CN1766607A - 基于图像处理技术的薄层色谱定量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于数字图像处理和化学分析领域，其特征在于利用数码相机或摄像机在不同波长的光照条件下对薄层板进行拍摄；对所拍摄的图像进行镜头畸变校正、噪声虑除预处理；利用点样时点均匀分布的特点以及纵向距离等分原则确定控制点；根据控制点再利用插值方法构造出图像背景；将构造出的背景图像从镜头畸变校正后的薄层图像中去除，并根据所构造的背景图像对每一像素点进行亮度归一化；对去掉背景图像后的薄层图像进行分割；根据分割结果对每个区域内的灰度进行积分。本方法不仅能够准确的描述所给图像背景信息，分割出目标图像，而且还可以对每一点的光照强度进行修正，图像分割以及样品定量分析结果精度都很高，重复性也非常好，易于推广。

Description

基于图像处理技术的薄层色谱定量分析方法

技术领域

本发明属于计算机数字图像处理领域和化学分析领域。

背景技术

在化学分析、生物医学、医药研究、临床医学、食品加工等领域中，对某种微量物质成份的检测与鉴定是一项非常必要的工作，其中薄层色谱法或薄层层析法(Thin LayerChromatography，简称TLC)被广为使用。所谓薄层色谱法就是将吸附剂(例如硅胶或氧化铝)铺到平面物体上如玻璃板、塑料片或金属箔形成一薄层，然后用溶剂把样品展开和分离的方法，它是一种简便、经济、微量、适用范围广的色谱方法。薄层色谱法主要由三个步骤组成：样品的点样、点样后样品的展开、展开后对样品的测量。样品的点样与展开已经成为非常成熟的技术，而对展开后的样品进行测定，特别是精确的定量测量技术却仍处于不断地探索当中。目前，薄层色谱定量分析基本上都采用了薄层扫描仪法。虽然薄层扫描仪被广泛地使用。但是，薄层扫描仪存在着以下缺点：

(a)测量速度慢，测量一块薄层板要花费几十分钟，不利于大量样品的检测；

(b)精度较低，特别是对于面积较大、不规则的斑点，误差更大；

(c)无法直接拍照或录像，降低了可信度；

(d)不直观，因无法看到扫描的定位情况，易造成定位不准，从而产生较大误差；

(e)操作复杂，由于薄层扫描仪的光学结构比较复杂，因此调整起来非常困难；

(f)成本高，由于薄层扫描仪的光学结构比较复杂，因而制作起来工序多，因而成本高；

最近几年，国际上有学者提出了利用平板式图像扫描仪法对薄层板上的样品进行定量分析测量。有人利用平板式图像扫描仪将染色后的薄层板进行扫描，得到数字图像后再进行处理。他们用分辨率为100DPI的扫描仪将薄层图像扫描到计算机中，然后利用计算机编程进行定量分析。他们的结论是，此方法不但可以进行定性分析，也可以进行定量分析。对平板式图像扫描仪而言，由于利用线型光源移动扫描，其扫描光线分布比较均匀，因而它对染色后的薄层板进行处理时得到的效果比较好。但是平板式图像扫描仪不能扫描需要特殊光源进行成像的薄层层析板，如荧光照射、紫外线照射等。此外，这种处理方法费时比较长，也无法与其他仪器集成一体。

要解决平板式图像扫描仪所带来的问题，人们自然就会想到摄像机。其实，在平板式图像扫描仪被使用之前，利用摄像机成像对薄层色谱进行定量分析就被研究了，这是因为摄像机的成像速度快，安装方便，而且很容易和其它仪器集成使用。然而，在采用了摄像机进行薄层色谱分析后，人们给出的结论却不十分理想。原因是与传统的薄层扫描仪相比，摄像机成像的正确性受到光照均匀性的制约，因而结果不是十分精确，重复性不好。除了他们指出的原因外，摄像机成像时，光源不定、光圈不定、曝光速度不定也给研究带来了困难，也就是重复性不强。正是这些问题，使摄像机成像法在薄层色谱中的定量分析中得不到较好的应用。

发明内容

从上面的分析来看，如果能够将摄像机成像过程中光照不均的缺点进行相应的弥补，摄像机成像在薄层色谱中就会有强大的生命力：成像速度快、分析精度高、结果直观、易于存储、成本低廉。摄像机成像过程中光照不均的现象是固有的，为此，怎样利用数字图像处理的手段弥补这一现象所带来的缺陷，这就是本发明的关键所在。

另外，本发明的目的还在于提供了一种基于背景估计的一种图像分割方法。

本发明的基本原理是：当被测样品在薄层板上展开并干燥以后，就把该薄层板放置到具有多波长光照的灯箱中，然后利用数码相机或摄像机拍照形成数字图像，最后由计算机估测出薄层板上每一点的光照强度，根据估测出的光照强度把样品分割出来并根据样品灰度的积分来确定样品的实际含量。具体步骤包括利用摄像机在不同波长的光照条件下对薄层板进行拍摄；对所拍摄的图像进行镜头畸变校正、噪声虑除等预处理；利用纵向像素灰度积分投影法确定控制点；根据所得到的控制点，再利用插值方法构造出图像背景；将构造出的背景图像从镜头畸变校正后的薄层图像中去除，同时根据所构造的背景图像对每一像素点进行光照强度归一化；对去掉背景图像后的薄层图像进行分割；根据分割结果对每个样品区域内的灰度进行积分；根据样品灰度积分与样品质量成线性关系的特点，再对比标准品，计算出每个样品的实际含量。

本发明特征在于，依次按下述步骤：

步骤1.对载有样品的薄层板利用数码相机或摄像机在所选的波长光照条件下进行拍摄，形成数字图像后存于计算机或DSP处理系统中；

步骤2.计算机对所拍摄的图像按以下步骤进行预处理：

步骤2.1.镜头畸变校正：用数码相机或摄像机拍摄标准方格图，再根据网格交点一一对应的关系，把步骤2.1得到的图像校正成标准方格图，记录下各点的校正参数，供以后拍摄薄层板图像时作校正用；

步骤2.2.虑除噪声，采用下述滤波方法中的任何一种方法进行：平滑滤波、或低通滤波、或维纳滤波，从而得到薄层板的数字图像；

步骤3.利用点样时是沿着垂直于展开方向均匀分布的这一特点，从步骤2得到的预处理后图像中找到控制点的横坐标，再按照纵向距离等分的原则，确定控制点的纵坐标，从而得到控制点；

步骤4.利用下述各插值方法中的任何一种方法依据步骤3得到的控制点来构造背景图像：所述插值方法是拉格朗日插值、或均差的牛顿插值、或分段低次插值、或样条插值；

步骤5.从步骤2得到的薄层板数字图像中减去所构造出的背景图像，设f(x，y)是镜头畸变校正后薄层板数字图像中像素(x，y)处的灰度，而g(x，y)是估测出的背景图像中像素(x，y)处的灰度，则相减得到图像的像素(x，y)处的灰度值为(g(x，y)-f(x，y))；再根据所构造的背景图像对每一点进行归一化，得到均匀背景的薄层板数字图像，该图像中对应点(x，y)处的灰度修正后为 或者

其中，I_max为所构造的背景图像的最高灰度，I_min为最小灰度，I_b为所述背景图像中同一点(x，y)处的灰度值，即每一点(x，y)的实际光强与背景光成反比；

步骤6.利用全局阈值方法分割出目标图像，所述全局阈值取2或3；

步骤7.对步骤6得到的图像中各个区域内每一象素以灰度值进行累加，即进行灰度积分；

步骤8.根据步骤7得到的灰度积分值的大小通过线性比例关系确定各样品点之间定量关系。具体的计算方法为：设某一被测样品的灰度积分值为S，而标准品的积分值为T，且标准品的质量为G，则被测样品的质量为

采用本方法进行处理不仅能够准确的描述所给图像背景信息，分割出目标图像，而且还可以对每一点的光照强度进行归一化，分割结果达到很高的准确率，从而使定量分析的结果达到了较高的精度。

下面结合附图对本发明作进一步说明。

附图说明：

图1为本发明的硬件组成框图；

图2为本发明的整体流程框图；

图3是本发明的薄层板图像采集装置；

图4是本发明的镜头畸变校正拍摄图；

图5是本发明采集到的薄层板图像拍摄原图；

图6是本发明所采集的薄层板图像的三维立体显示；

图7是本发明的滤波模板；

图8是本发明用于选择控制点的示意图，基于图5拍摄图；

图9是利用本发明所构造图像背景的三维显示；

图10是本发明得到的去除不均匀光照背景后的薄层板图像的三维显示结果；

图11是本发明的样品分割结果。

具体实施方式：

图1给出了本发明的硬件组成框图。载有样品的薄层板1被放置到灯箱2中，然后由摄像机或数码相机3对其拍照，形成的图像被送到计算机或DSP处理系统4中，处理的结果被送到打印机6打印或其它设备7中备用。图1中的监视器5用以显示所拍摄的图像和程序运行过程。

图2给出了本发明的工作流程框图，包括拍摄薄层板图像(第一步)；对拍摄图像做镜头畸变畸校正、噪声滤除等图像预处理(第二步)；利用图像纵向像素灰度积分投影确定控制点的横坐标，然后利用距离等分求出控制点的纵坐标，从而得到控制点(第三步)；根据上述控制点插值产生背景图像(第四步)；从原始图像中减去插值所生成的背景，并根据背景图像对各像素点灰度进行修正处理(第五步)；利用连通域或全局域值分割图像(第六步)；根据分割结果计算各区域的灰度积分(第七步)，根据灰度积分结果计算样品的含量(第八步)。

本发明的第一步是拍摄薄层板图像，图3给出了具体的拍摄过程。载有样品的薄层板a被放置在可以选择光照波长(波长为254nm，312nm，365nm，以及白色光)的灯箱b中，然后由装有滤光片的数码相机或摄像机c对薄层板进行拍照形成数字图像并存于计算机或DSP处理系统中。图5给出了一幅所拍摄的薄层板图像，其中f是要测量的样品。为了进一步说明不均匀的背景给定量分析带来的影响，图6给出了图5的三维立体显示效果(为清楚起见，图6中的像素灰度被反相了)，图中g是三维图中样品的位置，可以看出背景的影响是十分明显的。

在得到薄层板的数字图像后，为了校正由镜头畸变引起的影响，并去掉噪声干扰，必须对所得到的薄层板数字图像进行镜头畸变校正、噪声滤除等图像预处理(第二步)。镜头畸变的矫正方法是用数码相机或摄像机。拍摄标准方格图得到畸变图像，如图4(a)所示，然后根据网格交点一一对应的关系，如e与d的对应关系，将畸变图像校正成标准方格图，如图4(b)所示，记录下校正参数，在以后拍摄薄层板图像时，就用该校正参数进行校正。而噪声滤波则采用平滑滤波，或低通滤波，或维纳滤波等滤波方法。例如采用3×3的平滑滤波模板进行平滑滤波，图7给出了这种3×3的模板，具体计算时 $K_0=\frac{1}{9}\underset{i=0}{\overset{8}{\mathrm{\Σ}}}{K}_i,$ 其中K_i是模板内各点的灰度值。

为了估测出薄层板图像的不均匀光照背景，本发明的第三步和第四步就是从预处理后的薄层板数字图像中寻找到控制点的横坐标，然后利用距离等分法求出控制点的纵坐标，从而得到控制点，这是第三步，接着再根据所求控制点利用拉格朗日插值，或均差与牛顿插值公式，或差分与等距节点插值，或埃尔米特插值，或分段低次插值，或样条插值等插值方法构造出图像背景图，这是第五步。图8给出了从预处理后的薄层板数字图像寻找控制点的示意图。由于样品是沿着相同方向展开的，因而我们在点样的时候，可以沿着垂直于展开方向的方向进行等距离点样，测量的时候，根据点样通道数先进行等距划分，找到控制顶点的横坐标，如图8(a)中的垂直线h所示，这些垂直线所通过的位置就是图像背景，从这些直线处取点就能得到将来构造背景图像的控制点。在取得控制点的横坐标后，再按不大于横坐标间距的方式对图像进行纵向等距划分，从而确定控制点的纵坐标，图8(b)给出了控制点的最后示意图，各交叉点i就是我们要找的控制点。有了控制顶点，利用上面提到的曲面构造方法就能构造出图像背景。例如，利用3次Catmull-Rom样条曲面构造图像背景，公式为：

$P(u,v)=\underset{i=0}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}\underset{j=0}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{P}_{\mathrm{ij}}{B}_{i,3}\left(u\right)B_{j,3}\left(v\right),0\≤u\≤1,0\≤v\≤1$

上式中的P_ij(i＝0，1，…，n；j＝0，1，…，m)是步骤三中找到的控制点，u，v是插值参数，其取值的大小，影响着插值点的疏密，B_i，3(u)是调和函数，它们的表示式如下：

B_0，3(u)＝-τ+2τu²-τu³

B_1，3(u)＝1+(τ-3)u²+(τ-2)u³

B_2，3(u)＝τu+(3-2τ)u²+(τ-2)u³

B_3，3(u)＝-τu²+τu³

τ为力度控制系数，0≤τ≤1，一般取值为0.2。

图9是根据图8所确定的控制点而由Catmull-Rom样条曲面插值产生的背景图像j的三维立体显示。为清楚起见，图9中的像素灰度被反相了。

在估测出不均匀的背景图像后，从镜头畸变校正后的薄层板数字图像减去所构造出的背景图像就得到了均匀背景的薄层板数字图像，这就是本发明的第五步。具体的相减方法是，设f(x，y)是镜头畸变校正后薄层板数字图像中像素(x，y)处的灰度，而g(x，y)是估测出的背景图像中像素(x，y)处的灰度，则相减得到图像的像素(x，y)处的灰度值为(g(x，y)-f(x，y))。图10给出了去掉非均匀背景的薄层板图像的三维显示，其中k代表样品点。

另外，有了估测出的背景，我们也就得到了每一像素点的相对光强值，从而可以进行光强修正。修正的方法是：设估测背景j的最高灰度为I_max，最小为I_min，j中某一像素点(x，y)的灰度值为I_b，图10中对应(x，y)处的灰度值为I，则图10中对应(x，y)处的灰度值被修正为 或者

也就是每一点的实际光强与背景光成反比。

有了去掉非均匀背景的薄层板图像，利用全局阈值方法分割出目标图像(第六步)，并去掉孤立点。全局阈值理论上为0，但实际上由于噪声的存在，一般取2或3。图11就是最后的分割结果，l就是分割出的样品区域。

根据上面的分割结果，我们就可以在图10中对相应区域进行灰度积分，也就是把区域内的每一像素的灰度值累加，这是第七步。

最后，根据灰度积分值的大小就可以通过线性比例确定各样品点之间定量关系，这是本发明的最后一步，即第八步。具体的计算方法为：设某一被测样品的灰度积分值为S，而标准品的积分值为T，且标准品的质量为G，则被测样品的质量为

Claims (1)

1.基于图像处理技术的薄层色普定量分析法，其特征在于：

步骤1.对载有样品的薄层板利用数码相机或摄像机在所选的波长光照条件下进行拍摄，形成数字图像后存于计算机或DSP处理系统中；

步骤2.计算机对所拍摄的图像按以下步骤进行预处理：

步骤2.1.镜头畸变校正：用数码相机或摄像机拍摄标准方格图，再根据网格交点一一对应的关系，把步骤2.1得到的图像校正成标准方格图，记录下各点的校正参数，供以后拍摄薄层板图像时作校正用；

步骤2.2.虑除噪声，采用下述滤波方法中的任何一种方法进行：平滑滤波、或低通滤波、或维纳滤波，从而得到薄层板的数字图像；

步骤3.利用点样时是沿着垂直于展开方向均匀分布的这一特点，从步骤2得到的预处理后图像中找到控制点的横坐标，再按照纵向距离等分的原则，确定控制点的纵坐标，从而得到控制点；

步骤4.利用下述各插值方法中的任何一种方法依据步骤3得到的控制点来构造背景图像：所述插值方法是拉格朗日插值、或均差的牛顿插值、或分段低次插值、或样条插值；

步骤5.从步骤2得到的薄层板数字图像中减去所构造出的背景图像，设f(x，y)是镜头畸变校正后薄层板数字图像中像素(x，y)处的灰度，而g(x，y)是估测出的背景图像中像素(x，y)处的灰度，则相减得到图像的像素(x，y)处的灰度值为(g(x，y)-f(x，y))；再根据所构造的背景图像对每一点进行归一化，得到均匀背景的薄层板数字图像，该图像中对应点(x，y)处的灰度修正后为

或者

其中，I_max为所构造的背景图像的最高灰度，I_min为最小灰度，I_b为所述背景图像中同一点(x，y)处的灰度值，即每一点(x，y)的实际光强与背景光成反比；

步骤6.利用全局阈值方法分割出目标图像，所述全局阈值取2或3；

步骤7.对步骤6得到的图像中各个区域内每一象素以灰度值进行累加，即进行灰度积分；

步骤8.根据步骤7得到的灰度积分值的大小通过线性比例关系确定各样品点之间定量关系。具体的计算方法为：设某一被测样品的灰度积分值为S，而标准品的积分值为T，且标准品的质量为G，则被测样品的质量为

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