CN109765376A - 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿液细胞外囊泡生物标志物 - Google Patents

用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿液细胞外囊泡生物标志物 Download PDF

Info

Publication number
CN109765376A
CN109765376A CN201810943264.9A CN201810943264A CN109765376A CN 109765376 A CN109765376 A CN 109765376A CN 201810943264 A CN201810943264 A CN 201810943264A CN 109765376 A CN109765376 A CN 109765376A
Authority
CN
China
Prior art keywords
urine
diabetic nephropathy
early stage
biomarker
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810943264.9A
Other languages
English (en)
Inventor
邹和群
宁靖
黄颖冰
谷东风
李小琳
周琴
陈韵颖
邹子良
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Shunde Southern Medical University Science And Technology Park Co Ltd
Southern Medical University
Original Assignee
Guangdong Shunde Southern Medical University Science And Technology Park Co Ltd
Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Shunde Southern Medical University Science And Technology Park Co Ltd, Southern Medical University filed Critical Guangdong Shunde Southern Medical University Science And Technology Park Co Ltd
Priority to CN201810943264.9A priority Critical patent/CN109765376A/zh
Publication of CN109765376A publication Critical patent/CN109765376A/zh
Priority to PCT/CN2019/100826 priority patent/WO2020035035A1/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供一种用于诊断糖尿病肾病早期阶段的生物标志物，以及诊断糖尿病肾病早期阶段的方法。所述生物标志物为尿液细胞外囊泡(urine extracellular vesicles,尿EVs)内含的S100A9，其在糖尿病肾病早期阶段表达量相对于正常人显著下降。本发明的诊断方法是非侵入式的，有着巨大应用前景。

Description

用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿液细胞外囊泡生物标志物
技术领域
本发明涉及蛋白检测领域，具体涉及糖尿病肾病早期阶段的尿EVs生物标志物的检测。
背景技术
糖尿病已成为全球公共卫生问题。2015年，国际糖尿病联盟(InternationalDiabetes Federation,IDF)宣布，中国有1.096亿糖尿病患者，多数为2型糖尿病，在其血糖达到糖尿病诊断标准之前先出现空腹血糖受损和/或糖耐量异常，称之为糖尿病前期(又被称为前糖尿病)。这些患者尽管没有明显的血糖升高，但是已经开始出现器官损害，因此对其早期诊断有极其重要的意义，能更有效地防止糖尿病并发症的发生。糖尿病肾病和肾衰竭是糖尿病常见的并发症，目前确诊糖尿病肾病依靠肾脏活检穿刺，但这是一种有风险的有创性检查。微量白蛋白尿可以诊断糖尿病肾病第3期，但当糖尿病肾病还处在第1,2期时，尿中还未出现微量白蛋白，这时如何诊断早期糖尿病肾病目前依然是国际上本领域研究的重点和难点。目前国内外还没有公认的能在微量白蛋白尿出现之前早期诊断糖尿病肾病的尿液生物标志物。
尿液细胞外囊泡(EVs)源自整个泌尿生殖道的多种细胞，释放到尿液中，并且可以作为肾功能障碍和结构损伤的生物标志物。
糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的主要并发症，显著增加心血管风险和相关死亡率。尿液细胞外囊泡(EVs)被认为不仅仅是肾损害标志物的丰富的非侵入性来源，也是全身器官或者是血管损伤的重要标志物来源。本发明作者试图验证尿EVs中的某些蛋白可能与糖尿病肾病存在关联。
生理状态下尿液中存在大量高丰度蛋白，例如Tamm-Horsfall蛋白，而能够反映疾病早期信息的尿液中的蛋白常常是低丰度的，由于受到其他高丰度蛋白的影响，很难被特异敏感地检测出来。有意义的是，这些反映疾病早期信息的尿液蛋白质很多存在于尿液的EVs中，如果我们能够找到科学有效的富集尿 EVs的方法，然后检测尿EVs中的能够反映疾病早期信息的蛋白质，就能克服尿液中高丰度蛋白的影响。在本发明研究中，我们试图在尿液EVs中寻找并验证一种重要的生物标志物，最终可以对其进行评估或监测，以达到DN早期诊断的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液EVs内含蛋白，用于在尿液出现微量白蛋白之前早期诊断糖尿病肾病早期阶段。
我们假设在患有糖尿病肾病(DN)的患者的尿液EVs中可以发现不同的蛋白质，特别是在微量白蛋白尿出现之前。本项研究中，用于DN患者尿EVs研究的大量尿液样本是在本课题组在南方社区人群开展ISN“KHDC”项目支持的社区分子流行病学研究中获得的。在本研究中，采用双向电泳技术分离来自患有DN 和健康受试者的患者的尿液EVs，并且通过MALDI TOF/MS分析对其蛋白质组分进行分析和定量比较。
通过电泳技术分离出患者尿液EVs中1980个蛋白斑点，其中40个蛋白斑点与NC组相比有至少1.5倍的显著性差异。对上述40个蛋白斑点进行质谱鉴定，发现其中22种蛋白质可能与糖尿病肾病密切相关。
对上述差异蛋白质进行文献检索，并且充分检索其中尿液S100A9(NCBI登录号P06702，分子量16290.5，等电点5.71)的文献。钙结合蛋白S100A9，曾被称为钙粒蛋白/钙颗粒素B(calgranulin B)、骨髓相关蛋白-14 (myeloid-relatedprotein-14,MRP14或P14)、细胞迁移抑制因子相关蛋白-14 (migrationinhibitory factor-related protein-14,MRP14)、囊性纤维化蛋白-14(cysticfibrosisprotein-14,CFP14)、白细胞L1复合体重链(leukocyte L1complex heavy chain,L1Ag-H)等。经充分检索关于S100A9在尿液中表达的研究，发现目前国内外对于尿液中S100A9的表达研究甚少，而其中也主要是对于癌症的探索，包括膀胱癌、前列腺癌及肝癌等。尚未检索到S100A9在慢性肾脏病，尤其是我们所研究的糖尿病肾病中的相关文献，我们的研究发现具有创新性。
目前，利用蛋白组学联用质谱技术鉴定出尿EVs中存在蛋白S100A8和 S100A9的报道并不多，从EXOCAETA数据库中发现只有3篇文献。只在膀胱癌细胞来源的尿EVs中发现蛋白S100A8和S100A9。
有益效果：本发明提供了一种尿液细胞外囊泡内含标志物S100A9，可用于非入侵式的诊断早期糖尿病肾病。
附图说明
1.五组试验对象尿液EVs内含S100A9的表达量变化
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步解释本发明，但不限定本发明权利要求范围，本发明所用试剂如无特别说明皆为市售。
实施例1.尿液EVs的透射电子显微镜(TEM)和纳米粒子轨迹分析(NTA)
将参与者分为5组：健康对照组(NC,n＝60)，前糖尿病组(PreDM,n＝60)，蛋白尿水平正常的糖尿病组(DM，n＝60)，微量白蛋白尿糖尿病组(DM-micro,n＝60) 和大量白蛋白尿糖尿病组(DM-macro,n＝60)。第一天早上从所有参与者收集尿液。使用我们先前建立的方法(Musante L,Saraswat M,Ravida A,Byrne B, et al..Recovery of urinarynanovesicles from ultracentrifugation supernatants.Nephrol Dial Transplant2013；28:1425-1433.)，使用流体静力透析方法用于尿液中EVs富集。
具体地，收集研究对象的晨尿100ml，无蛋白酶抑制剂，低速离心后，收集上清液，保存于-80℃冰箱。
HETTICH CENTRIFUGE universal 320(UK)离心机，2000g RCF，室温，离心30min，除去T-H蛋白、细胞碎片和其他沉渣。收集上清液。
纳米膜超滤并浓缩样品：采用自制的纳米膜浓缩装置，连接1000kDa纳米膜，SDS清洗，miliQ水清洗，检查无漏液漏气，装置工作完好后，开始处理样品，每次处理八例样品，分若干批次处理所有糖尿病和正常对照者尿液。纳米膜浓缩样品过程中，密切观察装置是否运行完好，如有漏液现象，及时更换新的纳米膜，重新处理样品。我们的纳米膜浓缩装置运行完好，尚无此现象发生。当超滤到 6-8ml时，加入10-20mlmiliQ水，收集滤过液，反复浓缩过滤三次，然后加入 200mlmiliQ纯水，继续浓缩超滤。待尿液浓缩到3-5ml时，收集样品保存待用。
通过透射电子显微镜(TEM)鉴定来自5组的尿液EVs。进行纳米粒子轨迹分析，使用配备有sCMOS的NanoSight NS300相机估计尿液EVs的数量和大小分布。在Bradford蛋白质测定中使用SDS-PAGE分离5微克尿液EVs蛋白质。将凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，与特异性兔抗人抗体TSG101孵育，然后与辣根过氧化物酶缀合的二抗孵育。最后，用KodakIS 4000R图像站观察样品。
结果表明，尿液EVs具有均匀分布，呈现膜封装结构，杯形或圆形，直径为40-100nm。使用NTA对每个组进行了更全面的尿液EVs大小分析。该曲线显示主峰在55和110nm之间。
实施例2.对实施例1得到的尿液EVs进行蛋白电泳和质谱鉴定
使用Cy2以等量标记每个样品中的内标蛋白质(TSG101)。分别用cy3和cy5 染料标记来自对照组和患者的蛋白质。使用IPG immobilineTM drystrip(24cm， pH4-7)进行等电聚焦(IEF)，并在IPGphor(GE Healthcare)中进行等电聚焦，在1000V(2小时)梯度下进行；8000V(2小时)；在黑暗中以17W/凝胶进行双向电泳程序(2D-DIGE)5-6小时。用Typhoon9410扫描仪(GE Healthcare) 扫描凝胶。通过Ettan Spot Picker(GE Healthcare)切取在所有这些蛋白质点图中两组(preDM，DM，DM-micro和DM-macro与NC相比)之间一致地改变的差异蛋白质点(|比率|>1.5，p<0.05)，然后在超纯水中进行彻底清洗并进行凝胶内胰蛋白酶消化。蛋白质鉴定通过ABI 4800蛋白质组学分析仪 MALDI-TOF-MS(AppliedBiosystems)进行。使用Global Proteome Server Explorer软件(Applied Biosystems)在Swiss Prot数据库中搜索质谱鉴定用于蛋白质鉴定。
使用ExoCarta数据库(www.exocarta.org)进行比较数据分析。使用基因本体软件(GO)分析这些鉴定的蛋白质的分子功能和生物学过程。通过肾和泌尿道途径知识库(KUPKB)进一步分析蛋白质在肾病中的作用。通过检索参考文献最终筛选了未发现的作为糖尿病和糖尿病肾病的一些潜在生物标志物。
而二维DIGE(2D-DIGE)分析表明，在5组中，与NC组相比，1980个蛋白斑点中有近40个蛋白在PreDM，DM，DM-micro和DM-大组之间至少有1.5倍的显着差异，|比率|>1.5，p<0.05。选择上述差异蛋白质点以通过质谱法鉴定。根据我们的分析，选择了22种特定蛋白质进行下一步数据分析，如表1所示。
表1：差异蛋白质
上述数据由ExoCarta，Gene Ontology和KUPKB数据库进行分析，以揭示与尿液EVs相一致的蛋白质组，尤其是尿液来源并且与糖尿病肾病相关的。根据ExoCarta数据库，先前已在正常尿液EVs中报告了所有鉴定的差异蛋白质。如图1所示，发现S100A9表现出表达下降，进行文献检索，未发现尿液EVs内含S100A9与糖尿病/糖尿病肾病的相关性研究。而现有研究中，对1型糖尿病唾液蛋白组学研究发现，S100A9的表达增加与糖尿病微血管并发症如视网膜病和肾病相关。本发明新发现的尿液EVs内含S100A9的表达下降可用于鉴定糖尿病患者的早期肾损伤，即糖尿病肾病早期阶段(早于微量白蛋白尿的出现)。

Claims (5)

1.用于诊断糖尿病肾病早期阶段的生物标志物，所述生物标志物为尿EVs内含的S100A9，其NCBI登录号为P05109。
2.尿EVs内含的S100A9在诊断糖尿病肾病早期阶段中的应用，所述S100A9相对于正常人表达量显著下降。
3.根据权利要求2所述的应用，所述S100A9相对于正常人表达量下降30％以上。
4.根据权利要求3所述的应用，所述S100A9相对于正常人表达量下降40％以上。
5.根据权利要求4所述的应用，所述S100A9相对于正常人表达量下降50％以上。
CN201810943264.9A 2018-08-17 2018-08-17 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿液细胞外囊泡生物标志物 Pending CN109765376A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810943264.9A CN109765376A (zh) 2018-08-17 2018-08-17 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿液细胞外囊泡生物标志物
PCT/CN2019/100826 WO2020035035A1 (zh) 2018-08-17 2019-08-15 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿液细胞外囊泡生物标志物s100a9

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810943264.9A CN109765376A (zh) 2018-08-17 2018-08-17 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿液细胞外囊泡生物标志物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109765376A true CN109765376A (zh) 2019-05-17

Family

ID=66449848

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810943264.9A Pending CN109765376A (zh) 2018-08-17 2018-08-17 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿液细胞外囊泡生物标志物

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN109765376A (zh)
WO (1) WO2020035035A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020035035A1 (zh) * 2018-08-17 2020-02-20 南方医科大学 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿液细胞外囊泡生物标志物s100a9
CN111398595A (zh) * 2020-02-17 2020-07-10 天津医科大学眼科医院 一种血浆小细胞外囊泡中的蛋白质tnfaip8的应用和检测方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210125206A (ko) * 2020-04-08 2021-10-18 건국대학교 산학협력단 세포외소포체를 포함한 살충제 검출용 조성물 및 이의 용도

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102590491B (zh) * 2012-02-06 2014-12-10 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 一种用于早期筛查或辅助诊断泌尿系统疾病的检测试剂盒、检测方法及其用途
WO2014055687A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 Hitachi Chemical Co., Ltd. Urine exosome mrnas and methods of using same to detect diabetic nephropathy
CN109765376A (zh) * 2018-08-17 2019-05-17 南方医科大学 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿液细胞外囊泡生物标志物

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020035035A1 (zh) * 2018-08-17 2020-02-20 南方医科大学 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿液细胞外囊泡生物标志物s100a9
CN111398595A (zh) * 2020-02-17 2020-07-10 天津医科大学眼科医院 一种血浆小细胞外囊泡中的蛋白质tnfaip8的应用和检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020035035A1 (zh) 2020-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109765376A (zh) 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿液细胞外囊泡生物标志物
CN107541563B (zh) 一种用于早期诊断、预测脓毒血症并发急性肾损伤的分子标记物、试剂盒及应用
Hughes et al. The cytologic diagnosis of low-grade transitional cell carcinoma
CN105543361B (zh) 一种检测诊断多囊肾致病基因的dna文库及其应用
CN109470859A (zh) 一种外泌体蛋白作为鉴别肺结节良恶性标志物及其应用
CN109752558A (zh) 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的生物标志物
CN102221607A (zh) 一种抗体组合物及其应用
CN109765377A (zh) 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿EVs生物标志物
CN116735889B (zh) 一种用于结直肠癌早期筛查的蛋白质标志物、试剂盒及应用
CN109828115A (zh) 用于诊断糖尿病肾病早期阶段的尿EVs生物标志物
CN115128285B (zh) 一种蛋白质组合对甲状腺滤泡性肿瘤鉴别评估的试剂盒、系统
WO2023000689A1 (zh) 一种IgA肾病的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用
CN114724707A (zh) 一种肝细胞癌自身抗体标志物组合诊断模型
CN104962612B (zh) BRCA1基因g.41256139delT移码突变及其在制备乳腺癌辅助诊断试剂盒中的应用
CN113832223A (zh) 高血压血清细胞外囊泡蛋白标志物及其应用
CN113584148A (zh) 用于无精子症和严重少精子症检测的特异性标志物筛选方法
CN103983687A (zh) 人源hsf2作为溃疡性结肠炎特异性诊断分子标记物的应用
CN112394102A (zh) 一种检测垂体功能减退症的标志物及其应用
CN104946751A (zh) BRCA1基因g.41244291delT突变及其在乳腺癌辅助诊断中的应用
CN115216530A (zh) Anxa3在制备脓毒症诊断试剂或试剂盒中的应用
CN112114126B (zh) 一种系统性红斑狼疮的诊断标志物及其应用
CN114525331B (zh) 一种快速识别重症肺炎的检测产品
CN117647645B (zh) Lbp、atf6、m-csfr联用在制备诊断自身免疫性肝病产品中的应用及试剂盒
CN113884684B (zh) 一种活动性结核病多组学整合标志物、试剂盒及检测模型的构建方法
CN118731362A (zh) Ef1g作为分子标志物在制备用于诊断良性前列腺增生的产品中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190517