CN104271168A - 三维的预血管化的工程化的组织建造物、制造以及使用组织建造物的方法 - Google Patents

三维的预血管化的工程化的组织建造物、制造以及使用组织建造物的方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容的实施方案提供三维的(3D)预血管化的工程化的组织建造物、癌症的3D预血管化的工程化的组织模型以及包括所述组织建造物的生物反应器和生物反应器阵列。本公开内容还提供制造组织建造物的方法、使用组织建造物的方法、使用组织建造物和/或癌症模型发现药物的方法、等等。

Description

三维的预血管化的工程化的组织建造物、制造以及使用组织建造物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年3月6日提交的具有序列号61/607,397的题为“PREVASCULARIZED 3D CO-CULTURED MODEL FOR BREASTCANCER DRUG DEVELOPMENT”的美国临时申请的优先权，其通过引用整体并入本文。
背景
当前的药物开发平台比如二维的(2D)体外细胞培养系统和体内动物实验不精确预测候选疗法的人体内效果。由于仅一种细胞类型被采用，这些细胞培养系统具有与原代的人细胞和组织有限的相似性，并且由于不同的物种在新陈代谢、生理机能以及行为方面具有差别，动物实验对重现人的药物响应具有一般有限的能力。由于当前筛选技术比如体外实验室组织分析和动物研究的无能，很多实验性药物在临床研究中未能精确预测药物将如何在人中表现。
因此，药物发现和开发领域需要体外平台来测试候选疗法用于人的响应的更好的预测。当前的体外系统(例如旋转生物反应器、球状体的悬浮液以及多孔支架上的生长)在尺寸上是有限的(1-2mm)并且倾向于是二维的。在3D组织建造物方面的尝试只有有限的成就并且一直十分小或者具有短的寿命。这些组织模型的失败至少部分是由于允许氧气和营养素扩散进入组织以支撑更大量、更自然、更持久的组织生长的模型血管系统的不存在。
概要
本公开内容的实施方案提供三维的(3D)预血管化的工程化的组织建造物、用于癌症的3D预血管化的工程化的组织模型、包括组织建造物的灌注式生物反应器、制造组织建造物的方法、使用组织建造物的方法、使用组织建造物的药物发现的方法、等等。
本公开内容的三维的(3D)工程化的血管化的组织建造物的实施方案包括3D生物相容的支架材料；支架材料内的活细胞的3D网络；多个微通道，所述多个微通道延伸贯穿建造物，使得通道的实质部分具有在建造物的一个表面处的入口以及在建造物的相对的表面处的出口，并且在建造物中，通道形成内腔以允许液体通过建造物；以及至少部分地在内腔形成内衬的多个内皮细胞。
本公开内容还提供用于支撑包括3D生物相容的支架材料的体外的3D组织培养物的3D血管化的生物相容的支架的实施方案，所述3D生物相容的支架材料包括固体的多孔材料、凝胶基质材料或者这些材料的组合。固体的多孔材料选自包括以下的材料的组：气凝胶、网状玻璃碳、颗粒稳定的泡沫以及这些材料的组合；并且凝胶基质材料选自包括以下的凝胶基质材料的组：合成的水凝胶、自然衍生的水凝胶以及这些材料的组合。3D血管化的生物相容的支架还包括多个通道，所述多个通道延伸贯穿支架，使得通道的实质部分具有在支架的一个表面处的入口以及在支架的相对的表面处的出口，并且在支架中，通道形成内腔以允许液体通过支架。在3D血管化的生物相容的支架的实施方案中，凝胶基质材料包括一种或者更多种水凝胶，所述一种或者更多种水凝胶选自包括以下的合成的以及自然衍生的水凝胶的组：胶原、纤维蛋白、MatrigelTM、细菌纤维素、HuBiogelTM、藻酸盐、聚合物基水凝胶、共聚物基水凝胶、聚乙二醇(PEG)基水凝胶、弹性蛋白以及角蛋白。另外，在实施方案中，本公开内容的3D血管化的生物相容的支架包括多孔材料，所述多孔材料选自包括以下的组：气凝胶、颗粒稳定的生物相容的泡沫、网状玻璃碳(RVC)、天然静电纺聚合物(naturalelectrospun polymers)、合成的静电纺聚合物(synthetic electrospunpolymers)以及这些材料的组合。在本公开内容的3D血管化的组织建造物和支架的实施方案中，微通道具有约200微米至约450微米的直径。在某些实施方案中，微通道具有约250微米或者更小的直径。
本公开内容的实施方案还包括三维的(3D)体外血管化的癌症模型，所述三维的(3D)体外血管化的癌症模型包括本公开内容的3D组织建造物。在实施方案中，癌症模型的3D组织建造物包括生物相容的支架材料；在支架材料内的活细胞的3D网络，其中细胞的网络包括癌细胞或者癌细胞和非癌细胞的组合；多个通道，所述多个通道延伸贯穿建造物，使得通道的实质部分具有在建造物的一个表面处的入口以及在建造物的相对的表面处的出口，在建造物中，通道形成内腔以允许流体介质通过建造物；以及至少部分地在内腔形成内衬的多个内皮细胞。在本公开内容的3D血管化的癌症模型的实施方案中，模型是人乳腺癌模型并且活细胞的网络包括人乳腺癌肿瘤细胞和非癌的人乳房成纤维细胞。
本公开内容还包括灌注式生物反应器，所述灌注式生物反应器包括本公开内容的3D工程化的组织建造物。在实施方案中，本公开内容的灌注式生物反应器包括如上所述的本公开内容的三维的(3D)工程化的组织建造物以及组织室，所述组织室被配置为容纳组织建造物，使得组织建造物形成穿过室的介质的流上游和下游之间的屏障，导引介质的流穿过组织建造物的通道。在实施方案中，室具有组织建造物的部位上游的至少一个输入口、组织建造物的部位下游的至少一个输出口以及以控制穿过组织室的介质的流的至少一个泵。如上所述，在实施方案中，用于生物反应器的3D工程化的组织建造物包括3D生物相容的支架材料；在支架材料内的活细胞的3D网络；多个通道，所述多个通道延伸贯穿建造物，使得通道的实质部分具有在建造物的一个表面处的入口以及在建造物的相对的表面处的出口，在建造物中，通道形成内腔以允许流体介质通过建造物；以及至少部分地在内腔形成内衬的内皮细胞。
本公开内容还提供体外制造三维的(3D)血管化的组织建造物的方法。在实施方案中，制造3D血管化的组织建造物的方法包括提供3D血管化的生物相容的支架，其中支架包括3D生物相容的支架材料和多个通道，所述多个通道延伸贯穿支架，使得通道的实质部分具有在支架的一个表面处的入口以及在支架的相对的表面处的出口；形成用于允许液体通过支架的内腔。方法还包括用内皮细胞播种内腔，使得内皮细胞在内腔的至少一部分形成内衬；以及用至少一种组织类型的细胞播种支架。方法还包括用细胞培养基灌注支架，并且温育已经播种了的支架，使得至少一种组织类型的细胞的3D网络在支架内生长。
本公开内容的方法还包括制造本公开内容的三维的(3D)血管化的支架材料的方法。在实施方案中，此方法包括提供3D生物相容的支架材料并且使用微通道建造物在支架材料中形成多个微通道，其中通道延伸贯穿支架，使得通道的实质部分具有在支架的一个表面处的入口以及在支架的相对的表面处的出口；形成用于允许液体通过支架的内腔。
本公开内容还包括筛选测试化合物的方法，所述方法包括提供本公开内容的三维的(3D)工程化的血管化的组织建造物，使3D组织建造物暴露于测试化合物；并且监测在暴露于测试化合物之后组织建造物中的任何变化，其中变化选自包括以下的组：组织学变化、生物化学变化以及生理变化或者其组合。在实施方案中，本公开内容的筛选方法包括筛选潜在的癌症治疗化合物的方法。在实施方案中，此方法包括提供本公开内容的3D工程化的血管化癌症组织建造物，其中在支架材料内的活细胞的3D网络包括癌细胞或者癌细胞与非癌细胞的组合，使3D癌症组织建造物暴露于测试化合物；并且检测在暴露于测试化合物之后癌细胞网络的生长或者生存能力的变化，其中癌细胞的生长或者生存能力的减小表明测试化合物是潜在的乳腺癌治疗化合物。在实施方案中，此方法还包括检测癌症治疗的化合物的毒性，如通过细胞网络的组织学变化、生物化学变化、生理学变化的一种或更多种衡量的。
本公开内容还包括生物反应器网络，所述生物反应器网络包括相互连接的生物反应器的阵列以及控制穿过生物反应器的介质的流速的至少一个泵，其中，阵列中的生物反应器互相流体连通。在生物反应器网络的实施方案中，阵列中的至少一个生物反应器包含来自与阵列中的至少一个其他生物反应器中的细胞不同的组织类型的细胞。在生物反应器网络的实施方案中，每个生物反应器包括：本公开内容的三维的(3D)工程化的组织建造物以及组织室，所述组织室被配置为容纳组织建造物，使得组织建造物形成穿过室的介质的流上游和下游之间的屏障，导引介质的流穿过组织建造物的通道。其中室具有组织建造物的部位上游的至少一个输入口以及组织建造物的部位下游的至少一个输出口。
这些实施方案、这些实施方案的用途以及其它的用途、本公开内容的特点以及优点，当结合附图阅读以下优选的实施方案的详细描述时，将对相关领域的那些一般技术人员变得更加明显。
附图简述
本公开内容的很多方面参考以下附图可以被更好地理解。附图中的部件不必按比例，而是把重点放在清楚地说明本公开内容的原理。此外，在附图中，相同的参考数词标出贯穿几个视图的相应的部分。
图1是用于在本公开内容的3D建造物中形成微通道的微通道建造物的实施方案的示意图。
图2是包括以HuBiogel形成生物相容的支架材料的至少一部分的本公开内容的3D血管化的组织建造物的实施方案的本公开内容的生物反应器的实施方案的示意图。流速可以被引入以使通道中的内皮细胞暴露于与生理环境类似的流体切应力。灌注液可以在下游收集并且通过活检口组织活检是可能的。
图3A-3B阐明包括本公开内容的3D血管化的组织建造物的本公开内容的单个生物反应器的实施方案。在所阐明的实施方案中，3D建造物具有用于已播种了细胞的建造物的增强的灌注的微通道的阵列。图3A显示生物反应器的部件分解图，而图3B显示装配好的生物反应器的视图。
图4A-4B是表示本公开内容的生物反应器的实施方案的数码图像。图4A显示装配好的生物反应器的侧视图，并且图4B显示敞开的生物反应器的顶视图。
图5阐明在500×放大率下本公开内容的3D组织建造物中的微通道的实施方案的数码图像。图5显示以细菌纤维素作为支架材料的本公开内容的建造物的实施方案内的250微米直径的通道的图像。比例尺是30微米。
图6是显示由开孔网络提供的格状结构骨架的可商购的网状玻璃碳(RVC)在10×放大率下拍摄的EM图像。比例尺是4mm。
图7是阐明在颗粒稳定的泡沫上生长的MDA-MB-231细胞在第七天在40×放大率下的相差显微镜(PCM)图像。
图8是在RVC 45孔/英寸(ppi)上生长的MDA-MB-231细胞在第七天的PCM图像。与背景中的(2D)平面细胞相比，能观察到3D细胞团在材料周围生长。比例尺是400微米。
图9是在RVC 45孔/英寸(ppi)上生长的MDA-MB-231肿瘤细胞在第11天的PCM图像。细胞粘附在支架材料的单个孔的内部上是可见的。比例尺是400微米。
图10是在RVC 45孔/英寸(ppi)上生长的MDA-MB-231肿瘤细胞在第16天的图像。比例尺是400微米。
图11是在与3D支架材料不同的平面基材上生长的MDA-MB-231肿瘤细胞在第16天的2D对照的图像。比例尺是400微米。
图12是在RVC 65孔/英寸(ppi)上生长的MDA-MB-231肿瘤细胞在第17天的图像。比例尺是400微米。
图13A-13B是在本公开内容的不同的支架材料上生长的MDA-MB-231细胞的图像。比例尺是200微米。图13A显示在气凝胶基材(比如以下在实施例3中所述的)上生长的第11天的细胞。细胞粘附在支架材料的单个孔的内部上是可见的。图13B显示在RVC 65上生长的第11天的MDA-MB-231细胞。
图14A-14D是本公开内容的血管化的支架建造物的实施方案的图像。图14A显示45ppi胶原/RVC支架(1.5mg/ml胶原/RVC)的图像，所述45ppi胶原/RVC支架具有显示为渗透穿过4mm厚的RVC/胶原支架的两个400微米直径的微通道。图14B显示45ppi胶原/Matrigel/RVC支架(1.9mg/ml胶原/Matrigel/RVC)的图像，所述45ppi胶原/Matrigel/RVC支架具有穿过支架的三个400微米直径的微通道。图14C是穿过胶原/RVC/Matrigel支架材料的切片(100um)的图像；微通道作为空白区可见，RVC支架材料的部分作为黑色部分可见。图14D是阐明在微通道的内腔形成内衬的内皮细胞的穿过凝胶材料的切片(20um)的图像。
图15A是对于测量为10mm直径×3mm高度(例如实施例4中的版本1生物反应器)的本公开内容的生物反应器的实施方案，本公开内容的盘状支架的实施方案的支架的示意图。图15B是对于测量为10mm宽度×5mm长度×2.4mm高度(例如实施例4中的版本2生物反应器)的本公开内容的生物反应器的另一实施方案，矩形状支架的实施方案的示意图。
图16是为本公开内容的组织建造物的矩形的实施方案设计的本公开内容的生物反应器的实施方案的数码图像。
详细描述
在以更加详细的方式描述本公开内容之前，应理解的是本公开内容不限于所述的特定实施方案并且如此当然可以变化。还应理解的是，本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，并不是意图限制，因为本公开内容的范围将仅由所附权利要求限定。
在值的范围被提供时，应理解，在该范围的上限和下限之间，每个居中值到下限单位的十分之一(除非上下文另外明确指出)，和该所述范围内任何其他指出的或者居中值都包括在本公开内容内。这些较小范围的上下限可独立地被包括在较小范围内并也包括在本公开内容内，受所述范围内任何特别排除的限值的影响。在所述范围包括限值中的一个或者两个时，排除那些所包括限值中任一或者两个的范围也包括在本公开内容内。
除非另外规定，否则本文使用的所有技术以及科学术语具有本公开内容所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。虽然在本公开内容的实践或者测试中也可以使用与本文所述的方法和材料类似或者相当的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。
在本说明书中列举的所有出版物和专利通过引用并入到本文中，如同每个单独的出版物或者专利具体和单独地被表明通过引用并入到本文中，并且被通过引用并入到本文中以与公开和描述结合提及出版物的方法和/或材料来并入到本文中。任何出版物的引用是因为其公开在申请日之前，并且不应该解释成承认：本公开内容由于先前的公开而不具有先于这样的出版物发生的资格。而且，所提供的公布日期可能与实际的出版日期不同，且可以需要独立地证明。
如阅读了本公开内容后将对本领域技术人员明显的，本文所描述和阐明的每个单独的实施方案具有离散的组成部分和特征，其可以容易地与任何其它一些实施方案的特征分离或者相结合而不背离本公开内容的范围或者精神。任何所列举的方法可按照所列举的事件的顺序进行，或者以逻辑上可能的任何其它顺序进行。
除非另有指示，否则，本公开内容的实施方案将采用化学技术、有机化学技术、有机金属化学技术、高分子化学技术、微生物学技术以及类似的技术，这在本领域技术人员的知识范围内。这些技术在文献中得到了充分解释。
提出下列实施方案以对本领域普通技术人员提供对于如何进行该方法和使用所公开和要求保护的组合物和化合物的完全的公开和说明。已经做出努力以保证数值(例如量、温度等等)的精确性，但应该考虑一些误差和偏差。除非另有指示，份数是重量份数，温度是℃，以及压力是在或者接近大气压的。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。
在详细描述本公开内容的实施方案之前，应该理解，除非另有指示，本公开内容不限于特定材料、试剂、反应材料、制造工艺或者类似物，因为这些都可以改变。还应理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，并不是用来限制。在本公开内容中，还可能的是，可以用逻辑上可能的不同顺序来进行各个步骤。
必须指出，说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代对象，除非上下文清楚地另外规定。因此，例如，“一支撑物”的提及包括多个支撑物。在本说明书和后面的权利要求中，将提及许多术语，所述术语将被定义为具有下列含义，除非明显具有相反的意义。
定义
在描述和要求所公开的主题时，将遵循下文陈述的定义使用以下术语。
如本文使用的，术语“工程化”表示工程化的物体由人类创造和/或改变。工程化的物体可以包括自然衍生的物质，但物体本身通过人为干涉和设计在某些方面改变。
如本文使用的术语“血管化”表示物体包括能够输送流体(例如培养基、液体介质中的细胞、营养素等)穿过物体/建造物的管道(例如血管、通道、管)。
如本文使用的术语“通道”或者“微通道”指在建造物内的似管的形成物。通道具有大体圆柱形状，所述圆柱形状具有通常圆的横截面。通道具有为流体的输送创造渠道/管道的敞开的(例如中空的或者大体中空的)内部(指如本文的“内腔”)。如本文使用的微通道具有在微米范围(例如100-900微米、200-500微米等等)的直径。
如本文使用的术语“生物相容”指与活的生物物质和/或生物系统(例如细胞、细胞组成部分、活组织、器官等等)共存而不对生物物质或者生物系统发挥过度的胁迫、毒性或不良影响的能力。
如本文使用的术语“生物相容的支架材料”指具有提供支撑活的生物物质(例如活细胞)的生长的基材的充分的结构稳定性的任何化合物物质。在本公开内容的实施方案中，生物相容的支架材料具有三维结构(而不是平面的2-二维结构)以支撑活细胞的三维生长。
术语“凝胶基质材料”指具有凝胶样稠度和能够支撑活的生物物质(活细胞)的生长的结构的半固体至固体材料的几种不同类型。合成的凝胶基质材料和自然衍生的凝胶基质材料两者都存在并且被本领域的技术人员在使用。凝胶基质材料包括水凝胶，比如生物相容的自然衍生的水凝胶或者合成的水凝胶，比如但不限于聚合物基水凝胶、PEG基水凝胶、纤维素、角蛋白、弹性蛋白、胶原以及类似物。凝胶基质材料还包括生物相容的聚合物基或者共聚物基凝胶材料，比如聚合物基和共聚物基水凝胶。凝胶基质材料还可包括胶凝剂或者交联剂(例如甲醛、戊二醛等)以增强凝胶的结构稳定性(例如以给予其更加“结实的”特性)。
如本文使用的，短语“固体的多孔材料”指具有固体(而不是凝胶样的)稠度和具有敞开的或者多孔的结构的支架材料，所述敞开的或者多孔的结构是为了提供用于支撑活细胞的3D网络的生长的结构骨架，固体的多孔材料具有比凝胶基质材料比如水凝胶更加刚性的支撑。在实施方案中，用于本公开内容的支架材料和建造物的这些固体的多孔材料是惰性材料，所述惰性材料对在其骨架内/其骨架上生长的生物材料不干涉或者发挥负面影响。在实施方案中，本公开内容的固体的多孔材料可以具有似晶格的结构，所述似晶格的结构提供足够的表面面积来支撑三维细胞生长。可以被包括在本公开内容的实施方案中的固体的多孔材料的实施例在以下讨论中被描述。
术语“细胞的网络”指互相连接的或者以其他方式互相细胞连通的多个细胞(例如三个或者更多个)的分组。术语“细胞的3D网络”包括如上所述的细胞的网络，其中，细胞占据三维空间。换言之，三个或者更多个细胞以多于一个平面的形式聚集在一起。
本文使用的术语“癌症”将被给予其通常意义，作为其中异常细胞不受控制地分裂并且形成癌细胞或者赘生性细胞或者组织的疾病的通用术语。术语癌症可包括癌细胞和/或癌变前细胞。特别地，并且在本公开内容的实施方案的上下文中，癌症指血管发生相关的癌症。癌细胞可以侵袭附近的组织并且可以通过血流和淋巴系统蔓延到身体的其它部分。有几种主要的类型的癌症，例如癌是始于皮肤或者始于在内脏中形成内衬或者覆盖内脏的组织的癌症。肉瘤是始于骨骼、软骨、脂肪、肌肉、血管或者其它结缔组织或者支撑的组织的癌症。白血病是开始于形成血液的组织比如骨髓并且引起大量的不正常血液细胞被产生并且进入血流的癌症。淋巴瘤是始于免疫系统的细胞的癌症。
当正常细胞失去其表现为特化的、受控制的以及协调的单元的能力时，可形成肿瘤。通常，实体瘤是通常不包含囊肿或者液体区(尽管某些脑肿瘤的确具有囊肿以及充有液体的中央坏死区)的组织的不正常的块。单一的肿瘤可以甚至具有不同的细胞群在其内，具有已经出错的相异的进程。实体瘤可以是良性的(非癌性的)或者恶性的(癌性的)。实体瘤的不同类型对形成其的细胞的类型命名。实体瘤的实例是肉瘤、癌以及淋巴瘤。白血病(血液的癌症)通常不形成实体瘤。
典型的癌症包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈癌、甲状腺癌、胃癌、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星型细胞瘤、成胶质细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肉瘤家族肿瘤、生殖细胞瘤、颅外癌、霍奇金病、白血病、急性成淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肝癌、成神经管细胞瘤、成神经细胞瘤、通常的脑肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、骨骼的恶性纤维组织细胞瘤、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、通常的软组织肉瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤以及松果体肿瘤、视路以及下丘脑胶质瘤、维尔姆斯肿瘤、急性淋巴细胞白血病、成人急性髓性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、食道癌、毛细胞白血病、肾癌、多发性骨髓瘤、口腔癌、胰腺癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、皮肤癌、小细胞肺癌，除了别的之外。
肿瘤可以被归类为恶性的或者良性的。在两种情况中，有细胞的不正常的聚集以及增殖。在恶性肿瘤的情况下，这些细胞更加侵略性地行为，获得增强的侵袭性性能。最后，肿瘤细胞甚至可以获得从肿瘤细胞在其中起源的微观环境脱离，蔓延至身体的另一区(具有通常不有益于其生长的非常不同的环境)，并且在此新的位置继续其迅速的生长以及分裂的能力。这叫做转移。一旦恶性细胞开始转移，实现治疗就更加困难。
良性肿瘤具有较少的侵入的倾向并且不太可能转移。脑肿瘤在脑内广泛蔓延但通常不转移到脑外部。神经胶质瘤在脑内部是非常有侵略性的，甚至横跨大脑半球。然而，它们以不受控制的方式分裂。取决于其位置，它们可以正如恶性病变一样威胁生命。其实例将是脑中的良性肿瘤，其可以生长并且占据头颅内的空间，导致在脑上增加的压力。
应注意，癌变前细胞、癌症、肿瘤常常可交换地使用在本公开内容中。
术语“聚合物”包括由互相共价结合的两个或者更多个单体单元所组成的任何化合物，其中，单体单元可以是相同的或者不同的，使得聚合物可以是均聚物或者杂聚物。典型的聚合物包括聚酰胺比如多肽、聚-N-取代甘氨酸(聚类肽物(polypeptoids))，多糖，聚乙二醇或者聚氧化乙烯，塑料(例如聚-L-乳酸、聚-L谷氨酸及其共聚物)，核酸以及类似物，其中聚合物可以是自然发生的、非自然发生的或者合成的。术语“生物聚合物”指由生物衍生的和/或生物相容的化合物组成的聚合物。
术语“附接”或者短语“相互作用”以及“相关联”指稳定的物理关联、生物关联、生物化学关联和/或化学关联。一般来说，关联可以是化学键结(例如共价地或者离子键地)、生物的相互作用、生物化学的相互作用以及在某些情况下的物理相互作用。关联可以是共价键、非共价键、离子键、金属离子螯合相互作用以及通过相互作用比如但不限于疏水相互作用、亲水相互作用比如水凝胶键结、电荷-电荷相互作用、π堆积相互作用、其组合以及类似的相互作用被连接的部分。
讨论
本公开内容提供三维的(3D)工程化的血管化的组织建造物，包括建造物的生物反应器，制造建造物的方法以及使用建造物用于组织设计、药物发现和很多其他用途的各种方法。本公开内容的3D工程化的血管化的组织建造物代表定制的微生理学平台，该平台支撑长期的组织生长、重演生理组织功能、提供人的疾病进展或者对外部攻击(药物或者病原体)的响应的模型，以及其他优于现有技术的优势。
现有药物发现平台利用2D细胞培养系统复制组织微环境和生理端点。利用原代的人细胞的3D组织模型更好地复制了组织的生物化学特性和生物物理学特性。此外，与2D培养相比，3D培养的基因表达谱更加精确地模拟天然组织并且更加精确地再现药物灵敏度反应。目前，利用合成的(水凝胶、藻酸盐)或者动物源(MatrigelTM、HuBiogelTM、胶原)生物基质支架开发很多3D组织模型。此外，大部分3D组织建造方法通常仅培养原代的实质细胞类型而不合并间质或者血管部件。相比之下，本公开内容的3D血管化的组织建造物通过使用生物基质支架来精确地模拟组织功能和对药物的反应来表现更加“完全的人类”组织建造物，该生物基质支架适合于在血管化的网络中长期培养带有实质和间质细胞组件的恰当的人原代细胞类型。
在本公开内容的组织建造物内工程化的微通道的网络对建造物提供血管化以克服在较大组织中的氧气扩散局限性并且允许引入循环的机械刺激用来提供适当的内皮功能以及与周围组织的新陈代谢连通。组织建造物的血管化允许更好的三维生长以及更大规模的生长和更长的持续性。在3D组织模型技术上的这些进展通过提供具有更加生理有关的功能以及结构并且从而具有更加似体内的新陈代谢和分子预测端点的组织建造物将加速药物开发。
本公开内容的3D血管化的组织建造物与各种细胞类型相容，并且因此可以被用来生长包括任何不同细胞类型的组织建造物，所述任何不同细胞类型然后可以被采用用于很多不同的用途。例如，在本3D血管化的组织支架的生理学环境中可以生长健康的细胞和患病的细胞两者并且这两种细胞可以被用来模拟各种疾病状态、器官系统等等。并且，来自捐赠者和患者的人细胞可以被用在本建造物中以创建生理相关的组织建造物和疾病状态的精确的表现。在制造本公开内容的3d血管化的组织建造物中利用患者细胞可以提供用于个体化用药的平台，比如通过提供用于与患者本身的组织的体外测试药物相互作用的个体化模型。
这些3D多细胞组织建造物在新型的微生理灌注式生物反应器中被培养，所述微生理灌注式生物反应器允许组织功能和连接多个器官系统(以即插即用的设计)的能力的实时的非破坏性的测定以重现复杂的生物体生理机能。本公开内容的生物反应器被工程化为与取样和光学成像技术整合在一起来评估组织特异功能以及对药物和毒素攻击的反应。生物反应器可以被合并成为阵列，每个生物反应器支撑组织建造物。这些“即插即用”平台可以被互相连接并且被重新配置为包括多种不同的组织。在实施方案中，本公开内容的3D组织建造物可以被整合成为具有不同组织类型和/或疾病状态的组织建造物的阵列系统以形成整合的微生理系统，用于更具预测性、更迅速并且更加成本有效的药物发现、药物开发、药物功效以及毒理学试验策略。这些创造性方法将代替和/或加强用于药物开发和药物验证的利用2D细胞培养和动物试验方案的现有方法，所述现有方法是昂贵的，具有有限的预测能力并且需要大量的完成时间。本公开内容的3D组织建造物和组织建造物的整合的阵列将提供对于药物从实验到临床的更加成本有效和及时的转化的强大的新型的范例。
本公开内容的3D血管化的组织建造物、利用组织建造物的疾病状态模型、用于组织建造物的生长和保持的生物反应器、生物反应器阵列、利用组织建造物筛选测试化合物的方法、以及制造本公开内容的组织建造物的方法的实施方案和本公开内容的其它实施方案在以下更加详细地被描述。
3D工程化的血管化的组织建造物
本公开内容的3D工程化的血管化的组织建造物包括用于对细胞生长提供结构支撑的三维的生物相容的支架材料；在支架材料内的活细胞的三维的网络；延伸贯穿建造物的多个微通道，其中微通道用内皮细胞被至少部分地在内表面(内腔)上形成内衬。本公开内容包括3D血管化的组织建造物以及用于支撑组织生长的3D血管化的支架(例如不含活细胞的网络的播种前的支架)两者。
生物相容的支架材料：
为了支撑三维空间中细胞的生长，本公开内容的组织建造物提供生物相容的支架材料，所述生物相容的支架材料对建造物提供结构支撑和结构完整性。在实施方案中，生物相容的支架材料是凝胶基质材料、固体的多孔材料或者这些材料的两者的组合。
凝胶基质材料用于组织工程化和芯片实验室的设计的应用是众所周知的。在本公开内容的建造物的实施方案中，在这些应用中使用的任何此种生物相容的凝胶基质材料可以被用来提供本公开内容的结构支架。代表性的凝胶基质材料包括但不限于合成的和自然衍生的水凝胶。本公开内容的凝胶基质材料可以包括合成的水凝胶、自然衍生的水凝胶以及合成的水凝胶和自然的水凝胶两者的组合。此种水凝胶在本领域中是众所周知的并且可以被定制为具有各种物理性质(例如通过掺入各种聚合物材料)并且可以用营养素和其他蛋白质(例如生长因子)被加强。尽管不意图限制本公开内容的范围，以下讨论水凝胶的某些方面和代表性的水凝胶。
通常描述的，水凝胶是以水作为分散介质的亲水性的聚合物链的自然的或者合成的网络。水凝胶是非常能吸收的(其可以包含超过99.9％的水)并且由于其显著的水含量具有与自然组织非常相似的弹性程度。通过控制并且优化其孔隙度和共轭黏附以及其它生物识别或者凝胶交联分子，水凝胶可以被定制为具有紧密匹配自然组织的机械性质的材料性质。
在实施方案中，水凝胶可以通过可调的材料性质(例如凝胶刚度、孔隙度以及降解速率)被特别地设计。组成水凝胶的多肽的选择以及多肽的交联程度(例如通过添加各种交联剂、胶凝剂以及类似物)可以被用来控制水凝胶的材料特性。此外，水凝胶可以被设计为控制所提供的生物基材(例如粘附基材、蛋白酶基材以及类似物)的浓度。在实施方案中，水凝胶可以是合并合成的聚合物比如聚乙二醇加上生物合成所得到的重复的蛋白质的混合的合成材料。在某些实施方案中，水凝胶可以由蛋白质聚合物构成，蛋白质聚合物可以利用化学交联剂、物理交联剂和/或生物交联剂(例如酶)被交联成为水凝胶。在某些实施方案中，水凝胶已经被合成为包括特定的蛋白结合结构域；从而能够实现对细胞生长和保持有用的蛋白质比如生长因子的结合。
本公开内容的建造物可以包括自然衍生的和合成的水凝胶的任何一个或者两者。在本公开内容的实施方案中，代表性的自然衍生的水凝胶包括但不限于以下：胶原、纤维蛋白、MatrigelTM、细菌纤维素、HuBiogelTM及其组合。
在本公开内容的3D血管化的组织建造物的实施方案中，凝胶基质材料可以是细菌纤维素和/或纤维蛋白的自然衍生的水凝胶。细菌纤维素水凝胶和纤维蛋白水凝胶具有不同的化学组成、机械结构，并且可以支撑不同的细胞类型。来源于通过细菌的纤维素纳米纤维的合成的不可降解的水凝胶-细菌纤维素已被证明为支撑血管平滑肌细胞、内皮细胞以及造骨细胞。在哺乳类动物中发现的凝血的可降解的产物-纤维蛋白凝胶已被证明为支撑包括乳腺癌细胞的很多细胞类型。纤维蛋白还在组织再生以及组织修复中起重要作用。其是血栓的主要的蛋白质成分并且经由通过酶凝血酶裂解蛋白纤维蛋白原形成。纤维蛋白可以在生理温度形成凝胶并且已被广泛使用在从心血管组织工程到创伤修复尝试的生物医学工程应用中。
胶原是可以被用在本公开内容的3D血管化的组织建造物中的另一自然的水凝胶。胶原其是在哺乳类动物中发现的最丰富的蛋白质并且是细胞外基质的主要组分。I型胶原是所有的胶原中最丰富的并且在组织再生以及组织修复中起重要作用。其作为溶解材料是可商购的并且在很多生物医学工程应用和包括整形外科组织工程的组织工程应用中已经被用作为3D基质材料。I型胶原在生理温度形成水凝胶。
MatrigelTM(BD Biosciences)是从鼠科动物肿瘤30中提取的溶解的基底膜基质。此水凝胶还被使用在很多组织工程应用中。HuBiogelTM是由VivoBiosciences(VBI)产生的为人生物基质的水凝胶。HuBiogel是包括Col-I、层粘连蛋白、Col-IV、Col-III、巢蛋白(entactin)以及HSPG的自然的细胞外基质(ECM)，但是缺乏所有主要的已知的生长因子。其与人组织更加相容并且更加安全，既不是生成血管的也不是致有丝分裂的。HuBiogel经由局部生长因子信号促进细胞生长和分化并且允许长期培养一种或者更多种细胞类型。其与人细胞相容和/或用于人组织模型的生长。
在本公开内容的实施方案中，代表性的合成的水凝胶包括但不限于以下：藻酸盐、聚乙二醇(PEG)基水凝胶、聚合物低聚(聚延胡索酸乙二醇酯)(OPF)、其它生物相容的聚合物基或者共聚物基水凝胶以及这些材料的组合。
OPF水凝胶是合成的聚乙二醇(PEG)基水凝胶。OPF是在RiceUniversity开发的新型的水凝胶并且已经被用作为用于软组织工程应用和整形外科组织工程应用36-39的3D基质。其性能比如无毒性、生物相容性以及迅速的胶凝作用使其成为用于3D细胞培养的有前途的材料。OPF水凝胶、其它的PEG基水凝胶、藻酸盐以及其它合成的水凝胶可以被用作为用于形成本公开内容的生物相容的支架材料的凝胶基质。
在其中生物相容的支架材料包括凝胶基质材料的本公开内容的实施方案中，其还可以包括一种或者更多种交联剂、胶凝剂或者组合，其中此类试剂能够增加凝胶基质材料的结构稳定性和/或结构完整性。由于水凝胶的高含量，某些水凝胶可以具有比本公开内容的建造物中所期望的更流动的稠度。因此，在某些实施方案中，胶凝剂和/或交联剂或者类似物可以被用来“凝固”或者“固化”水凝胶。在某些实施方案中，单独的热的应用可能足以胶凝或者“固化”水凝胶。热供应、凝胶剂或者交联剂或者其它填充物的使用的组合可以被使用在本公开内容的实施方案中以提供支架材料的期望的结构完整性。
虽然凝胶基质材料比如水凝胶在具有孔板设计或者薄的芯片实验室技术的组织工程应用和细胞培养应用中具有使用的历史，但其在过去不能支撑大的3D组织建造物的生长和/或长期的保持。如由本公开内容提供的建造物的血管化克服这些困难的某些，允许培养基、营养素以及类似物另外递送至细胞以允许更加持久的和大量的组织生长。在本公开内容的实施方案中，凝胶基质材料单独作为支架材料对用于孔板格式、某些生物反应器设计以及其它实施方案的建造物的实施方案是合适的。然而，对于某些应用，另外的结构完整性可以是支架材料中期望的。
在本公开内容的3D血管化的组织建造物的实施方案中，生物相容的支架材料可以包括固体的多孔材料比如但不限于气凝胶、颗粒稳定的生物相容的泡沫、网状玻璃碳(RVC)、天然静电纺聚合物、合成的静电纺聚合物以及这些材料的组合。此种固体的多孔材料提供用于支撑活细胞的3D网络的生长的固体结构骨架。在实施方案中，用于本公开内容的建造物的支架材料的这些固体的多孔材料是惰性材料，所述惰性材料对在其骨架内部/骨架上生长的生物材料不干涉或发挥不良影响。
这些固体多孔材料的某些具有似晶格的结构，所述似晶格的结构提供足够的表面面积来支撑三维细胞生长。例如网状玻璃碳(RVC)具有由敞开的孔隙网络提供的固体的晶格结构。RVC的图像显示在图7中。其它固体的多孔结构也提供晶格型或者似网的结构特征，比如气凝胶、颗粒稳定的生物相容的泡沫、自然的和合成的静电纺聚合物等等。气凝胶是来源于凝胶的固体材料，其中液体已经从凝胶蒸发，留下超轻但牢固的固体骨架。这些材料和其它生物相容的固体的多孔材料可以被单独或者与其它材料比如以上讨论的凝胶基质材料结合使用于形成本公开内容的支架材料。
因此，在本公开内容的3D血管化的组织建造物和3D血管化支架材料的实施方案中，生物相容的支架材料可以包括一种或更多种固体的多孔材料和一种或更多种凝胶基质材料，以及用来加强、修改或控制支架材料的性质的任何其他的化合物(例如粘合剂、胶凝剂、交联剂、蛋白质、聚合物等等)。在本公开内容的实施方案中，生物相容的支架材料包括与一种或更多种凝胶基质材料结合的网状玻璃碳和/或气凝胶，所述凝胶基质材料比如但不限于MatrigelTM、细菌纤维素、胶原、纤维蛋白、弹性蛋白、角蛋白、HuBiogel及其组合。在本公开内容的实施方案中，生物相容的支架材料包括RVC、MatrigelTM和胶原，以及任选的交联剂和/或凝胶剂比如但不限于戊二醛、甲醛以及类似物。
支架的血管化：
本公开内容的3D工程化的血管化的组织建造物和3D血管化的支架材料包括延伸贯穿建造物的多个通道。在实施方案中，通道是微通道。在实施方案中，微通道具有约1微米至约1000微米、从约5微米至约600微米、或者从200微米至约450微米以及在所陈述的范围内和/或者重叠所陈述的范围的其它范围的直径。在实施方案中，微通道具有约250微米或者更小的直径。在实施方案中，微通道具有从约5微米至约250微米的直径。微通道被配置使得通道的实质部分具有在建造物的一个表面处的入口以及在建造物的相对的表面处的出口。微通道是大体中空的，使得通道形成内腔以允许液体通过建造物。因此，微通道在支架建造物内创建血管网络以促进细胞培养基、营养素、氧气、蛋白质、生长因子以及类似物递送至3D建造物的各个部分，允许在建造物内生长的细胞的改进的生长和保持。在实施方案中，微通道是大体对齐的(例如其是通常面向在同一方向以允许流体/介质单向流动穿过通道)。
在本公开内容的3D血管化的建造物和支架的实施方案中，微通道是至少部分地以内皮细胞在内部表面(内腔)上形成内衬。这些内皮细胞可以形成完整的网络以近似于生理血管的内衬。内皮细胞被引入通道并且被培养以便多个内皮细胞至少部分地在内腔形成内衬。内皮细胞可以以对本领域技术人员已知的各种方式被引入。例如，在实施方案中，在建造物内形成的具有微通道的支架/建造物可以被放置在包含内皮细胞的培养基中并且被温育足够量的时间用于内皮细胞生长。在其他的实施方案中，内皮细胞可以如下播种：通过用包含内皮细胞的介质灌注到生物反应器中，通过注射泵，通过注入微通道中或者递送内皮细胞至建造物的微通道的其它方法。
在本公开内容的制造建造物和支架的方法的实施方案中，微通道通过使用微通道建造物形成。在实施方案中，微通道建造物由刚性的耐用的材料比如金属(例如不锈钢)、玻璃、聚合物、可再吸收的细丝以及类似物构成。微通道建造物可以具有底部和用于形成微通道的棒或者线的阵列。图1表示本公开内容的微通道建造物的实施方案的示意图。在本公开内容的实施方案中，棒或者线具有大体圆柱形状并且具有类似于微通道的期望的横截面的横截面。因此，棒/线可以具有约10微米至约1000微米、100微米至约600微米、约200微米至约400微米和约250微米以及类似的直径。在实施方案中，微通道还可以通过激光切削加工被形成。
微通道建造物可以被用来以各种方式在3D支架材料中形成通道。在支架材料包括凝胶基质材料的实施方案中，在固化(例如交联、胶凝或者以其他方式“凝固”)凝胶基质材料之前，微通道建造物可以被插入到凝胶基质材料中或者固体的多孔材料和凝胶基质材料的组合中。然后在凝胶已经固化后，微通道建造物可以被移除，留下微通道在支架/建造物内。在其它实施方案中，在固化、形成或者将通道“戳入”到支架/建造物中后，微通道建造物可以被插入/戳入凝胶基质材料、固体的多孔材料或者固体的多孔材料和凝胶基质的组合中)。用于在建造物/支架中形成微通道的其它方法也可以被采用并且被认为是在本公开内容的范围内。
细胞的3D网络：
本公开内容的3D血管化的组织建造物还包括在支架材料内的细胞的3D网络。细胞的网络包括生长在三维空间中(例如在多于一个平面中)的多个细胞，其中细胞以某种方式比如物理接触、细胞连通等等互相连接。本公开内容的组织建造物可以支撑几乎任何种类的细胞的生长，特别感兴趣的是动物细胞。在实施方案中，本公开内容的组织建造物包括哺乳动物细胞，特别地人细胞。细胞可以来自感兴趣的任何组织，包括健康的组织和/或患病的组织。在支架材料和微通道的形成之后，或者在某些实施方案中，与凝胶基质材料或者其它试剂的添加同时，细胞可以被引入支架材料。细胞可以通过注射、灌注、共温育或者这些方法的组合以及对本领域的技术人员已知的其它方法被引入培养基中。
本公开内容的组织建造物可以包括病理性细胞(例如用于建模患病组织)、健康细胞或者健康细胞和病理性细胞的组合。总之，细胞类型可以是引起或者能够引起疾病比如癌症的病理性细胞。在实施方案中，细胞类型可以包括癌症细胞，比如癌性人细胞和/或癌前人细胞。在实施方案中，癌细胞可以包括癌细胞比如转移癌细胞。在实施方案中，癌性人细胞可以包括人癌细胞比如转移性的人癌细胞。细胞类型可以对应于癌症比如以上定义的那些。特别地，细胞类型可以包括人或者哺乳类动物中的前列腺癌细胞，乳腺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、肺癌细胞以及结肠癌细胞。尽管本文涉及到癌症以及癌细胞，但癌症以及癌细胞可以被替换为致病细胞。
在实施方案中，细胞包括癌细胞和健康(非癌)细胞的组合。以这种方式，用本公开内容的建造物以类似于疾病的体内状态的方式建模某些疾病状态是可能的。例如，在某些肿瘤的情况下，本公开内容的3D血管化的组织建造物允许模拟宿主中肿瘤的结构和构成的与健康组织组合的3D肿瘤的形成。由支架材料提供的结构以及由微通道提供的血管化允许细胞的改进的生长以形成具有更加类似于生理状态的空间定向和结构的组织。
在本公开内容的某些实施方案中，建造物可以被用来提供三维的(3D)体外血管化的癌症模型。在某些这类实施方案中，3D组织建造物包括具有在支架材料内的活细胞的三维网络的生物相容的支架材料，其中细胞的网络包括癌细胞或者癌细胞与非癌细胞的组合。3D血管化的癌症模型还包括延伸贯穿建造物的多个通道以形成内腔以及至少部分地在内腔形成内衬的多个内皮细胞，如上所述的。
在实施方案中，本公开内容的3D血管化的组织建造物可以被用来提供人乳腺癌的模型。在实施方案中，3D血管化的组织建造物包括细胞的网络，所述细胞包括乳腺癌肿瘤细胞和健康乳房组织细胞比如但不限于乳房成纤维细胞和/或乳房上皮细胞)。在本公开内容的乳腺癌模型的某些实施方案中，乳腺癌肿瘤细胞形成球状体结构。球状体常常由具有乳腺癌的宿主的乳腺癌细胞体内形成。本公开内容的实施方案还包括利用本公开内容的3D血管化的组织建造物的其它癌症以及其它疾病的模型。
3D血管化的支架和组织建造物的配置：
在实施方案中，3D血管化的组织建造物和/或3D生物相容的血管化的支架的物理性质(例如大小、形状、密度等等)可以被配置和/或调整用于各种应用。例如，本公开内容的3D支架/组织建造物可以被调整为具有不同的大小、形状、厚度、密度以及类似物用于各种试验、培养、成像和筛选应用以及其它用途和应用。例如，在某些实施方案中，组织建造物被配置为被放置在孔板和/或扁平的平行板的流动室中。在其它实施方案中，组织建造物被配置用于在共焦成像设备、荧光成像设备、相差成像设备、或者可交换地在这些设备的任何一个上放置。在实施方案中，本公开内容的组织建造物和/或支架适合于被放置在生物反应器组织室以及一种或者更多种其它的上述的设备中。例如，适用于孔板格式的组织建造物可不需要同样多的结构完整性，所以较柔软的凝胶基质支架材料可以是合适的。在其中需要更多的结构完整性的某些实施方案中，固体的多孔材料比如RVC可以被包含在支架材料中。形状也可以对适当的应用定制。例如，在对于孔板的实施方案中，用于建造物的更加似盘的结构可能是需要的(例如图15A)，而，对于在共焦成像设备上的应用，更加矩形的形状可能是合适的(例如图15B)。
而且，建造物的形状可以被调整用于各种生物反应器中。例如，建造物可以具有略微圆柱形状或者盘状(例如图15A)用于圆柱形生物反应器，比如图4A和4B中所示，同时建造物可以具有更加矩形的形状(例如图15B)用于矩形生物反应器，比如图16中所示。
如上所述，本公开内容不仅包含本公开内容的三维的(3D)血管化的组织建造物，也包含用于支撑体外3D组织培养的3D血管化的生物相容的支架。3D血管化的生物相容的支架类似于组织建造物，但还不包括在支架材料内的细胞的3D网络。因此，这些支架可以被用来如上所述地生长细胞的3D网络并且制造组织模型和如上所述的疾病模型。在实施方案中，本公开内容的3D生物相容的支架材料可以包括固体的多孔材料、凝胶基质材料或者其组合，如上所述。
血管化的生物相容的支架的微通道可以或者可以不包括在内腔内的内皮细胞的层。内皮细胞可以在感兴趣的细胞的添加稍后的时间、之前或者同时被添加到支架。本公开内容还包括成套元件，所述成套元件包括本公开内容的3D生物相容的支架，所述本公开内容的3D生物相容的支架包括生物相容的支架材料和如上所述的多个微通道，并带有或者不带有在微通道的内腔形成内衬的内皮细胞。在实施方案中，成套元件还可包括内皮细胞的培养物和/或感兴趣的其它组织细胞的培养物以及用于添加内皮细胞和/或感兴趣的其它组织细胞以产生本公开内容的3D血管化的组织建造物的说明书。
制造组织建造物和支架的方法
本公开内容还提供制造本公开内容的3D血管化的组织建造物和生物相容的支架的方法以及体外生长三维的(3D)组织建造物的方法。在实施方案中，制造本公开内容的3D血管化的支架的方法包括提供三维的(3D)血管化的生物相容的支架，其中支架包括3D生物相容的支架材料和多个延伸贯穿支架的通道，其中通道形成允许液体通过支架的内腔。
在实施方案中，制造本公开内容的生物相容的支架和组织建造物的方法包括通过利用本公开内容的微通道建造物形成微通道，如上所述。在某些实施方案中，微通道通过利用建造物以将通道戳入支架材料中被形成，而在其他实施方案中，微通道建造物被插入用于形成支架材料的材料(比如凝胶基质材料或者凝胶基质材料与固体的多孔材料的组合)中，并且凝胶基质材料在微通道建造物周围被固化或者胶凝。然后建造物被移除，留下通道在支架材料内。在实施方案中，方法还包括用内皮细胞播种内腔，使得内皮细胞在内腔的至少一部分形成内衬。制造本公开内容的3D血管化的组织建造物的实施方案还包括用至少一种组织类型的细胞播种支架。支架然后可以用包括感兴趣的细胞的细胞培养基灌注(或者以其他方式接触感兴趣的细胞)以用感兴趣的细胞播种支架材料。在实施方案中，播种了的支架材料被温育并且所述至少一种组织类型的细胞的3D网络在支架内生长。
生物反应器
本公开内容的3D血管化的组织建造物也适合于被包括在生物反应器中。用于容纳本公开内容的组织建造物的生物反应器也包括在本公开内容的范围中。在实施方案中，生物反应器被提供具有用于容纳组织建造物的组织室和用于流体(例如培养基)的转移的上游口和下游口以及用于控制培养液的流的任选的泵。本公开内容的生物反应器的实施方案的原理图在图2中被阐明。本公开内容的生物反应器可以被设计和/或调整用于组织建造物的各种实施方案。例如，生物反应器可以被调整用于盘状的组织建造物，并且在其他实施方案中，生物反应器可以被调整用于大体矩形状的组织建造物。在实施方案中，生物反应器还与成像设备比如共焦成像设备、荧光成像设备、相差成像设备或者可交换地与这些设备的任一种兼容。在实施方案中，生物反应器被配置为当组织建造物在生物反应器内时允许组织建造物成像。
本公开内容的代表性的生物反应器的实施方案在图3中示出，其将在本文作为代表性的实施方案被更详细的描述。生物反应器(10)包括用于容纳具有多个微通道(13)的3D血管化的组织建造物(12)的组织室(11)。生物反应器还包括输入区/室(14)，和输出区/室(16)以及盖(18)。输入室以及输出室包括口(20)。输入室是组织室的上游并且包括输入口(22)(比如但不限于用于引入新鲜介质团的输入口(22A)和用于引入新鲜检验试剂的输入口(22B))。并非所有的实施方案将包括此处说明和描述的每个口，因为在某些实施方案中，某些输入口可以有助于输入多种物品，同时某些输出口还可以用于多种不同的输出物。在实施方案中，生物反应器包括上游输出口(24)。在实施方案中，输出口(24A)提供用于从用于分析的建造物中提取流体的口。另一输出口(24B)可以提供机会以冲洗流体，进行介质改变以及类似的。在实施方案中，生物反应器还包括用于灌注液从输出室(16)离开的下游输出口(28)。本公开内容的生物反应器还可以包括用于将连续的介质流输入输入室中的输入(26)。在实施方案中，生物反应器还包括用于从组织建造物提取活检样品的活检口(30)以及用于对其它设备或者系统比如另一生物反应器密封的任选的O型环(31)。在本公开内容的实施方案中，组织建造物充当输入室和输出室(14和16)之间的屏障，使得通过泵、注射器等等引入的介质的流流过建造物的微通道。
在本公开内容的生物反应器的实施方案中，生物反应器包括三维的(3D)工程化的组织建造物；被配置为容纳组织建造物的组织室；以及控制穿过组织室的介质的流的至少一个微泵、注射泵或者蠕动泵，所述三维的(3D)工程化的组织建造物包括三维的生物相容的支架材料(如上所述)；在支架材料内的活细胞的三维网络；以及多个通道，所述多个通道延伸贯穿建造物，使得通道的实质部分具有在建造物的一个表面处的入口以及在建造物的相对的表面处的出口；以及至少部分地在内腔形成内衬的多个内皮细胞，所述被配置为容纳组织建造物的组织室使得组织建造物形成穿过室的介质的流上游和下游之间的屏障并导引介质的流穿过组织建造物的通道，其中所述室具有组织建造物的部位上游的至少一个输入口以及组织建造物的部位下游的至少一个输出口。
生物反应器网络/阵列
如以上所讨论的，本公开内容的生物反应器可以被调整为是互相连接的以创建生物反应器的阵列。在阵列中，不同的生物反应器可以支撑不同的组织类型的组织建造物，使得不同的组织类型可以在阵列中互相连接。这允许组织类型之间的细胞相互作用以及其它的相互作用的测试、检验、观察、分析。其还允许人们监测被提议的治疗剂或者其它的化合物如何对一种组织类型发挥影响并且可以如何对另一组织类型发挥不同的影响。此“即插即用”设计允许人们混合组织类型并且以更加精确地建模宿主系统的配置使组织类型互相连接。
在实施方案中，生物反应器网络包括根据本公开内容的互相连接的生物反应器的阵列以及至少一个泵，所述至少一个泵控制穿过生物反应器的介质的流，使得阵列中的生物反应器互相流体连通。
筛选方法
本公开内容还包括利用本公开内容的3D血管化的组织建造物筛选测试化合物的方法。在实施方案中，组织建造物可以被用作患病组织和/或健康组织的模型以确定候选药物、治疗剂、生物试剂或者其他化合物对组织的效果。在实施方案中，筛选方法包括提供带有支架材料内的感兴趣的组织的活细胞的网络的如上所述的三维的(3D)工程化的血管化的组织建造物；将3D组织建造物暴露于测试化合物；以及监测在暴露于测试化合物之后组织建造物中的任何变化，其中变化选自由以下组成的组：组织学变化、生物化学变化以及生理学变化或者其组合。建造物可以被用来不仅监测患病组织类型对潜在的候选药物的响应并且监测健康组织对相同的化合物的反应以便测试毒性和/或不良影响。
在实施方案中，本公开内容的组织建造物可以被用来筛选潜在的乳腺癌治疗化合物。化合物可以利用模拟人乳腺癌疾病(例如包括乳腺癌细胞和/或乳腺癌细胞与其它健康的人乳房细胞的组合)的组织建造物被筛选。在此实施方案中，将包括3D乳腺癌组织和/或其它患病的细胞或者健康的细胞的建造物与所测试化合物(例如潜在的乳腺癌治疗剂)接触。方法包括在暴露于所测试化合物后检测乳腺癌细胞网络和/或健康的乳房细胞在生长或者生存能力上的变化。在实施方案中，乳腺癌细胞在生长或者生存能力上减少表明所测试的化合物是潜在的乳腺癌治疗化合物。方法还可包括检测乳腺癌治疗化合物的毒性，如通过细胞网络的组织学变化、生物化学变化、生理变化或者其组合所测量的。这些方法以及这些方法的改变形式可以被用来为对各种组织类型的影响筛选多种化合物，所述各种组织类型可以被生长在本公开内容的3D血管化的组织建造物中。
实施例
既然已经描述了本公开内容的实施方案，通常，实施例描述本公开内容的某些另外的实施方案。虽然本公开内容的实施方案结合实施例以及相应的文本和图形被描述，并非意图将本公开内容的实施方案限制于此描述。相反的，意图是覆盖包括在本公开内容的实施方案的精神和范围内的所有的可选方案、变型以及等同物。
实施例1-具有凝胶基质支架的3D血管化的组织建造物
本实施例描述用于评价乳腺癌药物治疗的3D工程化的组织模型的创建。预料的是此平台将显著地减少与抗癌治疗的监管审批有关的时间和成本，目前为数十亿美元的努力。以3D形成的细胞/生物材料模型代表药物开发中的新兴的范例，新型的治疗化合物在其中被迅速开发、赋予新的用途或者终止。然而，具有将提供氧气和营养素给细胞至更大的体积的预制的血管网络系统的3D模型之前未被开发。本公开内容的预血管化的3D工程化的组织建造物模拟人乳腺癌，提供将以代表体内的人的响应的方式响应抗癌治疗性干预的该疾病的3D模型。
材料和方法：
所使用的两种支架是细菌纤维素和纤维蛋白。通道通过微通道建造物(图1)的使用被创建在每个生物材料中。支架材料通过借助于具有直径为大约250微米的线/微棒的阵列的微通道建造物形成直径为250μm或者更小的微通道被预血管化。对于细菌纤维素建造物，微通道建造物被插入支架材料-包括细菌纤维素的凝胶基质材料中。在微通道建造物的插入之后，细菌纤维素基质材料被固化(例如“胶凝”)。
在基质材料胶凝形成支架之后，微通道建造物被移除，留下穿过支架建造物的微通道的阵列。对于纤维蛋白凝胶建造物，微通道建造物在胶凝之后被戳入纤维蛋白凝胶的凝胶基质材料中；微通道建造物的移除留下穿过纤维蛋白凝胶支架建造物的微通道的阵列。
SEM被用来对通道成像(图5)。细菌纤维素通道然后通过HUVEC灌注穿过生物反应器系统被内皮化。
结果：
SEM确证，微通道在引进微通道建造物之后被形成。图5显示在细菌纤维素凝胶支架材料中的微通道的SEM图像。组织学以及H&E染色验证，通道内衬有内皮细胞的融合性的层。成像还确证内皮细胞在由细菌纤维素支架材料(未显示)做成的建造物中的微通道的内腔形成内衬。
结论：
细菌纤维素和纤维蛋白通过SEM图像两者都已被证明支撑通道制造。此外，H&E染色已表明细菌纤维素通道被内皮化来创建预血管化的支架以支撑其它细胞网络比如成纤维细胞和乳腺癌细胞的生长。因此，细菌纤维素和纤维蛋白两者代表用于模拟人乳腺癌环境的用于预血管化的3D共培养模型生物材料的建造的有前途的支架材料。
实施例2-具有具有凝胶基质支架的3D血管化的组织建造物的生物反应器
以上的实施例1描述在水凝胶生物材料内的预血管化的3D体积的成功的创建；本实施例描述在本公开内容的支架上的哺乳动物细胞的生长以及用于组织建造物的生长、保持以及观察/分析的生物反应器的建造。
本实施例的组织建造物包括人乳腺癌细胞。两种生物材料被选择用于建造预血管化的支架来支撑乳腺癌细胞，所述两种生物材料为：细菌纤维素和纤维蛋白凝胶。如以上实施例1中所述，这些材料用直径小于约250μm的微通道被成功预血管化，并且这些微通道用血管内皮细胞播种，这表明微通道可以支撑融合性的血管内皮细胞层。本实施例进一步表明用乳腺癌细胞播种3D预血管化的组织建造物并且本公开内容的这些组织建造物可以被连续地灌注到流式生物反应器中。此实施例表明此建造物和生物反应器可以充当支撑乳腺癌上皮细胞、乳房成纤维细胞以及血管内皮细胞的可行的3D共培养的开发的基础。
生物反应器设计
图2是如在本实施例中所使用的在室内包括3D血管化的组织建造物的本公开内容的生物反应器的组织建造物室的示意图。如图3的原理图中说明的以及如图4A和4B的图像中所示的圆柱形的流通式生物反应器是用聚碳酸酯建造的以便用培养基使微通道经受脉动流。生物反应器被设计以便预血管化的盘状的生物材料可以被安装到更大的盘状座位中并且被放置在圆柱形的流通式室内部。生物材料以及座位代表上游流和下游流之间的隔离物，从而强迫介质穿过微通道的阵列。两个盖密封生物反应器并且能够实现上游硅胶管路与泵连接并且下游管路充当对储存器的返回。如以上实施例1中所述，细菌纤维素的微通道在250μm直径的线的阵列周围形成，而纤维蛋白的微通道通过在胶凝之后将阵列戳入支架中被形成。具有5mm×5mm×1mm的尺寸的不锈钢板被用作微通道建造物基部。扫描电镜术确证，细菌纤维素和纤维蛋白中的微通道在引进微通道建造物之后被形成。H&E染色也显示细菌纤维素通道中的内皮细胞的融合性的层。然而，细菌纤维素通道在形状上是不规则的并且具有不平坦的以及漏斗形状的通道开口。人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)以及人乳房成纤维细胞(HT1080)的多培养物被播种到纤维蛋白支架建造物中并且成功地在培养中生长并且维持持续2周。
3D微生理生物反应器
穿过每个预血管化的组织建造物生物反应器系统的介质流由可商购的高性能微泵提供。这些微泵适合于递送精确的介质的流至每个组织室。微泵将用对组织类型特异性的介质灌注组织。穿过每个3D组织的全部的流被均匀分配穿过在组织内的每个圆柱形通道。流由Navier-Stokes方程支配，当惯性项对粘性项的比率(以Reynolds数Re为特征)变得可以忽略时(Re＜＜1)，该方程在微流体系统中可以被简化。这导致适用Stokes方程估算微通道压力梯度：
0 = - ▿ p + μ ▿ 2 u →
其中p是压力，u是流体速度，并且μ是介质的动态粘度。在圆柱形微通道的情况下，抛物线型的流形成并且对于切应力的关系可以通过Hagen-Poiseuille方程被描述：
τ = 4 μQ π r 3
其中τ是在通道壁处的通道切应力中的介质的流体，Q是容积流率，r是通道的半径并且μ是介质的动态粘度。为了估算微通道的壁处的切应力的目的，介质将被假设为是在壁处不具有滑的刚性壁边界的单相牛顿的(Newtonian)。
微通道在如上所述的组织建造物内被铸造并且组织利用微泵用介质被灌注。对于具有250微米直径的微通道的20×20mm阵列(总数＝400)的10mm直径和3mm厚的HuBiogel建造物，如果每个微通道的直径是0.250mm，那么总的横截面积是400(πr2)＝400(μπ.1252)＝20mm2。在微通道系统内包含的介质的总体积是约60mm3或者60微升。60微升每分钟的平均容积流率(在来自蠕动泵的脉动流的情况下)在每个通道内产生大约8-10达因/cm2的壁切应力。
实施例3-具有多孔固体和凝胶基质组合支架的3D血管化的组织建造物
利用基质以提高细胞生长的细胞培养是众所周知的(例如Matrigel、HuBiogel)。3D细胞培养是迅速前进的领域，其中例如肿瘤细胞可以被生长，更接近地表现在体内环境中发现的肿瘤微环境。此后者的事实已经导致用于多种药物筛选实验中的这些3D细胞培养物的增加的使用。然而，使用3D和/或matrigel方法的问题之一是以此种方式形成的球状体可以形成坏死中心并且当其增长到可用的大小时可以收缩，这至少部分地归因于缺乏对包括营养素、氧气等等的介质的可及。
以上的实施例证明在更加生理的环境中形成支撑细胞网络的生长的3D血管化的组织建造物的潜能。本实施例证明利用多种新型的材料充当支架用于多种细胞培养应用。这些材料和此技术的应用可以包括肿瘤细胞培养物以及共培养物的生长而不需要凝胶支撑或者结合凝胶支撑以提高结构完整性。此材料的使用还可以也支撑生理学上相关的微生理系统(例如药物开发期间被用来代替动物的微型器官模型或者疾病模型(例如乳腺肿瘤模型))的生长并且作为产生潜在的合成血管的机制，所述潜在的合成血管为以穿过一种或者更多种这些材料的内皮化的微通道的形式。
在本实施例中所使用的支架材料包括从Southern ResearchTM所获得的多种气凝胶以及具有各种孔径的以网状玻璃碳(RVC)(图6)的形式的商购的材料。RVC，又名玻璃碳泡沫并且以商标名称UltrafoamTM可得，其从UltrametTM，Pacoima，CA获得。气凝胶/溶胶凝胶(Solgels)根据如下方法被制得，其中玻璃微珠、气凝胶或者纳米纤维被涂覆两亲物并且在含水溶液中起泡沫。溶胶凝胶作为锁定剂被加入以保持泡沫在原位。溶胶凝胶可以通过加热至600摄氏度被热移除。藻酸盐或者明胶也可以被用作为锁定剂。来自Southern ResearchTM的在本实施例中所使用的气凝胶具有甲醛/间苯二酚/两亲物(没食子酸、乙酯)的特殊的化学组成(图13A和13B)。气凝胶可以根据以下出版物中所述的方法被制得(两者都通过引用被并入本文)：Pekala,R.W.等人,“Resorcinol-Formaldehyde Aerogels and TheirCarbonized Derivatives.”1989.American Chemical Society Division ofPolymer Preprints.30:221-223；以及Pekala,R.W.等人,“Carbon Aerogels forElectrochemical Applications.”1998.Journal of Non-Crystalline Solids 225:74-80。
实验条件
培养基：具有10％FBS和1％PSG的DMEM，板：12孔细胞培养群集板(Corning#3513)，细胞系：乳腺癌MDA-MB-231(RFP稳定系)，细胞接种：250,000细胞/孔/2ml的培养基，温育：37℃以及5％的CO2，培养基更换：每隔2-3天，在第8天将气凝胶移动到新的板中。
图7表示颗粒稳定的泡沫。并入到泡沫中的是3M的二氧化硅微气泡。间苯二酚-甲醛被用作为基质来增强RVC泡沫。在此实施例中，泡沫用乳腺癌细胞温育。
此外，这些建造物以对于组织病理学正常的方式成功地把这些材料分段，并且采用细胞以及组织功能的其他标准的细胞和分子评估方案是可能的。利用常规的H&E处理样品证明，细胞已经设法渗入单个的孔并且保持存活一段时间。
在此实施例中制备的所有的支架支撑在37摄氏度的O2/CO2环境的适当的生理介质中的各种细胞类型的生存力。图8-10是支撑生长在RVC 45孔/英寸(ppi)上的MDA-MB-231乳腺癌肿瘤细胞的生长的RVC泡沫的在不同的时期拍摄的图像。图12显示在RVC 65ppi上生长的MDA-MB-231细胞。图11代表显示在平坦的基材上生长的MDA-MB-231细胞的图像的对照。图7显示在以上所述的颗粒稳定的泡沫上生长的MDA-MB-231细胞。图13A显示在以上所述的气凝胶支架材料上生长的MDA-MB-231细胞。
实施例4-对于RVC基支架的3D血管化的组织建造物的组织建造物和生物反应器
本实施例证明，细胞外基质支架已经发展到模拟天然的细胞外基质并且包括沿着预制的血管网络(预血管化)的相关细胞类型(例如人乳腺癌上皮细胞和人乳腺成纤维细胞)的生长。这些系统是为了支撑长期的生长、重现生理组织功能并且精确地建立对治疗的响应的模型。这些可以支撑可再生的组织体积的生长的3D血管化的组织建造物的使用将通过提供可靠的、成本有效的模型改观乳腺癌药物开发，所述可靠的、成本有效的模型可以比当前临床前的体内和体外模型更加精确地预测治疗效果。
实验方法
灌注式生物反应器的设计
灌注式生物反应器的两种版本曾被设计并且制造。第一，与12孔板版式相容的圆盘形(图15A)。第二，适合于共焦成像的矩形体积(图15B)。富含内皮细胞(EC)的介质用泵输送穿过在闭合回路系统中的微通道。蠕动泵诱发非稳定流。注射泵被用于短期实验的单向流。在两种配置中，支架充当在上游流和下游流之间的分隔物，强迫介质流动穿过支架中的制造的微通道。
支架&微通道的制造
支架由玻璃碳(RVC)和胶原组成，测量为直径10mm×高度3mm，或者由RVC、胶原和Matrigel组成，测量为宽度10mm×长度5mm×高度2.4mm。在胶凝之前，直径400微米的不锈钢棒被泡在25％的戊二醛中，风干，并且然后被纵长地注入到RVC泡沫孔中。对于RVC/胶原支架，1.5mg/ml胶原的溶液被注入到RVC孔中。对于RVC/胶原/Matrigel支架，包含10％的Matrigel的1.9mg/ml胶原的溶液通过使14.7％(v/v)的DMEM/10％FBS、1.9mg/ml胶原、10％(v/v)的10×介质、10％(v/v)的Matrigel以及0.524M的碳酸氢钠混合被组成。胶原/Matrigel溶液被注入到RVC孔中。
对于胶原/matrigel混合的支架的胶凝，将冻结的Matrigel和胶原在冰中解冻。细胞培养基和碳酸氢钠也在冰上被保持寒冷。以下成分以规定的顺序被混合在2ml的微量离心管中用于产生包含10％(v/v)Matrigel的1.9mg/ml浓度的胶原溶液，所述以下成分为：介质或者去离子水-137μl，胶原-633μl(逐滴)，Matrigel-100μl，10×介质的体积-100μl，碳酸氢钠-30μl(逐滴)。试管被轻微地前后倒置直到颜色均匀。使用1ml的注射器，取出0.3ml的液体溶液。27Gauge针头被添加至注射器的末端并且溶液被插入在适当位置具有微通道建造物的RVC样品中，注意不要用液体触动微通道建造物线。PDMS管/RVC/基质建造物被放置在有盖培养皿中并且用parafilm包裹。真空被用来除去气体并且通过允许真空降至4英寸汞柱来移除气泡。样品被移动至保温箱持续45分钟以允许Matrigel和胶原的胶凝。
在所有的支架胶凝之后，棒被轻轻地移除以形成微通道，所述微通道被显示在图14A和14B的图像中。
生物反应器 版本1-微通道内皮化
RVC/胶原支架被放置在生物反应器中。为了用内皮细胞静止地播种所制造的微通道，2.44×108的大鼠脑内皮细胞(RBEC)被培养并且被铺在每个支架的顶部上。生物反应器被密封并且放入保温箱(37℃，5％CO2)中持续30分钟以用RBEC静止地播种微通道。待发的试管(primed tubing)被连接至生物反应器、储层以及蠕动泵，泵被发动，并且生物反应器被留在保温箱(37℃，5％CO2)中过夜以用RBEC动态地播种微通道。然后，生物反应器被拆卸并且支架被福尔马林固定、处理、固体石蜡包埋并且用切片机切片。切片被H&E染色。苏木精将细胞核染成紫色并且曙红将细胞质染成粉红色。
生物反应器 版本1-共培养生存能力
胶原/RVC支架如以前被制备，但DMEM/10％FBS介质包含7.5×106细胞/ml的人乳腺癌上皮细胞(MDA-MB-231)和2.5×106细胞/ml的人乳腺成纤维细胞(F080)的细胞悬液。此外，凝胶在12孔板的生物反应器而不是灌注式生物反应器中被胶凝。在保温箱中45分钟以允许胶凝之后，1ml的介质被放置在支架的顶部上。支架被留在保温箱中持续3天并且然后其被切片并且被H&E染色。
生物反应器 版本2-微通道内皮化
RVC/胶原/Matrigel支架被放置在48-孔板中。为了用内皮细胞静止地播种已制造的微通道，富含RBEC的介质(16.1×106细胞/支架)被添加到容纳支架的48-孔板中。这些支架被放置在保温箱(37℃，5％CO2)中持续3天以允许微通道的静止的播种。
结果&讨论
H&E染色确证，RVC/胶原和RVC/胶原/Matrigel中的微通道在胶凝之前引入不锈钢棒之后被形成，并且胶原和胶原/Matrigel两者渗入RVC泡沫孔中。此外，H&E染色显示在RVC/胶原微通道形成内衬的内皮细胞的单层。最后，H&E染色已显示在胶原支架中的细胞(例如MDA-MB-231和F080)的共培养物的存活。
图14A-14D显示本实施例的血管化的支架建造物的图像。具有显示渗透穿过4mm厚RVC/胶原支架的两个400微米直径的微通道的45ppi胶原/RVC支架(1.5mg/ml胶原/RVC)在图14A中被显示出。图14B显示具有穿过支架的三个400微米直径的微通道的胶原/Matrigel/RVC支架(1.9mg/ml胶原/Matrigel/RVC，45ppi)的图像。图14C是穿过胶原/RVC/Matrigel支架材料的切片的图像，所述胶原/RVC/Matrigel支架材料具有作为敞开的圆形区域可见的微通道以及作为黑色部分可见的RVC支架材料的部分。图14D是穿过显示单一的微通道的横截面的凝胶材料的切片(20um)的图像，所述微通道具有在微通道的内表面形成内衬的内皮细胞。
这些结果证明在流的条件下3D体积中制造的微通道的成功的内皮化。穿过这些3D建造物的流体容积流率以及在这些通道的壁处的流体切应力，特别是循环切应力还没有被计算出。由于内皮，在血管壁形成内衬的内皮细胞的单层，暴露于脉动的血流的振荡流体切应力和周围的循环应变维持血管的生理状态，模拟或者接近生物反应器中的这些应力有助于产生生理生物材料/细胞支架[5]。此外，氧气、营养素、废物以及候选治疗剂的内皮运输部分地取决于在内皮处被赋予的流体切应力。因此，这些微通道不仅提供用于流体介质、细胞培养、生长因子以及类似的导管，而且还希望其可以开发额外的毛细管功能比如从液体介质提取氧气。
结论
预血管化的工程化的组织具有变革用于疾病组织或者受创伤的组织的组织替代的潜能[6]。除组织替代之外，预血管化的3D建造物还具有模拟多种疾病状态用于药物开发的潜能。
此实施例证明通过预血管化这些支架，超过氧气的扩散距离的RVC/胶原和RVC/胶原/Matrigel的3D体积的成功的产生。在胶原的情况下，微通道被产生并且成功地在建造物内内皮化，并且细胞的共培养物被生长在血管化的建造物内。这些结果为被灌注的高度界定的3D组织体积创造条件，并且可以被用于利用原代人类细胞系或者从乳腺癌患者提取的细胞评价抗癌治疗。未来的工作将包括RVC/胶原/Matrigel支架微通道的完全的内皮化、RVC/胶原/Matrigel支架中MDA-MB-231和F080的生长、以及微通道的壁切应力的流体力学参数的定量。
关于包括以上实施例以及权利要求的本文的讨论，应注意比率、浓度、量以及其它的数值数据可以以范围格式在本文表示。要理解，为了方便和简洁起见使用此种范围格式，并且因此应以灵活的方式被解释为不仅包括作为范围的限值明确列举的数值还包括包含在该范围内的所有单个的数值或者子区间，如同每个数值和子区间被明确列举。举例说明，“约0.1％至约5％”的浓度范围应被解释为不仅包括约0.1wt％至约5wt％的明确列举的浓度，还包括在所列举的范围内的单个的浓度(例如1％、2％、3％和4％)以及子区间(例如0.5％、1.1％、2.2％、3.3％以及4.4％)。术语“约”可以包括被修饰的数值的±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％、±10％或者更多。此外，短语“约‘x’至‘y’”包括“约‘x’至约‘y’”。
应强调的是，以上所述的本公开内容的实施方案仅仅是实施方式的可能的实施例，并且仅为了本公开内容的原理的清楚的理解被阐述。很多变型以及修改可以对本公开内容的以上所述的实施方案进行，而大体不背离本公开内容的精神和原理。所有此类修改以及变型意图于此被包括在本公开内容的范围内并且通过以下权利要求被保护。
参考文献
所有的参考文献以相关部分被并入本文。
1.Birgersdotter A,Sandberg R,Ernberg I:Gene expression perturbation invitro--a growing case for three-dimensional(3D)culture systems,SeminCancer Biol 2005,15:405-412.
2.“FDA Issues Advice to Make Earliest Stages of Clinical Drug DevelopmentMore Efficient.”FDA.Jan 2006.
<http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/2006/ucm108576.htm>
3.“U.S.Breast Cancer Statistics.”BreastCancer.org.Oct 2012.<http://www.breastcancer.org/symptoms/understand_bc/statistics>.
4.Kim SS,Utsunomiya H,Koski JA,Wu BM,Cima MJ,Sohn J,Mukai K,Griffith LG,Vacanti JP:Survival and function of hepatocytes on a novelthree-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsicnetwork of channels,Ann Surg 1998,228:8-13.
5.Davies,P.F.1995.“Flow Mediated Endothelial Mechano-transduction.”Physiological Reviews.75:pp.519-51.
6.Wu,X.等人.2004.“Tissue Engineered Microvessels on 3D BiodegradableScaffolds Using Human Endothelial Progenitor Cells.”Am J Physiol HeartCirc Physiol.287:pp.H480-7.
7.Pec,Martina等人.2010.“Reticulated Vitreous Carbon:A Useful MaterialFor Cell Adhesion and Tissue Invasion.”European Cells and Materials.20:282-94.
8.Pekala,R.W.等人,“Resorcinol-Formaldehyde Aerogels and TheirCarbonized Derivatives.”1989.American Chemical Society Division ofPolymer Preprints.30:221-223.
9.Pekala,R.W..等人,“Carbon Aerogels for Electrochemical Applications.”1998.Journal of Non-Crystalline Solids 225:74-80.

Claims (47)

1.一种三维的(3D)工程化的血管化的组织建造物，所述三维的(3D)工程化的血管化的组织建造物包括：
3D生物相容的支架材料；
在所述支架材料内的活细胞的3D网络；
多个微通道，所述多个微通道延伸贯穿所述建造物，使得所述通道的实质部分具有在所述建造物的一个表面处的入口以及在所述建造物的相对的表面处的出口，其中所述通道形成内腔以允许液体穿过所述建造物；以及
至少部分地在所述内腔形成内衬的多个内皮细胞。
2.根据权利要求1所述的3D血管化的组织建造物，其中所述3D生物相容的支架材料包括固体的多孔材料、凝胶基质材料或者其组合。
3.根据权利要求2所述的3D血管化的组织建造物，其中所述生物相容的支架材料包括凝胶基质材料并且还包括增加所述凝胶基质材料的结构稳定性的交联剂、胶凝剂或者其组合。
4.根据权利要求1所述的3D血管化的组织建造物，其中所述凝胶基质材料选自由以下组成的凝胶基质材料的组：合成的水凝胶、自然衍生的水凝胶及其组合。
5.根据权利要求1所述的3D血管化的组织建造物，其中所述合成的水凝胶选自由以下组成的组：藻酸盐、生物相容的聚合物水凝胶、生物相容的共聚物水凝胶、聚乙二醇(PEG)基水凝胶及其组合。
6.根据权利要求1所述的3D血管化的组织建造物，其中所述自然衍生的水凝胶选自由以下组成的组：胶原、纤维蛋白、弹性蛋白、角蛋白、MatrigelTM、细菌纤维素、HuBiogelTM及其组合。
7.根据权利要求1所述的3D血管化的组织建造物，其中所述固体的多孔材料选自由以下组成的组：气凝胶、颗粒稳定的生物相容的泡沫、网状玻璃碳(RVC)、天然静电纺聚合物、合成的静电纺聚合物及其组合。
8.根据权利要求1所述的3D血管化的组织建造物，其中所述生物相容的支架材料包括网状玻璃碳以及选自由以下组成的组的凝胶基质材料：MatrigelTM、细菌纤维素、胶原、纤维蛋白、弹性蛋白、角蛋白、HuBiogel及其组合。
9.根据权利要求8所述的3D血管化的组织建造物，其中所述生物相容的支架材料包括RVC、胶原与选自MatrigelTM和HuBiogel的第二凝胶基质材料的组合。
10.根据权利要求1所述的3D血管化的组织建造物，其中所述组织建造物被配置为被放置在孔板的或者扁平的平行板的流动室中。
11.根据权利要求1所述的3D血管化的组织建造物，其中所述组织建造物被配置用于在共焦成像设备、荧光成像设备、相差成像设备、或者可交换地在这些设备的任何一个上放置。
12.根据权利要求1所述的3D血管化的组织建造物，其中所述微通道具有约200微米至约450微米的直径。
13.根据权利要求1所述的3D血管化的组织建造物，其中所述微通道具有约250微米或者更少的直径。
14.根据权利要求1所述的3D血管化的组织建造物，其中所述细胞包括哺乳动物细胞，其中所述细胞是病理性的或者健康的哺乳动物细胞或者其组合。
15.根据权利要求1所述的3D血管化的组织建造物，其中所述细胞包括癌细胞或者癌细胞与非癌细胞的组合。
16.根据权利要求15所述的3D血管化的组织建造物，其中所述非癌细胞包括成纤维细胞、上皮细胞、人组织细胞或者其组合。
17.根据权利要求15所述的3D血管化的组织建造物，其中所述细胞包括乳腺癌细胞，并且所述细胞的3D网络形成乳腺癌肿瘤。
18.根据权利要求15所述的3D血管化的组织建造物，其中所述细胞包括乳腺癌细胞以及非癌乳房组织细胞，并且其中所述细胞的3D网络形成乳腺癌肿瘤。
19.根据权利要求18所述的3D血管化的组织建造物，其中所述乳腺癌细胞包括人乳腺癌上皮细胞并且其中所述非癌乳房组织细胞包括人乳房成纤维细胞。
20.一种用于支撑体外3D组织培养物的三维的(3D)血管化的生物相容的支架，所述三维的(3D)血管化的生物相容的支架包括：
3D生物相容的支架材料，所述3D生物相容的支架材料包括固体的多孔材料、凝胶基质材料或者其组合，其中所述固体的多孔材料选自由以下组成的组：气凝胶、网状玻璃碳、颗粒稳定的泡沫及其组合，并且其中所述凝胶基质材料选自由以下组成的凝胶基质材料的组：合成的水凝胶、自然衍生的水凝胶及其组合；以及
多个通道，所述多个通道延伸贯穿所述支架，使得所述通道的实质部分具有在所述支架的一个表面处的入口以及在所述支架的相对的表面处的出口，其中所述通道形成内腔以允许液体通过所述支架。
21.根据权利要求20所述的3D血管化的生物相容的支架，还包括至少部分地在所述内腔形成内衬的多个内皮细胞。
22.根据权利要求20所述的3D血管化的生物相容的支架，其中所述凝胶基质材料包括选自由以下组成的组的一种或者更多种水凝胶：由以下组成的合成的以及自然衍生的水凝胶：胶原、纤维蛋白、MatrigelTM、细菌纤维素、HuBiogelTM、藻酸盐、聚合物基水凝胶、共聚物基水凝胶、聚乙二醇(PEG)基水凝胶、弹性蛋白以及角蛋白。
23.根据权利要求20所述的3D血管化的生物相容的支架，其中所述固体的多孔材料选自由以下组成的组：气凝胶、颗粒稳定的生物相容的泡沫、网状玻璃碳(RVC)、天然静电纺聚合物、合成的静电纺聚合物及其组合。
24.根据权利要求20所述的3D血管化的生物相容的支架，其中所述微通道具有约200微米至约450微米的直径。
25.一种三维的(3D)体外血管化的癌症模型，所述三维的(3D)体外血管化的癌症模型包括3D组织建造物，所述3D组织建造物包括以下：
生物相容的支架材料；
在所述支架材料内的活细胞的3D网络，其中所述细胞的网络包括所述支架材料内的癌细胞或者癌细胞与非癌细胞的组合；
多个通道，所述多个通道延伸贯穿所述建造物，使得所述通道的实质部分具有在所述建造物的一个表面处的入口以及在所述建造物的相对的表面处的出口，其中所述通道形成内腔以允许流体介质通过所述建造物；以及
至少部分地在所述内腔形成内衬的多个内皮细胞。
26.根据权利要求25所述的3D血管化的癌症模型，其中所述模型是人乳腺癌模型并且其中所述活细胞的网络包括人乳腺癌肿瘤细胞以及非癌的人乳房成纤维细胞。
27.根据权利要求26所述的3D血管化的癌症模型，其中所述乳腺癌肿瘤细胞形成球状体。
28.一种灌注式生物反应器，所述灌注式生物反应器包括：
三维的(3D)工程化的组织建造物，所述三维的(3D)工程化的组织建造物包括：
3D生物相容的支架材料；
在所述支架材料内的活细胞的3D网络；
多个通道，所述多个通道延伸贯穿所述建造物，使得所述通道的实质部分具有在所述建造物的一个表面处的入口以及在所述建造物的相对的表面处的出口，其中所述通道形成内腔以允许流体介质通过所述建造物；以及
至少部分地在所述内腔形成内衬的多个内皮细胞；
组织室，所述组织室被配置为容纳所述组织建造物，使得所述组织建造物形成穿过所述室的介质的流上游和下游之间的屏障，导引介质的流穿过所述组织建造物的所述通道，其中所述室具有所述组织建造物的部位上游的至少一个输入口以及所述组织建造物的部位下游的至少一个输出口；以及
控制穿过所述组织室的介质的流的至少一个泵。
29.根据权利要求28所述的灌注式生物反应器，其中所述至少一个泵选自由以下组成的组：微泵、注射泵、蠕动泵及其组合。
30.一种体外制造三维的(3D)血管化的组织建造物的方法，所述方法包括：
提供3D血管化的生物相容的支架，其中所述支架包括：3D生物相容的支架材料以及多个通道，所述多个通道延伸贯穿所述支架，使得所述通道的实质部分具有在所述支架的一个表面处的入口以及在所述支架的相对的表面处的出口，其中所述通道形成内腔以允许流体通过所述支架；
用内皮细胞播种所述内腔，使得内皮细胞在所述内腔的至少一部分形成内衬；
用至少一种组织类型的细胞播种所述支架；
用细胞培养基灌注所述支架；以及
温育已经播种了的支架，
其中所述至少一种组织类型的细胞的3D网络在所述支架内生长。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述3D生物相容的支架材料包括固体的多孔材料、凝胶基质材料或者其组合，其中所述固体的多孔材料选自由以下组成的组：气凝胶、网状玻璃碳以及颗粒稳定的泡沫，并且其中所述凝胶基质材料选自由以下组成的组：合成的水凝胶、自然衍生的水凝胶及其组合。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述凝胶基质材料包括一种或者更多种水凝胶，所述一种或者更多种水凝胶选自由以下组成的合成的以及自然衍生的水凝胶的组：胶原、纤维蛋白、MatrigelTM、细菌纤维素、HuBiogelTM、藻酸盐、聚合物基水凝胶、共聚物基水凝胶、聚乙二醇(PEG)基水凝胶、弹性蛋白以及角蛋白。
33.根据权利要求30所述的方法，其中至少一种类型的细胞是癌细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述细胞包括人乳腺癌肿瘤细胞或者人乳腺癌肿瘤细胞与人乳房成纤维细胞的组合。
35.一种制造三维的(3D)血管化的支架材料的方法，所述方法包括：
提供3D生物相容的支架材料；以及
使用微通道建造物在所述支架材料中形成多个微通道，其中所述通道延伸贯穿所述支架，使得所述通道的实质部分具有在所述支架的一个表面处的入口以及在所述支架的相对的表面处的出口，其中所述通道形成内腔以允许液体通过所述支架。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述微通道建造物包括用于形成所述通道的多个棒或者线。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述多个棒或者线具有约200微米至约400微米的单独的直径。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述3D生物相容的支架材料包括固体的多孔材料、凝胶基质材料或者其组合，其中所述固体的多孔材料选自由以下组成的组：气凝胶、网状玻璃碳以及颗粒稳定的泡沫，并且其中所述凝胶基质材料选自由以下组成的组：合成的水凝胶、自然衍生的水凝胶及其组合。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述凝胶基质材料包括一种或更多种水凝胶，所述一种或者更多种水凝胶选自合成的和自然衍生的水凝胶的组，所述合成的和自然衍生的水凝胶选自由以下组成的组：胶原、纤维蛋白、MatrigelTM、细菌纤维素、HuBiogelTM、藻酸盐、聚合物基水凝胶、共聚物基水凝胶、聚乙二醇(PEG)基水凝胶、弹性蛋白以及角蛋白。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述生物相容的支架材料包括凝胶基质材料，并且其中所述微通道建造物在所述凝胶基质材料被固化前被插入到所述支架材料中并且在所述凝胶基质材料被固化后从所述支架材料移除。
41.一种筛选测试化合物的方法，所述方法包括：
提供三维的(3D)工程化的血管化的组织建造物，所述三维的(3D)工程化的血管化的组织建造物包括：3D生物相容的支架材料；在所述支架材料内的感兴趣的组织的活细胞的3D网络；多个微通道，所述多个微通道延伸贯穿所述建造物，使得所述通道的实质部分具有在所述建造物的一个表面处的入口以及在所述建造物的相对的表面处的出口，其中所述通道形成内腔以允许液体通过所述建造物；以及至少部分地在所述内腔形成内衬的多个内皮细胞；
使所述3D组织建造物暴露于所述测试化合物；以及
监测在暴露于所述测试化合物之后所述组织建造物中的任何变化，其中所述变化选自由以下组成的组：组织学变化、生物化学变化以及生理变化以及其组合。
42.根据权利要求41所述的方法，其中在所述活细胞的3D网络内的所述细胞的至少一部分包括患病的细胞，并且其中所述测试化合物包括用于治疗所述疾病的候选药物。
43.一种筛选潜在的癌症治疗化合物的方法，所述方法包括：
提供三维的(3D)工程化的血管化的癌症组织建造物，所述三维的(3D)工程化的血管化的癌症组织建造物包括：3D生物相容的支架材料；在所述支架材料内的活细胞的3D网络，所述活细胞的3D网络包括癌细胞或者癌细胞与非癌细胞的组合；多个微通道，所述多个微通道延伸贯穿所述建造物，使得所述通道的实质部分具有在所述建造物的一个表面处的入口以及在所述建造物的相对的表面处的出口，其中所述通道形成内腔以允许液体通过所述建造物；以及至少部分地在所述内腔形成内衬的多个内皮细胞；
使所述3D癌症组织建造物暴露于测试化合物；以及
检测在暴露于所述测试化合物后所述癌细胞网络的生长或者生存能力的变化，其中所述癌细胞的生长或者生存能力的减少表明所述测试化合物是潜在的乳腺癌治疗化合物。
44.根据权利要求43所述的方法，还包括检测所述癌症治疗化合物的毒性，所述癌症治疗化合物的毒性如通过细胞网络的组织学变化、生物化学变化、生理学变化或者其组合来衡量的。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述细胞的网络包括乳腺癌细胞和非癌乳房组织细胞。
47.一种生物反应器网络，所述生物反应器网络包括相互连接的生物反应器的阵列以及控制穿过所述生物反应器的介质的流的至少一个泵，其中所述阵列中的所述生物反应器是互相流体连通的，并且其中每个生物反应器包括：
三维的(3D)工程化的组织建造物，所述三维的(3D)工程化的组织建造物包括：
3D生物相容的支架材料，
在所述支架材料内的活细胞的3D网络，
多个通道，所述多个通道延伸贯穿所述建造物，使得所述通道的实质部分具有在所述建造物的一个表面处的入口以及在所述建造物的相对的表面处的出口，其中所述通道形成内腔以允许流体介质通过所述建造物，以及
至少部分地在所述内腔形成内衬的多个内皮细胞；以及
组织室，所述组织室被配置为容纳所述组织建造物，使得所述组织建造物形成穿过所述室的介质的流上游和下游之间的屏障，导引介质的流穿过所述组织建造物的所述通道，其中所述室具有所述组织建造物的部位上游的至少一个输入口以及所述组织建造物的部位下游的至少一个输出口；其中在所述阵列中的至少一个生物反应器包含来自与在所述阵列中的至少一个其他生物反应器中的细胞不同的组织类型的细胞。
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WO (1) WO2013134383A1 (zh)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105435308A (zh) * 2015-12-23 2016-03-30 天津幂方科技有限公司 一种乳房植入体三维结构及其快速成形方法
CN105771004A (zh) * 2016-03-09 2016-07-20 东南大学 一种水凝胶、其制备方法及其应用
CN108398381A (zh) * 2015-04-21 2018-08-14 上海交通大学医学院附属第九人民医院 无创性动态监测材料降解速率与组织再生匹配程度的方法
CN108434525A (zh) * 2018-03-06 2018-08-24 西安交通大学 一种带血管网的人工肌组织及其制备方法
CN109312290A (zh) * 2016-05-25 2019-02-05 卢万天主教大学 灌注式生物反应器和处理血管化复合组织的方法
CN109731143A (zh) * 2019-01-10 2019-05-10 上海大学 一种生物结构体预血管化的方法
CN110198664A (zh) * 2016-11-10 2019-09-03 奥本大学 用于评估血管的方法和系统
CN110213964A (zh) * 2016-11-22 2019-09-06 纽泰克温图斯公司 利用封闭微型细胞培养系统的个体化细胞生物制备
CN110607271A (zh) * 2018-06-14 2019-12-24 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于微加工技术的体外血管化3d组织的制备方法
CN111286489A (zh) * 2020-02-21 2020-06-16 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 肿瘤血管生成模型及其制备方法和应用
CN112190760A (zh) * 2020-10-17 2021-01-08 西安交通大学 一种适用于细胞三维培养的水凝胶及其制备方法
CN115702951A (zh) * 2021-08-10 2023-02-17 上海交通大学医学院附属第九人民医院 基于多孔水凝胶材料构建的血管化组织工程骨及其应用

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005081970A2 (en) 2004-02-24 2005-09-09 The Curators Of The University Of Missouri Self-assembling cell aggregates and methods of making engineered tissue using the same
WO2010008905A2 (en) 2008-06-24 2010-01-21 The Curators Of The University Of Missouri Self-assembling multicellular bodies and methods of producing a three-dimensional biological structure using the same
WO2012054195A2 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Organovo, Inc. Devices, systems, and methods for the fabrication of tissue
WO2013025819A2 (en) * 2011-08-16 2013-02-21 The University Of Kansas Fibrous tracheal patch
US9499779B2 (en) 2012-04-20 2016-11-22 Organovo, Inc. Devices, systems, and methods for the fabrication of tissue utilizing UV cross-linking
WO2014110300A1 (en) * 2013-01-09 2014-07-17 Harvard Apparatus Regenerative Technology Synthetic scaffolds
US9442105B2 (en) 2013-03-15 2016-09-13 Organovo, Inc. Engineered liver tissues, arrays thereof, and methods of making the same
EP3028042B1 (en) 2013-07-31 2021-06-30 Organovo, Inc. Automated devices, systems, and methods for the fabrication of tissue
US10159765B2 (en) * 2013-10-25 2018-12-25 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Tissue engineered devices and methods for making same
CN103691005B (zh) * 2013-12-24 2015-10-28 华东交通大学 一种微-纳纤维组织工程支架及其制备方法
KR20170013865A (ko) * 2014-04-04 2017-02-07 오가노보, 인크. 조작된 3차원 유방 조직, 지방조직, 및 종양 질병 모델
US10919183B2 (en) * 2014-06-26 2021-02-16 Carnegie Mellon University, A Pennsylvania Non-Profit Corporation Method for engineering three-dimensional synthetic vascular networks through mechanical micromachining and mutable polymer micromolding
KR101747378B1 (ko) 2014-07-04 2017-06-15 서울대학교산학협력단 단방향성 신경축삭의 3차원 배양을 위한 미세유체장치
EP2995278A1 (en) * 2014-09-09 2016-03-16 Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München Medical/surgical implant
WO2016057571A1 (en) 2014-10-06 2016-04-14 Organovo, Inc. Engineered renal tissues, arrays thereof, and methods of making the same
CA2966415C (en) * 2014-10-31 2023-03-28 University Of Iowa Research Foundation Fluid handling systems for application of fluid shear stress to a fluid sample
US11529436B2 (en) 2014-11-05 2022-12-20 Organovo, Inc. Engineered three-dimensional skin tissues, arrays thereof, and methods of making the same
WO2016130928A1 (en) 2015-02-12 2016-08-18 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Aminoglycoside hydrogel microbeads and macroporous gels with chemical crosslink, method of preparation and use thereof
CA2983821A1 (en) * 2015-04-24 2017-01-05 President And Fellows Of Harvard College Devices for simulating a function of a tissue and methods of use and manufacturing thereof
US10839509B2 (en) 2015-07-10 2020-11-17 3Scan Inc. Spatial multiplexing of histological stains
KR102398531B1 (ko) 2015-08-26 2022-05-17 에뮬레이트, 인크. 관류 매니폴드 조립체
EP3138904A1 (en) * 2015-09-02 2017-03-08 Bertholdt, Günter Device and method for tissue culture comprising a hermetically sealed blood circulation
JP7007267B2 (ja) 2015-11-09 2022-01-24 オルガノボ インコーポレイテッド 組織製造のための改善された方法
WO2017161100A1 (en) * 2016-03-16 2017-09-21 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State Iniversity Engineered adhesive substrates for high-throughput cell isolation and separation
CN109072276B (zh) * 2016-04-19 2022-11-01 凸版印刷株式会社 抗癌剂的评价方法
WO2017183677A1 (ja) * 2016-04-19 2017-10-26 凸版印刷株式会社 ガン化の可能性評価方法及びキット
PL238379B1 (pl) * 2016-06-10 2021-08-16 Univ Jagiellonski Urządzenie do perfuzyjnych hodowli komórkowych
US11051509B2 (en) 2016-11-22 2021-07-06 William Lafayette Mondy Method and apparatus for keeping artificially created tissues alive
WO2018227101A1 (en) * 2017-06-09 2018-12-13 President And Fellows Of Harvard College Methods of enhancing development of renal organoids and methods of using the same
WO2019113026A1 (en) * 2017-12-04 2019-06-13 John Slater Crosslinked hydrogel compositions for regulating states of encapsulated cancer cells
JP2021506319A (ja) * 2017-12-22 2021-02-22 アンスティテュ・パストゥール ヒドロゲル型の生体機能チップマイクロ流体デバイス
EP3574103A4 (en) * 2018-01-12 2020-09-23 Cellmig Biolabs Inc. METHOD FOR GENERATING CYTOCAPSULES AND CYTOCAPSULA TUBE
RU192234U1 (ru) * 2018-06-29 2019-09-09 Общество с ограниченной ответственностью "Микрофлюидные технологии" Проточный чип для моделирования участка сосудистого русла для испытания имплантатов и оборудования для сердечно-сосудистой хирургии
WO2020197323A1 (ko) * 2019-03-28 2020-10-01 연세대학교 산학협력단 마이크로채널 네트워크가 형성된 하이드로젤 구조체
US11760966B2 (en) 2019-06-14 2023-09-19 University Of Connecticut Multigel tumor-on-a-chip system
WO2023060271A1 (en) * 2021-10-07 2023-04-13 The Administrators Of The Tulane Educational Fund System, disease model and methods of using the same
WO2023096371A1 (ko) * 2021-11-24 2023-06-01 연세대학교 산학협력단 종양 조직 배양용 종양 조직 모델
WO2024120482A1 (en) * 2022-12-07 2024-06-13 Nutrir Limited Methods, devices and systems of producing cultured tissues

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049839A1 (en) * 2001-08-01 2003-03-13 The University Of Texas System Transparent multi-channel cell scaffold that creates a cellular and/or molecular gradient
WO2009042639A2 (en) * 2007-09-24 2009-04-02 Nortis, Inc. Method for creating perfusable microvessel systems
WO2012016711A1 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 Technische Universität Berlin Circulation system

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999047922A2 (en) * 1998-03-18 1999-09-23 Massachusetts Institute Of Technology Vascularized perfused microtissue/micro-organ arrays
WO2005046457A2 (en) * 2003-11-05 2005-05-26 Texas Scottish Rite Hospital For Children A biomimetic biosynthetic nerve implant
US8367639B2 (en) * 2005-03-31 2013-02-05 University Of Delaware Hydrogels with covalent and noncovalent crosslinks
US8445280B2 (en) * 2006-03-24 2013-05-21 Nortis, Inc. Method for creating perfusable microvessel systems
TW200817019A (en) 2006-07-10 2008-04-16 Univ Columbia De novo formation and regeneration of vascularized tissue from tissue progenitor cells and vascular progenitor cells
EP2244815A1 (en) * 2007-12-11 2010-11-03 Aquaporin A/S Scaffold for composite biomimetic membrane
WO2010011281A2 (en) * 2008-07-22 2010-01-28 The Research Foundation Of State University Of New York Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cancer
WO2010033820A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Bioreactors, systems, and methods for vascularizing tissue constructs

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049839A1 (en) * 2001-08-01 2003-03-13 The University Of Texas System Transparent multi-channel cell scaffold that creates a cellular and/or molecular gradient
WO2009042639A2 (en) * 2007-09-24 2009-04-02 Nortis, Inc. Method for creating perfusable microvessel systems
WO2012016711A1 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 Technische Universität Berlin Circulation system

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108398381A (zh) * 2015-04-21 2018-08-14 上海交通大学医学院附属第九人民医院 无创性动态监测材料降解速率与组织再生匹配程度的方法
CN105435308A (zh) * 2015-12-23 2016-03-30 天津幂方科技有限公司 一种乳房植入体三维结构及其快速成形方法
CN105435308B (zh) * 2015-12-23 2018-10-26 天津幂方科技有限公司 一种乳房植入体三维结构及其快速成形方法
CN105771004B (zh) * 2016-03-09 2019-07-12 东南大学 一种水凝胶、其制备方法及其应用
CN105771004A (zh) * 2016-03-09 2016-07-20 东南大学 一种水凝胶、其制备方法及其应用
CN109312290A (zh) * 2016-05-25 2019-02-05 卢万天主教大学 灌注式生物反应器和处理血管化复合组织的方法
CN110198664A (zh) * 2016-11-10 2019-09-03 奥本大学 用于评估血管的方法和系统
CN110198664B (zh) * 2016-11-10 2023-04-18 奥本大学 用于评估血管的方法和系统
CN110213964A (zh) * 2016-11-22 2019-09-06 纽泰克温图斯公司 利用封闭微型细胞培养系统的个体化细胞生物制备
CN108434525A (zh) * 2018-03-06 2018-08-24 西安交通大学 一种带血管网的人工肌组织及其制备方法
CN110607271A (zh) * 2018-06-14 2019-12-24 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于微加工技术的体外血管化3d组织的制备方法
CN110607271B (zh) * 2018-06-14 2023-01-20 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于微加工技术的体外血管化3d组织的制备方法
CN109731143A (zh) * 2019-01-10 2019-05-10 上海大学 一种生物结构体预血管化的方法
CN111286489A (zh) * 2020-02-21 2020-06-16 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 肿瘤血管生成模型及其制备方法和应用
CN112190760A (zh) * 2020-10-17 2021-01-08 西安交通大学 一种适用于细胞三维培养的水凝胶及其制备方法
CN112190760B (zh) * 2020-10-17 2022-06-21 西安交通大学 一种适用于细胞三维培养的水凝胶制备方法
CN115702951A (zh) * 2021-08-10 2023-02-17 上海交通大学医学院附属第九人民医院 基于多孔水凝胶材料构建的血管化组织工程骨及其应用
CN115702951B (zh) * 2021-08-10 2024-05-31 上海交通大学医学院附属第九人民医院 基于多孔水凝胶材料构建的血管化组织工程骨及其应用

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