CN113331991A - 一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法，包括以下具体步骤：(1)水凝胶微球的制备；(2)牺牲模型的制备；(3)生物结构体模具的制备；(4)生物结构体的制备。本发明以水凝胶微球作为生物结构体的基本构建单元，利用微球堆叠后产生的球与球之间的微细间隙与增减材复合成形制备的宏观尺度三维血管网络相结合，从而实现具有三维多尺度、高密度血管网络的预血管化生物结构体的可控制备。
Description
技术领域
本发明属于生物医药以及生物制造技术领域，具体涉及一种具有多尺度 通道网络的预血管化生物结构体的制备方法。
背景技术
器官移植是终末期器官衰竭患者的黄金治疗方法，由于供体的数量有限， 因此需要开发新的方法实现受损器官的再生与修复。组织工程是一种制造受 损组织器官替代物的潜在方法，然而，目前复杂器官或具有临床尺度的组织 的制造仍然面临巨大挑战，其中一个重要的问题就是组织的血管化。氧气的 运输是细胞生存的关键因素，其在组织中的扩散距离一般为150-200μm，因此 在生理细胞密度条件下，厚度大于400μm的组织会产生坏死核心。此外，没 有血管网络会影响到营养物的供应以及二氧化碳与细胞代谢废物的排出，与 此同时，血管网络也是循环细胞及生物因子进入组织的重要通道。因此，构 建具有足够密度的多尺度血管通道网络，为细胞提供充足的氧气与营养物质 并去除代谢废物，从而构建适宜细胞生长的微环境，对于结构体内细胞的存 活乃至最终的临床应用都有巨大的意义。
在血管化生物结构体的制备中，理想的血管网络应该具有类似天然血管 网络的多等级、多层次结构特征，网络中的血管内径分布从数微米到数毫米 不等，且在空间中呈现树状分叉结构。目前，常用的血管通道制备方法主要 包括细胞自组装、软光刻、静电纺丝以及细胞片等。尽管这些方法已经在微 血管网络或大血管的构建中取得了一些成果，然而受到成形速度、成形原理、 成形尺寸等技术特征的限制，上述方法仍然无法满足在大尺度生物结构体中 可控构建三维多尺度血管网络的需求。
生物3D打印是一种融合了快速成形、组织工程以及生物制造等多种技术 的新兴制造工艺，凭借其分层制造，层叠堆积的成形特点，在实现精确的细 胞、材料、生长因子的图案化分布上具有独特优势。因此，将生物3D打印技 术应用于血管化生物结构体的制备受到了越来越多的关注。目前，集成生物 3D打印技术与牺牲材料的增减材复合成形方法在可控制备具有三维结构的中 大尺度血管通道中已经获得了很大的进展，然而，受到模型设计以及成形原 理的限制，目前仍然存在三维多尺度血管直径变化范围窄，血管网络空间分布密度不足的问题，无发支持具有生理细胞密度的生物结构体的长期存活。
为此，能够提供一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体是本领 域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构 体的制备方法，本发明以水凝胶微球作为生物结构体的基本构建单元，利用 微球堆叠后产生的球与球之间的微细间隙与增减材复合成形制备的宏观尺度 三维血管网络相结合，从而实现具有三维多尺度、高密度血管网络的预血管 化生物结构体的可控制备。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法，包括以下 具体步骤：
(1)水凝胶微球的制备：将水凝胶溶液采用高压静电喷射装置制备成水 凝胶微球，备用；
(2)牺牲模型的制备：将牺牲材料装入到打印机的喷头中，使用3D打 印机制备牺牲模型，备用；
(3)生物结构体模具的制备：将打印材料装入到打印机的喷头中，使用 3D打印机制备生物结构体模具，备用；
(4)生物结构体的制备：先将所述水凝胶微球加入到所述生物结构体模 具中，再将所述牺牲模型嵌入到微球堆叠成的结构中，进行交联，交联完成 后去除所述牺牲模型，即得一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体。
本发明制备方法中利用水凝胶微球作为构建单元代替均质水凝胶材料， 其堆叠后能够产生密集且互相连通的球间缝隙，通过将3D打印制备的具有三 维结构的牺牲模型加入微球堆叠形成的立体结构中，将球间缝隙与模型牺牲 后形成的宏观尺度通道网络相结合，可以在宏观尺度血管之间增加由球间缝 隙形成的微血管网络，使其更加接近天然血管网络的多等级、多层次结构， 能为细胞生长提供充足的养分及良好的微环境。
优选地，步骤(1)中所述水凝胶溶液的制备方法为：将海藻酸钠溶液与 明胶溶液在40℃下混合后，即得所述水凝胶溶液；其中，所述水凝胶溶液中 所述海藻酸钠的质量浓度为0.5-2％，所述明胶的质量浓度为5-10％
海藻酸钠加入有利于使用电喷法制备微球；明胶则为结构体的基质材料， 可以由甲基丙烯酸酐化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸等材料替代；溶液中加 入海藻酸钠有利于电喷法制备的微球的尺寸均一性，加快微球的成形速度， 而溶液中明胶或甲基丙烯酸酐化明胶等材料的含量的变化能够实现对微球的 力学以及微观结构等性能的调控，满足不同使用环境的需求。
优选地，步骤(1)中所述水凝胶微球的制备方法为：将所述水凝胶溶液 加入到注射器中，连接高压静电喷射装置，设置静电高压电源电压以及微量 注射泵的进给量，在收集器内得到水凝胶微球溶液，将所述溶液离心、洗涤 后，弃去上清，即得所述水凝胶微球。
优选地，所述收集器内含有氯化钙溶液，所述洗涤采用柠檬酸钠溶液或 乙二胺四乙酸。
优选地，步骤(1)中所述水凝胶微球的制备方法为：将所述水凝胶溶液 加入到注射器中，在收集器内加入氯化钙溶液，连接注射器针头与静电高压 电源正极，收集器连接静电高压电源的接地极，设置静电高压电源电压以及 微量注射泵的进给量，调节针头与收集器内氯化钙溶液液面的间距，注射器 内溶液在注射泵推进力与高压电场的作用下离开针头并形成微液滴进入下方 收集器的溶液中，从而在收集器内形成尺寸均一的水凝胶微球溶液，将所述 溶液离心、洗涤后，弃去上清，即得所述水凝胶微球。
本发明采用电喷进行微球的制备，可以制备尺度均一且大小可控的微球， 利用微球尺度的变化能够实现对微球间缝隙大小的调控，从而可以对血管网 络的尺度、结构以及生物结构体的总体力学特性进行调节。此外，在载细胞 微球方面，由于细胞与通道的距离取决于微球的大小，因此通过控制微球的 粒径可以实现微球内细胞与通道距离的精确控制，减少因氧气、养分等供应 不足产生的组织核心坏死及细胞凋亡。
优选地，步骤(2)中所述牺牲材料为聚乙烯醇、F-127和海藻酸钙中的 任意一种。
牺牲材料可用聚乙烯醇、F-127、海藻酸钙等，但是不同材料的打印工艺 不同。本发明所述为聚乙烯醇的打印工艺，F-127与海藻酸钙在常温下打印； 打印中使用的气压与材料的性质与浓度有关，约为0.2～0.8MPa；同时喷头移 动速度与所需的纤维粗细有关，速度越慢，则单位长度下材料堆积越多，纤 维直径增加，此参数与结构体设计、材料供给速度以及材料特性有关，按需 即可。
本发明采用的牺牲材料具有良好的可打印性能，能够通过3D打印技术快 速制备具有特定形貌的通道牺牲模型，有利于在结构中按需构建具有生理、 病理特征的血管网络，使其满足使用需求。所述牺牲材料具有温和的去除过 程，能够较好的保护通道结构，降低对通道外周基质材料的损伤，所述牺牲 材料具有良好的生物相容性，能够改善结构体制备过程中细胞的存活性能。
优选地，步骤(2)中所述喷头为内径0.4mm的金属喷头，所述喷头的温 度为180-200℃，底板温度为55-65℃，移动速度为35-45mm/s。
优选地，步骤(3)中所述打印材料为水凝胶、高分子材料和硅胶中的任 意一种。
优选地，步骤(3)中所述喷头的移动速度为30mm/s，气源挤出压力为 400kPa。
优选地，步骤(4)中所述水凝胶微球加入到所述生物结构体模具前需要 进行预处理，所述预处理的方法为：将所述水凝胶微球加入TG酶溶液中制成 悬液，静置后离心去除上清液，即得水凝胶-TG酶微球。
本发明为了增强明胶的热稳定性，加入TG酶，如是甲基丙烯酸酐化明胶 等材料，可加入LAP或者Irgacure2959等。
优选地，所述悬液中水凝胶与TG酶的质量比为10:1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明利用水凝胶微球作为构建单元代替均质水凝胶材料，其堆叠后 能够产生密集且互相连通的球间缝隙；通过将3D打印制备的具有三维结构的 牺牲模型加入微球堆叠形成的立体结构中，将球间缝隙与模型牺牲后形成的 宏观尺度通道网络相结合，可以在宏观尺度血管之间增加由球间缝隙形成的 微血管网络，使其更加接近天然血管网络的多等级、多层次结构，能为细胞 生长提供充足的养分及良好的微环境。
2)本发明基于电喷的微球制备方法，可以制备尺度均一且大小可控的微 球，利用微球尺度的变化能够实现对微球间缝隙大小的调控，从而可以对血 管网络的尺度、结构以及生物结构体的总体力学特性进行调节；此外，在载 细胞微球方面，由于细胞与通道的距离取决于微球的大小，因此通过控制微 球的粒径可以实现微球内细胞与通道距离的精确控制，减少因氧气、养分等 供应不足产生的组织核心坏死及细胞凋亡。
3)本发明通过使用不同的电喷工艺，可以制备具有芯壳或其它特定微结 构的水凝胶微球，从而可以在微观层面上按需塑造细胞的生长微环境。
4)本发明可以通过多工位与阵列喷头的方式进行微球的高通量制备，为 使用微球通过从下而上的方式构建大尺度的生物结构体提供可行性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不 付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明水凝胶微球的制备流程示意图；
图2为本发明一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体模具的制 备流程示意图
图3为本发明一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备流 程示意图；
其中，I1注射泵，I2注射器，I3注射器针头，I4收集器，I5电源，I6微 球，II1气源，II23D打印机的注射器，II33D打印机的注射器针头，II4生物 结构体模具，III1明胶-TG酶微球，III2牺牲模型。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法(如图1-3)， 包括以下具体步骤：
(1)水凝胶微球的制备：制备过程如图1所示，将海藻酸钠溶解在去离 子水中，在室温下搅拌1h，配制成2％(w/v)的海藻酸钠溶液，将明胶溶解 在去离子水中，在60℃下搅拌1h，配制成14％(w/v)的明胶溶液，将配置 好的海藻酸钠与明胶溶液在40℃下按照体积比1:1的方式混合，获得含有1％ (w/v)海藻酸钠与7％(w/v)明胶的混合水凝胶溶液；将氯化钙溶解在去离 子水中，在室温下搅拌0.5h，配制成1％(w/v)的氯化钙溶液作为交联剂；将柠檬酸钠溶解在去离子水中，在室温下搅拌0.5h，配制成1％(w/v)的柠 檬酸钠溶液作为螯合剂；将配置完成的水凝胶溶液加入到注射器(I2)中，在 收集器(I4)内加入氯化钙溶液，连接注射器针头(I3)与静电高压电源(I5) 正极，收集器(I4)连接静电高压电源(I5)的接地极，设置静电高压电源(I5) 电压以及微量注射泵(I1)的进给量，调节针头(I3)与收集器(I4)内液面 的间距，注射器内溶液在注射泵(I1)推进力与高压电场的作用下离开针头并 形成微液滴进入下方收集器(I4)的溶液中，从而在收集器(I4)内形成尺寸 均一的水凝胶微球，将含有微球的溶液加入离心管中，离心后倒出上清液， 并加入柠檬酸钠溶液去除微球中的海藻酸钙，再次离心后倒出上清液，即得 明胶微球(I6)；
(2)牺牲模型的制备：使用计算机辅助设计软件设计三维通道牺牲模型， 将模型转换为STL文件，利用切片软件对该文件进行处理以生成G代码格式 的打印路径并输入3D打印机的控制系统；使用聚乙烯醇(PVA)作为牺牲材 料装入到打印机的喷头中，使用内径0.4mm的金属喷头，设置喷头温度为 180-200℃，底板温度为55-65℃，喷头运动速度为35-45mm/s，使用3D打印 机完成牺牲模型(III2)的制备；
(3)生物结构体模具的制备：制备过程如图2所示，使用计算机辅助设 计软件设计生物结构体模具的模型，将模型转换为STL文件，利用切片软件 对该文件进行处理以生成G代码格式的打印路径并输入3D打印机的控制系 统；将海藻酸钠溶解在含有0.3％氯化钙的去离子水中，在室温下搅拌直至海 藻酸钠完全溶解，配制成6％(w/v)的预交联的海藻酸钙溶液，将上述溶液 加入到生物3D打印机的注射器(II2)中，设置打印喷头的移动速度为30mm/s， 气源(II1)的挤出压力设置为400kPa，针头规格为21G(II3)，使用3D打印机进 行生物结构体模具(II4)的制备，打印完成后使用4％的氯化钙溶液对模具进 行二次交联，提高模具的力学性能；
(4)生物结构体的制备：制备过程如图3所示，将谷氨酰转氨酶(TG 酶)溶解在去离子水中，在室温下搅拌0.5h，配制成10％(w/v)的TG酶溶 液，将收集好的明胶微球(I6)加入TG酶溶液中制成悬液，悬液中的明胶与 TG酶质量比为10:1，静置后用离心法去除上清液，收集明胶-TG酶微球(III1)， 将明胶-TG酶微球(III1)加入到海藻酸钙构建的生物结构体模具(II4)中， 将制备好的PVA通道牺牲模型(III2)嵌入到明胶-TG酶微球(III1)堆叠成的结构中，待交联完成后将结构体放置在去离子水中去除结构体内的PVA通 道牺牲模型(III3)，从而获得具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体。
本发明旨在提出一种以微球作为构建单元，通过使用牺牲模型，获取具 有多尺度血管化网络的预血管化结构体。其中，大血管的尺度由牺牲模型的 外边界决定，尺寸按需，从数百微米至数毫米不等，而小尺度血管网络由微 球之间的间隙实现，从十数微米到百微米不等，血管网络的密度则能按需通 过微球粒径大小调节，该值可由实际使用需求决定。
各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实 施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用 本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易 见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例， 而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)水凝胶微球的制备：将水凝胶溶液采用高压静电喷射装置制备成水凝胶微球，备用；
(2)牺牲模型的制备：将牺牲材料装入到打印机的喷头中，使用3D打印机制备牺牲模型，备用；
(3)生物结构体模具的制备：将打印材料装入到打印机的喷头中，使用3D打印机制备生物结构体模具，备用；
(4)生物结构体的制备：先将所述水凝胶微球加入到所述生物结构体模具中，再将所述牺牲模型嵌入到微球堆叠成的结构中，进行交联，交联完成后去除所述牺牲模型，即得一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体。
2.根据权利要求1所述的一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述水凝胶溶液的制备方法为：将海藻酸钠溶液与明胶溶液在40℃下混合后，即得所述水凝胶溶液；其中，所述水凝胶溶液中所述海藻酸钠的质量浓度为0.5-2％，所述明胶的质量浓度为5-10％。
3.根据权利要求1所述的一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述水凝胶微球的制备方法为：将所述水凝胶溶液加入到注射器中，连接高压静电喷射装置，设置静电高压电源电压以及微量注射泵的进给量，在收集器内得到水凝胶微球溶液，将所述溶液离心、洗涤后，弃去上清，即得所述水凝胶微球。
4.根据权利要求3所述的一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法，其特征在于，所述收集器内含有氯化钙溶液，所述洗涤采用柠檬酸钠溶液或乙二胺四乙酸。
5.根据权利要求1所述的一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述牺牲材料为聚乙烯醇、F-127和海藻酸钙中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述喷头为内径0.4mm的金属喷头，所述喷头的温度为180-200℃，底板温度为55-65℃，移动速度为35-45mm/s。
7.根据权利要求1所述的一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述打印材料为水凝胶、高分子材料和硅胶中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述喷头的移动速度为30mm/s，气源挤出压力为400kPa。
9.根据权利要求1所述的一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述水凝胶微球加入到所述生物结构体模具前需要进行预处理，所述预处理的方法为：将所述水凝胶微球加入TG酶溶液中制成悬液，静置后离心去除上清液，即得水凝胶-TG酶微球。
10.根据权利要求8所述的一种具有多尺度通道网络的预血管化生物结构体的制备方法，其特征在于，所述悬液中水凝胶与TG酶的质量比为10:1。
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