CN116380886B - 一种双信号智能化检测有机磷农药的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双信号智能化检测有机磷农药的方法。其中提供了一种Fe‑N‑C@Hemin纳米酶的双信号智能化有机磷农药快速检测方法，包括：（1）比色信号检测体系，（2）电化学信号检测体系；其中比色信号体系利用Fe‑N‑C@Hemin的类氧化酶活性及硫代胆碱对其活性的抑制，验证乙酰胆碱酯酶与Fe‑N‑C@Hemin类氧化酶活性的相关性；电化学信号利用乙酰胆碱酯酶与乙酰硫代胆碱（Acetylthiocholine，ATCh）产物硫代胆碱与电流信号的相关性，基于有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制，验证了双信号智能传感器对有机磷农药的检测性能。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种双信号智能化农药残留快速检测方法。
背景技术
农药的过多施用对土壤和地下水造成严重污染，有机磷农药占农业领域总体农药使用量的40%，发展中国家农药污染的问题尤为严重，这与检测方法、技术的不足也息息相关，对生态系统和人类健康产生负面影响。目前农药残留检测面临检测准确性不足、前处理复杂、实验操作繁琐、难以适应现场检测等问题。智能手机具有便携性、可高质量成像、且能够装载各种软件，现以受到广泛关注。本发明结合智能手机设计了一种双信号智能化有机磷农药残留快速检测方法，利用小型设备和智能手机实现电化学信号输出，该方法操作简单，成本低廉，反应时间短，可用于有机磷农药的快速检测。
发明内容
本发明通过建立一种双信号智能化快速检测方法用于食品中有机磷农药残留的检测。首先，利用Fe-N-C@Hemin纳米酶的氧化酶活性，建立比色信号传感，其次基于Fe-N-C@Hemin引起电子转移及其导电性能，建立电化学信号传感，利用智能手机作为信号输出设备，构建双信号、智能化的有机磷农药快速检测方法。其次，本发明中通过优化实验条件，使该检测方法于20 min内即可得到电化学信号，2 h内即可得到比色信号，且利用智能手机实现便携、智能检测，与传统检测方法长达相比，本方法大大缩短了检测时间，避免了传统方法大型仪器设备的应用，利用智能手机大大提高了检测的便携性，灵活性。本发明为实现现场即时快速检测提供可能性。
为了实现双信号智能化有机磷农药残留快速检测需求，本发明分别设计比色/电化学信号输出，配合便携式电化学工作站和智能手机的信号读取设备，实现对有机磷农药定量快速检测。
本发明一方面提供一种双信号智能化检测有机磷农药的试剂盒，所述的试剂盒包括：
1）比色信号检测体系；2）电化学信号检测体系；
其中比色信号检测体系包括：Fe-N-C@Hemin，乙酰胆碱酯酶，乙酰硫代胆碱，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）；
电化学信号检测体系包括：Fe-N-C@Hemin/普鲁士蓝（Fe-N-C@Hemin/PB）以及乙酰胆碱酯酶修饰的丝网电极。
在一个具体的实施方式中，其中比色信号检测体系中Fe-N-C@Hemin、ATCh的工作浓度分别为0.05~0.15mg/mL，2~5mM。
在另外一个具体的实施方式中，其中比色信号检测体系中TMB、AChE的工作浓度分别为1~3μM，100~300 mU/mL。
在另外一个具体的实施方式中，其中电化学信号检测体系通过以下方法制备：
采用滴涂法，将Fe-N-C@Hemin/普鲁士蓝复合材料修饰于丝网印刷电极上，于45~55°C烘箱烘干，随后滴加AChE，自然晾干，再滴加AChE保护液，自然晾干，制备好的电极置于4°C密封保存。
在另外一个具体的实施方式中，滴加AChE的体积为2~5μL，浓度为100~300 mU/mL。
在另外一个具体的实施方式中， AChE的保护液为Nafion，浓度为0.03~0.08%，滴加体积为2~5μL。
本发明的第二个方面是提供第一方面所述的试剂盒在检测有机磷农药的应用，优选的，所述的有机磷农药为蔬菜、水果、农作物产品中的残留。
在一个具体的实施方式中，所述的应用的方法步骤为：
1）取待测样品，与乙酰胆碱酯酶均匀混合；
2）加入ATCh，继续于反应；
3）加入Fe-N-C@Hemin反应5 min后TMB，测定其在652 nm处的OD值；
4）给定电压，分别取样品，滴加在Fe-N-C@Hemin/PB/AChE电极上反应随后将电极置于PBS配制的ATCh中，进行时间-电流扫描。
在一个具体的实施方式中，其中步骤1）中样本与AchE 35~40℃ 反应20~40min；加入ATCh后，继续于35~40℃ 反应20~40min；
在另外一个具体的实施方式中，其中步骤2）中加入Fe-N-C@Hemin反应3~8min，后加入TMB，反应10~20 min后测652 nm处的OD值。
在另外一个具体的实施方式中，给定的电压为0.5V，滴加样品到电极的反应时间为10~20min，所述的PBS 为0.5 mM含有0.1 M KCl，所述的ATCh配制以0.05M配制，利用Sensit Smart装置及智能手机扫描。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
（1）准确性：利用两种信号共同检测，能够提高农药残留检测的准确性，避免了单一信号造成的检测误差；
（2）智能化：以智能手机为最终定量装置，实现了有机磷农药残留检测的智能应用；
（3）操作简便、快速：仅利用4种试剂，通过简单的添加即可完成检测，操作简单，耗时较少，其中电化学信号于20 min内即可获得检测结果；
（4）便携性：以智能手机为比色信号输出，以智能手机及便携式电化学工作站为电化学信号输出，体积较小，携带容易，适用于农药残留的现场快速检测。
附图说明
图1为双信号智能化检测有机磷农药的原理图。
图2为检测方法的可行性验证图：图A-B为比色信号可行性验证；图C-D为电化学信号可行性验证。
图3为传感体系浓度优化结果，3A-3D分别为Fe-N-C@Hemin、ATCh、TMB和AChE的浓度变化与信号变化。
图4为反应条件优化结果，其中图4A和图4C为AChE与ATCh的反应条件优化，图4B和4D为有机磷农药与AChE的反应条件优化。
图5为双信号智能化有机磷检测的灵敏度：图5A-图5D分别为乐果、亚胺硫磷、马拉硫磷的浓度线性回归方程图；图5E和图5F分别为电化学信号对乐果的检测结果。
图6为双信号智能化传感器检测有机磷农药残留的特异性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 一种双信号智能化有机磷农药快速检测方法的建立
1、实验材料
乙酰胆碱酯酶(AChE)、乙酰硫代胆碱(ATCh)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、丝网印刷电极、普鲁士蓝等均购自市售产品。
2、一种双信号智能化有机磷农药快速检测方法的设计原理
基于Fe-N-C@Hemin的类氧化酶活性设计双信号智能化有机磷农药残留检测方法。如图1所示，在有机磷农药不存在的情况下，AChE能够催化ATCh底物水解生成TCh，TCh含有大量巯基，基于巯基抑制Fe-N-C@Hemin纳米酶类氧化酶活性的原理，当TCh存在时，Fe-N-C@Hemin的类氧化酶活性被抑制，因此催化TMB显色的能力减弱，在652 nm处的吸光值随之减小；而当有机磷农药存在时，抑制AChE的活性，水解底物生成TCh的量随之减少，因此Fe-N-C@Hemin能够催化TMB使溶液呈现蓝色。同时基于产生的TCh作为电活性物质，能够引起电流变化，以时间-电流法测定电流，能够代表TCh的浓度，当有机磷农药存在时，抑制AChE活性，TCh产物减少，电流减弱；当不存在有机磷农药时，TCh产物增加，电流增强。
3、双信号智能化检测有机磷农药的可行性验证
首先验证比色作为信号输出方式的传感器可行性，取四个2 mL离心管，分别加入①Fe-N-C@Hemin；②Fe-N-C@Hemin和TMB；③Fe-N-C@Hemin、TMB、AChE和ATCh；④Fe-N-C@Hemin、TMB、AChE、ATCh以及有机磷农药；最后补充pH3.6的乙酸钠缓冲液至1 mL，用紫外分光光度计检测652 nm下的吸光度。图2A显示，不同的离心管中的吸光度不同，可以进一步区分。
利用比色方法验证该传感器对乙酰胆碱酯酶的检测能力，乙酰胆碱酯酶的浓度与比色信号呈现良好的线性关系，线性方程为y=2.174x-0.6034,R2=0.9741，说明该系统可应用于进一步的有机磷农药残留检测（图2B）。
对丝网印刷电极进行不同材料的修饰，采用滴涂法，分别将常用修饰材料普鲁士蓝、Fe-N-C@Hemin、Fe-N-C@Hemin/普鲁士蓝复合材料修饰于丝网印刷电极上，于50°C烘箱烘干，随后滴加2.5 μL 200 mU/mL的AChE，自然晾干，再滴加2.5 μL 0.05%的Nafion作为AChE保护液，自然晾干。制备好的电极置于4°C密封保存。如图2C，Fe-N-C@Hemin/PB组电流响应最大，说明Fe-N-C@Hemin/PB修饰的丝网印刷电极具有最佳的导电性能。
利用循环伏安法验证电化学作为信号输出方式的传感器可行性，丝网印刷电极上装载的AChE会与ATCh反应产生电活性硫醇产物TCh，利用TCh产生的电信号变化反应AChE的活性，由于有机磷农药浓度与AChE活性具有相关性，因此，判断装载在电极上的AChE能否与ATCh反应产生TCh，进而引起电信号变化对传感器的构建至关重要。将Fe-N-C@Hemin/PB/AChE丝网印刷电极分别置于含有ATCh和不含有ATCh的缓冲液中，其中缓冲液为含有0.1 MKCl的pH 7.4，0.05 M的PBS，以50 mV/s扫描10圈检测电信号。如图2D所示，将Fe-N-C@Hemin/PB/AChE丝网印刷电极置于含有ATCh的溶液中能够引起电流变化。
实施例2 检测条件优化结果
1、组分浓度优化
为了达到最佳检测性能，对传感器进行了一系列优化，首先针对传感器元件的相关浓度进行了优化，反应过程中Fe-N-C@Hemin、ATCh、TMB和AChE的浓度均会对传感器性能产生影响，若纳米酶浓度过高，AChE则不能有效抑制纳米酶的显色反应。最终优化Fe-N-C@Hemin、ATCh、TMB和AChE的浓度分别为2 μg/mL、3 mM、100 μM和200 mU/mL（图3）。
2、反应条件优化
除传感器中各种反应元件浓度会对传感器性能产生影响外，传感器反应过程中的外界条件也会影响最终检测效果和检测限，因此对反应过程中的时间和温度进行优化。因为反应涉及到两个步骤，分别为有机磷农药抑制AChE的反应以及余下的AChE与ATCh产生TCh的反应，因此需要对这两个步骤的反应条件分别进行优化。如图4，其中图A和图C为AChE与ATCh的反应条件优化，图B和D为有机磷农药与AChE的反应条件优化。结果表明当有机磷农药与AChE共同孵育30 min时，有机磷农药对AChE的抑制率最高，达到70.96%，因此30 min为有机磷农药与AChE的最佳孵育时间；针对温度对传感器性能的影响，选取了4、25、37、50、60°C这五个温度作为实验优化条件，AChE与ATCh的反应过程中，温度为37°C的时候抑制率最高，为80.74%，因此37°C为AChE与ATCh反应过程中的最佳温度；在有机磷农药与AChE的反应过程中，在4°C、25°C、37°C、50°C反应条件下经T检验显著性分析发现P>0.05，并无显著差异，说明在4~50°C之间，不同温度的变化对于有机磷农药与AChE的反应影响不大，该反应在此温度区间具有一定的稳定性。考虑到实验的一致性，同样选取37°C作为后续实验中有机磷农药与AChE的反应温度。因此，最终优化结果为，首先将有机磷农药与AChE于37°C下孵育30 min，后加入ATCh，继续于30°C下反应30 min。
实施例3 检测方法的灵敏度测定
根据上述优化体系，取不同浓度的农药样品，与25 μL浓度为200 mU/mL的乙酰胆碱酯酶均匀混合，37°C反应30 min。随后加入25 μL的浓度为3 mM的ATCh，继续于37°C反应30 min。加入Fe-N-C@Hemin 10 μL反应5 min后加入10 μL 2 mM TMB，15 min后测定其在652 nm处的OD值，同时用智能手机取色法测定抑制率。计算抑制率(A-A0)/A×100，其中A0为不添加有机磷农药的一组。
用时间-电流法检测农药残留，给定电压0.5 V，分别取不同浓度的农药2.5 μL，滴加在Fe-N-C@Hemin/PB/AChE电极上，反应15 min，随后将电极置于0.5 mM含有0.1 M KCl的以0.05 M的PBS配制的ATCh中，利用Sensit Smart装置及智能手机进行时间-电流扫描。计算抑制率(A0-A)/A0×100，其中A0为不添加OP的一组。
根据LOD=3.3σ/s计算检测限，σ为响应值的标准偏差，s为标准曲线的斜率，结果如图5A-D。
乐果在10~100 μg/mL范围内的线性回归方程为y=0.6283x+25.05，σ为0.00148，s为0.6283，检测限为7.77 ng/mL（图5A）；利用智能手机取色RGB分析，乐果在10~100 μg/mL范围内的线性回归方程为y=0.9253x+0.08752，σ为0.0027，s为0.9253，检测限为9.63 ng/mL（图5B）；亚胺硫磷在10~100 μg/mL浓度范围内的线性回归方程为y=9.263x+6.842，σ为0.017，s为9.263，亚胺硫磷的检测限为6.06 ng/mL(图5C)；马拉硫磷在10~100 μg/mL浓度范围内的线性回归方程为y=0.723x+17.26，σ为0.001795，s为0.723，对马拉硫磷的检测限为8.19 ng/mL，均低于国标GB23200.113-2018食品安全国家标准中规定的10 ng/mL。
图5E-F为电化学信号对乐果的检测结果，从图5E中可以看出，电流响应随着时间延长逐渐平稳，到100~150 s时基本稳定，且随着农药浓度的增加，电流响应逐渐提高。图5F为依据时间电流图绘制的标准曲线，其中A0为未加OPs的CK组，从图中可以得出乐果在浓度1~250 μg/mL范围内与抑制率呈线性相关，其回归方程为y=0.2923x-19.96，R2为0.9878，利用LOD=3.3σ/s对检测限进行计算，电化学传感器检测限为8.58 ng/mL，σ为0.00076，s为0.2923，低于GB23200.113-2018食品安全国家标准中规定的10 ng/mL。
实施例4 检测方法的选择性验证
为了验证传感器是否针对有机磷类农药具有特异性，因此以常见金属离子、蛋白类、糖类物质作为干扰物，判断传感器的特异性检测能力。农药类干扰物的浓度为200 μg/mL，其他干扰物浓度为100 mM，远高于有机磷农药选取的浓度100 μg/mL。所开发的双信号智能化有机磷农药检测方法对有机磷类农药的响应信号远大于其他干扰物，具有良好的特异性（图6）。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种双信号智能化检测有机磷农药的试剂盒，所述的试剂盒包括：
1）比色信号检测体系；2）电化学信号检测体系；
其中比色信号检测体系包括：Fe-N-C@Hemin，乙酰胆碱酯酶，乙酰硫代胆碱，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺TMB；
电化学信号检测体系包括：Fe-N-C@Hemin/普鲁士蓝Fe-N-C@Hemin/PB以及乙酰胆碱酯酶修饰的丝网电极；
其中电化学信号检测体系通过以下方法制备：
采用滴涂法，将Fe-N-C@Hemin/普鲁士蓝复合材料修饰于丝网印刷电极上，于45~55°C烘箱烘干，随后滴加AChE，自然晾干，再滴加AChE保护液，自然晾干，制备好的电极置于4°C密封保存；
其中比色信号检测体系中Fe-N-C@Hemin、ATCh的工作浓度为1~5μg /mL，2~5mM；
其中比色信号检测体系中TMB和AChE的工作浓度分别为50~200μM和100~300 mU/mL。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中电化学信号检测体系的制备方法中，滴加AChE的体积为2~5μL，浓度为100~300 mU/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，AChE的保护液为Nafion，浓度为0.03~0.08%，滴加体积为2~5μL。
4.利用权利要求1-3任一项所述的试剂盒检测有机磷农药的方法。
5.根据权利要求4所述的试剂盒检测有机磷农药的方法，所述的方法步骤为：
1）取待测样品，与乙酰胆碱酯酶AChE均匀混合；
2）加入ATCh，继续于反应；
3）加入Fe-N-C@Hemin反应5 min后TMB，测定其在652 nm处的OD值；
4）给定电压，分别取样品，滴加在Fe-N-C@Hemin/PB/AChE电极上反应随后将电极置于PBS配制的ATCh中，进行时间-电流扫描。
6.根据权利要求5所述的试剂盒检测有机磷农药的方法，其特征在于，其中步骤1）中待测样品与AChE 35~45℃ 反应20~40min；加入ATCh后，继续于30~45℃ 反应20~40min；步骤2）中加入Fe-N-C@Hemin反应3~8min，后加入TMB，反应10~20 min后测652 nm处的OD值。
7.根据权利要求6所述的试剂盒检测有机磷农药的方法，其特征在于，给定的电压为0.5V，滴加样品到电极的反应时间为10~20min，所述的PBS 为0.5 mM含有0.1 M KCl，所述的ATCh配制以0.05M配制，利用Sensit Smart装置及智能手机扫描。
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