CN113462566A - 神经束构造支架及神经束构造方法 - Google Patents

神经束构造支架及神经束构造方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种神经束构造支架，涉及组织工程技术领域，包括：多个微导管、支撑体和壳体，壳体内用于容置培养液，微导管用于培育神经细胞，多个微导管均通过支撑体悬置固定于壳体内，各微导管均沿壳体的一端至另一端的方向设置，微导管的导管壁上设有多个过孔，微导管中的神经细胞不能够通过过孔流出，培养液能够通过过孔进入到微导管中；本发明还提供了一种基于如上所述的神经束构造支架的神经束构造方法，包括：用胶原蛋白水凝胶原液包裹神经细胞填充进微导管内，待胶原蛋白水凝胶原液完全交联后，将装载有神经细胞的神经束构造支架放在培养装置内进行灌流培养，本发明提供的神经束构造支架及神经束构造方法便于制作多通路神经束。

Description

神经束构造支架及神经束构造方法
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，特别是涉及一种神经束构造支架及神经束构造方法。
背景技术
据统计，目前世界上有超过10亿人受到神经系统受损的困扰，然而神经组织的自我修复能力很弱，因此通过组织工程的方法体外构建神经组织作为植入物，以神经植入的方式实现修复受损神经的方法受到广泛关注；而在神经组织植入受损神经前需要预先对体外构建出的神经组织做药物测试，以测试所构建的神经组织的信息传导特性等功能，解剖分析表明外周神经系统的传入、传出神经是具有复杂的三维层次结构的，由多路神经纤维集合在一起形成的束状结构，据相关研究报道，神经束内的高度定向排列的线性化结构特点对神经信号的定向传导具有重要的作用，因此对具有三维层次结构的多通路束状神经组织进行测试显然比对单根的神经纤维进行测试得出的结果更加的可靠准确，然而现有的体外构建神经组织的方法主要分为基于细胞生物学的方法和基于工程的方法两种。基于细胞生物学的方法主要有通过细胞自组装的方法培养神经球和将神经干细胞嵌入基质胶等其他基质，通过诱导分化构建类器官模型两种思路，基于细胞生物学方法难以精确调控组织的结构尺寸和相形状大小，不适用于多通路神经束的构建。基于工程的方法主要有微流道，基于微流道的方法常用于制作单根神经纤维，也不能满足构建多通路神经束；因此，亟需一种新型的神经束构造支架来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种神经束构造支架及神经束构造方法，以解决上述现有技术存在的问题，便于制作多通路神经束。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种神经束构造支架，包括：多个微导管、支撑体和壳体，所述壳体呈套筒状，所述壳体内用于容置培养液，所述壳体一端设有培养液进口，另一端设置有培养液出口；所述微导管用于培育神经细胞，多个所述微导管均通过所述支撑体悬置固定于所述壳体内，各所述微导管均沿所述壳体的一端至另一端的方向设置，所述微导管的导管壁上设有多个过孔，所述微导管中的神经细胞不能够通过所述过孔流出，所述培养液能够通过所述过孔进入到所述微导管中。
优选的，所述支撑体为镂空结构，所述支撑体固定设置于所述壳体内，所述微导管嵌入固定于所述支撑体内。
优选的，还包括灌流盘，所述壳体两端敞口设置，各所述微导管均平行，各所述微导管的同一端均从所述支撑体中露出；所述灌流盘的底板上设置有多个灌流孔，各所述灌流孔分别对应于一个所述微导管，且各所述灌流孔分别与各所述灌流孔密封连接，所述灌流盘将所述支撑体遮挡。
优选的，所述微导管内壁为亲水表面。
优选的，所述支撑体为可灌流晶体结构。
优选的，所述微导管、所述支撑体、所述壳体以及所述灌流盘为一体式结构，所述微导管、所述支撑体、所述壳体以及所述灌流盘通过光刻加工一体制作。
本发明还提供了一种基于如上所述的神经束构造支架的神经束构造方法，包括：用胶原蛋白水凝胶原液包裹神经细胞填充进所述微导管内，待胶原蛋白水凝胶原液完全交联后，将装载有神经细胞的神经束构造支架放在培养装置内进行灌流培养。
优选的，所述神经束构造支架包括灌流盘，各所述微导管均平行，各所述微导管的同一端均从所述可灌流培养体中露出；所述灌流盘的底板上设置有多个灌流孔，各所述灌流孔分别对应于一个所述微导管，且各所述灌流孔分别与各所述灌流孔密封连接，所述灌流盘将所述可灌流培养体遮挡；将胶原蛋白水凝胶原液包裹神经细胞通过所述微导管连接所述灌流盘的一端灌入所述微导管中后，将灌流盘除去。
优选的，在培养装置中对装载有神经细胞的神经束构造支架进行持续流动灌流培养。
优选的，将装载有神经细胞的神经束构造支架放在移液枪吸头中，移液枪的培养液入口连接培养液注射器，移液枪的废液出口放置有废液收集皿，以200uL/h～400uL/h的流速持续流动灌流培养一周。
本发明相对于现有技术取得了以下技术效果：
本发明提供了一种神经束构造支架及神经束构造方法，其中，悬置固定于壳体内的各微导管均能够培养出神经纤维，因此，本发明提供的神经束构造支架及神经束构造方法便于制作多通路神经束。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例一提供的神经束构造支架的整体结构示意图；
图2为实施例一提供的神经束构造支架1中的支撑体和壳体的结构示意图；
图3为实施例一提供的神经束构造支架1中的支撑体、壳体和微导管的结构示意图；
图4为实施例一提供的神经束构造支架1中的微导管的结构示意图；
图中：1-壳体、2-灌流盘、21-灌流孔、3-微导管、31-过孔、4-支撑体。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的目的是提供一种神经束构造支架及神经束构造方法，以解决现有技术存在的问题，以便于制作多通路神经束。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例一
本实施例提供一种神经束构造支架，如图1～4所示，包括：多个微导管3、支撑体4和壳体1，壳体1呈套筒状，壳体1内用于容置培养液，壳体1一端设有培养液进口，另一端设置有培养液出口；微导管3用于培育神经细胞，多个微导管3均通过支撑体4悬置固定于壳体1内，各微导管3均沿壳体1的一端至另一端的方向设置，微导管3的导管壁上设有多个过孔31，微导管3中的神经细胞不能够通过过孔31流出，培养液能够通过过孔31进入到微导管3中；悬置固定于壳体1内的各微导管3均能够培养出神经纤维，多根神经纤维组成一个多通路神经束，多个神经纤维在壳体1内同时进行培育，且制作出来的神经束可直接投入药物测试中进行使用，无需拆除壳体1以及支撑体4，因此，本发明提供的神经束构造支架及神经束构造方法便于制作多通路神经束且能够提高药物测试的可靠性、真实性。
进一步的，支撑体4为镂空结构，支撑体4固定设置于壳体1内，微导管3嵌入固定于支撑体4内，镂空结构的支撑体4内可灌注有培养液，具体的，支撑体4为可灌流晶体结构，采用上述结构可提高微导管3的稳定性且不会影响对微导管3内的神经细胞进行灌流培养。
进一步的，还包括灌流盘2，壳体1两端敞口设置，各微导管3均平行，各微导管3的同一端均从支撑体4中露出；灌流盘2的底板上设置有多个灌流孔21，各灌流孔21分别对应于一个微导管3，且各灌流孔21分别与各灌流孔21密封连接，灌流盘2将支撑体4遮挡，设置灌流盘2以防止在向微导管3内灌注神经细胞以及其初始的培养物质时，神经细胞以及其初始的培养物质流进支撑体4内，上述设置提高了灌注的精准性，初始的培养物质为胶原蛋白水凝胶原液。
进一步的，微导管3内壁为亲水表面，因此，在向微导管3内灌注包裹有神经细胞的胶原蛋白水凝胶原液时，胶原蛋白水凝胶原液在毛细力的作用下自动被吸入进到微导管3中；具体的，采用等离子体对其进行亲水性处理，等离子体发生设备使用PVA Tepla AGGIGA batch 310M，使用氧气产生等离子体，气体流量设置为100sccm，功率设置为300W，处理时间5分钟。等离子体处理结束后再将神经束构造支架置于紫外灯下照射30分钟进行杀菌处理。
进一步的，微导管3、支撑体4、壳体1以及灌流盘2为一体式结构，微导管3、支撑体4、壳体1以及灌流盘2通过光刻加工一体制作，加工尺寸精确，具体的，由Nanoscribe公司的Photonic Professional GT2系统加工而成，加工过程使用25倍物镜，光刻胶选择IP-S光刻胶，基底为镀有ITO的玻璃基底，工艺参数设置为Slicing 1.0，Hatching 0.5，激光功率为最大功率的80％，扫描速度为70000um/s，Z方向驱动方式选择为Z-drive，不对结构做分块处理，在加工完成后，将神经束构造支架浸泡在丙二醇甲醚醋酸酯(PGMEA)内显影处理6小时，然后浸泡在异丙醇中30分钟即可取出使用。
进一步的，为了提供足够引导神经纤维线性生长的曲率，微导管3的直径设计为150um，优选设置七根微导管3，七根微导管3之间以呈晶格结构的支撑体4作为连接，晶格结构的晶胞设计为边长100um的正方体，晶胞的支柱厚度、微导管3的壁厚以及壳体1的厚度均设计为10um，晶格结构的设计使得支撑体4是可灌注的，微导管3侧壁上的微孔阵列排布，起到了促进微管内神经组织与培养液的物质交换，从而更好的发挥灌流培养的作用，过孔31直径为5um，由于神经细胞的平均胞体直径在10um以上，因此微导管3侧壁过孔31在允许如葡萄糖、蛋白质等大分子营养物质通过的同时，可以避免微导管3内的神经细胞迁移至管外，因微导管3的侧壁大量开孔造成应力集中，因此微导管3上每互相相邻的三个孔均为三角形的排布形式，上述结构设计使得应力集中现象得到一定的缓解。
实施例二
本实施例提供了一种基于实施例一所述的神经束构造支架的神经束构造方法，包括：用胶原蛋白水凝胶原液包裹神经细胞填充进微导管3内，待胶原蛋白水凝胶原液完全交联后，将装载有神经细胞的神经束构造支架放在培养装置内进行灌流培养，交联是指胶原蛋白水凝胶原液由液体变成凝胶的过程。
进一步的，神经束构造支架包括灌流盘2，各微导管3均平行，各微导管3的同一端均从可灌流培养体中露出；灌流盘2的底板上设置有多个灌流孔21，各灌流孔21分别对应于一个微导管3，且各灌流孔21分别与各灌流孔21密封连接，灌流盘2将可灌流培养体遮挡；将胶原蛋白水凝胶原液包裹神经细胞通过微导管3连接灌流盘2的一端灌入微导管3中后，将灌流盘2除去。
进一步的，在培养装置中对装载有神经细胞的神经束构造支架进行持续流动灌流培养。
进一步的，将装载有神经细胞的神经束构造支架放在移液枪吸头中，移液枪的培养液入口连接培养液注射器，移液枪的废液出口放置有废液收集皿，以200uL/h～400uL/h的流速持续流动灌流培养一周，持续灌流培养是为了模拟人体中神经纤维真实的培养环境，提高仿生性，且神经细胞代谢的废物可经过过孔流出微导管，降低神经细胞生长环境中新陈代谢废物的浓度。
具体的神经束构造方法为：
首先配制胶原蛋白水凝胶原液，胶原蛋白水凝胶原液的具体制作方法为：称取10mg鼠尾胶原蛋白，溶解于0.2％的冰醋酸溶液中，然后取100uL胶原蛋白溶液，向其中加入36uL浓度为0.1M的NaOH溶液至中和，加入15uL的10倍浓度PBS调节离子盐浓度，最后加入49uL神经细胞培养液，所述神经细胞培养液配比为添加10％马血清，5％胎牛血清，1％青霉素、链霉素的RPMI1640培养液，制作完成后用胶原蛋白水凝胶原液包裹神经细胞，神经细胞选择PC12，具体方法为：对长满培养皿的PC12细胞传代，将离心后的细胞悬浮液稀释10倍后再次离心，向离心得到的细胞沉淀物加入由0.22um微孔过滤膜过滤之后的胶原蛋白水凝胶原液，吹打悬浮即可得到包裹有神经细胞的胶原蛋白水凝胶原液，在向微导管3内灌注胶原蛋白水凝胶原液后室温放置15分钟等待胶原蛋白预交联后加入培养液，放入37℃培养箱内静置1小时，待胶原蛋白完全交联后取出将灌流盘2用镊子剥离，再将装载细胞的多孔仿生支架小心地塞进10uL移液枪吸头，微导管3的一端可设置为封闭状态，移液枪吸头中营养液的沿微导管3的封闭端至其开口端的方向流动，用毛细玻璃管轻推多孔仿生支架至支架稳定地固定在移液枪吸头尖端，然后置于显微镜镜上培养装置中，将移液枪吸头的入口连接注射器，另一端在移液枪吸头的出口处放置培养皿用以收集废液，以300uL/h的流量灌流培养一周，即可得到细胞活性高、细胞密度大、线性生长的多通路神经束。
本发明中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种神经束构造支架，其特征在于：包括：多个微导管、支撑体和壳体，所述壳体呈套筒状，所述壳体内用于容置培养液，所述壳体一端设有培养液进口，另一端设置有培养液出口；所述微导管内用于培育神经细胞，多个所述微导管均通过所述支撑体悬置固定于所述壳体内，各所述微导管均沿所述壳体的一端至另一端的方向设置，所述微导管的导管壁上设有多个过孔，所述微导管中的神经细胞不能够通过所述过孔流出，所述培养液能够通过所述过孔进入到所述微导管中。
2.根据权利要求1所述的神经束构造支架，其特征在于：所述支撑体为镂空结构，所述支撑体固定设置于所述壳体内，所述微导管嵌入固定于所述支撑体内。
3.根据权利要求2所述的神经束构造支架，其特征在于：还包括灌流盘，所述壳体两端敞口设置，各所述微导管均平行，各所述微导管的同一端均从所述支撑体中露出；所述灌流盘的底板上设置有多个灌流孔，各所述灌流孔分别对应于一个所述微导管，且各所述灌流孔分别与各所述灌流孔密封连接，所述灌流盘将所述支撑体遮挡。
4.根据权利要求1所述的神经束构造支架，其特征在于：所述微导管内壁为亲水表面。
5.根据权利要求2所述的神经束构造支架，其特征在于：所述支撑体为可灌流晶体结构。
6.根据权利要求3所述的神经束构造支架，其特征在于：所述微导管、所述支撑体、所述壳体以及所述灌流盘为一体式结构，所述微导管、所述支撑体、所述壳体以及所述灌流盘通过光刻加工一体制作。
7.一种基于权利要求1～6任意一项所述的神经束构造支架的神经束构造方法，其特征在于：包括：将神经细胞填充进所述微导管内，将装载有神经细胞的神经束构造支架放在培养装置内进行灌流培养。
8.根据权利要求7所述的神经束构造方法，其特征在于：所述神经束构造支架包括灌流盘，各所述微导管均平行，各所述微导管的同一端均从所述可灌流培养体中露出；所述灌流盘的底板上设置有多个灌流孔，各所述灌流孔分别对应于一个所述微导管，且各所述灌流孔分别与各所述灌流孔密封连接，所述灌流盘将所述可灌流培养体遮挡；将胶原蛋白水凝胶原液包裹神经细胞通过所述微导管连接所述灌流盘的一端灌入所述微导管中后，将灌流盘除去。
9.根据权利要求7所述的神经束构造方法，其特征在于：在培养装置中对装载有神经细胞的神经束构造支架进行持续流动灌流培养。
10.根据权利要求9所述的神经束构造方法，其特征在于：将装载有神经细胞的神经束构造支架放在移液枪吸头中，移液枪的培养液入口连接培养液注射器，移液枪的废液出口放置有废液收集皿，以200uL/h～400uL/h的流速持续流动灌流培养一周。
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