

步骤B1，待测品的处理，

取待测品1-4g于离心管中，加入浓度为60-90％乙腈水溶液5-15mL及1-3g无水硫酸铵，然后震荡、涡旋混匀10min，再5000r·min^-1离心处理10min，然后萃取待测品中的磺胺残留，得待测品溶液；

步骤B2，待测品的薄层色谱分离成像，

将步骤B1中制备的待测品溶液和步骤A1中制取的磺胺标准溶液平行点样于同一块硅胶薄层色谱G板，在展开剂中展开并吹干，其中，三氯甲烷与水饱和正丁醇按照体积比3-5：1.5-0.5比例配制为展开剂，使用浓度为0.005-0.02％荧光胺作为显色剂，均匀喷涂在薄层色谱板上，吹干，然后将硅胶薄层色谱G板置于365nm紫外灯箱下检视，并使用相机拍摄黑白照片；

步骤B3，待测品的磺胺定性，

步骤B2中拍摄的黑白照片中磺胺标准溶液为显色斑点，待测品溶液在其展开的相应位置如果出现显色斑点，则说明检测出待测品中含有磺胺；

步骤C，待测品的磺胺定量检测

若步骤B2拍摄的黑白照片中待测品溶液在其展开的相应位置出现显色斑点，则使用ImageJ2x软件测定其显色斑点的平均光强度，然后将测定的待测品显色斑点的平均光强度代入步骤A4建立的工作曲线方程计算出待测品中的磺胺含量。

优选，步骤A2中准确称取不少于4份1.0g匀质化的样品分别置于10mL聚四氟乙烯管中。

优选，一种便携式成像法检测磺胺类药物残留的方法适用于磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶中任意一种的快速检测和磺胺含量的计算。

一种便携式成像法检测磺胺类药物残留的方法可以用于动物性食品中磺胺类药物残留的快速检测和磺胺类药物残留含量计算的用途，尤其适用于猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鱼、虾、扇贝、海参等动物性食品中磺胺类药物残留的快速检测和磺胺类药物残留含量计算的用途。

该发明的色谱成像可通过价廉物美的微型电脑或手机即可实现，因此该方法操作方便、快速，适合在动物性食品的生产与销售过程中进行现场检测。

该发明中工作曲线方程和工作曲线建立后，就可以针对上述任意的动物性食品进行磺胺类药物残留检测和含量计算，没有必要每次都重新建立工作曲线方程。

同时该发明在操作时由于受试验条件等因素的影响，因此工作曲线方程也并不完全相同，本发明通过提过一种检测方法来快速的对磺胺类药物进行检测。

本发明以双水相萃取实现待测品的快速前处理，结合薄层色谱成像系统实现磺胺抗生素残留的现场快速定量检测。本方法的建立，可以使基层检测人员更加方便、易行的对市场中动物性食品质量进行监测，保障食品安全。

本发明的检测和测定方法具有突出的实质性特点和显著的进步，本发明的薄层色谱成像技术可以对发光点全光谱进行测定，从而使得薄层色谱成像测定的光通量较大，相比于采用扫描的方法测定发光点扫描峰值强度的方式，成像法具有更高的检测灵敏度；然后本方法的测定检出限为0.1μg/g，具有较高的检测灵敏度，达到农业部规定的检测标准；最后该方法通过建立工作曲线可以快速、准确的得到磺胺残留的浓度，降低了检测和计算的复杂程度，适用于广泛的基层检测工作的应用。

该发明的方法尤其具有以下创新和进步，

1.检测费用低。本方法需要的检测设备简单，没有大型设备，可以便携，相较于高效液相色谱，液-质联用的技术需要的设备较为昂贵，很难在基层配备，而且需要专业人员才能操作，不易检测，本方法很好的解决了这个问题。

2.样品前处理简单，不需要提取液净化等复杂步骤，节省提取溶剂，降低了对环境的危害。

3.检测限低。在空白的样品中添加不同量的磺胺标准溶液，测定检出限为0.1μg/g，达到农业部规定的检测标准。

4.回收率高，精密度良好，达到检测标准。薄层色谱成像法在测定鱼肉、猪肉及虾中四种磺胺类药物残留回收率范围为70.1％-113.7％之间，相对标准偏差为2.4％-20％之间。此方法的精密度和重现性可以达到磺胺类药物残留的检测要求。

5.本发明与现有动物性食品的药物残留检测技术相比，具有样品前处理步骤快速简单，测定设备体积小，便于携带，检测灵敏度高的优点。

附图说明

图1是本发明中实施例1的测定磺胺类药物线性范围与检出限的薄层色谱图。

图2-4分别是本发明中实施例2的测定磺胺类药物在鱼肉中的回收率薄层色谱图。

图5-7分别是本发明中实施例3的测定磺胺类药物在猪肉中的回收率薄层色谱图。

图8是本发明中实施例4的测定磺胺类药物在虾肉中的回收率薄层色谱图。

具体实施方式

以下实施例中使用的黑白照片均为索尼DSC-W830数码照相机拍摄或尼康COOLPIXA10拍摄，以上两种相机携带方便，适用于本发明方法的成像。

实施例1

该实施例测定磺胺类药物线性范围与检出限，同时通过该实施例计算出工作曲线方程，并建立工作曲线。

工作曲线方程按如下所述建立，

制取磺胺标准溶液：选取磺胺类药物标准品，然后用乙腈溶解摇匀并定容制取磺胺标准溶液，然后用吸量管精确吸取不同量的磺胺标准溶液制取梯度浓度的磺胺标准溶液；

供试品溶液的制备：将野生鲤鱼作为空白样品，鱼肉匀质化处理，分别准确称取五份1.0g鱼肉样品于10mL聚四氟乙烯管中，分别加入不同浓度的磺胺标准溶液，配制成加标量分别是0、0.1、0.4、0.8、1.0μg/g的样品，将五份样品均混匀静置30min，然后分别加入浓度为70％乙腈水溶液，浓度为70％乙腈水溶液的具体配比为1mL水中加入2.5mL乙腈，然后再分别加入1.0g无水硫酸铵，震荡、涡旋混匀10min，再按5000r·min^-1离心处理10min，取每份的上层有机层溶液1.5mL，既得供试品溶液；

测定方法：用微量进样器分别抽取各浓度的供试品溶液20μL在同一硅胶薄层色谱G板上点样，在展开剂中展开并吹干，其中，三氯甲烷与水饱和正丁醇按照体积比4：1比例配制为展开剂，使用浓度为0.01％荧光胺作为显色剂，均匀喷涂在薄层色谱板上，吹干，然后将薄层色谱板置于365nm紫外灯箱内，使用相机拍摄黑白照片；

建立工作曲线：使用ImageJ2x软件测定上述拍摄的黑白照片上的显色斑点的平均光强度，然后以供试品溶液浓度为纵坐标，平均光强度为横坐标，计算工作曲线方程，从而建立工作曲线。

通过上述同样的方法，分别对磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶进行操作，并建立四种磺胺的工作曲线方程，如表1所示。

表1 四种磺胺的工作曲线方程

然后拍摄的照片如图1所示，图1中a、b、c、d分别为磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶，点1为空白，点2、3、4、5为加标量分别为0.1、0.4、0.8、1.0μg/g的上述四种磺胺样品，可以看出加标量为0.1μg/g时磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶均显示为显色斑点，因此可以检出。所以本方法中磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶的检出限为0.1μg/g。

磺胺定性检测的具体操作如下，

步骤1，标准溶液的制备和待测品处理，

取上述操作中“制取磺胺标准溶液”步骤中制备的磺胺标准溶液，

取上述操作中“供试品溶液的制备”步骤中制备的任意供试品溶液为待测品溶液；

步骤2，薄层色谱分离成像，

将步骤1中待测品溶液和磺胺标准溶液平行点样于同一块硅胶薄层色谱G板，在展开剂中展开并吹干，其中，三氯甲烷与水饱和正丁醇按照体积比4：1比例配制为展开剂，使用浓度为0.01％荧光胺作为显色剂，均匀喷涂在薄层色谱板上，吹干，然后将薄层色谱板置于365nm紫外灯箱内，使用相机拍摄黑白照片；

步骤3，样品磺胺定性，

步骤2拍摄的黑白照片中磺胺标准溶液为显色斑点，待测品溶液在其相对应位置如果出现显色斑点，则说明检测出样品中含有磺胺。

通过上述同样的磺胺定性检测方法，分别对磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶进行操作，只要样品中以上四类磺胺药物的含量不小于0.1μg/g均可以通过该方法检出，如图1所示上述四种磺胺含量为0.1μg/g时，点样位置为显色斑点。

实施例2 本发明对鱼肉样品加标回收率的检测试验

试验前，首先选取磺胺类药物标准品，然后用乙腈溶解摇匀并定容制取磺胺标准溶液。

供试品溶液的制备：另取野生鲤鱼为空白样品，将鱼肉匀质化处理，分别准确称取3份1.0g鱼肉样品于10mL聚四氟乙烯管中，分别加入不同浓度的磺胺标准溶液，配制成加标量分别是0.25、0.5、0.8μg/g的样品，混匀静置30min，然后分别加入浓度为70％乙腈水溶液，浓度为70％乙腈水溶液的具体配比为1mL水中加入2.5mL乙腈，然后再分别加入1.0g无水硫酸铵，震荡、涡旋混匀10min，再按5000r·min^-1离心处理10min，取每份的上层有机层溶液1.5mL，既得供试品溶液；

同时将上述供试品溶液做为待测品溶液进行检测；

测定方法：同实施例1中“测定方法”操作。梯度选取各加标待测品溶液平行点样三次分别于三个薄层色谱板上；然后将相机拍摄的黑白照片并输入计算机，使用ImageJ2x软件测定图片上的显色斑点光强度平均值，然后通过实施例1建立的工作曲线方程计算磺胺浓度，并计算回收率。

通过上述同样的方法，分别对磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶进行操作，结果如表2所示。工作曲线方程见表1所示，同时如图2、3、4所示点样的上述四种磺胺均为显色斑点，说明被检测出。

表2 四种磺胺在鱼肉中含量的检测结果

拍摄的照片如图2、3、4所示。图2、3、4为平行试验，点1、2、3加标量分别为0.25、0.5、0.8μg/g。a、b、c、d分别为磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶。根据计算结果表明本方法应用于鱼肉中的回收率在71.6-109.1％之间，RSD在2.4-20.0％之间。

实施例3 本发明对猪肉样品加标回收率的检测试验

同样试验前，首先选取磺胺类药物标准品，然后用乙腈溶解摇匀并定容制取磺胺标准溶液。

供试品溶液的制备：选择无污染的猪肉为空白样品，然后将猪肉匀质化处理，分别准确称取3份1.0g猪肉样品于10mL聚四氟乙烯管中，分别加入不同浓度的磺胺标准溶液，配制成加标量分别是0.2、0.5、0.8μg/g的样品，混匀静置30min然后分别加入浓度为70％乙腈水溶液，浓度为70％乙腈水溶液的具体配比为1mL水中加入2.5mL乙腈，然后再分别加入1.0g无水硫酸铵，震荡、涡旋混匀10min，再按5000r·min^-1离心处理10min，取每份的上层有机层溶液1.5mL，既得供试品溶液；

同时将上述供试品溶液做为待测品溶液进行检测；

测定方法：同实施例1中“测定方法”操作。选取各加标待测品溶液平行点样三次分别于三个薄层色谱板上；然后将相机拍摄的黑白照片并输入计算机，使用ImageJ2x软件测定图片上的显色斑点光强度平均值，然后通过实施例1建立的工作曲线方程计算磺胺浓度，并计算回收率。工作曲线方程见表1所示。

通过上述同样的方法，分别对磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶进行操作，结果如表3所示，同时如图5、6、7所示点样的上述四种磺胺均为显色斑点，说明被检测出。

表3 四种磺胺在猪肉中含量的检测结果

拍摄的照片如图5、6、7所示。图5中点1为空白试验，点2、3、4加标量分别为0.2、0.5、0.8μg/g，图6、7为平行试验，图中点1、2、3加标量分别为0.2、0.5、0.8μg/g。a、b、c、d分别为磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶。根据计算结果表明本方法应用于猪肉中的回收率在69.1-97.1％之间，RSD在7.0-16.8％之间。

实施例4 本发明对虾肉样品加标回收率的检测试验

供试品溶液的制备：选取无污染的北极虾为空白样品，将虾肉匀质化处理，分别准确称取3份1.0g虾肉样品于10mL聚四氟乙烯管中，分别加入不同浓度的磺胺混标溶液，配制成加标量为0.2μg/g的样品，混匀静置30min，然后分别加入浓度为70％乙腈水溶液，浓度为70％乙腈水溶液的具体配比为1mL水中加入2.5mL乙腈，然后再分别加入1.0g无水硫酸铵，震荡、涡旋混匀10min，再按5000r·min^-1离心处理10min，取每份的上层有机层溶液1.5mL，既得供试品溶液；

同时将上述供试品溶液做为待测品溶液进行检测；

测定方法：同实施例1中“测定方法”操作；然后将相机拍摄的黑白照片并输入计算机，使用ImageJ2x软件测定图片上的显色斑点光强度平均值，然后通过实施例1建立的工作曲线方程计算磺胺浓度，并计算回收率。工作曲线方程见表1所示。

通过上述同样的方法，分别对磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶进行操作，同时如图8所示点样的上述四种磺胺均为显色斑点，说明被检测出。

拍摄的照片如图8所示。图中点1为空白试验，a、b、c、d分别为磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶。点2、3、4的上述四种磺胺加标量都为0.2μg/g，为平行试验。根据计算结果表明本方法应用于虾肉中的回收率在70.8-113.7％之间，RSD在6.4-15.8％之间。

Claims (6)

1.一种便携式成像法检测磺胺类药物残留的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤A，建立工作曲线方程和工作曲线，

步骤A1，选取磺胺类药物标准品，然后用乙腈溶解摇匀并定容制取磺胺标准溶液，然后用吸量管精确吸取不同量的磺胺标准溶液制取梯度浓度的磺胺标准溶液；

步骤A2，选取无污染的空白样品，并对空白样品进行匀质化处理，然后准确称取若干份1.0g匀质化的样品分别置于10mL聚四氟乙烯管中，然后向各所述的10mL聚四氟乙烯管中加入步骤A1制取的不同浓度的磺胺标准溶液，制成梯度的不同质量浓度的加标样品；

然后将每份制备的不同质量浓度的加标样品混匀静置30min后分别加入浓度为70％的乙腈水溶液，然后分别再加入1.0g无水硫酸铵，震荡、涡旋混匀10min后，再按5000r·min^-1离心处理10min，最后取每份的上层有机层溶液1.5mL，得到供试品溶液；

步骤A3，用微量进样器分别抽取步骤A2制备的各浓度的供试品溶液20μL在硅胶薄层色谱G板上点样，在展开剂中展开并吹干，其中，三氯甲烷与水饱和正丁醇按照体积比3-5：1.5-0.5比例配制为展开剂，使用浓度为0.005-0.02％荧光胺作为显色剂，均匀喷涂在薄层色谱板上，吹干，然后将硅胶薄层色谱G板置于365nm紫外灯箱下检视，并使用相机拍摄黑白照片；

步骤A4，使用ImageJ2x软件测定步骤A3中拍摄的黑白照片上的显色斑点的平均光强度，然后以供试品溶液浓度为纵坐标，平均光强度为横坐标，计算工作曲线方程，从而建立工作曲线；

步骤B，待测品的磺胺定性检测，

步骤B1，待测品的处理，

取待测品1-4g于离心管中，加入浓度为60-90％乙腈水溶液5-15mL及1-3g无水硫酸铵，然后震荡、涡旋混匀10min，再5000r·min^-1离心处理10min，然后萃取待测品中的磺胺残留，得待测品溶液；

步骤B2，待测品的薄层色谱分离成像，

将步骤B1中制备的待测品溶液和步骤A1中制取的磺胺标准溶液平行点样于同一块硅胶薄层色谱G板，在展开剂中展开并吹干，其中，三氯甲烷与水饱和正丁醇按照体积比3-5：1.5-0.5比例配制为展开剂，使用浓度为0.005-0.02％荧光胺作为显色剂，均匀喷涂在薄层色谱板上，吹干，然后将硅胶薄层色谱G板置于365nm紫外灯箱下检视，并使用相机拍摄黑白照片；

步骤B3，待测品的磺胺定性，

步骤B2中拍摄的黑白照片中磺胺标准溶液为显色斑点，待测品溶液在其其展开的相应位置如果出现显色斑点，则说明检测出待测品中含有磺胺；

步骤C，待测品的磺胺定量检测

若步骤B2拍摄的黑白照片中待测品溶液在其其展开的相应位置出现显色斑点，则使用ImageJ2x软件测定其显色斑点的平均光强度，然后将测定的待测品显色斑点的平均光强度代入步骤A4建立的工作曲线方程计算出待测品中的磺胺含量。

2.根据权利要求1所述的一种便携式成像法检测磺胺类药物残留的方法，其特征在于，步骤A2中准确称取不少于4份1.0g匀质化的样品分别置于10mL聚四氟乙烯管中。

3.根据权利要求1或2所述的一种便携式成像法检测磺胺类药物残留的方法，其特征在于，使用的相机为索尼DSC-W830数码照相机或尼康COOLPIXA10相机。

4.根据权利要求3所述的一种便携式成像法检测磺胺类药物残留的方法，其特征在于，该方法适用于磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶中任意一种的快速检测和磺胺含量的计算。

5.根据权利要求4所述的一种便携式成像法检测磺胺类药物残留的方法的用途，其特征在于该方法用于动物性食品中磺胺类药物残留的快速检测和磺胺类药物残留含量计算的用途。

6.根据权利要求5所述的一种便携式成像法检测磺胺类药物残留的方法的用途，其特征在于该方法适用于猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鱼、虾、扇贝、海参的磺胺类药物残留的快速检测和磺胺类药物残留含量计算的用途。