CN109731143A - 一种生物结构体预血管化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物结构体预血管化的方法，具体包括：制备水凝胶I薄膜、打印实性通道、制备水凝胶III、制备夹芯体、制备支架等过程。本发明采用具有生物相容性和生物可降解性能的水凝胶作为支架的主体材料，利用离子间的交联成型特性实现支架的成型以及支架内部微通道的开放，工艺简单，制备条件温和，能够形成复杂类血管网络通道，所用材料具有很好的生物相容性，能够很好的应用于组织工程领域。

Description

一种生物结构体预血管化的方法

技术领域

本发明涉及生物制造及组织工程技术领域，更具体地说是涉及一种生物结构体预血管化的方法。

背景技术

目前通过生物制造方法在体外构建人工生物结构体，在病变组织器官修复等领域已经取得了一定的突破并且具有广阔的前景，但是生物结构体的血管化问题一直是影响该技术走向临床的瓶颈。为此，在人工构建生物结构体的过程中，在结构体内部预制类血管网络的微通道结构成为近期研究的热点。

一些学者借助光刻、微型印刷、低温沉积等方法，制备的三维结构取得了一些成果，但是这些方法的制备工艺较为复杂，在材料的选择以及制备过程的温和性方面存在一定的局限。另外一些研究者，通过增减材复合的方法，制备具有分叉等复杂结构的微通道网络结构，但是此类方法在去除复杂网络结构时，还是存在困难。

因此，如何让提供一种能同时制造复杂网络结构且工艺简洁的生物结构体预血管化的制造方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种生物结构体预血管化的方法，采用具有生物相容性和生物可降解性能的水凝胶作为支架的主体材料，利用离子间的交联成型特性实现支架的成型以及支架内部微通道的开放。本发明提出的组织工程结构预血管化方法，工艺简单，制备条件温和，能够形成复杂类血管网络通道，所用材料具有很好的生物相容性，能够很好的应用于组织工程领域。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种生物结构体预血管化的方法，利用3D打印技术，将打印模型导入打印机中，包括以下步骤：

a.制备水凝胶I薄膜：制备水凝胶I液体，并将所述水凝胶I液体导入微量泵，根据需求厚度，将所述水凝胶I液体喷入容器底部，使所述水凝胶I液体在2-6℃下冷却，形成水凝胶I薄膜；

b.打印实性通道：制备水凝胶II液体并冷却成水凝胶II，水凝胶II的浓度为3％-8％，并采用打印技术在所述薄膜上对所述水凝胶II进行打印，形成一定形状的实性通道；此过程中，可以将水凝胶II打印成任意形状。

c.制备水凝胶III：将浓度为2％的溶液I喷入所述容器中，使得所述溶液I与所述网络通道交联，形成水凝胶III；水凝胶III为固体纤维水凝胶；

d.制备夹芯体：再次向所述容器中喷洒所述水凝胶I液体，直到所述水凝胶I液体完全覆盖所述水凝胶III，于2-6℃下，静置1-2h，形成水凝胶I-水凝胶III-水凝胶I的夹芯体；

e.制备支架：将所述夹芯体浸泡在溶液II中，将水凝胶III还原成水凝胶II液体，并将水凝胶II液体排出，形成内部具备中空管道的支架；溶液II可以将固态纤维水凝胶还原成液态的水凝胶II，最后借助外力使得水凝胶II流出。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明利用离子间的化学交联以及离子螯和特性，实现支架的成型和支架内部微通道的形成。

可选的，所述水凝胶I为明胶和mTG酶的混合溶液，按照质量比明胶：mTG酶＝10：1。

可选的，所述水凝胶II包括海藻酸钠的水溶液。

可选的，所述溶液I包括氯化钙的水溶液。

海藻酸钠和氯化钙交联成海藻酸钙，在制备夹芯体时，首先将海藻酸钠溶于去离子水，选择气压作为供料单元，施用一次性注射枕头为出料口，在水凝胶I薄膜上进行打印后，用氯化钙溶液以喷雾的形式交联海藻酸钠，形成水凝胶III海藻酸钙。

可选的，所述溶液II包括柠檬酸钠的水溶液，浓度为4％。

柠檬酸钠可以螯合钙离子，将上述制备好的夹芯体，首尾去除，露出海藻酸钙，然后浸泡在柠檬酸钠溶液中钙离子被螯合，还原成液态的海藻酸钠，流出通道。

可选的，所述水凝胶I液体的制备方法包括：

1)将所述明胶溶于60℃去离子水中搅拌溶解，得到明胶溶液；

2)待明胶溶液降温至37℃时，按照质量比加入mTG酶溶液，得到水凝胶I液体。

可选的，所述预血管化的方法还包括：f.在所述支架制备完成后，对所述支架进行消毒，在所述中空管道中接种内皮细胞，实现内皮化。

可选的，所述容器包括但不限于培养皿。

综上所述，本发明与现有技术相比，优越性在于：利用材料自身的特性实现上下两层明胶的贴合，根据制备工艺，底层为明胶薄膜，顶层为明胶溶液，试验表明溶液与薄膜可以实现完美融合形成一体结构。而传统方法则是分别制造上下两层，随后使用胶水等实现两层的贴合。在结构的完整性以及一体成型的制备工艺上有优势。同时使用该方法不仅可以制备单层结构，通过多层的堆叠可以实现多层通道的构建，并且上下两层薄膜的厚度可控，有利于通道间物质的交换。借助3D打印技术可以打印复杂结构的水凝胶II牺牲层。直接通过挤出打印牺牲层的方法也要比通过FDM技术打印模具的效率要高，打印同样的Y型结构，打印只要10s，而FDM打印需要5分钟。制备出的支架的杨氏模量平均为4.6Mpa。支架的细胞试验结果表明，支架有利于细胞的粘附和增殖。

达到的技术效果为：

1)本发明提出的一种生物结构体的预血管化方法，制备工艺简单，并且能够形成复杂的类血管网络通道。

2)本发明提出的制备方法，制备条件温和，所用材料均为具有良好生物相容性和生物可降解性的材料，具备直接载细胞进行打印的能力。

3)本发明的制备过程自动化程度高，能实现结构从设计到完成一体成型，制备效率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的流程示意图；

图2附图为本发明制备水凝胶I的结构示意图；

图3附图为本发明打印水凝胶II的结构示意图；

图4附图为本发明夹芯体的结构示意图；

图5附图为本发明支架的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：本发明的工作原理为：

参见附图1，本发明实施例公开了一种生物结构体的预血管化的方法，首先使用喷头1供料，在接收容器中里形成一层能精确控制厚度的明胶和mTG酶的混合薄膜；然后使用喷头2供料，在混合薄膜上打印海藻酸钠凝胶，采用3D打印技术可以任意打印海藻酸钠凝胶的形状，待海藻酸钠凝胶打印完毕，使用喷头3喷雾供料，喷头3中的材料氯化钙溶液能与海藻酸钠凝胶发生交联反应形成海藻酸钙，随后往接收容器里再次使用喷头1供料明胶和mTG酶的混合溶液，直到完全覆盖海藻酸钙。此时制造完成的结构类似于“夹芯体”，上下两层为明胶与mTG酶的混合薄膜，中间层为海藻酸钙，待上下两层的凝胶融合凝固，将整个支架浸泡于柠檬酸钠溶液中，柠檬酸钠能将固态的海藻酸钙还原成液态的海藻酸钠液体，最后借助外力使得海藻酸钠液体流出，在原结构中留下通道。

实施例二

一种生物结构体预血管化的方法，利用3D打印技术，将打印模型导入打印机中，其特征在于，包括以下步骤：

a.按照质量比明胶：mTG酶＝10：1称取原料，将明胶溶于60℃去离子水中搅拌溶解，得到明胶溶液；待明胶溶液降温至37℃时，加入事先称取好的mTG酶，得到水凝胶I液体，然后将水凝胶I液体在37℃条件下导入微量泵，根据需求厚度挤出底部水凝胶I液体，降低温度至4℃后，两种材料交联成水凝胶I薄膜；

b.将海藻酸钠溶于去离子水，选择气压为供料单元，使用一次性注射针头为出料口，在水凝胶I薄膜上打印后，用氯化钙溶液以喷雾的形式交联海藻酸钠，形成海藻酸钙，最后用水凝胶I液体覆盖住海藻酸钙，并置于4℃条件下1h，使得上下两层水凝胶I融合成型，形成夹芯体；

c.制备支架：将夹芯体浸泡在柠檬酸钠溶液中，将海藻酸钙还原成海藻酸钠液体，并将其排出，形成内部具备中空管道的支架；

d.内皮化：在支架制备完成后，对支架进行消毒，在中空管道中接种内皮细胞，实现内皮化。

实施例三

一种生物结构体预血管化的方法，利用3D打印技术，将打印模型导入打印机中，其特征在于，包括以下步骤：

a.按照质量比明胶：mTG酶＝10：1称取原料，将明胶溶于60℃去离子水中搅拌溶解，得到明胶溶液；待明胶溶液降温至37℃时，加入事先称取好的mTG酶，得到水凝胶I液体，然后将水凝胶I液体在37℃条件下导入微量泵，根据需求厚度挤出底部水凝胶I液体，降低温度至2℃后，两种材料交联成水凝胶I薄膜；

b.将海藻酸钠溶于去离子水，选择气压为供料单元，使用一次性注射针头为出料口，在水凝胶I薄膜上打印后，用氯化钙溶液以喷雾的形式交联海藻酸钠，形成海藻酸钙，最后用水凝胶I液体覆盖住海藻酸钙，并置于2℃条件下1h，使得上下两层水凝胶I融合成型，形成夹芯体；

c.制备支架：将夹芯体浸泡在柠檬酸钠溶液中，将海藻酸钙还原成海藻酸钠液体，并将其排出，形成内部具备中空管道的支架；

d.内皮化：在支架制备完成后，对支架进行消毒，在中空管道中接种内皮细胞，实现内皮化。

实施例三

一种生物结构体预血管化的方法，利用3D打印技术，将打印模型导入打印机中，其特征在于，包括以下步骤：

a.按照质量比明胶：mTG酶＝10：1称取原料，将明胶溶于60℃去离子水中搅拌溶解，得到明胶溶液；待明胶溶液降温至37℃时，加入事先称取好的mTG酶，得到水凝胶I液体，然后将水凝胶I液体在37℃条件下导入微量泵，根据需求厚度挤出底部水凝胶I液体，降低温度至6℃后，两种材料交联成水凝胶I薄膜；

b.将海藻酸钠溶于去离子水，选择气压为供料单元，使用一次性注射针头为出料口，在水凝胶I薄膜上打印后，用氯化钙溶液以喷雾的形式交联海藻酸钠，形成海藻酸钙，最后用水凝胶I液体覆盖住海藻酸钙，并置于6℃条件下1h，使得上下两层水凝胶I融合成型，形成夹芯体；

c.制备支架：将夹芯体浸泡在柠檬酸钠溶液中，将海藻酸钙还原成海藻酸钠液体，并将其排出，形成内部具备中空管道的支架；

d.内皮化：在支架制备完成后，对支架进行消毒，在中空管道中接种内皮细胞，实现内皮化。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种生物结构体预血管化的方法，利用3D打印技术，将打印模型导入打印机中，其特征在于，包括以下步骤：

a.制备水凝胶I薄膜：制备水凝胶I液体，并将所述水凝胶I液体喷入容器底部，使所述水凝胶I液体在2-6℃下冷却，形成水凝胶I薄膜；

b.打印实性通道：制备水凝胶II液体，并采用打印技术在所述薄膜上对所述水凝胶II液体进行打印，待水凝胶II液体冷却后，形成一定形状的实性通道；

c.制备水凝胶III：将溶液I喷入所述容器中，使得所述溶液I与所述实性通道交联，形成水凝胶III；

d.制备夹芯体：再次向所述容器中喷洒所述水凝胶I液体，直到所述水凝胶I液体完全覆盖所述水凝胶III，于2-6℃下，静置1-2h，形成水凝胶I-水凝胶III-水凝胶I的夹芯体；

e.制备支架：将所述夹芯体浸泡在溶液II中，将水凝胶III还原成水凝胶II液体，并将水凝胶II液体排出，形成内部具备中空管道的支架。

2.根据权利要求1所述的一种生物结构体预血管化的方法，其特征在于，所述水凝胶I为明胶和mTG酶的混合溶液，且按照质量比明胶：mTG酶＝10：1。

3.根据权利要求1所述的一种生物结构体预血管化的方法，其特征在于，所述水凝胶II包括海藻酸钠的水溶液。

4.根据权利要求1所述的一种生物结构体预血管化的方法，其特征在于，所述溶液I包括氯化钙的水溶液。

5.根据权利要求1所述的一种生物结构体预血管化的方法，其特征在于，所述溶液II包括柠檬酸钠的水溶液。

6.根据权利要求2所述的一种生物结构体预血管化的方法，其特征在于，所述水凝胶I液体的制备方法包括：

1)将所述明胶溶于60℃去离子水中搅拌溶解，得到明胶溶液；

2)待明胶溶液降温至37℃时，按照质量比加入mTG酶溶液，得到水凝胶I液体。

7.根据权利要求1所述的一种生物结构体预血管化的方法，其特征在于，所述预血管化的方法还包括：f.在所述支架制备完成后，对所述支架进行消毒，在所述中空管道中接种内皮细胞，实现内皮化。

8.根据权利要求1所述的一种生物结构体预血管化的方法，其特征在于，所述容器包括但不限于培养皿。