CN110960732A - 一种具有中央灌流系统的活体神经支架及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有中央灌流系统的活体神经支架及其制造方法，所述活体神经支架通过在体外三维培养具有管腔结构的神经束，并在神经束的管腔内壁修饰内皮细胞，在灌流培养的条件下制作而成。灌流培养过程中，流体的切应力可以提高内皮细胞的活性，有利于实现血管化神经束的构建，从而改善神经束在植入体内后早期阶段的局部血供。同时流体切应力可以促进神经干细胞的增值与分化，并且灌流培养可以使神经束获得更充足的营养物质供应，降低细胞生长环境中新陈代谢废物的浓度，从而获得具有更高细胞密度的神经束。

Description

一种具有中央灌流系统的活体神经支架及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种具有中央灌流系统的活体神经支架的制造方法，属于组织工程领域。
背景技术
目前，由于意外事故、恶性疾病等原因，在世界范围内存在众多外周神经损伤患者，并且还在以每年新增100多万患者的速度持续增长，神经损伤患者的受损伤神经所支配的区域会出现感知障碍、运动障碍、营养障碍等问题，给患者的生活带来许多不便。由于神经组织的自我修复能力很弱，研究可靠的神经修复技术，成为神经组织工程领域内备受关注的关键问题。
目前用于神经修复的方法主要分为基于自体神经细胞移植的方法和基于生物材料构建神经支架的方法两种。然而，基于自体神经细胞移植的方法存在着长度有限、移植后如果不施加适当的引导，宿主神经无法有序再生等问题，而基于生物材料构建的神经支架在植入体内后需要一段时间降解，会对生物体产生一定影响。
随着组织工程技术的发展，组织工程领域的相关学者提出了基于活体支架的神经再生方法。目前现有的活体神经支架通过构建水凝胶导管，在水凝胶导管的管腔内三维培养星形胶质细胞束的方式制作而成，在水凝胶导管内腔表面的较大的曲率影响下，星形胶质细胞会以线性生长的方式形成束状结构，将通过上述方法制作的星形胶质细胞束从水凝胶导管中剥离出来，可作为活体支架，用于神经修复。而现有的活体神经支架的制作方法是直接在水凝胶导管内使星形胶质细胞线性生长成束状结构，其中存在的问题是，在神经束植入体内后，不能在早期及时建立神经束内在的血液循环，体外培养的神经束由于缺血缺氧，易形成胶质疤痕，影响神经再生的质量。
发明内容
为了解决现有的活体神经支架植入体内后存在的局部血供不足，易形成胶质疤痕等问题，本发明提供了一种具有中央灌流系统的活体神经支架及其制造方法。上述方法通过在神经束内制作灌流通道，并在灌流通道内修饰内皮细胞层，在持续的灌流培养条件下获得血管化的人工神经束。
本发明通过以下技术方案实现。
本发明第一方面提供一种活体神经支架，包括三维培养制作而成的神经细胞束，其中，所述神经细胞束为具有灌流通道的管腔结构，并且所述灌流通道内修饰有内皮细胞层。
本发明第二方面提供一种用于制造根据本发明第一方面所述的活体神经支架的模具，包括：第一定位板、下安装板、上安装板和针；
所述第一定位板有两个，其分别设置有一定数量个用于安装所述针的第一孔；
所述下安装板和所述上安装板能够装配在一起，形成一定数量个管腔，并且在所述管腔的两端形成能够与所述第一定位板配合的表面；由此，使得所述下安装板和所述上安装板放置于两个所述第一定位板之间时，所述第一孔与所述管腔的轴线对齐。
优选地，所述下安装板具有平行于所述管腔的第一表面，并且在所述第一表面上设置有一定数量个第一沟槽；所述上安装板具有平行于所述管腔的第二表面，并且在所述第二表面上设置有一定数量个第二沟槽；所述下安装板嵌入所述上安装板时，所述第一表面能够与所述第二表面接触，从而使所述第一沟槽和所述第二沟槽形成所述管腔。
优选地，所述上安装板和所述下安装板与两端的所述第一定位板可拆卸地连接。
优选地，所述模具还包括第二定位板和毛细玻璃管；
所述第二定位板有两个，其上分别设置有一定数量个用于安装所述毛细玻璃管的第二孔；
所述下安装板和所述上安装板放置于两个所述第二定位板之间时，所述第二孔与所述管腔的轴线对齐。
优选地，所述毛细玻璃管能够在所述管腔内滑动。
本发明第三方面提供一种使用本发明第二方面所述的模具制备根据本发明第一方面所述的活体神经支架的方法，包括如下步骤：
步骤1，使用第一定位板、下安装板、上安装板和针制作第一装配体，在所述第一装配体中制作用于为神经干细胞线提供三维线性化生长环境的琼脂糖导管；
步骤2，移除所述第一装配体中的第一定位板和针，装配第二定位板和毛细玻璃管得到第二装配体，在所述琼脂糖导管的管腔内对神经干细胞三维培养，制作包裹神经干细胞的水凝胶，所述包裹神经干细胞的水凝胶为具有内部通道的管腔结构；
步骤3，在所述内部通道的内壁上修饰一层内皮细胞层；
步骤4，将营养液通入所述包裹神经干细胞的水凝胶，在长期灌流培养的条件下，培养至神经干细胞线性生长为束状结构的神经束；
步骤5，将所述神经束从所述琼脂糖导管中剥离，得到活体神经支架。
优选地，所述步骤1进一步包括：
称取琼脂糖粉末，溶解于去离子水中，得到琼脂糖溶液；
在烧杯内加入磁力搅拌子，加热至琼脂糖溶液沸腾；
将沸腾的琼脂糖溶液静置待气泡消失后，倒入模具中，静置直到琼脂糖溶液冷却至室温，得到结构稳定的琼脂糖导管。
优选地，所述步骤2进一步包括：
配置GelMA水凝胶原液；
进行神经干细胞的培养及传代；
将传代后的神经干细胞做离心处理，去掉培养液，并向离心后的神经干细胞中加入经由微孔过滤膜过滤之后的GelMA水凝胶原液，吹散神经干细胞，使所述神经干细胞均匀分布在GelMA原液中；
取包裹有神经干细胞的GelMA原液，缓慢加入所述琼脂糖导管的管腔中；
从所述第二定位板的第二孔插入毛细玻璃管，利用光交联法，使用紫外灯照射琼脂糖导管得到包裹有神经干细胞的水凝胶。
优选地，所述步骤3进一步包括：
取下第二定位板，打开下安装板和上安装板，取出填充有所述包裹有神经干细胞的水凝胶的琼脂糖导管；
抽出所述毛细玻璃管一定长度，将嵌有所述毛细玻璃管的琼脂糖导管置于培养皿中；
将内皮细胞悬浮液注射进所述毛细玻璃管内，使内皮细胞在所述包裹有神经干细胞的水凝胶的内部通道表面贴壁生长；
待内皮细胞生长，得到贴壁生长的内皮细胞层。
通过以上技术方案，本发明能够取得以下技术效果。
本发明所述的具有中央灌流系统的活体神经支架，通过在体外三维培养具有管腔结构的神经束，并在神经束的管腔内壁修饰内皮细胞，在灌流培养的条件下制作而成，灌流培养过程中，流体的切应力可以提高内皮细胞的活性，有利于实现血管化神经束的构建，并且可以促进神经干细胞的增值与分化，同时灌流培养可以使神经束获得更充足的营养物质供应，降低细胞生长环境中新陈代谢废物的浓度，从而获得具有更高细胞密度的神经束。
附图说明
图1是根据本发明的活体神经支架示意图。
图2是用于制作琼脂糖导管的模具第一装配体的结构图。
图3是第一装配体中第一定位板的结构图。
图4是第一装配体中下安装板的结构图。
图5是第一装配体中上安装板的结构图。
图6是用于制作具有管腔结构的GelMA水凝胶的模具第二装配体的结构图。
图7是第二装配体中零件10的结构图。
图8是根据本发明的灌流培养系统示意图。
图中各个附图标记的含义如下：1.神经束，2.内皮细胞层，3.灌流通道，4.第一定位板，5.下安装板，6.上安装板，7.螺母，8.螺栓，9.针，10.第二定位板，11.毛细玻璃管，12.琼脂糖导管，13.第一注射器针头，14.固定架，15.第二注射器针头。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种活体神经支架，如图1所示，包括神经束1、内皮细胞层2。所述神经束内具有灌流通道3，所述内皮细胞层2修饰。
依据神经细胞在曲率较大的表面上会以线性生长的方式生长成束状结构的现象，所述神经活体支架由神经干细胞SH-SY5Y在水凝胶导管内线性化生长而成。
实施例2
本实施例提供用于制造根据本发明第一方面所述的活体神经支架的模具，包括：第一定位板4、下安装板5、上安装板6和针9。
所述第一定位板4有两个，其分别设置有一定数量个用于安装所述针9的第一孔。
所述下安装板5和所述上安装板6能够装配在一起，形成一定数量个管腔，并且在所述管腔的两端形成能够与所述第一定位板配合的表面。由此，使得所述下安装板5和所述上安装板6放置于两个所述第一定位板4之间时，所述第一孔与所述管腔的轴线对齐。
在一优选的实施方式中，所述下安装板5具有平行于所述管腔的第一表面，并且在所述第一表面上设置有一定数量个第一沟槽。所述上安装板6下部设置有一能够容纳所述下安装板5的空间，所述空间具有平行于所述管腔的第二表面，并且在所述第二表面上设置有一定数量个第二沟槽。所述下安装板嵌入所述上安装板的所述空间时，所述第一表面能够与所述第二表面接触，从而使所述第一沟槽和所述第二沟槽形成所述管腔。
在一优选的实施方式中，所述上安装板6和所述下安装板5与两端的所述第一定位板4可拆卸地连接。
在一优选的实施方式中，所述模具还包括第二定位板10和毛细玻璃管11。第二定位板10与第一定位板4的形状大致相同，区别在于第二定位板10的中心孔尺寸为400um、第一定位板4的中心孔尺寸为1mm。
所述第二定位板10有两个，其上分别设置有一定数量个用于安装所述毛细玻璃管11的第二孔。
所述下安装板5和所述上安装板6放置于两个所述第二定位板10之间时，所述第二孔与所述管腔的轴线对齐。
在一优选的实施方式中，所述毛细玻璃管11能够在所述管腔内滑动。
实施例3
本实施例提供利用实施例2中的模具制造如实施例1所述的活体神经支架制造方法，具体实施方式如下。
首先制作用于为神经干细胞线提供三维线性化生长环境的水凝胶导管。
所述水凝胶导管材料选择为琼脂糖，尺寸为外径2mm，管腔直径为1mm。所述琼脂糖导管的制造方法具体为称取3g琼脂糖粉末，溶解于100ml去离子水中，在烧杯内加入磁力搅拌子，在100℃加热、120转/分的条件下加热至琼脂糖溶液沸腾，将沸腾的琼脂糖溶液静置1分钟待气泡消失后，倒入模具中，静置直到琼脂糖溶液冷却至室温，得到结构稳定的琼脂糖导管。
所述模具如图2所示，由下安装板5、上安装板6和第一定位板4以及定位螺栓8、螺母7、针9组成。所述模具的零部件首先经过超声清洗10分钟，晾干后，置于紫外灯照射下进行杀菌处理，在无菌工作台上将零部件组装为第一装配体，如图3所示。在一优选的实施方式中，所述第一装配体的第一定位板4上设置有五个孔径为1mm的固定孔，用于安装针9，以形成琼脂糖导管的管腔。组装所述第一装配体的具体操作步骤为：首先装配下安装板5和上安装板6，放置于第一定位板4之间，通过螺栓8和螺母9连接并固定，以确保下安装板5和上安装板6之间的管腔和第一定位板4的中心孔的轴线对齐，然后向定位板的孔中加入沸腾的琼脂糖溶液，之后插入针9，等待琼脂糖溶液冷却后，即可得到嵌入在下安装板5和上安装板6之间的琼脂糖导管。上述所有操作均在无菌工作台上进行。
之后，将针9和第一定位板4拆下，暂不取出琼脂糖导管；安装第二定位板10得到用于制作包裹神经干细胞的GelMA水凝胶的模具，即第二装配体。对毛细玻璃管11作杀菌处理，用于形成GelMA水凝胶的管腔，其中毛细玻璃管11的外径为400um，内径为200um。将第二装配体水平放置在培养皿中，用于在琼脂糖导管的管腔内对神经干细胞三维培养。
在一优选的实施方式中，所述三维培养的具体方法为：首先配制GelMA水凝胶原液；然后进行神经干细胞的培养及传代，将传代后的神经干细胞做离心处理，去掉培养液，并向离心后的细胞中加入经由微孔过滤膜过滤之后的GelMA水凝胶原液，吹散细胞，使细胞均匀分布在GelMA原液中；通过移液枪取10uL包裹有神经干细胞的GelMA原液，缓慢从第二定位板10的孔中加入进琼脂糖导管的管腔中，然后从第二定位板10的小孔内插入毛细玻璃管11，利用光交联法，使用功率密度为1.65mW/cm2的紫外灯照射琼脂糖导管15s即可得到载有神经干细胞的GelMA水凝胶，由于毛细玻璃管11，得到的GelMA水凝胶具有管腔结构。
在一优选的实施方式中，所述GelMA水凝胶原液的具体制作方法为：首先称取0.1gGelMA粉末加入试管，再向试管中加入1mL磷酸盐(PBS)缓冲液,置入温度37℃、超声震荡频率为30kHz的水浴锅内1小时后取出，放入冰箱内在4℃环境下保存，待需要使用时，再置于37℃水浴锅内加热5分钟，并用微孔过滤膜过滤之后即可使用。
在一优选的实施方式中，所述神经干细胞选用细胞SH-SY5Y，其培养及传代的方法为：将SH-SY5Y细胞置于含有5％胎牛血清、100ug/mL青霉素及100ug/mL链霉素的高糖DMEM培养液中，放置在37℃、5％CO2浓度的培养箱中培养，培养液每隔两天更换一次，待细胞铺满培养皿时进行一次传代。
通过上述方法得到装载神经干细胞的GelMA水凝胶后，拆下螺栓8、螺母7，由于此时琼脂糖导管12内的GelMA水凝胶已形成管腔结构，且管腔内嵌有毛细玻璃管11，因此应在避免用力触碰毛细玻璃管11的前提下小心取下第二定位板10。打开下安装板5和上安装板6，小心取出填充有GelMA水凝胶的琼脂糖导管12，轻轻抽出毛细玻璃管11大约15mm，将嵌有毛细玻璃管11的琼脂糖导管12置于培养皿中。为避免琼脂糖导管的移动，用琼脂糖溶液将琼脂糖导管固定。通过注射器向毛细玻璃管11内注射内皮细胞悬浮液，在GelMA管腔内壁上修饰一层内皮细胞层。
在一优选的实施方式中，上述内皮细胞层的培养方法为：首先将第一注射器针头13和第二注射器针头15通过胶水固定在固定架14上。然后将第一注射器针头13和第二注射器针头15小心插进毛细玻璃管11中。将装有内皮细胞悬浮液的注射器通过第一注射器针头13以500uL/h的流速缓慢注射进GelMA水凝胶的通道内，使内皮细胞在通道表面贴壁生长，待内皮细胞生长24小时之后，即可得到贴壁生长的内皮细胞层。
将通向第一注射器针头13的液体换为神经干细胞培养液，在500uL/h的流速的灌流状态下动态培养，液体将从第二注射器针头15流至外界的废液缸。
在一优选的实施方式中，所述神经干细胞培养液为含有5％胎牛血清、100ug/mL青霉素及100ug/mL链霉素的高糖DMEM培养液。
由于琼脂糖导管的内腔表面有较大的表面曲率，神经干细胞在琼脂糖导管内会以线性生长的方式生长成神经束，待神经干细胞生长成束状组织后，将培养得到的神经束通过镊子从琼脂糖导管中分离出来，得到可用于神经修复的活体神经支架。
本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种活体神经支架，包括三维培养制作而成的神经细胞束，其特征在于，所述神经细胞束为具有灌流通道的管腔结构，并且所述灌流通道内修饰有内皮细胞层。
2.一种用于制造根据权利要求1所述的活体神经支架的模具，其特征在于，包括：第一定位板、下安装板、上安装板和针；
所述第一定位板有两个，其分别设置有一定数量个用于安装所述针的第一孔；
所述下安装板和所述上安装板能够装配在一起，形成一定数量个管腔，并且在所述管腔的两端形成能够与所述第一定位板配合的表面；由此，使得所述下安装板和所述上安装板放置于两个所述第一定位板之间时，所述第一孔与所述管腔的轴线对齐。
3.根据权利要求2所述的模具，其特征在于，所述下安装板具有平行于所述管腔的第一表面，并且在所述第一表面上设置有一定数量个第一沟槽；所述上安装板具有平行于所述管腔的第二表面，并且在所述第二表面上设置有一定数量个第二沟槽；所述下安装板嵌入所述上安装板时，所述第一表面能够与所述第二表面接触，从而使所述第一沟槽和所述第二沟槽形成所述管腔。
4.根据权利要求2或3所述的模具，其特征在于，所述上安装板和所述下安装板与两端的所述第一定位板可拆卸地连接。
5.根据权利要求2所述的模具，其特征在于，所述模具还包括第二定位板和毛细玻璃管；
所述第二定位板有两个，其上分别设置有一定数量个用于安装所述毛细玻璃管的第二孔；
所述下安装板和所述上安装板放置于两个所述第二定位板之间时，所述第二孔与所述管腔的轴线对齐。
6.根据权利要求5所述的模具，其特征在于，所述毛细玻璃管能够在所述管腔内滑动。
7.一种使用根据权利要求6所述的模具制备根据权利要求1所述的活体神经支架的方法，包括如下步骤：
步骤1，使用第一定位板、下安装板、上安装板和针制作第一装配体，在所述第一装配体中制作用于为神经干细胞线提供三维线性化生长环境的琼脂糖导管；
步骤2，移除所述第一装配体中的第一定位板和针，装配第二定位板和毛细玻璃管得到第二装配体，在所述琼脂糖导管的管腔内对神经干细胞三维培养，制作包裹神经干细胞的水凝胶，所述包裹神经干细胞的水凝胶为具有内部通道的管腔结构；
步骤3，在所述内部通道的内壁上修饰一层内皮细胞层；
步骤4，将营养液通入所述包裹神经干细胞的水凝胶，在长期灌流培养的条件下，培养至神经干细胞线性生长为束状结构的神经束；
步骤5，将所述神经束从所述琼脂糖导管中剥离，得到活体神经支架。
8.根据权利要求7所述的一种制备根据权利要求1所述的活体神经支架的方法，其特征在于，所述步骤1进一步包括：
称取琼脂糖粉末，溶解于去离子水中，得到琼脂糖溶液；
在烧杯内加入磁力搅拌子，加热至琼脂糖溶液沸腾；
将沸腾的琼脂糖溶液静置待气泡消失后，倒入模具中，静置直到琼脂糖溶液冷却至室温，得到结构稳定的琼脂糖导管。
9.根据权利要求8所述的一种制备根据权利要求1所述的活体神经支架的方法，其特征在于，所述步骤2进一步包括：
配置GelMA水凝胶原液；
进行神经干细胞的培养及传代；
将传代后的神经干细胞做离心处理，去掉培养液，并向离心后的神经干细胞中加入经由微孔过滤膜过滤之后的GelMA水凝胶原液，吹散神经干细胞，使所述神经干细胞均匀分布在GelMA原液中；
取包裹有神经干细胞的GelMA原液，缓慢加入所述琼脂糖导管的管腔中；
从所述第二定位板的第二孔插入毛细玻璃管，利用光交联法，使用紫外灯照射琼脂糖导管得到包裹有神经干细胞的水凝胶。
10.根据权利要求9所述的一种制备根据权利要求1所述的活体神经支架的方法，其特征在于，所述步骤3进一步包括：
取下第二定位板，打开下安装板和上安装板，取出填充有所述包裹有神经干细胞的水凝胶的琼脂糖导管；
抽出所述毛细玻璃管一定长度，将嵌有所述毛细玻璃管的琼脂糖导管置于培养皿中；
将内皮细胞悬浮液注射进所述毛细玻璃管内，使内皮细胞在所述包裹有神经干细胞的水凝胶的内部通道表面贴壁生长；
待内皮细胞生长，得到贴壁生长的内皮细胞层。
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