JP7075599B2 - 組織プリンタ - Google Patents
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Description
a)支持フレームおよび支持フレームに取り付けられた印刷ヘッドであって、印刷ヘッドは、第1配列の押出チャネルを、および、少なくとも、動作時において第1配列が表面に対して近位に隣接して配置され、印刷ヘッドの端部区域が、第1配列および第2配列が幅Wにわたるように幅Wを有するよう、第1配列に対して配置された、押出チャネルの第2配列を、含む、支持フレームおよび印刷ヘッドと、
b)フレームに取り付けられた第1貯蔵槽であって、押出チャネルの第1配列は、表面上に対して押し出されるバイオポリマーの第1貯蔵槽に対して流体連通し、液体の第2貯蔵槽はフレームに取り付けられ、第2配列は、押し出されるバイオポリマーとともに押し出される液体の第2貯蔵槽に対して流体連通し、QMの流速でバイオポリマーを吐出するよう構成された第1貯蔵槽に関連付けられた第1吐出機構、および、QCの流速で液体を吐出するよう構成された第2貯蔵槽に関連付けられた第2吐出機構を含む、第1貯蔵槽と、
c)オペレータにより作動されたとき印刷ヘッドが表面の上方で垂直方向高さHに配置された表面に沿って事前選択された速度Vで駆動されるよう、フレームに取り付けられた駆動機構と、
d)駆動機構および第1吐出機構に接続され、かつ、駆動機構を作動させたときに、第1吐出機構はバイオポリマーを流速QM、厚さtの層で吐出するようプログラムされた制御器であって、これは、
QM=W・V・H(6(t/H)-6(t/H)2+3(t/H)2(μC/μM))/(6(t/H)(μC/μM)-6(t/H)+6)
という条件を満足する、制御器と
を含む、バイオポリマーシートおよび平坦な組織の制御されたインサイチュ形成および表面上の堆積のためのバイオプリンタを提供する。
QC=0.5W・V・(H-t)
を満足する流速QCで液体を吐出するよう構成される。
a)支持フレームおよび支持フレームに取り付けられた印刷ヘッドであって、印刷ヘッドは、第1配列の押出チャネルを、および、少なくとも、動作時において第1配列が表面に対して近位に隣接して配置され、印刷ヘッドの端部区域が、第1配列および第2配列が幅Wにわたるように幅Wを有するよう、第1配列に対して配置された、押出チャネルの第2配列を、含む、支持フレームおよび印刷ヘッドと、
b)フレームに取り付けられた第1貯蔵槽であって、押出チャネルの第1配列は、表面上に対して押し出されるバイオポリマーの第1貯蔵槽に対して流体連通し、液体の第2貯蔵槽はフレームに取り付けられ、第2配列は、押し出されるバイオポリマーとともに押し出される液体の第2貯蔵槽に対して流体連通し、QMの流速でバイオポリマーを吐出するよう構成された第1貯蔵槽に関連付けられた第1吐出機構、および、QCの流速で液体を吐出するよう構成された第2貯蔵槽に関連付けられた第2吐出機構を含む、第1貯蔵槽と、
c)オペレータにより作動されたとき印刷ヘッドが表面の上方で垂直方向高さHに配置された表面に沿って事前選択された速度Vで駆動されるよう、フレームに取り付けられた駆動機構と、
d)駆動機構および第1吐出機構に接続され、かつ、駆動機構を作動させたときに、第1吐出機構はバイオポリマーを流速QM、厚さtの層で吐出するようプログラムされた制御器であって、これは、QM=W・V・H(6(t/H)-6(t/H)2+3(t/H)2(μC/μM))/(6(t/H)(μC/μM)-6(t/H)+6)という条件を満足する、制御器と
を含む、バイオポリマーシートおよび平坦な組織の制御されたインサイチュ形成および表面上の堆積のためのバイオプリンタを提供する。
QC=0.5W・V・(H-t)という条件を満足する流速QCで液体を吐出するよう構成される。
QM=W・V・H(6(t/H)-6(t/H)2+3(t/H)2(μC/μM))/(6(t/H)(μC/μM)-6(t/H)+6)
という条件を満足する。
多くの場合では、封じ込め溶液はバイオポリマー溶液の粘度、μMよりもはるかに低い粘度、μCを有し、関係はQM=W・V・tに簡略化される。Wは、プリントヘッドの設計特徴であり、したがって固定値であり、通常は、約5mm~約30mmの範囲内の値として選択される。後で論じるように、プリントヘッドの幅全体にわたり印加される力は、プリントヘッドにおいて第1配列の押出チャネルの幅の全域にわたり均一な吐出が保証されるよう、均等であると好適である。吐出されるバイオポリマーの厚さtは通常、約0.01mm~約1mmの範囲内である(図21および図23参照)。
QC=0.5W・V・(H-t)
という条件を満足する流速QCで液体を吐出するよう構成される。
特に、生体内および試験管内の両方の研究が、組織プリンタのハンドヘルド型実施形態を使用して実施された。前者に対して、発明者らは、シャーレまたは複数ウェルを有するプレートの底部表面をヒドロゲル層(例えばアガロースまたはゼラチン)で被覆し、架橋剤溶液を用いてヒドロゲル層を水和させた。親水性および生物学的不活性を示す表面は、印刷整合性を保証し、培養の間の機械的支持を有するバイオプリンティングされた皮膚組織を提供する。ハンドヘルド型組織プリンタがバイオインク層を堆積した後、ゲル化が、下方から、および、上部に共押出しされた架橋剤層から、架橋剤の拡散的放出により、誘導された。用途に応じて、バイオプリンティングされた皮膚代替物は同一のシャーレで培養されてもよく、または、切断され、2~10分(シート厚さに応じて)後に、他のシャーレ、マルチウェルプレート、トランスウェルインサートに、または創傷部位に、転送され得る。生体内での直接的堆積に対する本アプローチの適合性を示すよう作用する事例研究として、われわれはバイオインク層を創傷床に対して直接的に堆積した。
アガロース基質の準備
脱イオン化(DI)水内の2%アガロース(UltraPure Agarose、16500100、Invitrogen)の溶液が、マイクロ波加熱により準備された。溶液は、殺菌済み正方形シャーレ(モデルZ692344、Sigma Aldrich)に注がれる前に摂氏60度に冷却されることを許可され、3mm厚さのゲルが生成された。ゲルは使用の前に室温で30分間で凝固した。アルギン酸ナトリウム由来のシートを準備するために50mM塩化カルシウム(CCL302、BioShop)がマイクロ波処理の前に溶液に加えられた。フィブリン由来シートの印刷の前に、PBS(10010023、Gibco)中の2mlの50IUトロンビン(T4648、Sigma Aldrich)が押し出しの前にアガロース基質を水和するためにピペット分注された。
3つの異なる組成を有するバイオインクが準備された。アルギン酸塩-コラーゲンシートに対して、アルギン酸ナトリウム(Pronva UPLVG、Novamatrix)がDMEM(11965-084、Gibco)および20mMのHEPES(15630080、Gibco)中に溶解され、0.1μmシリンジマイクロフィルタ(Millipore)を使用して濾過された。1型コラーゲン(rat tail、354249、Corning)は、PBS中の1MのNaOHを使用してpH7に均衡された。2つの原液が混合され、5mg/mlの最終濃度のコラーゲンおよび2%アルギン酸塩が得られた。溶液は使用の前に氷の上で保たれた。真皮層のためのバイオインクを準備するために、5%フィブリノゲン(F8630、Sigma)が摂氏37度で2時間にわたる穏やかな攪拌によりPBS中で溶解された。1%HA(sodium hyaluronate Pharma Grade 80、Novamatrix)がPBS中で溶解された。溶液は1:1の比率で混合され、次に濾過された。1型コラーゲン溶液はpH7となるようNaOHと均衡され、1.25%の最終濃度のフィブリノゲン、0.25%HA、および0.25%コラーゲンを得るために、濾過済みフィブリン/HA溶液と混合された。溶液は使用の前に氷の上で保たれた。上皮層のためのバイオインクは2.5%の最終濃度のフィブリノゲンおよび0.25%HAを用いて準備された。
堆積されたシートの物理特性評価は、シート厚さならびに接触角の測定、斑点ならびに縞のサイズ、および引っ張り強度の測定を含んだ。微細構造はn≧3の試料に対して走査型電子顕微鏡法(SEM)により特性評価された。
前駆体溶液は5%の0.2μm直径の蛍光微小粒子(FP-0245-2またはFP-0256-2、Spherotech)と混合された。シートは顕微鏡カバースライド上に転送され、デジタルカメラ(モデルRetiga 2000R Fast 1394、Q Imaging)を使用する共焦点顕微鏡(モデルA1、Nikon)を使用して撮影された。画像はImageJソフトウェアを使用して分析された。各試料上の5つのランダムな地点の厚さが平均され、合計で5つのランダムな地点が、各実験条件に対して選択された。シート厚さも、光学式表面形状測定器(モデルContour GT-K、Bruker)を使用して決定された。シートは、アガロース基質に取り付けられている間に切断され、表面形状測定器ステージに転送された。Vision64ソフトウェアプログラムが、シート厚さデータの分析およびエクスポートのために使用された。次に3DプロファイルデータがMatLabにインポートされた。報告された厚さデータは、試料上でランダムに選択された5つの地点のうちの各地点に対する0.5×0.5mm2の対象領域における局所的平均に対応する。各実験条件に対して、n=3のシートが測定された。図21では測定データが示されている。様々な厚さを取得するためにこの研究調査で使用された流速は、図22で示されるモデルから導出される。図23では、モデル予測と比較して異なるバイオポリマーにおいて準備されたシートに対する測定データが示されている。
われわれはアルギン酸塩-コラーゲン、フィブリン-コラーゲン、およびフィブリンのシートを、10mmの長さ、14mmの幅、および250μmの厚さを有するアガロース上に堆積した。並列試験では、同等体積のフィブリン-HAバイオインク、35μLがアガロース基質上にピペット分注され、培養器内で飽和空気(湿度100%)の状況下でゲル化することが許可された。堆積された液滴およびハンドヘルド型皮膚プリンタを使用して取得されたシートの形状が、基質平面に対して2度の傾斜角で液滴形状分析器(DSA30、KRUSS)を用いて写真撮影された。
インサイチュ濁度測定(IST:in-situ turbidity measurement)が以下のようにして実施された。持続波アルゴンイオンレーザ(λ=488nm、200mW、Spectra-Physics)のビームが10倍拡張され、ミラーを用いて案内され、光学的に透明な測定区域を垂直に貫通し、増幅光検出器(Thorlabs)により収集された。シート堆積実験は、アガロースで被覆されたシャーレ内で、測定区域の上部で実施された。シャーレおよびアガロースの吸収は無視可能であると見出された。ハンドヘルド型組織プリンタが、異なる厚さ(100、200、400、および600μm)を有するフィブリン-HAバイオインクを、V=4mm/秒の堆積スピードでアガロース層の上部に堆積するために使用された。伝達されたレーザ光から生成された電圧信号(U)はオシロスコープ(Tektronix)を使用して取得された。ISTを定量化するために、オシロスコープ上の記録された電圧は、A=-log(U/U0)=αlにより、吸収度に変換された。式中、U0はシートが存在しない状態でオシロスコープにより読み取られた電圧であり、αは吸収係数(cm-1)であり、lはシート厚さ、tに等しい光路の長さである。濁度、τ=(A/l)ln10が図24で示されるように一定時間にわたりプロットされた。濁度測定は、ハンドヘルド型組織プリンタのカートリッジが光路から出されたおよそ3秒後に記録された。
2つのシリンジのバイオインクが準備されたハンドヘルド型組織プリンタに装填された。2次バイオポリマー溶液は、蛍光性ナイルレッド微小粒子(FCM-1056-2、Spherotech)と、蛍光性粒子を有さない1次バイオポリマー溶液と、を含んだ。架橋剤溶液は外部シリンジポンプ(PH2000、Harvard Apparatus)を用いて供給された。縞パターンシートは専用のマイクロ流体カートリッジ設計を使用して堆積された。その微小チャネル構成は、バイオポリマーシートの形成を可能にした。ここでは、2次バイオポリマーの縞または斑点が周期的に1次バイオポリマー溶液内に組み込まれた。1次溶液および2次溶液の流速比を変動させることは、相対的縞幅を制御可能に変動させることを可能にした。ゲル化の後、縞パターンシートは共焦点のためにカバースライド上に転送された。報告された縞幅は、すべての縞に対して3つの地点(上部、中間、底部)において測定された個々の縞幅の集合平均を表す。ImageJが画像解析のために使用された。
コラーゲンおよびアガロースシートの一軸性引っ張り測定が、Tremblayら32により説明された設計に基づいて、受注製造の引っ張り試験機を使用して測定された。およそ10mm長さの水和された試料シートが、両側部において、サンドペーパーがクランプ表面上に取り付けられた受注製造のC字形状クランプにより保持された。クランプは、手動並進ステージ(MT1B; Thorlabs)を使用して垂直方向、zに配置された。引っ張り方向、xに沿った運動は、ボールベアリングスライド(37-360、Edmund Optics)上のリニアボイスコイルモータ(LVCM-051-051-01、MotiCont)により制御された。運動制御器(DMC-4143、Galil)は受注生産のLabVIEWソフトウェアプログラムを使用して扱われ、光学式エンコーダ(MII 1610S-40、Celera Motion)信号を用いてフィードバックモードでボイスコイルモータの移動を制御した。試料は0.01mm/秒のスピードで引っ張られ、破裂が生じるまで変位された。ロードセル(モデル31Low、Honeywell)が所与の変位における力を測定した。DAQカード(USB-1208LS、Measurement Computing)および増幅器(モデルUV-10、Measurement Computing)が、信号をロードセルから運動制御器に転送するために使用された。試料の長さおよび幅が、断面積を計算するために、ZeissおよびNikonのTi倒立顕微鏡を使用して評価された。後者と、モータ位置およびロードセル補正された力と、が組み合わされて、応力-歪み曲線が得られた。線形回帰が各試料のヤング率を計算するために、弾性領域に対して適用された。図26では、引っ張り測定からの結果が示されている。
アルギン酸塩、コラーゲン、およびフィブリン由来のバイオ物質は1時間にわたり室温でSorensenの緩衝液においてKarnovskyの固定液を用いて固定され、引き続き、30%~100%の範囲のエタノールを含む溶液を用いて連続的なエタノール洗浄において脱水された。次に試料は臨界点乾燥機を使用して乾燥された。30kVの加速電圧を使用する走査型電子顕微鏡(S-3400N、Hitachi)上での撮影の前に、金がスパッタされた。図25では、異なる組成を有する印刷されたバイオ物質シートの電子顕微鏡写真が示されている。
細胞供給源:
HDFは手術後に健康なヒトの通常皮膚から得られた。細胞は、コンフルエントに近い状態まで成長培地(DMEM、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%抗生物質/抗真菌剤(Ab/Am))、内で培養され、0.05%トリプシン-EDTA処理を用いて処理することにより、さらなる通路に分割された。ヒト臍帯表皮角化細胞(C-011-5C、Gibco Invitrogen)は、EpiLife培地内で1%HKGSおよび1%Ab/Amを用いて会社の説明にしたがって培養され、線維芽細胞の場合と同一のトリプシン-EDTA溶液を使用してトリプシン処理された。細胞通過3~5が本研究を通して使用された。
皮膚代替物の試験管内準備のために、真皮バイオインクは0.5×106個のヒト初代線維芽細胞を含み、次に、アガロース上にδD=500μm厚さのシートとして堆積された。シートは、コラーゲンの完全な熱ゲル化を可能にするために、摂氏37度で20分間にわたりインキュベートされた。上皮バイオインクは1.5×106個のヒト初代ケラチン生成細胞を含んだ。上皮層はtE=200μmの厚さを有する真皮層の上部に連続的に印刷された。研究に応じて、異なるパターンの上皮層(均一または縞状)が真皮層の上部に堆積された。次にシートは培地(EpiLife培地、60μMのカルシウムを含む、GibcoTM)において浸漬された。シートはアガロース基質から取り外され、所望のサイズに切断され、マルチウェルプレートにおいて培養された。
ヒトの皮膚線維芽細胞およびケラチン生成細胞は、HKGS成長補助剤および1%ペニシリン-ストレプトマイシンとともにEpiLife培地において3日間にわたり、それぞれコラーゲン/フィブリンおよびフィブリンゲルにおいて培養された。次に細胞は、生細胞対死細胞の分析のために、細胞核染色液としてのヘキストに加えて、カルセインおよびエチジウムホモダイマーを使用して染色された。個々の96ウェルプレートにおけるバイオ物質中の細胞の共焦点画像が、3回の生物学的反復を用いて4倍および10倍の拡大率で取られた。生存率パーセンテージは、カルセインまたはエチジウムホモダイマーのいずれかに対して陽性に染色された細胞の個数を計数するためにImageJソフトウェアを使用して計算され、この個数は、図28aおよび図28bで示されるようにヘキスト核染色を使用して示された細胞の総数と、比較された。
ヒト皮膚線維芽細胞およびケラチン生成細胞は前述の方法を使用して3日間にわたり培養された。細胞密度はヘキストを用いて細胞を染色し、共焦点顕微鏡検査を用いて撮影し、ImageJソフトウェアを使用して細胞の総数を自動計算することにより、観察された。
シートにおける細胞は室温に置いて1時間にわたりHBSSにおいて4%パラホルムアルデヒドを用いて固定され、その後、HBSSを用いて洗浄された。係る細胞は、室温において30分にわたりHBSSにおいて0.5%TritonX-100を用いて透過処理された後、HBSSを用いて洗浄された。細胞は1時間にわたりブロック緩衝液(HBSS内のBSA0.25%TritonX-100における1%BSA)を用いてブロックされた。抗体はブロック緩衝液内で希釈され、摂氏4度で終夜インキュベートされた。初代抗体はフルオレセインファロイジン(Life Technologies)およびサイトケラチン14(Santa Cruz Biotechnology)を含んだ。ファロイジン染色のみが実施された場合では、封入ステップは次に実施された。ケラチン生成細胞とともに試料はHBSSを用いて洗浄され、次に2次Alexa Fluor抗体(Life Technologies)とともにインキュベートされた。3回の洗浄の後、スライドはDAPI(Vector Laboratories)を有するVectashield封入剤を用いて封入された。画像は、Apotome Axiovert全視野蛍光またはObserver Z1スピニングディスク型共焦点顕微鏡上で取られた(両者、Zeiss)。
組織試料は、終夜摂氏4度で10%緩衝ホルマリンにおいて固定され、70%エタノールにおいて格納され、パラフィンにおいて包埋された。試料は創傷の中央において5μmの区域に切断された。トリクローム試薬は特記なき限りEMS(Hatfield)から取得された。簡略には、パラフィン包埋スライドはシトロソールを用いて脱パラフィン処理された後、様々な等級のエタノールを通して水に再水和された。スライドは摂氏60度で1時間にわたりブアン溶液に配置され、水中で洗浄された。ヘマトキシリン(Sigma)およびビーブリッヒスカーレット-酸性フクシン溶液が、それぞれ10分間にわたり、それぞれ中間に洗浄を行う状態で染色された。スライドは、15分間にわたりリンモリブデンタングステン酸において分化され、5分間にわたりアニリンブルーに転送された。スライドは2分間にわたり1%酢酸において洗滌および分化された。スライドは95%エタノールおよび無水エタノールを通して脱水され、その後、シトロソール中で洗浄された。スライドはSHUR/Mountキシレン由来液体封入剤(Triangle Biomedical Sciences)を用いて封入された。画像は光学顕微鏡(Leica DM2000LED)を使用して取得された。
図20では、手動ピペット分注されたヒドロゲル前駆体(左)と比較して皮膚プリンタを用いて生成された(右)、t=300μmのシートの明視野画像が示されている。両方の画像は、水和されたアガロース層で被覆された平坦表面に対して4度の角度で取られた。ピペット分注されたヒドロゲルは、不均一な厚さを有するドーム形状の湾曲した構造を形成する。接触角が小さいにも関わらず、ヒドロゲルの均一の展開は、外辺部から進行するヒドロゲルのゲル化により、妨げられた。一方、ハンドヘルド型皮膚プリンタで印刷されたシートは一定の厚さtを示した。なぜなら、マイクロ流体カートリッジ上の平行なチャネルを使用してヒドロゲル前駆体溶液が横方向、yに沿って均一に分配され、高速なゲル化がシートに垂直な方向において均一に発生したためである。結果として、堆積されたt=300μm厚さ、およびw0=14mm幅のシートは、光学式表面形状測定器スキャン(図20b)で示されるように、均一な厚さおよび鋭利な縁部を有した。アガロース層に対するシートの接触線に起因する不均一性は、各側面からシート幅の5%より小さい範囲でのみ生じる。
印刷方向(x)および横方向(y)の両方においてシート組成を制御する能力により、可動部分を必要とすることなく、構築されたシートの生産が可能になる。それぞれのバイオポリマー流速は、縞パターンが提供されるよう搭載型シリンジポンプを使用して(図5または図32a)、または斑点パターンが提供されるよう圧力制御を使用して(図7)、制御され得る。微細加工されたカートリッジの最小形状寸法よりも狭い縞は、流体力学的収束を利用することにより実現された29。ここで、われわれは、以前に開発された手法を使用することによる4つの縞の2次バイオポリマーの組み込みを示す30。相対的縞幅、wStripe/w0、は、図32bおよび図32cで示されるように流速比QM/QCを変化させることにより、変更された。2次バイオポリマー溶液が加圧ウェルから供給され、時間依存性の上部圧力が印加されたとき、縞に代わって斑点がパターン化された。矩形波圧力信号の周波数およびデューティサイクルを操作することにより、異なる斑点サイズがもたらされ得る。後続の斑点間の距離は、バルブのoff時間および1次バイオポリマー溶液の流速により、管理される(図32d、e)。
ハンドヘルド型組織プリンタは、物質選択および印刷パラメータに起因する細胞生存率に影響を及ぼすことなく、哺乳動物細胞を堆積する能力を有する。試験管内実験に対して、われわれは、ヒアルロン酸、フィブリノゲン、およびI型コラーゲンを含むバイオインク組成物を選択した。フィブリノゲン成分のゲル化は、中性pHおよび室温におけるトロンビンの酵素活性により誘導される。ヒアルロン酸の添加は、細胞生存率に悪影響を及ぼすことなく、バイオインクの粘度および印刷適性を改善した。したがって印刷手法は、細胞に損傷を生じさせない低い(1/秒のオーダー)剪断速度により特性評価される。図28aおよび図28bでは、培養の10日後に実施された生/死アッセイに基づいて、フィブリン由来バイオ物質に包埋されたヒト皮膚線維芽細胞(HDFa)が90%を越える生存能力を示したことが示されている。われわれは、10万~1000万/mlの範囲の5つの異なる濃度の細胞に対して、元の細胞播種密度が、印刷されたシートに対するヘキスト核染色および共焦点顕微鏡検査を実施した後の時間0において得られた細胞密度と一致することを見出した。細胞またはバイオ物質の凝集塊または凝集体は、印刷の直後にはまったく観察されなかった。このことは、供給された細胞がバイオ物質内で均等に分散された状態に保たれたことを示すものである。
25kgの体重を有するオスのヨークシャーピッグが、Sunnybrook動物実験委員会による審査プロトコル(AUP #:16-600)にしたがって切除皮膚生検に曝露された。ピッグはSunnybrook Research Instituteにおいて好みに合わせて食料および水が与えられる状態で12時間の明暗サイクルで室温において個々の檻において収容された。給餌および日常的ケアが家畜動物職員により実施され、担当獣医師により監督された。標準的な給餌および動物ケアの標準処理手順が順守された。すべての動物は手術前の少なくとも6時間の断食が実施され、獣医師と一緒に入念に作成された標準化されたプロトコルを使用して日常的に評価された。疼痛薬物治療が適宜調整された。麻酔の導入後、毛が電気シェーバーを用いて除去され、その後、化学的除毛が実施された。手術エリアはポビドンヨードで消毒され、以前に標識されたエリアにおける皮膚切除が外科用メスを用いて実施され、手術の残りの部分は単極電気メスを用いて実施された。単極電気メスは止血のためにも使用された。
構造化、標的表面に対する層状化されたバイオ物質および層状化された組織の制御されたインサイチュ堆積を可能にする技術的プラットフォームとしてのバイオプリンタが本明細書で開示される。利用可能なバイオポリマー堆積速度は、使用されるカートリッジおよびプリンタ前進速度に応じて、0.3~1.6cm2/秒である。これは、大部分の押し出しを利用するバイオプリンタのうちの1つを少なくとも1オーダーの大きさだけ越える。皮膚の状況における線維芽細胞およびケラチン生成細胞に対して示す一方で、本発明者らは、この手法が広範囲な細胞種類に対して適合可能であると考えた。用いられたバイオ物質を越えて、発明者らは広範囲な天然バイオポリマー溶液および合成バイオポリマー溶液が本開示に対して適合可能であると考えた。
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Claims (12)
- バイオポリマーシートおよび平坦な組織の制御されたインサイチュ形成および表面上の堆積のためのバイオプリンタであって、
a)支持フレームおよび前記支持フレームに取り付けられた印刷ヘッドであって、前記印刷ヘッドは、第1配列の押出チャネルを、および、少なくとも、動作時において前記第1配列の押出チャネルが前記表面に対して近位に隣接して配置され、前記印刷ヘッドの端部区域が、前記第1配列の押出チャネルおよび第2配列の押出チャネルが幅Wにわたるように前記幅Wを有するよう、前記第1配列の押出チャネルに対して配置された、前記第2配列の押出チャネルを、含む、支持フレームおよび印刷ヘッドと、
b)前記支持フレームに取り付けられたバイオポリマーの第1貯蔵槽であって、前記第1配列の押出チャネルは、前記表面上に対して押し出されるバイオポリマーの前記第1貯蔵槽に対して流体連通し、液体の第2貯蔵槽は前記支持フレームに取り付けられ、前記第2配列の押出チャネルは、前記押し出されるバイオポリマーとともに押し出される液体の前記第2貯蔵槽に対して流体連通し、QMの流速でバイオポリマーを吐出するよう構成されたバイオポリマーの前記第1貯蔵槽に関連付けられた第1吐出機構、および、QCの流速で前記液体を吐出するよう構成された液体の前記第2貯蔵槽に関連付けられた第2吐出機構を含む、第1貯蔵槽と、
c)オペレータにより作動されたとき前記印刷ヘッドが前記表面の上方で垂直方向高さHに配置された前記表面に沿って事前選択された速度Vで駆動されるよう、前記支持フレームに取り付けられた駆動機構と、
d)前記駆動機構および前記第1吐出機構に接続され、かつ、前記駆動機構を作動させたときに、前記第1吐出機構はバイオポリマーを流速QMで、厚さtの層で吐出するようプログラムされた制御器であって、これは、前記流速QM=W・V・H(6(t/H)-6(t/H)2+3(t/H)2(μC/μM))/(6(t/H)(μC/μM)-6(t/H)+6)という条件を満足するものであり、ここで、μ C は液体の粘度、μ M はバイオポリマーの粘度である、制御器と
を含む、バイオプリンタ。 - 前記駆動機構は可変速度Vを提供するよう構成され、前記制御器は、所与の速度Vに対して前記条件の流速が維持されるよう前記流速QMを応答的に調整するように、前記第1吐出機構を制御するよう命令を用いてプログラムされている、請求項1に記載のバイオプリンタ。
- 前記第2吐出機構は、前記制御器に対して動作可能に連結され、
流速QC=0.5W・V・(H-t)
という条件を満足する前記流速QCで前記液体を吐出するよう構成されている、請求項1に記載のバイオプリンタ。 - 前記駆動機構は可変速度Vを提供するよう構成され、前記制御器は、所与の速度Vに対して前記条件が維持されるよう前記流速QMおよびQCを応答的に調整するように、前記第1吐出機構および前記第2吐出機構を制御するよう命令を用いてプログラムされている、請求項3に記載のバイオプリンタ。
- 前記印刷ヘッドの前記端部区域は、前記第2配列の押出チャネルの上部表面から外向きに延長する張り出し区域を含み、前記張り出し区域は長さLだけ前記端部区域から外向きに延長する、請求項1~請求項4のうちのいずれか1項に記載のバイオプリンタ。
- Lは、Hの値に等しいか、またはHの値よりも大きい、請求項5に記載のバイオプリンタ。
- 前記第1配列の押出チャネルは、前記第1貯蔵槽に接続された第1チャネルからなる二叉分岐チャネルネットワークを介して前記第1貯蔵槽に対して流体連通し、前記第1貯蔵槽に接続された第1チャネルは2つのチャネルに二叉分岐し、前記二叉分岐したチャネルは、チャネルの最終個数が前記第1配列の押出チャネルにおける押出チャネルの個数と等しくなるまで、さらに二叉分岐し、各チャネルの端部は前記第1配列の押出チャネルにおける対応する押出チャネルの端部の近位に配置され、前記第2配列の押出チャネルは、前記第2貯蔵槽に接続された第1チャネルからなる二叉分岐チャネルネットワークを介して前記第2貯蔵槽に対して流体連通し、前記第2貯蔵槽に接続された第1チャネルは2つのチャネルに二叉分岐し、前記二叉分岐したチャネルは、チャネルの最終個数が前記第2配列の押出チャネルにおける押出チャネルの個数と等しくなるまで、さらに二叉分岐し、各チャネルの端部は前記第2配列の押出チャネルにおける対応する押出チャネルの端部の近位に配置される、請求項1~請求項6のうちのいずれか1項に記載のバイオプリンタ。
- 前記二叉分岐チャネルネットワークにおける前記チャネルの水力直径は、前記貯蔵槽から前記プリンタヘッドまで延長する各流入口から各流出口まで、マレイの法則にしたがって減少する、請求項7に記載のバイオプリンタ。
- 吐出動作の際に前記バイオプリンタがハンドヘルド型バイオプリンタとなるようユーザがバイオプリンティングを把持および使用することを可能にするハンドルをさらに含む、請求項7に記載のバイオプリンタ。
- 前記駆動機構は前記駆動機構に接続された1対のアクスル装着ローラを含み、前記印刷ヘッドは前記ローラ間に配置され、前記端部区域は、堆積角度が変化した場合でも、前記チャネル装置流出口と堆積表面との間で一定の間隙高さを維持する円形の案内機構を含み、動作時に前記駆動機構が作動すると、前記1対のアクスル装着ローラは、前記ハンドヘルド型バイオプリンタが前記速度Vで前記表面に沿って移動するよう、回転駆動される、請求項9に記載のバイオプリンタ。
- 前記駆動機構は前記駆動機構に接続されたローラを含み、前記ローラは前記印刷ヘッドの後方に配置され、前記端部区域は、堆積角度に変化が生じた場合でも前記チャネル装置流出口と堆積表面との間で一定の間隙高さを維持するための円形の案内機構を含み、動作時に前記駆動機構が作動すると、前記ローラは、前記ハンドヘルド型バイオプリンタが前記速度Vで前記表面に沿って移動するよう、回転駆動される、請求項9に記載のバイオプリンタ。
- 前記駆動機構は前記支持フレームに取り付けられた並進機構を含み、前記印刷ヘッドは前記並進機構上に取り付けられ、前記並進機構は前記表面に対して前記速度Vで前記プリンタヘッドを移動させるよう構成されている、請求項9に記載のバイオプリンタ。
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