CN109922755A

CN109922755A - 组织打印机

Info

Publication number: CN109922755A
Application number: CN201780067002.4A
Authority: CN
Inventors: N·哈基米; R·Y·程; M·H·索托德霍弗; Q·巴; S·阿米尼尼克; M·G·杰斯克; A·古瑟
Original assignee: University of Toronto; Sunnybrook Research Institute
Current assignee: University of Toronto; Sunnybrook Research Institute
Priority date: 2016-10-07
Filing date: 2017-10-10
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2037-10-10
Also published as: US11168295B2; EP3522828A4; US20200040291A1; EP3522828B1; JP7075599B2; CN109922755B; WO2018064778A1; EP3522828A1; JP2020502994A; AU2017338624A1; CA3039553A1; AU2017338624B2

Abstract

本文公开了一种生物打印机，其使得能够通过沿着诸如皮肤伤口的沉积表面平移打印头来原位形成架构型平面生物材料和组织。在仪器的手持式配置中，通过移动的微制造打印头灌注载有细胞的生物聚合物溶液并将其沉积在固定平面或伤口上。所述打印头可通过驱动机构平移。公开了所述仪器的不同实施方案以用于小型动物的体内应用，以及大型动物和临床应用。所述仪器的固定式实施方案非常适合于平面生物材料和组织的连续形成和卷对卷加工。

Description

组织打印机

技术领域

本公开涉及一种用于将生物聚合物或工程组织的层共形地打印到用于体外和/或体内应用的表面上或受伤区域上的打印机装置。

背景技术

皮肤是人体最大的器官并且具有细胞和细胞外基质成分的独特分层组织。此空间构成部分负责器官功能。患有皮肤损伤的患者，诸如具有急性复杂伤口和严重烧伤的患者常常会失去较大皮肤区域，使其容易发生机会性感染和脱水。对于真皮、表皮和皮下组织被破坏的全厚度伤口，目前的治疗选择包括：覆盖伤口部位以提供对抗细菌和水分流失的临时屏障，然后从身体的健康区域分离皮肤以作为网状移植物重新分布在受伤区域上，这叫做自体移植。自1937年由Earl C.Padgett引入以来，植皮刀已经被用于从供体部位通过外科手术采集皮肤以用于自体移植，但它们会产生另一种伤口。网格化允许可覆盖伤口区域超过采集部位的大小。不经常实践的微移植允许覆盖多达采集部位100倍的区域¹。虽然自体移植是当前临床实践中的黄金标准，但是对于具有大型伤口、复杂伤口或大型烧伤的患者，没有足够的供体皮肤可用于自体移植，从而留下与不良结果相关联的未移植或未覆盖的较大区域。为克服这一限制已引入皮肤替代品、甚至细胞治疗。

已经基于天然和合成聚合物两者开发了大量的皮肤替代品。虽然组织工程皮肤替代品是可商购获得的，但是细胞扩增/生长所需的时间长且其成本高，妨碍了它们广泛的临床适应性。目前的黄金标准之一是35年多以前开发的基于胶原的伤口敷料²，其允许残余的健康细胞迁移穿过设置的微孔并且需要2-3周来重构新的真皮层。已经提出将细胞直接沉积到伤口区域上作为更快更有效的治疗，但细胞外基质成分的缺乏导致结构完整性和皮肤组织架构的缺乏。临床上已经将细胞喷雾技术应用于在低浓度下均匀沉积自体细胞而不会扩散到部分厚度伤口上，并且已经证明改善的结果³。

增材制造方法越来越多地被采用来创建重现了完整人组织结构的各个方面的载有细胞的、架构式生物聚合物构建体。^4-6。得到证明的3D生物打印方法包括长丝和微滴挤出^7,8、立体光固化成型^9,10、喷墨打印^11,12、激光辅助打印^13,14和复制模塑¹⁵。它们主要用于关于不同细胞类型和生物聚合物的体外研究。后者有时被称为“生物墨水”，并且包括天然(例如，藻酸盐、胶原、纤维蛋白、明胶、琼脂糖、葡聚糖)和合成(例如，聚乙二醇和聚己内酯)生物聚合物两者。所选的基于蛋白质的材料包括胶原，即哺乳动物组织中最丰富的蛋白质，以及纤维蛋白，即一种参与伤口愈合的各种步骤的蛋白质。细胞青睐这些具有高孔隙率和含水量的软凝胶^16,17。但是，在没有基材支撑的情况下，任何对由这种机械强度较弱的凝胶制成的厘米大小生物打印片材的操纵都是极具挑战性的任务。克服这一限制的一种策略是利用涉及从合成聚合物打印支撑结构的多材料方法⁷。另一个挑战是通常与基于蛋白质的生物聚合物相关联的大约数分钟的长胶凝作用时间。

减轻这一限制的策略一度是添加更快胶凝的生物聚合物¹⁸，并且打印及随后移除牺牲材料。虽然目前的3D生物打印方法已经成功地在体外定义出具有组织相关架构的工程构建体，但是平移到体内是一个多步骤的、要求很高的过程，该过程依赖于使用合成支撑材料作为支架，其超过了天然组织的机械性能。另一方面，目前用于原位形成组织的方法缺乏对细胞和生物聚合物的空间组织的确定性控制，所述方法通过使用可注射水凝胶¹⁹、在伤口床处微尺度构建块的自组装²⁰、快速交联的含细胞水凝胶前体的喷雾^21,22以及各种各样可光学交联的软骨填料和粘合剂^23-25进行证明。

发明内容

本文公开了一种仪器，其使得能够通过沿着沉积表面平移打印头来原位形成架构式平面生物材料和组织。在仪器的手持式实施方案中，通过移动的微制造打印头灌注载有细胞的生物聚合物溶液并将其沉积在固定平面或伤口上。所述打印头可通过驱动机构平移。公开了所述仪器的不同实施方案以用于小型动物的体内应用，以及大型动物和临床应用。所述仪器的固定式实施方案非常适合于平面生物材料和组织的连续形成和卷对卷加工。

本公开提供了用于受控原位形成生物聚合物片材和平面组织并将其沉积在表面上的生物打印机，所述生物打印机包括：

a)支撑框架和附接到所述支撑框架的打印头，所述打印头包括第一挤出通道阵列和至少第二挤出通道阵列，所述至少第二挤出通道阵列相对于所述第一阵列定位，使得在操作中所述第一阵列向近端邻近所述表面，所述打印头的末端部分具有宽度W，使得所述第一阵列和所述第二阵列跨越所述宽度W；

b)附接到所述框架的第一贮存器，所述第一挤出通道阵列与具有待挤出到所述表面上的生物聚合物的所述第一贮存器流体连通，附接到所述框架的第二液体贮存器，所述第二阵列与具有待同所述挤出的生物聚合物一起挤出的液体的所述第二贮存器流体连通，并且包括与所述第一贮存器相关联的第一分配机构，所述第一分配机构被配置成以流量QM分配生物聚合物，以及与所述第二贮存器相关联的第二分配机构，所述第二分配机构被配置成以流量QC分配所述液体；

c)附接到所述框架的驱动机构，使得当由操作员启动时，所述打印头沿着高于所述表面竖直高度H的表面以预选的速度V被驱动；

d)连接到所述驱动机构和所述第一分配机构的控制器，所述控制器被编程，使得在启动所述驱动机构时，所述第一分配机构以流量QM分配一层厚度为t的生物聚合物，这满足条件QM＝W·V·H(6(t/H)-6(t/H)²+3(t/H)²(μc/μM))/(6(t/H)(μc/μM)-6(t/H)+6)。

所述驱动机构可被配置成提供可变速度V，并且其中所述控制器被编程有指令，所述指令用于控制所述第一分配机构以作为响应调整流量QM，使得针对给定的速度V保持所述流量条件。

所述第二分配机构可与所述控制器可操作地耦合，并且被配置成以流量QC分配所述液体，这满足条件

QC＝0.5W·V·(H-t)

所述驱动机构可被配置成提供可变速度V，并且其中所述控制器被编程有指令，所述指令用于控制所述第一分配机构和所述第二分配机构以作为响应调整所述流量QM和QC，使得针对给定的速度V保持所述条件。

所述打印头的出口部分可包括从所述第二阵列的顶表面向外延伸的悬伸部分，所述悬伸突出部分从所述出口部分向外延伸长度L。

所述长度L等于或大于H的值。

所述第一挤出通道阵列可通过分叉通道网络与所述第一贮存器流体连通，所述分叉通道网络包括连接到所述第一贮存器的第一通道，所述第一通道分叉成两个通道，所述两个通道进一步分叉，直到最终通道的数量等于所述第一阵列中挤出通道的数量，并且每个通道的末端与所述第一阵列中对应的挤出通道的末端相邻，并且其中所述第二挤出通道阵列通过分叉通道网络与所述第二贮存器流体连通，所述分叉通道网络包括连接到所述第二贮存器的第一通道，所述第一通道分叉成两个通道，所述两个通道进一步分叉，直到最终通道的数量等于所述第二阵列中挤出通道的数量，并且每个通道的末端与所述第二阵列中对应的挤出通道的末端相邻。

根据默里定律，所述分叉通道网络中的所述通道的水力直径从所述贮存器到所述打印头从每个入口到每个出口减小。

所述生物打印机还可包括手柄，所述手柄用于允许用户在分配操作期间抓握和使用所述生物打印机，使得所述生物打印机是手持式生物打印机。

所述驱动机构可包括连接到所述驱动机构的一对轴安装的辊子，并且其中所述打印头定位在所述辊子之间，并且其中所述末端部分包括圆形引导特征，所述圆形引导特征在通道装置出口与沉积表面之间保持一致的间隙高度而不管沉积角度是否改变，并且其中在启动所述驱动机构后的操作期间，所述一对轴安装的辊子被旋转驱动，使得所述手持式生物打印机以所述速度V沿所述表面移动。

所述驱动机构可包括连接到所述驱动机构的辊子，并且其中所述辊子定位在所述打印头后面，并且其中末端部分包含圆形引导特征，所述圆形引导特征在通道装置出口与沉积表面之间保持一致的间隙高度而不管沉积角度是否改变，并且其中在启动所述驱动机构后的操作期间，所述辊子被旋转驱动，使得所述手持式生物打印机以所述速度V沿所述表面移动。

所述驱动机构可包括附接到所述框架的平移机构，所述打印头安装在所述平移机构上，所述平移机构被配置成相对于所述表面以所述速度V移动所述打印头。

附图说明

现在将参考附图，仅通过示例的方式描述实施方案，在附图中：

图1.具有侧安装轮的实施方案中的手持式生物打印机的示意图。

图2.具有打印头后面的驱动机构的实施方案中的手持式生物打印机的示意图。

图3.具有扫描打印头的实施方案中的手持式生物打印机的示意图。

图4.具有沉积在传送带上的空间上固定的打印头的实施方案中的手持式生物打印机的示意图。

图5.用于条纹图案化的片材形成的示意图。

图6.用于平行纤维和波纹片材的沉积的示意图。

图7.用于斑点图案化的片材形成的示意图。

图8. 3D打印实施方案中的打印头设计中的微通道网络的前视图。

图9.打印头设计的侧视图。

图10.使用热压印或微注塑在热塑性基材中制造的打印头。

图11.具有安装在打印头两侧的辊子的实施方案中的手持式生物打印机的透视图。

图12.具有安装在打印头两侧的辊子的实施方案中的手持式生物打印机的侧视图和前视图。

图13.具有安装在打印头两侧的辊子的实施方案中的手持式生物打印机的分解图。

图14.具有安装在打印头后面的辊子的实施方案中的手持式生物打印机的分解图。

图15.具有安装在打印头后面的辊子的实施方案中的手持式生物打印机的透视图。

图16.具有安装在打印头后面的辊子的实施方案中的手持式生物打印机的侧视图和前视图。

图17.打印头安装在移动传送表面上方空间上固定的位置中的实施方案中的连续片材形成的示意图。由一种或多种可包含胶态有效负载的生物聚合物前体溶液制得的生物聚合物片材。交联剂溶液(顶部)和生物聚合物溶液(底部)在打印头出口处形成分层流，从而在界面处起始胶凝作用。

图18.具有传送带的配置中的用于片材形成的实验配置的示意图。双层打印头被供应有聚合物溶液和交联剂溶液。溶液由贮存器通过压力受控递送提供或者通过来自外部注射泵的流量受控递送提供。具有突出部分(顶部)和移动传送带(底部)的固定式打印头建立用于片材形成和胶凝作用的流体动力学边界条件。步进马达以速度V平移带。

图19.针对生物打印机实施方案1制造的3D打印的微制造打印头的照片。比例尺：10mm。

图20.对100μl纤维蛋白/HA生物聚合物溶液的液滴进行手工沉积之后的侧视图图像(左)与使用手持式生物打印机实施方案1进行片材沉积之后的侧视图图像(右)的比较。在两种情况下都使用用交联剂溶液水合的琼脂糖基材。图像在4度角度下获取。

图21.用手持式生物打印机实施方案1获得的t＝0.3mm的片材的代表性光学轮廓测量图像和剖视图，W＝14mm。

图22.指示粘度比μC/μM＝0.01以满足零压力梯度条件所需的QC/(W·V·H)和QM/(W·V·H)条件的分析模型预测(实线)。虚线对应于QC/(W·V·H)＝t/H。模型中忽略了胶凝作用。

图23.针对作为无量纲生物聚合物流量QM*＝QM/(WVH)的函数的无量纲片材厚度t*＝t/H的测量和模型预测。针对手持式生物打印机实施方案1而获得的测量结果。

图24.基于对具有不同厚度的基于纤维蛋白的片材的归一化浊度的时间依赖性变化的测量的胶凝作用动力学的表征。针对手持式生物打印机实施方案1而获得的测量结果。

图25.使用扫描电子显微镜对由不同生物聚合物组合物打印的片材的微观结构表征。针对使用手持式生物打印机实施方案1制备的片材而进行的测量结果。

图26.针对由纤维蛋白-HA/胶原、纤维蛋白-HA、胶原-藻酸盐和藻酸盐组成的片材测量的杨氏模量(左)和断裂伸长率(右)。针对使用手持式生物打印机实施方案1制备的片材而进行的测量结果。

图27.左图：通过后续沉积具有绿色荧光微粒的有效负载的0.2mm厚度藻酸盐片材(底层)和具有红色荧光微粒的0.1mm厚度藻酸盐片材(顶层)制备的双层片材的共焦图像。右图：通过后续沉积具有蓝色微粒的0.5mm(底层)的纤维蛋白-HA片材、具有FITC缀合的胶原的0.2mm(中间层)的藻酸盐-胶原片材和具有红色微粒的0.15mm(顶层)的藻酸盐片材制备的三层片材的共焦图像。比例尺：0.1mm。针对使用手持式生物打印机实施方案1制备的片材而获得的数据。

图28.同质打印片材包含人真皮成纤维细胞(FB)。用钙黄绿素染色指示活细胞，以及用荧光乙锭同型二聚体-1指示死细胞。(b)在10天培养期间打印的具有>90％细胞成活率的纤维蛋白/HA/I型胶原生物墨水中的FB成活率的定量评估。(c)各种浓度的细胞用生物墨水进行打印并且使用Hoechst细胞核染色进行定量，没有显示出由于打印而造成的总细胞数的损失。(d)以逐步的方式打印的双层构建体。在FB(鬼笔环肽)之上打印角质形成细胞(k14和鬼笔环肽共染色)，类似于皮肤的双层结构。针对使用手持式生物打印机实施方案1制备的片材而获得的数据。

图29.(a)在1.25％纤维蛋白/0.25％胶原/0.25％HA细胞外基质材料内打印并且用Hoechst和鬼笔环肽染色的FB显示细胞在12h内的附着和伸长。(b)使用针对细胞核、肌动蛋白和角蛋白-14的免疫荧光染色，对在纤维蛋白凝胶中打印的人角质形成细胞(KC)第0天与第3天之间的比较，指示了到第3天时的细胞分型(cell grouping)和聚集。(c)经过3天培养的FB和KC细胞数量的定量评估。比例尺：0.1mm(a、b)。针对使用手持式生物打印机实施方案1制备的片材而获得的数据。

图30.上图：示出使用手持式皮肤打印机在全厚度切除猪伤口之上原位沉积0.25mm厚的纤维蛋白-HA/胶原片材的代表性照片，以及使用微流体卡盒在伤口区域内沉积的特写视图。下图：第0天对照区域以及沉积一层生物材料5min后的伤口。比例尺为10mm。针对使用手持式生物打印机实施方案1制备的片材而获得的数据。

图31.(a)三色染色指示肉芽组织形成和再上皮化的程度。(a)中的箭头指示新形成的肉芽组织与完整的皮肤之间的边界。箭头标记了上皮化的区域。处理后的伤口中心处的箭头显示完全的再上皮化，而对照伤口中的中心箭头显示伤口中心处的未再上皮化的区。(b)角蛋白10染色显示了分化的角质形成细胞的程度相当。在打印伤口的角落处观察到更多角蛋白阳性细胞，支持了打印材料纤维蛋白-HA片材很可能增强伤口愈合的观点。(c)α-SMA染色显示打印和对照伤口两者中的阳性细胞数量相当。比例尺：1mm(a右图，b左图)，0.1mm(b右图)和0.05mm(c)。针对使用手持式生物打印机实施方案1制备的片材而获得的数据。

图32.使用微制造打印头将生物材料和细胞组织成条纹图案的示意图。(b)条纹状单层的代表性共焦图像。(c)作为流量比的函数的相对条纹宽度w_条纹/w₀。(d)压力受控点样的代表性图像。(e)在200ms的致动时间内作为贮存器压出压力的函数的斑点体积。比例尺：2mm(b)，6mm(d)。针对使用手持式生物打印机实施方案1制备的片材而获得的数据。

图33.(a)使用微流体卡盒将生物材料和细胞组织成波纹片材或平行纤维的示意图。(b)具有8个峰的波纹片材的代表性明视场图像。图像在4度下捕获。插图显示2度下两个相邻峰的放大图像。(c)具有四个峰的片材的横截面的代表性重建共焦图像。(d)双层片材的横截面的代表性重建共焦图像。第一层(绿色)是同质的。顶层由四条平行条纹组成。(e)通过打印彼此垂直的八条平行条纹而打印的网格图案。(f)藻酸盐片材内的纤维蛋白-HA条纹的代表性多材料组织。比例尺：5mm(b)、0.2mm(c、d)、4mm(e)、0.5mm(f)。针对使用手持式生物打印机实施方案1制备的片材而获得的数据。

图34.(a)在鼠伤口上沉积的条纹图案化的纤维蛋白-HA片材。(b).直接在鼠切除伤口模型上沉积的条纹图案的荧光图像。(c)在8mm伤口模型上打印的4个条纹的代表性图像。虚线圆圈显示伤口边缘。箭头显示打印的起始阶段，直到其达到稳态沉积。1μm绿色荧光微粒用作标记。(d)原位打印的条纹状藻酸盐片材上的归一化荧光强度(实线)和纤维蛋白片材上的归一化荧光强度(虚线)。(e)沉积在具有倾斜角的平坦表面上的生物打印的纤维蛋白-HA片材的标称面内分辨率的估计。(*)指示在没有流动聚焦特征的微流体卡盒上递送生物墨水条纹的通道宽度。(**)指示通过具有内部流动聚焦特征的3D打印的微流体卡盒实现的提高的分辨率。比例尺：2mm。针对使用手持式生物打印机实施方案1制备的片材而获得的数据。

具体实施方式

将参考下面论述的细节描述本公开的各种实施方案和方面。以下描述和附图是对本公开的说明，而不应解释为限制本公开。这些图未按比例绘制。描述了许多具体细节以便提供对本公开的各种实施方案的全面理解。然而，在某些情况下，为了提供对本公开的实施方案的简明讨论，未描述众所周知的或常规的细节。

如本文所用，术语“包括”(“comprises”)和“包括”(“comprising”)应解释为包括端值在内和开放式的，而不是排他性的。具体地，当在说明书和权利要求中使用时，术语“包括”(“comprises”)和“包括”(“comprising”)及其变型意指包括指定的特征、步骤或组分。这些术语不应被解释为排除其他特征、步骤或组分的存在。

如本文所用，术语“示例性的”，“例示性的”和“例如”意指“用作示例、实例或例证”，并且不应解释为比本文公开的其他配置更优选或更具优势。

如本文所用，术语“约”(“about”)和“约”(“approximately”)旨在涵盖可能存在于值范围的上限和下限中的变化，诸如特性、参数和尺寸的变化。在一个非限制性实例中，术语“约”(“about”)和“约”(“approximately”)意指加或减10％或更少。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都意图具有如本领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

3D生物打印策略旨在通过控制不同细胞类型和细胞外基质成分的位置来重建天然组织的结构元素。所提供的微环境和空间组织影响细胞迁移、伸长、聚集、增殖、分化和功能。目前的生物打印平台提供颇有前景的体外结果，但是尚未能与临床相关背景兼容。为最终治疗具有急性和复杂伤口的患者，需要更高的打印速度、更少的准备和等待时间以及用于器官尺度打印组织的现场沉积或转移的紧凑型解决方案，这是最具影响力的临床和经济挑战之一。本文公开了一种通过原位形成伤口粘合剂皮肤替代品来克服这些限制的手持式皮肤打印机。

d)连接到所述驱动机构和所述第一分配机构的控制器，所述控制器被编程，使得在启动所述驱动机构时，所述第一分配机构以流量QM分配一层厚度为t的生物聚合物，这满足条件QM＝W·V·H(6(t/H)-6(t/H)²+3(t/H)²(μ_C/μ_M))/(6(t/H)(μ_C/μ_M)-6(t/H)+6)。

在一个实施方案中，所述驱动机构被配置成提供可变速度V，并且其中所述控制器被编程有指令，所述指令用于控制所述第一分配机构以作为响应调整流量QM，使得针对给定的速度V保持所述流量条件。

在一个实施方案中，所述第二分配机构可与所述控制器可操作地耦合，并且被配置成以流量QC分配所述液体，这满足条件

QC＝0.5W·V·(H–t)

在一个实施方案中，所述驱动机构被配置成提供可变速度V，并且其中所述控制器被编程有指令，所述指令用于控制所述第一分配机构和所述第二分配机构以作为响应调整所述流量QM和QC，使得针对给定的速度V保持所述流量条件。

在一个实施方案中，所述打印头的出口部分包括从所述第二阵列的顶表面向外延伸的悬伸部分，所述悬伸突出部分从所述出口部分向外延伸长度L。

在一个实施方案中，所述长度L等于或大于H的值。

在一个实施方案中，所述第一挤出通道阵列通过分叉通道网络与所述第一贮存器流体连通，所述分叉通道网络包括连接到所述第一贮存器的第一通道，所述第一通道分叉成两个通道，所述两个通道进一步分叉，直到最终通道的数量等于所述第一阵列中挤出通道的数量，并且每个通道的末端与所述第一阵列中对应的挤出通道的末端相邻，并且其中所述第二挤出通道阵列通过分叉通道网络与所述第二贮存器流体连通，所述分叉通道网络包括连接到所述第二贮存器的第一通道，所述第一通道分叉成两个通道，所述两个通道进一步分叉，直到最终通道的数量等于所述第二阵列中挤出通道的数量，并且每个通道的末端与所述第二阵列中对应的挤出通道的末端相邻。

在一个实施方案中，根据默里定律，所述分叉通道网络中的所述通道的水力直径从所述贮存器到所述打印头从每个入口到每个出口减小。

在一个实施方案中，所述生物打印机还包括手柄，所述手柄用于允许用户在分配操作期间抓握和使用所述生物打印机，使得所述生物打印机是手持式生物打印机。

在一个实施方案中，所述驱动机构包括连接到所述驱动机构的一对轴安装的辊子，并且其中所述打印头定位在所述辊子之间，并且其中所述末端部分包括圆形引导特征，所述圆形引导特征在通道装置出口与沉积表面之间保持一致的间隙高度而不管沉积角度是否改变，并且其中在启动所述驱动机构后的操作期间，所述一对轴安装的辊子被旋转驱动，使得所述手持式生物打印机以所述速度V沿所述表面移动。

在一个实施方案中，所述驱动机构包括连接到所述驱动机构的辊子，并且其中所述辊子定位在所述打印头后面，并且其中末端部分包含圆形引导特征，所述圆形引导特征在通道装置出口与沉积表面之间保持一致的间隙高度而不管沉积角度是否改变，并且其中在启动所述驱动机构后的操作期间，所述辊子被旋转驱动，使得所述手持式生物打印机以所述速度V沿所述表面移动。

在一个实施方案中，所述驱动机构包括附接到所述框架的平移机构，所述打印头安装在所述平移机构上，所述平移机构被配置成相对于所述表面以所述速度V移动所述打印头。

现在将参考附图和以下部件列表描述组织打印装置。

部件列表

本文公开了一种用于将生物聚合物片材受控沉积到表面上的生物打印机，所述生物打印机包括支撑框架，所述支撑框架具有附接到其上的打印头。

构成打印片材的前体溶液是天然或合成生物聚合物溶液与细胞和/或生长因子的混合物，但不限于细胞外基质材料或任何结构类似物。批准用于临床使用并证实有效的合成聚合物可以是潜在应用，因为其具有大规模合成而没有批次间变化的优点。将生物聚合物装载到所述手持式打印机(图1、11、12、13)中的一者的贮存器(包括但不限于1-20cc范围内的标准BD注射器或3D打印特征)，并且保持在所需的储存温度。当生物聚合物溶液通过打印头灌注并沉积在损伤部位时，它发生聚合并因此固化。可通过不同的机理诱导固化，所述机理包括离子诱导的、pH诱导的和温度诱导的胶凝作用，以及酶促反应和由紫外光诱导的聚合及其组合。对于像纤维蛋白原的天然生物聚合物，交联可起始于伤口床中的血浆。打印头包括第一挤出通道阵列和第二挤出通道阵列，所述第二挤出通道阵列相对于第一阵列定位，使得在操作中，当打印机分配或挤出一个或多个层时，第一阵列向近端邻近所述层沉积在其上的表面。可包含用于预混合的交联剂的生物聚合物通常通过第一通道阵列灌注，以便根据下文所述的生物打印机的配置方式将均匀涂层施加到伤口或另一表面。可包含交联剂的限制或二级流体通过第二通道阵列灌注，并且在与伤口或沉积表面相邻的一侧上递送到生物聚合物涂层。如果将交联剂添加到限制流体中，则交联剂被扩散性地运输到生物聚合物层中。

从其中分配层的打印头的末端部分(参见图8、图9、图10、图19)具有宽度W，使得第一阵列和第二阵列跨越此宽度W。第一贮存器附接到基板并且与第一挤出通道阵列在上游流体连通，当在操作时，第一挤出通道阵列将包含待直接挤出到表面上的具有粘度μ_M的生物聚合物。具有限制或二级液体的第二贮存器附接到框架，第二贮存器与第二阵列在上游流体连通，通过第二阵列，具有粘度μ_C的二级液体被共挤出到第一层之上。与第一贮存器相关联的分配机构被配置成以体积流量QM供应生物聚合物，并且与第二贮存器相关联的另一分配机构被配置成以体积流量QC供应二级或限制液体。

生物打印机包括附接到框架的驱动机构，使得当启动时，打印头沿着高于所述表面竖直高度H的表面以预选的速度V被驱动。控制器连接到驱动机构和第一分配机构，并且控制器被编程，使得在启动驱动机构时，第一分配机构以流量QM分配厚度t的生物聚合物，这满足条件：

QM＝W·V·H(6(t/H)-6(t/H)²+3(t/H)²(μ_C/μ_M))/(6(t/H)(μ_C/μ_M)-6(t/H)+6)

参见图22。

在大多数情况下，与生物聚合物溶液的粘度μM相比，限制溶液具有低得多的粘度μC，并且这种关系简化为QM＝W·V·t。W是打印头的设计特征，因此是固定的，并且通常选择在约5mm至约30mm的范围内。如稍后所论述的，打印头上的力优选地均匀以确保在打印头中的第一挤出通道阵列的宽度上横向均匀分配。分配的生物聚合物的厚度t通常在约0.01mm至约1mm的范围内，参见图21和图23。

厚度t应小于约1mm，以便允许为没有血管化的细胞供应营养。可根据健康皮肤中的目标组织厚度和伤口的严重程度来选择生物聚合物片材的厚度。如果皮肤损伤仅是部分厚度并且真皮层保持完整，则待打印的片材厚度为约0.3mm。对于基底层，则仅需要0.01mm工程组合物片材。如果真皮层也受损，则(全厚度损伤)需要更厚的片材。基于损伤，皮肤中的真皮和表皮层在身体上具有不同厚度。这些层顺序地打印或同时共挤出。每个层可具有不同的组合物和细胞类型负载(参见图25、26、28和29)。

V通常在约1mm/s至约20mm/s的范围内，可优选1至8mm/s范围内的速度。对于缓慢胶凝作用的情况(例如，厚片材、没有预混合)，可优选更低的速度(参见图14、16、24)，其中提供针对片材厚度的测量和模型预测，从而对应于片材厚度t的变化修改速度V。打印头宽度W和速度V的乘积确定每次可覆盖面积。对于大型皮肤损伤(男性平均体型的40％烧伤转化为大约一平方米)，快速覆盖伤口受到关注。在打印头为W＝20mm的情况下，打印机可在不到半小时的时间内覆盖一平方米。H应是目标片材厚度t的至少两倍。H可在0.15mm与2mm之间变化。t可在0.01mm与1mm之间变化。

如上所述，分配机构和驱动机构被配置成提供生物聚合物流量QM，其满足流量条件QM＝W·V·t。操作员决定目标厚度。速度V根据胶凝作用动力学选择。流量QM(和QC)针对给定的打印头设计(L、H、和W)，使用上述关系计算并且由操作员通过用户接口在计算机上选择。在一个实施方案中，这将通过手柄上的单个开关来完成(参见图2和图15中的部件4)。

生物打印机可被配置成提供可变速度V，并且控制器被编程有指令，所述指令用于控制第一分配机构以作为响应调整流量QM，使得针对给定的速度V保持流量条件。

在一个实施方案中，还可控制液体的流量QC以满足某些条件。在这种情况下，第二分配机构也连接到控制器，并且被配置成以流量QC分配液体，这满足条件

QC＝0.5W·V·(H–t)。

当流量QM和QC两者都被选择来满足上述条件时，驱动机构被配置成提供可变速度V，并且控制器被编程有指令，所述指令用于控制第一分配机构和第二分配机构以作为响应调节流量QM和QC，使得针对给定的速度V保持上述流量。

控制器可以是计算机微处理器，所述计算机微处理器具有视觉显示器，以指示流量QM和QC以及横向方向上的生物打印机运动速度V。QM、QC和V的值可通过计算机输入，并且对应的马达速度将实时更新。位于手柄上的on/off开关将开启或停止手持式生物打印机的挤出和/或横向运动。

生物打印机可以被配置成使得打印头的出口部分包括从第二阵列的顶表面向外延伸的悬伸部分。这个悬伸突出部分从出口部分向外延伸长度L，所述长度L等于或大于H的值，如图17所示。

第一挤出通道阵列通过分叉通道网络与所述第一贮存器流体连通，所述分叉通道网络包括连接到所述第一贮存器的第一通道，所述第一通道分叉成两个通道，所述两个通道进一步分叉，直到最终的通道数量等于所述第一阵列中挤出通道的数量，其中每个通道的下游末端与所述第一阵列中对应的挤出通道的一端相邻。第二挤出通道阵列以与上述第一阵列相同的方式与第二贮存器流体连通。

可替代地，可在打印头内预混合生物聚合物和交联剂。在这种情况下，正从贮存器递送的流体在通过挤出通道之前通过微制造混合器。在这种配置中，流动限制溶液可由不促进胶凝作用的缓冲溶液组成。在这种情况下，片材厚度为t＝((QM+QC,PREMIX)/W*V)，其中QC,PREMIX是加入到生物聚合物溶液中用于预混合的交联剂的体积流量。

可替代地，紫外光源可直接定位在卡盒出口之上。可通过生物聚合物的自由基聚合引发固化。生物聚合物在被装载到手持式生物打印机上之前与光引发剂混合，或者光引发剂可在打印头上在线混合。当生物聚合物正在损伤部位挤出时，由发光或激光二极管生成的一片紫外光可用于聚合生物聚合物片材。这种情况下，片材厚度为t＝(QM/W*V)。

固化机理也可通过热胶凝作用来应用。在这个实施方案中，生物聚合物溶液在贮存器和打印头内保持加热或冷却状态。当生物聚合物离开卡盒并与受伤区域接触时，它胶凝化并固化。片材厚度为t＝(QM/W*V)。

分叉通道网络中的通道的水力直径从贮存器到打印头从每个入口到每个出口减小，以增加分配通道处的流动阻力并且确保沉积片材的均匀性。根据默里定律，在分叉的每一步中增加流动阻力的一种方式是减小子分支的水力直径。默里定律预测了运输网络中分支的尺寸，以最大限度地减少因运输和维护介质而造成的工作。对于从一个共同的母分支分裂的n个子分支，默里定律规定，r³＝r₁ ³+r₂ ³+r₃ ³+…+r₃ ⁿ，其中r是母分支的半径并且r₁,…r_n是子分支的半径(Sherman,TF,J Gen Physiol,1981)。由于对于随后分支架构而言在保持通道深度恒定的同时通道宽度有所增加，阻力得以减小，从而降低了压力并随后降低了生物材料堵塞的可能性(参见图8)。

在下文描述的附图中示出的贮存器和分配机构的非限制性实例是具有柱塞的注射器，其中柱塞连接到马达，诸如步进马达，所述步进马达通过有齿马达轴驱动有齿齿轮带，所述有齿齿轮带与柱塞上的有齿齿轮接合，使得控制器用于控制步进马达轴的旋转。应当理解，这个实施方案不限于步进马达、伺服马达、DC马达、气动驱动装置或其他类型的线性驱动器。

另外，除了上述马达、齿轮和有齿齿轮带之外，还可使用其他类型的分配机构。例如，方波压力信号可施加到充满空气的贮存器顶部空间。可使用由Arduino Mega微控制器控制以改变压力信号的频率和占空比的电磁阀(参见图7)。可通过调整上压力水平和阀打开时间来控制斑点大小和体积。还可通过使用压力调节器单独控制贮存器的压出压力来间接选择目标体积流量QM和QC。可针对不同流体根据校准测量获得所施加的进口压力与所获得的流量之间的关系。

微流体打印头可允许在平面方向上组织生物材料。多个贮存器可附接到层内的分配通道并且以条纹配置沉积。可通过调谐来自每个贮存器的生物聚合物溶液的相对流量来控制沉积条纹的几何形状和宽度(参见图5、图6、图32)。

可呈平面几何形状共挤出交联剂和生物聚合物，以获得波纹片材或平行纤维(参见图6、图33)。

组织生物打印机可被配置成独立于人类操作员安装，例如在期望在移动传送装置上产生涂层的情况下(参见图4、图18)，例如以使得能够实现生物材料和组织片材的连续卷对卷加工。

在另一个实施方案中，生物打印机可被配置成由临床医生手持，从而用一只手在表面上方运行装置。在这种情况下，生物打印机被配置成具有待由临床医生抓握的手柄。手柄可按人体工程学设计成具有速度控制开关或按钮，以便临床医生在打印机在患者的伤口区域上方移动时接合。在一个实施方案中，速度控制开关被配置成在开关被接合时给出一个设定速度，在另一个实施方案中，速度控制开关可被配置成根据临床医生按压开关的距离给出可变速度。

对于手持式生物打印机，驱动机构可包括连接到驱动机构的一对轴安装的辊子，并且其中打印头定位在辊子之间，并且打印头的末端与表面之间的角度由人类操作员保持。打印头的出口部分位于旋转轴线下方一个驱动轮半径处，并且挤出方向与驱动轮相切。即使在沉积角度的微小变化期间，这个配置也允许一致的片材沉积。打印头的底侧面紧靠沉积表面定位，并且H按照设计保持。在打印头以固定角度定位在传送装置上方的情况下，高度H可独立地被选择并在沉积过程中保持。在启动驱动机构后的操作期间，所述一对轴安装的辊子由马达(诸如但不限于形成驱动机构的一部分的步进马达、有齿齿轮和齿轮带)旋转地驱动，使得手持式生物打印机以选定的速度V沿表面移动。

可替代地，驱动机构包括连接到驱动机构的辊子，并且所述辊子定位在打印头后面(图2)。在这种情况下，打印头以这样的方式安装，即它可围绕辊子的旋转轴线旋转。从其中挤出生物聚合物的打印头的末端部分通过弹簧机构与沉积表面接触。在启动驱动机构后的操作期间，辊子由马达(诸如但不限于形成驱动机构的一部分的步进马达、有齿齿轮和齿轮带)旋转地驱动，使得手持式生物打印机以选定的速度V沿表面移动(图14、图15)。驱动机构不限于步进马达、有齿齿轮和有齿齿轮带。其他类型的驱动机构可包括伺服马达和气动驱动装置。

可替代地，可通过操作员主动移动打印机来实现移动。在这个实施方案中，利用惰轮或无接触运动检测方法(如任何运动传感器、加速度计或激光)来测量移动。在这种情况下，通过计算机和注射泵来寄存和计算移动，或者在闭环中对掌控生物聚合物和交联剂的流量的空气压力进行控制和调整。

可替代地，手持式生物打印机可被配置成在沉积期间保持固定不动，并且仅通过形成驱动机构的一部分的平移机构移动打印头，其中打印头安装在平移机构上(图3)。平移机构连接到控制器，所述控制器被编程为指示平移机构相对于手持式生物打印机的表面和其余部分两者以所选速度V移动打印头。

生物打印机装置使得生物聚合物片材能够受控沉积在基本上平坦或弯曲的表面上。材料沉积在平坦或弯曲的表面上或者直接沉积在伤口区域上。片材可具有均匀或异质的组合物(图20、图27、图32、图33、图34)。宽高比(宽度对高度，w/t)在10与3,000之间。

生物打印机装置使得生物聚合物片材能够受控沉积在基本上平坦或弯曲的表面上(图30、图31、图34)。材料沉积在平坦或弯曲的表面上或者直接沉积在伤口区域上。片材可具有均匀或异质的组合物。宽高比(宽度对高度，w/t)可在10与3,000之间的范围内。

打印机构不限于产生同质的分层片材。使用本文公开的打印机，可按照自下而上的方法原位制造更复杂的组织。可调谐每个层以具有期望的几何形状和组合物。任何附加层都可沉积在上述分层之上。

使用本发明装置和策略的原位生物打印的应用不限于局部和皮肤外科手术。可应用任何组织粘合剂或更加复杂的几何形状并且在外科手术中在内部器官上实现。

本发明打印机的应用不限于上述的细胞类型。如IPS衍生细胞的其他细胞类型和如细菌和真菌的其他微生物也可使用这个方法原位打印并在水凝胶片材内组织。负载可具有微粒、金和银纳米颗粒、微泡、石墨、导电墨水的乳液，并且也可使用这个方法打印上述材料的任何其他混合物和悬浮液。这个方法的应用不限于生物材料。美容用品、纹身、乳霜、局部覆盖物、运动和挠曲传感器、导电墨水等均可图案化并原位打印。

现在将结合以下非限制性实例描述本发明组织打印机在体外研究和体内研究两者中的用途

体外和体内研究

具体地，体外研究和体内研究两者都使用组织打印机的手持式实施方案进行。对于前者，发明人用水凝胶层(例如，琼脂糖或明胶)涂覆培养皿或多孔板的底表面并用交联剂溶液水合。亲水性和生物惰性表面确保打印一致性并且在培养期间为生物打印的皮肤组织提供机械支撑。在手持式组织打印机沉积生物墨水层之后，通过从下面扩散性释放交联剂以及在顶部处共挤出的交联剂层来诱导胶凝作用。根据应用，生物打印的皮肤替代品可在同一个培养皿中培养，或者在2min到10min(取决于片材厚度)后切割并转移到另一个培养皿、多孔板、半透膜(transwell insert)或转移到伤口部位。作为用于说明所述方法与体内直接沉积的兼容性的案例研究，我们将生物墨水层直接沉积在伤口床上。

方法

琼脂糖基材的制备

通过微波加热来制备2％琼脂糖(UltraPure Agarose，16500100，Invitrogen)在去离子(DI)水中的溶液。将溶液冷却至60℃，然后倒入无菌方形皮氏培养皿(型号Z692344，Sigma Aldrich)中，形成3mm厚的凝胶。使用前，将凝胶在室温下固化30min。为了制备基于藻酸钠的片材，在微波处理之前，将50mM氯化钙(CCL302，BioShop)添加到溶液中。为了打印基于纤维蛋白的片材，移液2ml在PBS(10010023,Gibco)中的50IU凝血酶(T4648,SigmaAldrich)以在挤出前对琼脂糖基材进行水合。

生物墨水制备

制备具有三种不同组合物的生物墨水。对于藻酸盐-胶原片材，将藻酸钠(PronvaUPLVG，Novamatrix)溶解于DMEM(11965-084，Gibco)和20mM HEPES(15630080，Gibco)中并使用0.1μm的注射器微过滤器(Millipore)过滤。使用PBS中的1M NaOH将1型胶原(鼠尾，354249，Corning)的pH平衡至7。将两种储备溶液混合以获得最终浓度为5mg/ml的胶原和2％的藻酸盐。使用前将溶液保持在冰上。为了制备用于真皮层的生物墨水，将5％纤维蛋白原(F8630，Sigma)在37℃下溶解在PBS中，同时温和搅拌2h。将1％HA(sodium hyaluronatePharma Grade 80,Novamatrix)溶解在PBS中。将溶液以1:1的比率混合，然后过滤。将1型胶原溶液的pH用NaOH平衡至7，并且经过滤的纤维蛋白/HA溶液混合，以获得最终浓度为1.25％的纤维蛋白原、0.25％的HA和0.25％的胶原。使用前将溶液保持在冰上。用最终浓度为2.5％的纤维蛋白原和0.25％的HA来制备用于表皮层的生物墨水。

为了打印基于纤维蛋白的片材，在基于纤维蛋白原的真皮和表皮生物墨水上方共挤出一层50IU凝血酶。纤维蛋白原与凝血酶之间的快速酶促反应在所考虑的情况下受质量传递限制。所选择的方法允许在沉积部位上形成片材，所述片材取决于凝血酶浓度和片材厚度t，在数十秒与数分钟之间的时间尺度下固化。胶凝作用时间直接取决于片材厚度。对于由胶原和纤维蛋白原的混合物组成的真皮生物墨水，首先发生纤维蛋白原的胶凝作用并且其通过凝血酶的扩散诱导。结果，在中性pH胶原的较慢热诱导胶凝作用进展的同时，保持了片材厚度和组合物。

通过在生物聚合物层上方共挤出10mM氯化钙来制备基于藻酸盐的片材。类似地，藻酸盐的快速离子交联先于中性pH胶原的较慢热胶凝作用。在完成片材的胶凝作用后，通过将片材在1mg/ml的藻酸盐裂解酶(A1603，Sigma)中温育30min来去除藻酸盐。

沉积的皮肤替代品的物理表征

沉积片材的物理表征包括片材厚度和接触角测量、斑点和条纹大小的测量、拉伸强度。通过扫描电子显微镜(SEM)对n≥3个样品的微观结构进行表征。

片材厚度

将前体溶液与5％的0.2μm直径的荧光微粒(FP-0245-2或FP-0256-2，Spherotech)混合。将片材转移到显微镜盖玻片上，并使用配备数码相机(型号Retiga 2000R Fast1394，Q Imaging)的共焦显微镜(型号A1，Nikon)对所述片材进行成像。使用ImageJ软件分析图像。对每个样品上的5个随机点的厚度进行平均，并且针对每个实验条件选择总共5个随机点。还使用光学轮廓仪(型号Contour GT-K，Bruker)来确定片材厚度。在附接到琼脂糖基材上时将片材切片并转移到轮廓仪样品台。使用Vision64软件程序来分析和导出片材厚度数据。然后将3D轮廓数据导入MatLab中。报告的厚度数据对应于针对样品上5个随机选择点中的每一个的0.5×0.5mm²的感兴趣区域的局部平均值。针对每种实验条件，测量n＝3的片材。图21显示测量数据。本研究中用于获得各种厚度的流量从图22中示出的模型推导出。图23显示了与模型预测相比的在不同生物聚合物中制备的片材的测量数据。

接触角

我们将藻酸盐-胶原、纤维蛋白-胶原和纤维蛋白的片材沉积于琼脂糖，其为10mm长、14mm宽和250μm厚。在平行测试中，将相当体积的纤维蛋白-HA生物墨水(35μL)移液到琼脂糖基材上，并允许其在培养箱内在饱和气氛(湿度为100％)下胶凝。使用液滴形状分析仪(Drop Shape Analyzer)(DSA30，KRUSS)以相对于基材平面2°的倾斜角拍摄沉积的液滴和使用手持式皮肤打印机获得的片材的形状。

浊度测量

原位浊度测量(IST)如下进行。将连续波氩离子激光器(λ＝488nm，200mW，Spectra-Physics)的光束扩大十倍，用镜面引导以竖直穿透光学透明的测量部分并且由放大光电探测器(Thorlabs)收集。在涂覆琼脂糖的皮氏培养皿内，在测量部分之上进行片材沉积实验。发现皮氏培养皿和琼脂糖的吸光度可忽略不计。使用手持式组织打印机，在琼脂糖层之上以V＝4mm/s的沉积速度沉积不同厚度(100、200、400和600μm)的纤维蛋白-HA生物墨水的片材。由发射的激光生成的电压信号(U)使用示波器(Tektronix)获取。为了量化IST，通过A＝-log(U/U₀)＝αl将示波器上记录的电压转换成吸光度，在所述公式中U₀是不存在片材时示波器读取的电压，α是吸收系数(cm^-1)，l是等于片材厚度t的光路的长度。浊度随时间绘制，如图24所示。在手持式组织打印机的卡盒从光路中平移出来约3s后记录浊度测量值。

条纹和斑点大小

制备两种生物墨水注射器并将其装载到手持式组织打印机上。一种包含荧光尼罗红微粒(FCM-1056-2，Spherotech)的二级生物聚合物溶液和一种不含荧光颗粒的一级生物聚合物溶液。用外部注射泵(PHD 2000，Harvard Apparatus)供应交联剂溶液。使用专用微流体卡盒设计沉积条纹图案化的片材。所述专用微流体卡盒的微通道配置允许形成生物聚合物片材，其中二级生物聚合物的条纹或斑点周期性地掺入一级生物聚合物溶液中。改变二级溶液和一级溶液的流量比允许相对的条纹宽度可控地变化。发生胶凝作用后，将条纹图案化的片材转移到盖玻片上以进行共焦显微镜观察。报告的条纹宽度表示针对所有条纹上在3个点(顶部、中部、底部)处测量的单个条纹宽度的总体平均值。ImageJ用于图像分析。

为了获得斑点状图案，制备另一种专用的微流体卡盒设计，其从片上贮存器(即，代替注射泵)供应二级生物聚合物溶液。在用荧光标记的二级生物聚合物溶液装填贮存器之后，将方波压力信号施加到充满空气的贮存器顶部空间。用Arduino Mega微控制器控制电磁阀(LHL系列，Lee公司)，以改变压力信号的频率和占空比。通过调整上压力水平和阀打开时间来控制斑点大小和体积。

拉伸特性

基于由Tremblay等人描述的设计³²，使用定制拉伸测试仪测量胶原和琼脂糖片材的单轴拉伸测量值。大约10mm长的水合样品片材在两个相对的侧面上，由定制C形夹具固持，所述夹具具有附接到其表面的砂纸。使用手动平移台(MT1B；Thorlabs)将夹具定位在竖直方向z上。沿拉动方向x的运动，由滚珠轴承滑道(37-360，Edmund Optics)上的线性音圈马达(LVCM-051-051-01，MotiCont)控制。使用定制LabVIEW软件程序对运动控制器(DMC-4143，Galil)进行寻址，并且运动控制器使用光编码器(MII 1610S-40，Celera Motion)信号在反馈模式下控制音圈马达的位移。以0.01mm/s的速度拉动样品并移位直至破裂。负载传感器(Load cell)(Model 31Low，Honeywell)测量给定位移下的力。使用DAQ卡(USB-1208LS，Measurement Computing)和放大器(型号UV-10，Honeywell)将信号从负载传感器传输到运动控制器。使用Zeiss和Nikon Ti倒置显微镜评估样品长度和宽度以计算横截面积。后者结合马达位置和负载传感器校正力得到应力-应变曲线。对弹性区域进行线性回归拟合以计算每个样品的杨氏模量。图26显示来自拉伸测量的结果。

微观结构

将基于藻酸盐、胶原和纤维蛋白的生物材料在室温下用Karnovsky类型固定液在Sorensen缓冲液中固定1h，然后在具有包含30％到100％乙醇的溶液的连续乙醇洗涤液中将其脱水。然后使用临界点干燥器干燥样品。在扫描电子显微镜(S-3400N，Hitachi)上成像之前，使用30kV的加速电压溅射金。图25显示了具有不同组合物的打印的生物材料片材的电子显微照片。

体外表征

细胞来源：

外科手术后从健康人正常皮肤获得HDFa。将细胞在生长培养基(DMEM，10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素/抗真菌剂(Ab/Am))中培养直至接近铺满状态，并通过用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理进行处理来分裂成后续传代细胞。根据公司说明书，在包含1％HKGS和1％Ab/Am的EpiLife培养基中培养人脐带表皮角质形成细胞(C-011-5C，Gibco Invitrogen)，并使用与用于成纤维细胞相同的胰蛋白酶-EDTA溶液进行胰蛋白酶消化。在整个研究中使用传代3-5次时的细胞。

细胞填充的皮肤替代品的沉积

对于皮肤替代品的体外制备，真皮生物墨水包含0.5·10⁶人原代成纤维细胞，然后在琼脂糖上沉积成厚度为δ_D＝500μm的片材。将片材在37℃下温育20min以允许胶原完全热胶凝。表皮生物墨水包含1.5·10⁶人原代角质形成细胞。将表皮层以厚度t_E＝200μm顺序地打印在真皮层之上。根据研究，将不同图案的表皮层(均匀或条纹状的)沉积在真皮层之上。然后将片材浸入培养基(EpiLife培养基，含60μm钙，Gibco^TM)中。将片材与琼脂糖基材分离，切片成期望大小并在多孔板中培养。

细胞成活率

在具有HKGS生长补充物和1％青霉素-链霉素的EpiLife培养基中，将人真皮成纤维细胞和角质形成细胞分别在胶原/纤维蛋白和纤维蛋白凝胶中培养3天。然后除了使用Hoechst细胞核染色，还用钙黄绿素和乙锭同型二聚体对细胞染色，以用于分析活细胞和死细胞。各个96孔板中的生物材料中细胞的共焦图像以4x和10x放大率拍摄，采用三次生物学重复。成活百分比的计算如下进行：使用ImageJ软件对钙黄绿素或乙锭同型二聚体染色呈阳性的细胞数量进行计数，并将所述数量与如使用Hoechst细胞核染色所指示的细胞总数进行比较，如图28a、b所示。

细胞密度

使用前述方法将人真皮成纤维细胞和角质形成细胞培养三天。通过用Hoechst染色细胞，用共焦显微镜成像，并且使用ImageJ软件自动计算细胞总数来观察细胞密度。

免疫组织化学

将片材中的细胞用HBSS中的4％低聚甲醛在室温下固定1h，然后用HBSS洗涤。将它们在室温下用HBSS中的0.5％Triton X-100透化30min，然后用HBSS洗涤。用封闭缓冲液(HBSS中的0.25％Triton X-100中的1％BSA)将细胞封闭1h。将抗体在封闭缓冲液中稀释并在4℃温育过夜。一级抗体包括荧光素鬼笔环肽(Life Technologies)和细胞角蛋白14(Santa Cruz Biotechnology)。在仅进行鬼笔环肽染色的情况下，接下来进行封固步骤。对于角质形成细胞，用HBSS洗涤样品，然后与二级Alexa Fluor抗体(Life Technologies)温育。洗涤3次之后，使用包含DAPI(Vector Laboratories)的Vectashield封固剂封固载玻片。在Apotome Axiovert全场荧光或Observer Z1转盘式共焦显微镜(均来自Zeiss)上拍摄图像。

组织学

将组织标本在10％缓冲福尔马林中在4℃固定过夜，储存在70％乙醇中并包埋在石蜡中。将标本在伤口中心切成5μm切片。除非另有说明，否则从EMS(Hatfield)获得三色试剂。简而言之，将石蜡包埋的载玻片用柠檬油精(citrosol)脱石蜡，然后通过各等级的乙醇再水合至水。将载玻片在60℃下置于布安氏溶液(Bouin’s solution)中1h并在水中洗涤。将苏木精(Sigma)和Biebrich猩红-酸性品红溶液分别各自染色10min，其间进行洗涤。使载玻片在磷钼酸-钨酸中分化15min，并转移至苯胺蓝保持5min。漂洗载玻片并在使其1％乙酸中分化2min。将载玻片通过95％乙醇和无水乙醇脱水，然后在柠檬油精中清洗。使用SHUR/Mount基于二甲苯的液体封固剂(Triangle Biomedical Sciences)封固载玻片。使用光学显微镜(Leica DM 2000LED)获得图像。

对于免疫组织化学染色，将石蜡包埋的皮肤组织载玻片用柠檬油精脱石蜡，然后再水合。将抗原去封闭剂(decloaker)(1X，Biocare)在预热的去封闭室中在110℃下添加到载玻片保持4min。用3％H₂O₂将样品封闭10min，然后用洗涤缓冲液(去离子水中的0.05MTris-HCl，0.15M NaCl，0.05％Tween 20)洗涤。将一级抗体在PBS中稀释，并在室温下温育1h。使用的一级抗体是细胞角蛋白14(Santa Cruz Biotechnology)。接下来，将载玻片首先与山羊抗啮齿类动物(goat-on-rodent)探针(Biocare Medical)一起温育15min，其次与山羊抗啮齿类动物HRP-聚合物一起温育15min。添加betazoid DAB色素原试剂盒(BiocareMedical)保持5-10min，并且用自来水终止反应。用苏木精进行细胞核染色30s，然后通过在1.5％酸性醇中浸蘸3次使其分化并在0.1％碳酸氢钠中蓝化处理10s。如前所述，将切片通过95％和无水乙醇脱水至柠檬油精并用SHUR/Mount封固。使用LeicaDM 2000LED光学显微镜获得图像。

片材同质性和均匀性。

图20示出与手动移液的水凝胶前体(左)相比的使用皮肤打印机(右)生产的t＝300μm片材的明视场图像。两张图像均以与涂覆有水合琼脂糖层的平坦表面成4°的角度获得。移液的水凝胶形成具有非均匀厚度的圆顶形弯曲结构。尽管接触角小，但是从周边进行的水凝胶的胶凝作用阻碍了水凝胶的均匀扩散。然而，用手持式皮肤打印机打印的片材表现出一致的厚度t，因为使用微流体卡盒上的平行通道，水凝胶前体溶液沿横向方向y均匀分布，并且在片材法线方向上均匀地发生快速胶凝作用。结果，沉积的t＝300μm厚、w₀＝14mm宽的片材具有均匀的厚度和锋利的边缘，如光学轮廓仪扫描所示(图20b)。由片材到琼脂糖层的接触线引起的不均匀性从每侧看仅跨越片材宽度的不到5％。

我们接下来讨论作为打印参数的函数的厚度t。我们考虑两个表面之间分层流体的层流并应用润滑理论²⁸。因为w₀/H>10，我们将水力直径近似为2H。我们忽略了z方向上的压力梯度和惯性力。连续性方程和简化动量平衡产生描述沿薄膜的压力梯度的单个椭圆微分方程。推导出了分析模型。所述模型考虑了生物聚合物和交联剂溶液的粘度(μ_m，μ_c)和流量(QC，QM)，并且预测了生物聚合物片材厚度t(图22)。通过分析预测的片材厚度与针对生物打印的基于纤维蛋白和基于藻酸盐的片材所测量的值非常一致(图23)。可使用所考虑的微流体卡盒可靠地获得t＝100μm与600μm之间的片材厚度(H＝1mm)。打印更厚的片材需要改进的卡盒设计(H>1mm)。此外，更大的片材厚度增加了扩散长度～t/2、扩散时间～t²/4和胶凝作用时间并且降低了厚度均匀性。零压力梯度情况下实现了一致的片材沉积。针对给定的粘度μ_m和μ_c，流量QM和QC被选择成使得压力沿沉积方向不变并且回流或溢流得以避免。

本文公开的手持式组织打印机与不同的生物聚合物兼容。在这里，我们展示了与利用离子交联的基于多糖的生物聚合物(藻酸盐)的兼容性，以及与利用酶促反应的基于蛋白质的生物聚合物(纤维蛋白)的兼容性。在仅藻酸盐和藻酸盐-胶原的情况下，通过与氯化钙离子交联来诱导胶凝作用。通过纤维蛋白原前体与凝血酶之间的酶促反应制备纤维蛋白和纤维蛋白-胶原的片材。表皮层和真皮层生物墨水以及交联剂溶液的组合物汇总在表1中。两种生物墨水选择都是高度生物相容的、可生物降解的，并且在体外培养或直接体内实现之前不需要二级洗涤步骤。

表1本研究中使用的不同生物聚合物和交联剂组合的配比。

了解片材胶凝作用的进展是手持式组织打印机应用的一个关键方面。胶凝作用起始于生物聚合物与交联剂层之间的界面处并且在整个生物聚合物的厚度中传播，从而得到片材的完全胶凝作用。对于基于藻酸盐的片材，在与从上方共同递送的氯化钙接触时快速诱导离子胶凝作用。纤维蛋白的胶凝作用是一个较慢的过程。为了保持沉积的片材架构，例如多层或条纹图案化的片材，当发生胶凝作用时，我们通过添加透明质酸来增加基于纤维蛋白的生物墨水的粘度。我们进行了系统浊度测量以评估胶凝作用的动力学。图24示出在t＝100μm与600μm之间变化的不同厚度下的纤维蛋白-HA片材的浊度测量结果。通过凝血酶从上方(共挤出)和下方(扩散地释放)的相互扩散诱导胶凝作用。

可控制地沉积基于多糖的(例如，藻酸盐)和基于蛋白质的材料(例如，纤维蛋白-胶原)及其混合物的能力允许我们根据有利的打印性能以及细胞附着和功能选择生物材料组合物。图25示出本文考虑的四种生物墨水组合物的微观结构的代表性扫描电子显微镜(SEM)图像。图26示出沉积片材的杨氏模量和断裂伸长率。与基于纤维蛋白的片材相比，基于藻酸盐的复合材料显示出更高的杨氏模量。前者表现出更高的弹性和2.6倍高的断裂伸长率(应变恒定)。

为了获得具有可控厚度的多层片材，可使用手持式皮肤打印机连续沉积片材。逐步方法使得能够沉积多层片材，其中基质或细胞成分在竖直(z)方向上变化。图27示出片材的共焦显微照片，所述片材在三个连续步骤中形成：首先，沉积500μm有效负载为0.1μm蓝色聚苯乙烯颗粒的纤维蛋白层。5min后，将藻酸盐和FITC缀合的1型胶原的混合物沉积在第一层之上。30min后，沉积最后的150μm厚的包含0.2μm尼罗红颗粒的藻酸盐层。

条纹和斑点图案化的片材

在打印方向(x)和横向方向(y)上控制片材组合物的能力允许在无需移动部件的情况下生产出架构式片材。可使用提供条纹状图案的机载注射泵(图5或图32a)或提供斑点状图案的压力控制(图7)来控制相应的生物聚合物流量。通过利用流体动力学聚焦实现比微制造卡盒的最小特征尺寸窄的条纹²⁹。在此，我们使用先前开发的方法证实了四个二级生物聚合物条纹的掺入³⁰。通过改变流量比率Q_M/Q_C来改变相对条纹宽度w_条纹/w₀，如图32b、c所示。当二级生物聚合物溶液从加压孔(well)递送并且施加时间依赖性压出压力时，斑点而不是条纹被图案化。操纵方波压力信号的频率和占空比可得到不同的斑点大小。后续斑点之间的距离由阀关闭时间以及一级生物聚合物溶液的流量掌控(图32d、e)。

手持式组织打印机体外研究

由于材料选择和打印参数，手持式组织打印机能够沉积哺乳动物细胞而不影响细胞成活率。对于体外实验，我们选择了一种包括透明质酸、纤维蛋白原和I型胶原的生物墨水组合物。通过凝血酶在中性pH和室温下的酶活性诱导纤维蛋白原组分的胶凝作用。透明质酸的添加提高了生物墨水的粘度和打印适性而不会对细胞成活率产生不利影响。另外，打印方法的特征在于不会损坏细胞的低剪切速率(大约1/s)。图28a和图28b示出包埋在基于纤维蛋白的生物材料中的人真皮成纤维细胞(HDFa)基于培养10天后进行的活/死测定表现出超过90％的成活率。我们发现，对于范围从0.1到1000万/ml的五种不同浓度的细胞，原始细胞接种密度与在打印片材上进行Hoechst细胞核染色和共焦显微镜检查之后在时间零处获得的细胞密度一致。在打印后没有立即观察到细胞或生物材料团块或聚集体，表明递送的细胞保持均匀地分散在生物材料内。

将FB与纤维蛋白-胶原-HA水凝胶前体混合并且使用手持式组织打印机打印。将生物打印的片材固定并在打印后的不同时间点(0、3、6和12h)对细胞核和细胞骨架染色。结果表明细胞适应3D支架而不影响形态，因为它们在打印的最初几个小时内表现出与标准细胞培养条件相当的伸长和附着(图29a)。与依赖于来自宿主的相邻细胞迁移和填充所递送的材料的无细胞支架(诸如Integra^TM)相比，我们的方法利用在沉积之前与细胞预混合的水凝胶以促进细胞存活和与周围微环境的交互作用³¹。这与无细胞基质相比可促进体内更快的真皮层重建。

角质形成细胞(HEKa)是皮肤表皮层的必要细胞组分。将人KC以125万/ml的浓度混合并且使用我们的纤维蛋白/HA生物墨水在δ＝200μm的层中打印。从这种组合物中省略I型胶原材料以模拟经历伤口修复的表皮层。通过将KC片材进行为期三天的培养，我们证明打印的角质形成细胞在这种3D基质中表现出正常的形态(图29c)。在第0天，将细胞单独分散并同质地分布在片材内。在3D培养的三天内，打印的角质形成细胞具有聚集的形态，如使用z堆叠共焦显微镜检查可视化的，这表明正常的上皮活性。另外，我们证明角质形成细胞也可组织在包括条纹在内的不同图案中。条纹的宽度和距离可通过调谐流体的体积流量和微流体打印头的设计来掌控，如图34a所示。在此，四个具有w_条纹＝500μm的包含角质形成细胞的条纹在8mm宽的片材中图案化，并且使用鬼笔环肽染色使其可视化。

为了模拟皮肤的分层架构，沉积包含角质形成细胞和真皮成纤维细胞两者的双层片材(图28d)。首先，沉积500μm厚的在胶原/纤维蛋白基质中浓度为4x10⁵细胞/ml的人真皮成纤维细胞层。其次，在真皮层之上沉积100μm的包埋在纤维蛋白/HA基质内的角质形成细胞层。双层构建体的免疫染色显示独特分层结构中的细胞区室化，如不同却又相连接的两个细胞层所示。使用Hoechst细胞核染色和共焦显微镜检查对细胞数量进行定量，显示出总细胞数在3天培养期间增加，表明持续的细胞生长和增殖(图29b)。

使用猪模型的体内沉积案例研究

按照Sunnybrook动物护理委员会(AUP#:16-600)的审阅方案，对体重为25kg的雄性约克郡(Yorkshire)猪进行切除皮肤活组织检查。在Sunnybrook研究所，在室温和12h光暗循环下将猪圈养在单独的围栏内，随意获取食物和水。由内部动物工作人员进行喂养和日常护理，并且由指定的兽医监督。遵守标准饮食和动物护理标准操作程序。所有动物在外科手术前禁食至少6h，并且使用与兽医一起制定的标准化方案每日评估。相应地调整止痛药。麻醉诱导后，通过电剃须去除毛，之后进行化学脱毛。手术区域用聚维酮碘消毒，使用外科手术刀在先前标记的区域进行皮肤切除，其余手术使用单极电刀进行，单极电刀也用于止血。

猪皮具有人皮肤的几个特征，使其成为用于评估在临床相关背景中利用组织打印机的可行性的理想模型。我们沉积到20mm×40mm全厚度切除皮肤伤口上，并且与未接受任何材料的对侧伤口进行比较(对照，n＝4)。手术前在动物背部标记伤口并且造成全厚度切除伤口。切除后，通过直接沉积300μm纤维蛋白-HA片材来覆盖伤口(图30a至d)，或者不做任何处理作为对照。伤口粘合剂片材覆盖的伤口约5min后停止出血，而对照伤口在几十分钟后达到止血。

对采集的愈合伤口的显微镜分析(第20天处死)显示：经处理的伤口和对照伤口两者都形成完整的肉芽组织(图31)，并且经处理的和对照伤口两者的胶原沉积和细胞性(cellularity)的水平相当。在4个对照伤口之中，只有1个显示完全再上皮化，而4个经处理的伤口中有3个具有完全再上皮化(非显著性参数检验)。为了进一步评估和比较伤口愈合特征，将愈合的伤口用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和角蛋白10(K10)抗体染色。α-SMA在皮肤愈合期间由肌成纤维细胞瞬时表达，并且用作评估皮肤愈合进展的标志物。

存在的数据未显示经处理的伤口与对照伤口相比之间的显著差异。作为表皮层中细胞分化标志物的K10的染色未显示经处理的伤口中的分化细胞程度与对照中相比之间的显著差异。体内结果说明：皮肤替代品的原位沉积在施用后立即提供无害的止血屏障，并且不妨碍正常的再上皮化和伤口收缩。

如上所述，在20天后实验结束时，对猪实施安乐死并切除伤口/瘢痕，固定在甲醛中并送去进行组织学制备。将用于染色的所有组织包埋在石蜡中，切成5μm厚的切片并置于标准载玻片上以用于三色染色和免疫组织化学染色。对于染色，在用柠檬油精(CitriSolvHybrid^TM，Decon Labs)脱石蜡后，将包含组织的载玻片在布安氏溶液(Bouin's Fixative，Electron Microscopy Sciences)中在室温温育24h。染色如下进行：苏木精(HarrisHematoxylin Solution，Sigma-Aldrich)，Bibrich猩红-酸性品红(Electron MicroscopySciences)，之后是苯胺蓝(Electron Microscopy Sciences)。

总结

本文公开了一种生物打印机，作为实现将架构式分层生物材料和分层组织可控原位沉积到目标表面上的技术平台。根据所使用的卡盒和打印机前进速度，可用的生物聚合物沉积速率为0.3-1.6cm²/s，所述沉积速率超过大多数基于挤出的生物打印机达至少一个数量级。虽然在皮肤背景下针对成纤维细胞和角质形成细胞进行了证明，但本发明人设想这个方法与宽泛范围的细胞类型兼容。除了所采用的生物材料之外，发明人设想了宽泛范围的天然和合成生物聚合物溶液与本公开内容兼容。

工程皮肤替代品(ESS)很容易沉积在平坦表面(体外)或伤口床(体内)上。所述方法避免了原本需要的附加洗涤和温育步骤以及对强度较弱且大宽高比的构建体的复杂操作。所述ESS在几分钟内以临床相关速率制备。反向植皮刀很容易使用，并且不需要复杂原位扫描和多轴打印头平移。我们预计所需的操作员培训水平与常规植皮刀所需的水平相当。

本文公开的手持式组织打印机是一种紧凑的仪器(重量小于0.8kg)，设计用于手术室的常规使用。针对所选择的将生物聚合物沉积到猪伤口模型上的案例研究所获得的体内结果表明：所述方法有利于在临床背景中用于伤口愈合研究的细胞、生长因子和细胞外基质材料(ECM)的递送。

所述描述是示例性的，并且不应被解释为限制本发明或其应用。说明书中提到的具体部件或部件标号可用功能等效物代替。

已经通过举例的方式示出上述具体实施方案，并且应理解，这些实施方案可容许各种修改和替代形式。还应当理解，权利要求不意图仅限于所公开的特定形式，而是覆盖落入本公开的精神和范围内的所有修改、等效物和替代物。

参考文献

1 T.et al.Autologous skin transplantation：comparison of mincedskin to other techniques.Journal of Surgical Research 103，19-29(2002).

2 Yannas，I.，Burke，J.，Orgill，D.&Skrabut，E.Wound tissue can utilize apolymeric template to synthesize a functional extension of skin.Science 215，174-176(1982).

3 Gerlach，J.C.et al.Method for autologous single skin cell isolationfor regenerative cell spray transplantation with non-cultured cells.TheInternational Joumal of Artificial Organs 34，271-279(2011).

4 Murphy，S.V.&Atala，A.3D bioprinting of tissues and organs.NatureBiotechnology 32，773-785(2014).

5 Tasoglu，S.&Demirci，U.Bioprinting for stem cell research.Trends inBiotechnology 31，10-19(2013).

6 Pati，F.，Gantelius，J.&Svahn，H.A.3D Bioprinting of Tissue/OrganModels.Angewandte Chemie-International Edition 55，4650-4665，doi：10.1002/anie.201505062(2016).

7 Kang，H.W.et al.A 3D bioprinting system to produce human-scaletissue corstructs with structural integrity.Nature Biotechnology 34，312-+，doi：10.1038/nbt.3413(2016).

8 Pataky，K.et al.Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into 3DTissue·Like Geometries.Advanced Materials 24，391-396(2012).

9 Dhariwala，B.，Hunt，E.&Boland，T.Rapid prototyping of tissue-engineering constructs，using photopolymerizable hydrogels andstereolithography.Tissue Engineering 10，1316-1322(2004).

10 Dendukuri，D.，Pregibon，D.C.，Collins，J.，Hatton，T.A.&Doyle，P.S.Continuous-flow lithography for high-throughput microparticlesynthesis.Nature Materials 5，365-369(2006)

11 Xu，T.，Jin，J.，Gregory，C.，Hickman，J.J.&Boland，T.Inkjet printing ofviable mammalian cells.Biomaterials 26，93-99(2005).

12 Boland，T.，Xu，T.，Damon，B.&Cui，X.Application of inkjet printing totissue engineering.Biotechnology Journal 1，910-917(2006).

13 Odde，D.J.&Renn，M.J.Laser-guided direct writing for applications inbiotechnology.Trends in Biotechnology 17，385-389(1999).

14 Barron，J.A.，Ringeisen，B.R.，Kim，H.，Spargo，B.J.&Chrisey，D.B.Application of laser printing to mammalian cells.Thin Solid Films 453，383-387(2004).

15 Norotte，C.，Marga，F.S.，Niklason，L.E.&Forgacs，G.Scaffold-freevascular tissue engineering using bioprinting.Biomaterials 30，5910-5917(2009).

16 Melchels，F.P.，Dhert，W.J.，Hutmacher，D.W.&Malda，J.Development andcharacterisation of a new bioink for additive tissue manufacturing.Journal ofMaterials Chemistry B 2，2282-2289(2014).

17 Ferris，C.J.，Gilmore，K.J.，Beirne，S.，McCallum，D.&Wallace，G.G.Bio-inkfor on-demand printing of living cells.Biomaterials Science 1，224-230(2013).

18 Onoe.H.et al.Metre-Iong cell-laden microfibres exhibit tissuemorphologies and functions.Nature Materials 12，584-590(2013).

19 Yu，L.&Ding，J.Injectable hydrogels as unique biomedicalmaterials.Chemical Society Reviews 37，1473-1481(2008).

20 Griffin，D.R.，Weaver，W.M.，Scumpia，P.O.，Di Carlo，D.&Segura，T.Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembledfrom annealed building blocks.Nature Materials 14，737-744(2015).

21 Navarro，F.et al.Sprayed keratinocyte suspensions accelerateepidermal coverage in a porcine microwound model.Joumal of Bum Care&Research21，513(2000).

22 Falanga，V.et al.Autologous bone marrow-derived culturedmesenchymal stem cells delivered in a fibrin spray accelerate healing inmurine and human cutaneous wounds.Tissue Engineering 13，1299-1312(2007).

23 Lee，S.-H.&Shin，H.Matrices and scaffolds for delivery of bioactivemolecules in bone and cartilage tissue engineering.Advanced Drug DeliveryReviews 59，339-359(2007).

24 de las Heras Alarcon，C.，Farhan，T.，Osborne，V.L.，Huck，W.T.S.&Alexander.C.Bioadhesion at micro-patterned stimuli-responsive polymerbrushes.Journal or Materials Chemistry 15，2089-2094(2005).

25 Foster，K.et al.Efficacy and safety of a fibrin sealant foradherence of autologous skin grafts to burn wounds：results of a phase3clinical study.Journal of Burn Care&Research 29，293-303(2008).

26 Wijnen，B.，Hunt，E.J.，Anzalone，G.C.&Pearce，J.M.Open-source syringepump library.PloS One 9，e107216(2014).

27 Au，A.K.，Huynh，W.，Horowitz，L.F.&Folch，A.3D·printedmicrofluidics.Angewandte Chemie International Edition(2016).

28 Batchelor，G.K.An introduction to fluid dynamics.(CambridgeUniversity Press，2000).

29 Knight，J.B.，Vishwanath，A.，Brody，J.P.&Austin，R.H.Hydrodynamicfocusing on a silicon chip：mixing nanoliters in microseconds.Physical ReviewLetters 80，3863(1998).

30 Leng，L.，McAllister，A.，Zhang，B.，Radisic，M.&Günther，A.Mosaichydrogels：one·step formation of multiscale soft materials.Advanced Materials24，3650-3658(2012).

31 Slaughter，B.V.，Khurshid，S.S.，Fisher，O.Z.，Khademhosseini，A.&Peppas，N A.Hydrogels in regenerative medicineAdvanced Materials 21，3307-3329(2009)

32 Tremblay，D.，Cuerrier，C.M.，Andrzejewski，L.，O′Brien，E.R.&Pelling，A.E.A novel stretching platform for applications in cell and tissuemechanobiology.Journal of Visualized Experiments，e51454-e51454(2014).

33 Emerson，D.R.，K.，Gu，X.&Barber，R.W.Biomimetic design ofmicrofluidic manifolds based on a generalised Murray′s law.Lab on a Chip 6，447-454(2006).

34 Pinkus.O.The Reynolds Centennial-a Brief-History of the Theory ofHydrodynamic Lubrication.J Tribol-T ASME 109，2-20(1987).

Claims

1.一种生物打印机，用于受控原位形成生物聚合物片材和平面组织并将其沉积在表面上，所述生物打印机包括：

2.根据权利要求1所述的生物打印机，其中所述驱动机构被配置成提供可变速度V，并且其中所述控制器被编程有指令，所述指令用于控制所述第一分配机构以作为响应调整所述流量QM，使得针对给定的速度V保持所述流量条件。

3.根据权利要求1所述的生物打印机，其中所述第二分配机构与所述控制器可操作地耦合，并且被配置成以所述流量QC分配所述液体，这满足条件

QC＝0.5W·V·(H–t)

4.根据权利要求3所述的生物打印机，其中所述驱动机构被配置成提供可变速度V，并且其中所述控制器被编程有指令，所述指令用于控制所述第一分配机构和所述第二分配机构以作为响应调整所述流量QM和QC，使得针对给定的速度V保持所述条件。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的生物打印机，其中所述打印头的出口部分包括从所述第二阵列的顶表面向外延伸的悬伸部分，所述悬伸突出部分从所述出口部分向外延伸长度L。

6.根据权利要求5所述的生物打印机，其中L等于或大于H的值。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的生物打印机，其中所述第一挤出通道阵列通过分叉通道网络与所述第一贮存器流体连通，所述分叉通道网络包括连接到所述第一贮存器的第一通道，所述第一通道分叉成两个通道，所述两个通道进一步分叉，直到最终通道的数量等于所述第一阵列中挤出通道的数量，并且每个通道的末端与所述第一阵列中对应的挤出通道的末端相邻，并且其中所述第二挤出通道阵列通过分叉通道网络与所述第二贮存器流体连通，所述分叉通道网络包括连接到所述第二贮存器的第一通道，所述第一通道分叉成两个通道，所述两个通道进一步分叉，直到最终通道的数量等于所述第二阵列中挤出通道的数量，并且每个通道的末端与所述第二阵列中对应的挤出通道的末端相邻。

8.根据权利要求7所述的生物打印机，其中根据默里定律，所述分叉通道网络中的所述通道的水力直径从所述贮存器到所述打印头从每个入口到每个出口减小。

9.根据权利要求7所述的生物打印机，其还包括手柄，所述手柄用于允许用户在分配操作期间抓握和使用所述生物打印机，使得所述生物打印机是手持式生物打印机。

10.根据权利要求9所述的手持式生物打印机，其中所述驱动机构包括连接到所述驱动机构的一对轴安装的辊子，并且其中所述打印头定位在所述辊子之间，并且其中所述末端部分包括圆形引导特征，所述圆形引导特征在通道装置出口与沉积表面之间保持一致的间隙高度而不管沉积角度是否改变，并且其中在启动所述驱动机构后的操作期间，所述一对轴安装的辊子被旋转驱动，使得所述手持式生物打印机以所述速度V沿所述表面移动。

11.根据权利要求9所述的生物打印机，其中所述驱动机构包括连接到所述驱动机构的辊子，并且其中所述辊子定位在所述打印头后面，并且其中末端部分包含圆形引导特征，所述圆形引导特征在通道装置出口与沉积表面之间保持一致的间隙高度而不管沉积角度是否改变，并且其中在启动所述驱动机构后的操作期间，所述辊子被旋转驱动，使得所述手持式生物打印机以所述速度V沿所述表面移动。

12.根据权利要求9所述的手持式生物打印机，其中所述驱动机构包括附接到所述框架的平移机构，所述打印头安装在所述平移机构上，所述平移机构被配置成相对于所述表面以所述速度V移动所述打印头。