CN107320780A

CN107320780A - 一种中空管结构的多层水凝胶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107320780A
Application number: CN201710530224.7A
Authority: CN
Inventors: 欧阳礼亮; 孙伟; 赵雨
Original assignee: Cape Boyuan Biological Technology Co Ltd (beijing)
Current assignee: Cape Boyuan Biological Technology Co Ltd (beijing)
Priority date: 2017-06-27
Filing date: 2017-06-27
Publication date: 2017-11-07
Anticipated expiration: 2037-06-27
Also published as: CN107320780B

Abstract

本发明公开了一种中空管结构的多层水凝胶及其制备方法与应用。所述制备方法包括如下步骤：(1)制备含有水溶性二价阳离子盐的温敏凝胶芯；(2)将温敏凝胶芯浸泡于海藻酸钠水溶液中，经交联反应即在温敏凝胶芯的表面形成一层海藻酸盐凝胶；(3)将经步骤(2)处理后的温敏凝胶芯重复步骤(2)，即在温敏凝胶芯的表面形成多层海藻酸盐凝胶，去除温敏凝胶芯即得。本发明方法操作简单，制造快速，数分钟即可成型多达10层的水凝胶结构；所形成的中空管几何形态灵活，可分叉，可变直径，可变形状，主要取决于温敏凝胶芯的几何形态；制作过程所处理化环境柔和，对细胞无损伤，多层凝胶结构可支持细胞、大分子、小分子的装载，具有广阔应用前景。

Description

一种中空管结构的多层水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种中空管结构的多层水凝胶及其制备方法与应用，属于材料科学和工程技术领域。

背景技术

水凝胶是一类以水为分散介质的凝胶，其中生物医用水凝胶是近年来的发展热点，被广泛用作药物、核酸、细菌、细胞等的载体。特别地，很多生物相容性水凝胶可以仿生细胞外基质的成分和结构，被用以贴附或包裹细胞进行仿生组织及器官的构建。基于细胞生长对水溶性环境的基本需求，水凝胶材料被认为是一类最主要的包裹细胞用的载体材料。

一直以来，组织及器官的损伤、缺失及功能障碍影响人类健康的重大问题，生物材料和再生医学的发展为病损组织及器官的修复提供了很多策略，比如组织工程支架、脱细胞支架及细胞三维打印等。不同技术手段在构建三维类组织模型上具有不同特点，从几何形态学上考虑，多层管状结构是组织及器官构建的一种常见的结构单元，广泛存在于体内的循环系统、呼吸系统、消化系统等生理系统中。比如，血管中存在内皮、平滑肌和成纤维细胞组成的三层结构，气管也分为黏膜、黏膜下层和外膜三层。

构建多层水凝胶管状结构对于生物医学领域，特别是组织及器官修复有着极其重要的意义，目前常用的构建方法可以分为一步成型和分步成型。一步成型指的是一次形成多层凝胶结构，典型的方法是通过多通道同轴喷头或微流控装置挤出分层形式的水溶胶材料，通过添加适当的交联剂使分层材料凝胶形成多层管状结构，比如在同轴喷头的芯通道挤出Ca²⁺溶液，在其他壳通道挤出海藻酸钠溶液，即可得到离子交联的海藻酸钙多层中空管。这种方法适用的水凝胶材料种类及管壁的数量较为有限，同时它无法形成分叉管网结构，对分叉血管的构建存在较大短板。分步成型指的是分步形成多层凝胶结构，最常见是分步浇筑法：比如分步将实心柱状模板放置于不同尺寸的柱状空腔中进行水凝胶的浇筑和交联，即可得到按照柱状空腔尺寸分布的多层凝胶结构(Soft Matter.2012；8(5):1643-7.)；还有研究者发明了复杂的三维分叉管模具，结合可溶性芯的使用，通过分步浇筑以期实现三维多层分叉血管支架的构建(CN106178130A)。这类浇筑法依赖于模具的设计，制造过程较为繁琐，由于水凝胶较差的力学性能，存在脱模困难以及成型尺寸的限制等难题。

水凝胶分步涂层法有望能实现多层管状结构的快速构建，研究者于2008年首次报道基于聚电解质涂层的多层凝胶膜结构(Nature.2008；452:76-9.)，2016年研究者报道了基于溶胀交联的水凝胶涂层方法(PNAS.2016；113(47):13295-300.)。大部分当前的水凝胶分步涂层法，在成型一层之后，需要补充交联剂或交联反应所需的组分再成型下一层，同时很多基于聚电解质的交联过程处于强酸或强碱条件并不适合活细胞的包裹。

发明内容

本发明的目的是提供一种中空管结构的多层水凝胶及其制备方法与应用，本发明利用交联剂在固-液界面可以进行扩散，从而激发交联反应的发生并形成凝胶层；交联剂被装载在固相(凝胶相)中，高分子材料溶解在液相(溶胶相)中，二者接触时，由于交联剂(某种小分子或离子)的扩散，使得固-液交界面形成一层明显的凝胶。

本发明所提供的中空管结构的多层水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备含有水溶性二价阳离子盐的温敏凝胶芯；

(2)将所述温敏凝胶芯浸泡于海藻酸钠水溶液中，经交联反应即在所述温敏凝胶芯的表面形成一层海藻酸盐凝胶；

(3)将经步骤(2)处理后的所述温敏凝胶芯重复步骤(2)，即在所述温敏凝胶芯的表面形成多层所述海藻酸盐凝胶，去除所述温敏凝胶芯，即得到所述中空管结构的多层水凝胶。

所述的制备方法中，步骤(1)中，所述水溶性二价阳离子盐可为氯化钙、硫酸钙、氯化钡、氯化镁和硫酸镁中至少一种；

所述温敏凝胶芯中所述水溶性二价阳离子盐的质量-体积浓度可为0.001～0.1g/ml，具体可为0.02g/ml。

所述的制备方法中，步骤(1)中，所述温敏凝胶芯由温敏凝胶成型得到；

可采用下述方法制备所述温敏凝胶芯：

①将温敏溶液浇注到采用金属、高分子塑料、高分子弹性体等材料制成的模具中(比如可以采用3D打印技术打印定制化模具)，等待凝胶完成即取出待用。

②用注射器吸取温敏溶液，等待凝胶完成，截断注射器前端，将凝胶芯推挤出即得到与注射器内部尺寸一致的凝胶芯。

③采用3D打印方法，将温敏溶液打印成想要的形状并进行凝胶；

上述制备过程中，将所述水溶性二价阳离子盐溶于温敏溶液中即可得到含有水溶性二价阳离子盐的温敏凝胶芯。

所述温敏凝胶可为明胶、改性明胶、普朗尼克F127、壳聚糖基水凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺和基质胶中任一种，它们具有温敏可逆交联特性；

所述改性明胶指的是通过各种化学改性得到的明胶，依然保持温敏特性，如明胶甲基丙烯酰胺。

不同种类的温敏凝胶，其成型温度也不同，如，对于明胶溶液，凝胶成型温度处于较低温度，根据其浓度可控制在0～25℃范围内；对于高温凝胶低温溶胶的材料，凝胶成型温度处于较高温度，如普朗尼克F127的成型温度可以在20～50℃。如本发明实施例中对于不同浓度的明胶，采用4℃的成型温度，均可适用；对于不同浓度的普朗尼克F127，采用22.5℃、30℃、37℃的成型温度，均可适用。

所述的制备方法中，步骤(1)中，所述温敏凝胶芯的形状具有如下1)-3)中至少一种特点：

1)横截面为圆形、正方形、梯形、五角星形、多边形或其他异形封闭图形；

2)具有单根或多分叉结构；所述多分叉结构的各轴线在二维平面或三维空间内；

3)沿轴线方向，横截面的形状和/或尺寸发生变化，如由粗到细、由圆柱渐变为方柱。

所述的制备方法中，步骤(2)中，所述海藻酸钠水溶液的质量-体积浓度可为0.002～0.1g/ml，具体可为0.02～0.03g/ml、0.02g/ml或0.03g/ml，可采用低粘度、中等粘度或高粘度种类的海藻酸钠；

所述海藻酸钠水溶液中可含有如下1)-4)种组分中任一种：

1)胶原、纤维蛋白原、基质胶、纤连蛋白、透明质酸、明胶、壳聚糖和聚乙二醇中任一种，即天然或合成的蛋白、多糖等成分；

2)内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、神经细胞、癌细胞、各种成体干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞中任一种，即各种哺乳动物原代细胞或成熟细胞系；

3)细菌或病毒；

4)药物和/或核酸分子，比如抗癌药物、siRNA等；

如制备多分叉、多层仿生的血管网时，可在不同层的海藻酸水凝胶中装载不同的细胞，如在第一层海藻酸水凝胶中装载内皮细胞、第二层海藻酸水凝胶中装载平滑肌细胞、第三层海藻酸水凝胶中装载成纤维细胞；其中所述海藻酸钠水溶液中混合的细胞浓度可以在0.0001～20×10⁶个/ml的范围内。

当不直接成型一层内皮细胞层时，可以在形成中空管结构后，往空腔中灌注内皮细胞，使其贴附在管腔内壁形成内皮层；

经上述方法形成的血管网结构可以进行静态培养、灌注培养、力刺激培养、电刺激培养及用其他生物反应器进行培养，或多种培养方式的组合；上述方法操作简单，速度快；较容易形成多分叉结构；较容易形成仿生多层血管结构；可以直接包裹不同细胞进行血管仿生。

所述的制备方法中，步骤(2)中，所述交联反应(即所述温敏凝胶芯浸泡于所述海藻酸钠水溶液中)的时间可为1s～10min，时间越长，水溶性二价阳离子往外渗透的深度越深，形成的凝胶层或管壁越厚，具体的凝胶层厚度与反应时间的关系如图3所示；

重复所述步骤(2)之前，包括将所述温敏凝胶芯进行如下1)-3)中任一处理的步骤：

1)置于空气中；

2)浸泡于水中，以清洗掉表面交联程度不强的海藻酸，得到更规则和明显分层结构；

3)浸泡于所述水溶性二价阳离子盐的水溶液中，以补充交联剂；

即将所述温敏凝胶芯(固相)从所述海藻酸钠水溶液(液相)中取出后进行上述处理即中断反应。

重复步骤(2)时，可采用同浓度的海藻酸钠水溶液或装载了其他组分的同浓度或不同浓度的海藻酸钠水溶液；再次交联反应的时间可以与前一次相同或不同，中断反应的操作可以与前一次相同或不同。

经成型的多层海藻酸盐水凝胶层数可以1～15层。

所述的制备方法中，步骤(3)中，当所述温敏凝胶芯中装载有细胞时，在去除所述温敏凝胶芯之前，还包括将所述表面形成多层所述海藻酸盐凝胶的所述温敏凝胶芯进行孵育的步骤，在所述孵育的温度下所述温敏凝胶芯溶解，内部的所述细胞可以自由游动，贴附在形成的凝胶管腔内壁；即凝胶芯溶解与细胞种植同时进行，无需灌注种植，潜在的种植效率高。

对于采用明胶作为温敏凝胶，孵育温度可设置在30～37℃之间；孵育时间可在30分钟～12小时之间；

去除所述温敏凝胶芯的步骤如下：

切除表面形成多层所述海藻酸盐凝胶的所述温敏凝胶芯的首尾端，使所述温敏凝胶芯溶出；

不同种类的温敏凝胶，其溶解温度也不同，如，对于用明胶作为温敏凝胶材料，溶芯温度可设置在30～70℃之间；对于用普朗尼克F127作为温敏凝胶材料，溶芯温度可设置在0～15℃；

可以单独切除首端或尾端或同时切除首尾端；对于多分叉结构，切除部位可以是任何一个或几个或所有分叉的尾端；切除操作可以在所述温敏凝胶芯溶解之前或之后。

本发明还提供了一种基于预制血管网的三维组织结构，包括所述中空管结构的多层水凝胶和浇注于所述中空管结构的多层水凝胶周围的组织细胞；

具体可按照如下步骤进行制备：

将所述中空管结构的多层水凝胶(血管网)置于匹配的组织成型腔中，露出灌流培养的进出口管口；在血管网周围，向组织成型腔中成型含特定组织细胞的结构；

所述组织成型腔可以是一个具有特定形状的顶部开口的空腔，用以固定预制血管网，并成型特定组织；其材质可以是ABS、PLA等塑料或者PDMS等弹性体，该成型腔的制造方法可以是铸造或直接3D打印。

关于所述成型步骤，可以向所述组织成型腔中直接浇注含细胞水凝胶或纯细胞溶液；添加的含细胞成分可以进行交联处理或不进行交联处理；还可以向组织成型腔中直接打印特定的组织细胞，在预制血管网周围将不同种类的水凝胶或细胞打印成不同的结构，以促进组织的生成；组织结构的打印及成型腔的打印可以同时进行；在组织成型过程中，浇注法和3D打印法可以同时或单独进行。

所述三维组织结构具有如下优点：1)利用预制仿生血管网，提高了组织的营养输运效率；2)组织拓展性好，根据目标组织的特点，可以进行不同仿生血管网络的定制化制造；3)结合预制仿生血管网及细胞直接打印技术，可以在血管网的基础上成型异质细胞组分的组织，具有更强的仿生效果。

所述中空管结构的多层水凝胶和所述三维组织结构在生物工程中具有潜在的应用，如用于：

1)组织及器官的修复与重建，可以针对心肌、肝脏、肾脏、骨、软骨等组织工程，进行相应的组织构建；

2)病理模型的研究，基于预制血管网，可以研究相应生理场景下癌症迁移等病变的规律；

3)药物测试，基于预制血管网，可以模拟药物的释放和作用，并基于构建的组织模型，检测特定药物的作用。

本发明利用海藻酸钠与二价阳离子能发生快速离子交联反应的特点，将装载了二价阳离子如Ca²⁺离子的温敏水凝胶浸泡在海藻酸钠溶液中，Ca²⁺被证明能透过固-液界面扩散至海藻酸钠溶液中，进行凝胶反应。Ca²⁺的扩散距离与固-液接触时间成正相关，分离温敏水凝胶与海藻酸钠溶液即可中断凝胶反应，通过分步反应，可以实现可控厚度的海藻酸凝胶涂层的生成，最终得到多层中空管结构。

本发明方法操作简单，制造快速，数分钟即可成型多达10层的水凝胶结构；所形成的中空管几何形态灵活，可分叉，可变直径，可变形状，主要取决于温敏凝胶芯的几何形态；制作过程所处理化环境柔和，对细胞无损伤，多层凝胶结构可支持细胞、大分子、小分子的装载，具有广阔应用前景。

附图说明

图1为本发明制备分叉多层水凝胶中空管结构的流程图。

图2为本发明制备的具有两级分叉的、多层水凝胶中空管结构示意图。

图3为本发明制备方法所依据的界面渗透交联原理示意图。

图4为本发明制备方法中单层凝胶层厚度与反应时间的关系。

图5为本发明制备的具有两级分叉的、多层水凝胶中空管结构的宏观数码照片。

图6为本发明制备的具有两级分叉的、多层水凝胶中空管结构横截面显微照片。

图7为本发明制备的含细胞多层中空管结构的横截面显微照片。

图8为本发明构建含血管网的三维厚组织结构的流程图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、两级分叉的、多层水凝胶中空管结构的制备

按照图1所示的流程图进行制备。

(1)制备两级分叉的凝胶芯

用FDM打印机制造PLA材质的两级分叉模具，浇注含有氯化钙(0.02g/ml)的明胶水溶液，其中明胶的质量体积浓度为0.05g/ml，在4℃下进行凝胶成型(明胶溶液具有高温溶解低温凝胶的特性，该过程可逆)，得到两级分叉的凝胶芯，直径为3mm。

(2)第一层海藻酸钙凝胶的制备

在室温下，将制备的两级分叉的凝胶芯浸泡在海藻酸钠水溶液(浓度为0.02g/ml)中，等待30s，由于钙离子(交联剂)向海藻酸钠溶液中的扩散并引起交联反应，取出后的凝胶芯表面即包裹一层海藻酸钙凝胶，然后浸泡在纯水中10s，以清洗掉表面交联程度不强的海藻酸，得到更规则和明显分层结构。

(3)第二层海藻酸钙凝胶的制备

将包裹一层海藻酸钙凝胶再次放入海藻酸钠水溶液(浓度为0.03g/ml)中进行第二层涂覆，交联反应30s后即在凝胶芯表面包裹上第二层海藻酸钙凝胶，并浸泡在纯水中10s。

(4)第三至五层海藻酸钙凝胶的制备

与步骤(3)相同，不同之处在于：海藻酸钠水溶液的浓度依次为0.02、0.03和0.02g/ml。交联时间均为30s，取出后均浸泡于纯水中。

涂覆完成后，通过变温即加热至37℃使得凝胶芯溶解，切断首尾出口，使溶解的凝胶芯流出，即可得到中空管网络，

本实施例制备的具有两级分叉的、多层水凝胶中空管结构示意图如图2所示，其中，左图为整体示意图，右图为一分叉结构的纵截面和横截面示意图，1表示制备后的多层水凝胶中空管结构，2表示中空管纵截面示意图，3表示中空管横截面示意图，4表示多层水凝胶管壁，5表示中空管芯。

本发明制备方法所依据的界面渗透交联原理如图3所示，左图为交联反应前的状态，右图为交联反应发生后的状态；其中，黑色圆点为交联剂(实例中为Ca²⁺)，折线长链为高分子链(实例中为海藻酸钠)，黑色短箭头所示为交联剂的渗透方向，折线长链夹杂黑色圆点为交联反应后产生的凝胶结构；图标：6表示未发生交联反应的高分子溶液(实例中为海藻酸钠溶液)，7表示相界面，8表示装载交联剂(实例中为Ca²⁺)的凝胶(实例中为明胶凝胶)，9表示交联反应后产生的凝胶层。

本发明考察了交联时间的影响，得到如图4所示的单层凝胶层厚度与反应时间的关系，反应时间指的是装载有交联剂的凝胶芯浸泡在高分子溶液中的时间，从图中可以看出，时间越长，钙离子往外渗透的深度越深，形成的凝胶层或管壁越厚，说明交联剂的扩散距离随着时间而增大，这个结果是后续进行多层涂覆的基础。

本实施例制备的具有两级分叉的、多层水凝胶中空管结构的宏观数码照片如图5所示，可以看出，中空管内部深色物质为灌注进去的培养液，证明分叉中空管的贯通性良好。

本实施例制备的具有两级分叉的、多层水凝胶中空管结构横截面显微照片如图6所示，显示出了五层明显的分层凝胶管壁以及中空的内芯，证明本发明方法能够有效地构建多层中空管结构。

实施例2、两级分叉的、含细胞多层水凝胶中空管结构的制备

制备方法与实施例1中基本相同，不同之处在于：

1)第一层海藻酸钙凝胶的制备步骤中，将凝胶芯浸泡在含内皮细胞的海藻酸钠水溶液中(细胞浓度为2.5×10⁶个/ml)，得到第一层内皮细胞凝胶层；

2)第二层海藻酸钙凝胶的制备步骤中，将凝胶芯浸泡在含成纤细胞的海藻酸钠水溶液中(细胞浓度为2.5×10⁶个/ml)，得到第二层成纤细胞凝胶层；

3)第三层海藻酸钙凝胶的制备步骤中，将凝胶芯浸泡在含内皮细胞的海藻酸钠水溶液中(细胞浓度为2.5×10⁶个/ml)，得到第三层内皮细胞凝胶层；

4)第四层海藻酸钙凝胶的制备步骤中，将凝胶芯浸泡在含成纤细胞的海藻酸钠水溶液中(细胞浓度为2.5×10⁶个/ml)，得到第四层成纤细胞凝胶层；

5)第五层海藻酸钙凝胶的制备步骤中，将凝胶芯浸泡在含内皮细胞的海藻酸钠水溶液中(细胞浓度为2.5×10⁶个/ml)，得到第五层内皮细胞凝胶层；

上述制备得到的含细胞多层中空管结构的横截面显微照片如图7所示，图中亮点是对不同细胞进行的荧光标记，用以示踪细胞，该图显示出了五层明显的分层细胞管壁结构以及中空内芯，且细胞在其中分布均匀，证明本发明方法能够构建包裹异质细胞的多层仿生中空管结构。

本实施例中，当不直接成型一层内皮细胞层时，可以在形成中空管结构后，向空腔中灌注内皮细胞，使其贴附在管腔内壁形成内皮层。

还可通过如下方式制备内皮细胞凝胶层：在成型的凝胶芯中装载内皮细胞，在依次涂覆了各细胞层之后，不切除端部，直接将结构浸泡于培养液并在较高温度(如30～37℃)进行孵育。以期在孵育过程中，随着内部温敏凝胶的溶解，内部的内皮细胞可以自由游动，贴附在形成的凝胶管腔内壁。一段时间(如30分钟～12小时)以后，切除首尾端，溶出温敏凝胶及可能的多余内皮细胞，由此形成多分叉、多层仿生血管网结构。该方法，凝胶芯溶解与内皮细胞种植同时进行，无需灌注种植，潜在的种植效率高。

本实施例形成的血管网结构可以进行静态培养、灌注培养、力刺激培养、电刺激培养及用其他生物反应器进行培养，或多种培养方式的组合。

实施例3、含血管网的三维厚组织的构建

按照图8所示的示意图进行构建，图标：10表示预制造的三维分叉中空多层血管网，11表示三维厚组织制造过程，12表示血液或培养液灌注方向，13表示由步骤11制造的组织结构，14表示多层血管壁结构，15表示中空血管通道。

将实施例2制备的预制血管网置于匹配的组织成型腔中，露出灌流培养的进出口管口；在血管网周围，向组织成型腔中成型含特定组织细胞的结构，即通过步骤11制造围绕该血管网的三维厚组织结构，预先制造的血管网能为厚组织提供细胞所必须的营养物质和氧气。

本实施例中，组织成型腔可以是一个具有特定形状的顶部开口的空腔，用以固定预制血管网，并成型特定组织；其材质可以是ABS、PLA等塑料或者PDMS等弹性体，该成型腔的制造方法可以是铸造或直接3D打印。

本实施例中，组织成型的方式可为：①向组织成型腔中直接浇注含细胞水凝胶或纯细胞溶液；②添加的含细胞成分可以进行交联处理或不进行交联处理；③向组织成型腔中直接打印特定的组织细胞，在预制血管网周围将不同种类的水凝胶或细胞打印成不同的结构，以促进组织的生成；④组织结构的打印及成型腔的打印可以同时进行；⑤在组织成型过程中，浇注法和3D打印法可以同时或单独进行。

通过含血管网的三维厚组织的构建，可以利用预制仿生血管网，提高组织的营养输运效率；组织拓展性好，根据目标组织的特点，可以进行不同仿生血管网络的制造；结合预制仿生血管网及细胞直接打印技术，可以在血管网的基础上成型异质细胞组分的组织，具有更强的仿生效果。

综上，本发明制备的预制血管网(如两级分叉的、(细胞)多层水凝胶中空管结构)以及基于预制血管网的三维厚组织可应用于如下方面：

1)组织及器官的修复与重建，如可针对心肌、肝脏、肾脏、骨、软骨等组织工程，进行相应的组织构建；

2)病理模型的研究，如基于预制血管网，可研究相应生理场景下癌症迁移等病变的规律；

3)药物测试，如基于预制血管网，可模拟药物的释放和作用，并基于构建的组织模型，检测特定药物的作用。

Claims

1.一种中空管结构的多层水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备含有水溶性二价阳离子盐的温敏凝胶芯；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述水溶性二价阳离子盐为氯化钙、硫酸钙、氯化钡、氯化镁和硫酸镁中至少一种；

所述温敏凝胶芯中所述水溶性二价阳离子盐的质量-体积浓度为0.001％～0.1g/ml。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述温敏凝胶芯由温敏凝胶成型得到；

所述温敏凝胶为明胶、改性明胶、普朗尼克F127、壳聚糖基水凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺和基质胶中任一种。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述温敏凝胶芯的形状具有如下1)-3)中至少一种特点：

3)沿轴线方向，横截面的形状和/或尺寸发生变化。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述海藻酸钠水溶液的质量-体积浓度为0.002～0.1g/ml。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述交联反应的时间为1s～10min；

1)置于空气中；

2)浸泡于水中；

3)浸泡于所述水溶性二价阳离子盐的水溶液中。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，当所述温敏凝胶芯中装载有细胞时，在去除所述温敏凝胶芯之前，还包括将所述表面形成多层所述海藻酸盐凝胶的所述温敏凝胶芯进行孵育的步骤，在所述孵育的温度下所述温敏凝胶芯溶解，使所述细胞粘附种植于所述中空管结构的多层水凝胶的内壁；

去除所述温敏凝胶芯的步骤如下：

切除表面形成多层所述海藻酸盐凝胶的所述温敏凝胶芯的首尾端，使所述温敏凝胶芯溶出。

8.权利要求1-6中任一项所述制备方法制备的中空管结构的多层水凝胶。

9.一种基于预制血管网的三维组织结构，包括权利要求8所述中空管结构的多层水凝胶和浇注于所述中空管结构的多层水凝胶周围的组织细胞。

10.权利要求8所述中空管结构的多层水凝胶或权利要求9所述基于预制血管网的三维组织结构在如下1)-3)中任一种中的应用：

1)组织及器官的修复与重建；

2)病理模型的研究

3)药物测试。