KR20200119919A

KR20200119919A - 바이오 프린팅 기술을 이용한 신경도관의 제조방법 및 이에 따라 제조된 신경도관

Info

Publication number: KR20200119919A
Application number: KR1020190030849A
Authority: KR
Inventors: 박종웅; 정영미; 김수현; 정지홍
Original assignee: 고려대학교 산학협력단; 한국과학기술연구원
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2020-10-21
Also published as: US20200376167A1; US11607474B2; KR102265640B1

Abstract

본 발명은 바이오 프린팅 기술을 이용한 신경도관의 제조방법 및 이에 따라 제조된 신경도관에 관한 것으로, 다공성 고분자 지지체의 일면에 신경재생물질을 포함하는 바이오잉크를 삼차원 프린팅하여 신경다발 및 신경조직 등을 모사함으로써 용이하게 신경도관을 제조할 수 있다.

Description

바이오 프린팅 기술을 이용한 신경도관의 제조방법 및 이에 따라 제조된 신경도관{Method for preparing of nerve conduit using bio-printing technology and the nerve conduit prepared by the same}

본 발명은 바이오 프린팅 기술을 이용한 신경도관의 제조방법 및 이에 따라 제조된 신경도관에 관한 것이다.

말초 신경이 외상에 의해 손상을 입은 경우, 절단된 신경의 절단면을 서로 직접 문합하는 방법이 시행된다. 그러나, 대부분의 신경을 정확하게 직접 문합하는 것은 거의 불가능하다. 직접 문합이 불가능한 경우, 그 기능의 회복을 위해서 자가 신경 이식술을 시행하고 있다. 그러나 자가 신경 이식술의 경우 손상 부위의 신경 조직과 이식 되어지는 신경 조직의 굵기와 형태를 일치시키기 어렵다는 단점이 있고, 채취 가능한 신경에도 제한이 있다. 또한 이식 신경을 채취한 부위에서도 기능의 저하가 일어날 수 있다. 따라서 신경 결손 부위가 생길 경우, 그것의 기능을 회복하기 위한 방법으로 신경도관(nerve conduit)이 사용되고 있다.

신경도관은 결손된 신경의 양끝을 연결하여 신경이 재생되도록 가이드 역할을 하는 연결관으로, 절단된 신경의 양쪽 끝을 신경도관 안에 고정하고 도관의 안으로 신경의 연결을 유도한다. 신경도관을 이용하게 되면, 신경 재생에 방해되는 반흔 조직의 침투를 막을 수 있고, 신경 재생의 방향을 올바른 방향으로 유도할 수 있다. 또한, 신경도관은 신경 자체에서 분비되는 신경 재생 촉진 물질들을 도관 내에 유지시키고 재생에 방해되는 물질들이 도관 내부로 들어오는 것을 막아주는 이점을 제공한다.

한편, 최초의 신경도관으로 비분해성인 실리콘 튜브가 사용되었다. 그러나, 신경이 재생된 후에도 체내에 남아 만성적인 염증, 실리콘의 칼슘화 및 재생된 신경을 압박하여 고통을 야기하는 문제가 있으며, 신경이 완전히 수복된 후에 재수술하여 튜브를 제거해야 하는 번거로움이 있었다.

최근에, 다양한 세포를 윈하는 위치에 정밀하게 위치시킬 수 있는 세포 프린팅 기술 등이 개발되어 왔다. 보다 구체적으로 3D 바이오 프린팅 기술을 이용하여 세포를 지지할 수 있는 스캐폴드, 그리고 세포의 성장을 도와주는 성장인자 등을 함께 프린팅 하여 인체의 손상된 장기나 조직을 대체할 수 있는 인공조직을 개발하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

그러나, 신경도관 제조시 3D 바이오 프린팅을 적용하는 경우, 인쇄된 신경도관의 손상된 조직을 만들기 위해 가이드를 해줄 조직이 필요한데 그 조직이 없었으며, 도관 내에서 신경이 자라날 수 있도록 하는 가이드 조직을 만드는 등의 어려움이 있었다.

일본 공개특허 제2009-45221호

본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 다공성 고분자 지지체의 일면 또는 양면에 신경재생물질을 포함하는 바이오 잉크를 프린팅하여 신경도관을 제조할 수 있는 신경도관의 제조방법을 제공하고자 한다.

아울러, 신경도관의 제조방법에 따라 제조되는 신경도관을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 일 실시예에서,

삼차원 바이오 잉크가 프린팅된 다공성 바이오 프린터(3D bio-printer)를 이용하여 다공성 고분자 지지체의 일면 또는 양면에 신경재생물질을 포함하는 바이오 잉크를 프린팅하는 단계; 및 고분자 지지체를 도관 형태로 래핑하여 신경도관을 제조하는 단계; 를 포함하며,

상기 바이오 잉크는, 하이드로겔, 신경재생인자 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 신경도관의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 일 실시예에서,

신경도관의 제조방법에 의해서 제조된 신경도관을 제공한다.

본 발명의 신경도관의 제조방법에 따르면, 외부 환경으로부터 물질 교환이 자유로운 다공성 고분자 지지체의 일면 또는 양면에 신경재생물질을 포함하는 바이오잉크를 삼차원 프린팅하여 신경다발 및 신경조직 등을 모사함으로써 용이하게 신경도관을 제조할 수 있다.

특히, 신경도관의 제조시 삼차원 프린팅을 이용함으로써, 신경도관을 이루는 신경재생물질 등을 용이하게 배열 및 혼합할 수 있다.

뿐만 아니라, 제조되는 신경도관 내에 신경재생 물질 및 신경세포 등을 제공하여, 신경 결손부위의 신경재생을 극대화하여 신경재생기간을 단축시킬 수 있으며, 최종적으로 신경재생 부위의 기능회복을 통하여 현재 신경도관이식술의 한계점을 극복할 수 있다.

나아가, 환자마다 모두 다른 직경, 길이가 다른 특성을 고려하여 환자 맞춤형의 외형을 갖는 신경도관을 프린트 할 수 있으며, 환자 친화적이며 면역반응을 최적화한 환자 맞춤형 바이오프린팅 신경도관으로 응용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 신경도관의 제조방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 신경도관의 제조방법의 단계를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 다공성 고분자 지지체를 도관 형태로 래핑하는 다양한 실시예를 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예에서, 다공성 고분자 지지체의 일면에 바이오 잉크를 한줄씩 인쇄하는 과정을 보여주는 도면이다.
도 5는 실시예에서 제조한 신경재생물질을 함유하는 신경도관을 나타내는 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 전기방사된 다공성 고분자 지지체를 전자현미경으로 촬영한 사진이다.
도 7은 신경세포의 생장 결과를 나타내는 도면이다 ((a) 0.25 % 콜라겐, (b) 0.25 % 콜라겐+0.1% dECM).

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.

그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.

본 발명에서, “포함한다” 또는 “가지다” 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명일 실시예에서,

삼차원 바이오 프린터(3D bio-printer)를 이용하여 다공성 고분자 지지체의 일면 또는 양면에 신경재생물질을 포함하는 바이오 잉크를 프린팅하는 단계; 및

바이오 잉크가 프린팅된 다공성 고분자 지지체를 도관 형태로 래핑하여 신경도관을 제조하는 단계; 를 포함하며,

또한, 본 발명은 일 실시예에서,

설명에 앞서, 본 발명에서 사용하는 용어들 중 "바이오 프린팅" 이란, 컴퓨터 보조의, 삼차원 시제품화 장치(예, 삼차원 프린터)와 상용되는 방법론을 통해 삼차원의 정확한 바이오 잉크 침착(예, 하이드로겔, 세포 용액, 세포 함유 겔, 세포 현탁액, 세포 농축물, 다세포 응집체, 다세포체 등)을 이용하는 것을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서는 삼차원 프린팅은 바이오플로터(bio-plotter)를 이용하여 제조되는 신경도관에서 신경조직을 구성할 수 있는 물질을 노즐로부터 압출하여 다공성 고분자 지지체에 적층함으로써 수행될 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 신경도관의 제조방법 및 이에 따라 제조된 신경도관을 상세히 설명하도록 한다.

도 1은 본 발명의 신경도관의 제조방법을 나타낸 순서도이며, 도 2는 본 발명의 신경도관의 제조방법의 단계를 개략적으로 나타낸 도면이다.

도 1과 도 2를 참조하면, 삼차원 바이오 프린터(bio-printer)를 이용하여 다공성 고분자 지지체의 일면에 바이오 잉크를 프린팅하는 단계(S100); 및

바이오 잉크가 프린팅된 다공성 고분자 지지체를 도관 형태로 래핑하여 신경도관을 제조하는 단계(S200); 를 포함한다.

상기 다공성 고분자 지지체는, 생체적합성 고분자와 용매가 혼합된 방사용액을 전기방사하여 얻어진 시트 형태일 수 있다.

한편, 본 발명에서는 다공성 고분자 지지체를 제조하기 위하여, 생체적합성 고분자와 용매를 혼합하여 방사용액을 만들고, 방사용액을 전기방사하여 다공성 고분자 지지체를 제조할 수 있다.

여기서, "생체적합성 고분자"란, 생체에 적합하고 생분해성인 고분자를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 생체적합성 고분자는, 폴리카프로락톤(Polycaprolactone; PCL), 폴리락타이드, PLA), 폴리글라이코라이드(Polyglycolide), 폴리우레탄(polyurethane, PU), 폴리다이옥사논(Polydioxanone, PDO), 폴리에틸렌 글라이콜(Poly Ethilene glycol, PEG), 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드-co-아크릴산)[poly(N-isopropyl acrylamide-coacrylic acid), 폴리비닐 알코올(Poly Vinyl Alcohol (PVA), 폴리스티렌(Polystyrene, PS) 및 폴리에스테르 (polyester)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고분자를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 폴리카프로락톤(Polycaprolactone; PCL)일 수 있다.

아울러, 전기방사에 사용되는 용매는 HFIP(Hexafluoro-2-propanol), DMAc(N,N-Dimethyl acetoamide), DMF(N,N-Dimethylformamide), NMP(N-methyl-2-pyrrolidinone), DMSO(dimethyl sulfoxide), THF(tetra-hydrofuran), (EC(ethylene carbonate), DEC(diethyl carbonate), DMC(dimethyl carbonate), EMC(ethyl methyl carbonate), PC(propylene carbonate), 물, 초산(acetic acid), 개미산(formic acid), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 아세톤(acetone) 및 이소프로필알콜(isopropylalchol)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

다공성 고분자 지지체를 제조하기 위하여 통상적의 전기방사 장치를 이용할 수 있다. 이에 특별히 제한하지 아니하며, 일반적인 고전압(5 내지 50kV)을 걸어줄 수 있는 전기방사장치가 널리 사용될 수 있다. 하나의 양태로서, 상기 전기방사는 전기방사 수집부에 상기 고분자 용액을 토출시켜 섬유화 구조를 갖는 다공성 고분자 지지체를 제조할 수 있다. 또한, 전기방사시 제조될 고분자 용액의 농도 및 신경도관의 직경을 고려하여 토출속도 및 전압을 조절할 수 있다. 일 예로, 토출속도는 0.1 내지 5.0 ㎖/h 일 수 있으며, 전압은 1 내지 50 kV의 전압을 걸어줄 수 있다.

이렇게 제조된 다공성 고분자 지지체는 평균 두께 10 내지 1000 nm 의 시트형태일 수 있으며, 평균 두께 1 nm 내지 500 nm 의 시트형태일 수 있다. 보다 상세하게는, 다공성 고분자 지지체의 평균 두께는 10 내지 1000 nm 범위, 20 내지 900 nm 범위, 40내지 800 nm 범위, 70 내지 700 nm 범위, 100 내지 600 nm 범위, 150 내지 500 nm 범위, 200 내지 400 nm 범위, 250 내지 350 nm 범위, 일 수 있으며, 일 예로, 상기 다공성 고분자 지지체는 평균 300 nm 일 수 있다.

나아가, 다공성 고분자 지지체는 평균 직경 1 nm 내지 500 nm 의 공극을 포함할 수 있으며, 5 nm 내지 450 nm, 10 nm 내지 400 nm, 20 nm 내지 350 nm, 30 nm 내지 300 nm, 40 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 200 nm, 60 nm 내지 150 nm, 또는 70 nm 내지 100 nm 일 수 있다. 특정 양태로서, 다공성 고분자 지지체의 공극이 1 nm 미만인 경우, 신경도관 내외부간의 체액 교환이 용이하게 이루어지지 않으며, 500 nm 을 초과하는 경우, 지지체의 공극이 너무 커서 바이오잉크가 도관 밖으로 누출되는 문제가 발생할 수 있다.

한편, 제조된 다공성 고분자 지지체는 후술하게 되는 바이오 잉크와의 부착율을 높이기 위하여 콜라겐과 같은 단밸질을 코팅하는 단계를 더 포함할 수 있다.

다음으로, 다공성 고분자 지지체의 일면 또는 양면에 신경재생을 위한 신경다발 재생 촉진을 위해, 신경조직을 구성할 수 있는 신경재생물질을 포함하는 바이오잉크를 3D프린팅 기법을 이용하여 프린팅할 수 있다. 예를 들면, 신경재생물질을 포함하는 바이오 잉크는, 하이드로겔, 신경재생인자 및 신경세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 바이오 잉크를 프린팅하는 단계는, 바이오 잉크를 축방향으로 복수개의 라인이 형성되도록 프린팅할 수 있다. 여기서, "일방향" 이라 함은 제조하게 되는 도관의 축방향을 의미할 수 있으며, 일 예로, 신경도관의 길이방향을 의미할 수 있다.

그리고, 바이오 잉크가 프린팅된 다공성 고분자 지지체를 도관 형태로 래핑하여 신경도관을 제조할 수 있다(도 3 참조).

바이오 프린팅된 다공성 고분자 지지체를 이식부위 신경의 두께와 같거나 약간 큰 직경을 갖도록 끝에서부터 말아서 원통형의 도관을 만들 수 있다. 상기 도관은 평균 직경이 0.5mm 내지 20 mm 이 되도록 래핑할 수 있다. 한편, 상기 신경도관은 중추신경 또는 말초신경에 적용될 수 있으며, 중추신경 및 말초신경에 적용되는 직경의 크기는 상이할 수 있다. 즉, 적용 부위에 따른 직경으로 랩핑될 수 있다.

신경도관을 제조하는 단계는, 상기 신경도관을 튜브형, 권취형 및 섬유다발 형태 중 어느 하나의 형태를 갖도록 래핑할 수 있으며, 다른 양태로서, 신경도관을 제조하는 단계는, 바이오 잉크가 프린팅된 다공성 고분자 지지체를 복수개 준비하고, 상기 복수개의 다공성 고분자 지지체를 적층하는 단계; 및 적층된 복수개의 다공성 고분자 지지체를 다중관 형태로 래핑하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 또 다른 양태로서, 신경도관을 제조하는 단계 이후, 복수개의 신경도관을 다공성 고분자 지지체로 감싸서 다중관 형태로 래핑하는 단계를 더 포함할 수 있다.

예를 들면, 바이오잉크가 하나의 레이어만을 형성하도록 하여 중앙에 공간을 형성하는 도관을 만들 수 도 있고(도 3(a)), 달팽이 모양으로 여러겹이 래핑되어 안쪽이 채워져 있도록 래핑할 수 있다(도 3(b)). 또한 바이오잉크가 여러층으로 적층된 경우 도관의 안쪽은 여러 라인의 바이오잉크로 채워진 공관과 그 사이사이에 공극으로 구성될 수 있다(도 3(c)). 또한, 바이오잉크가 하나의 레이어로 프린팅된 멤브레인을 여러겹으로 적층한뒤 한꺼번에 래핑할 수도 있고(도 3(d)), 여러 개의 멤브레인이 래핑된 다발성 구조를 다시 하나의 멤브레인으로 최종적으로 감싸서 도관을 제작할 수도 있다(도 3(e)).

상기 하이드로겔은 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 및 폴리카프로락톤 (PCL), 젤라틴, 알지네이트, 카라기난, 키토산, 하이드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 실리콘, 고무, 아가, 카르복시비닐 공중합체, 폴리디옥솔란, 폴라아크릴아세테이트, 폴리비닐클로라이드, 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin) 마트리젤(Matrigel), 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 및 무수말레인산/비닐에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

나아가, 바이오잉크는, 하이드로젤을 포함하며, 상기 하이드로젤은 바이오잉크 조성물 총 중량에 대하여, 5 중량 % 이하의 탈세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix, dECM) 분말을 더 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 탈세포화된 세포외기질 분말은 바이오잉크 총 중량에 대하여 1 중량 % 를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 탈세포화된 세포외기질은 신경세포가 일반 세포에서 더 잘 분화하고 생착하는 것을 도울 수 있다.

아울러, 상기 신경재생인자는 섬유아세포성장인자 (fibroblast growth factor, FGF), 뼈 형성단백질(Bone morphogenetic proteins, BMPs), 과립구집락자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 과립대식세포집락자극인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF),, 표피생장인자(Epidermal growth factor, EGF), 성장분화인자(Growth differentiation factor, GDF), 인슐린유사생장인자(Insulin-like growth factors, IGF), 인터루킨(Interleukins, IL), 이동자극인자(Migration-stimulating factor, MSF), 대식세포자극단백질(Macrophage-stimulating protein, MSP), 뉴로트로핀(NGF), 혈소판유래생장인자(Platelet-derived growth factor, PDGF), 형질전환생장인자(Transforming growth factors, TGF), 혈관내피생장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 신경영양인자군(neurotrophic factor family, NTF)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한, 세포는, 신경세포(neuron) 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

보다 구체적으로, 신경세포는 대뇌피질뉴런(cortical neuron), 해마뉴런(hippocampal neuron), 성상세포(astrocyte), 희소돌기 아교세포(oligodendrocyte), 미세아교세포(microglia)와 후근 신경절 뉴런(dorsal root ganglia neuron)과 같은 감각 뉴런(sensory neuron), 운동뉴런(motorneuron), 슈반세포(schwann cell), 위성세포(satellite cell) 중 하나 이상일 수 있으며, 줄기세포는 골수유래 중간엽줄기세포, 편도유래 중간엽줄기세포, 배아줄기세포, iPS 및 신경줄기세포(Neural stem cell), 신경능선세포(neural crest cell), 신경모세포(neuroblast), 잇몸유래 중간엽 줄기세포(gingiva-mesenchymal stem cell, 지방유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

이로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 슈반세포일 수 있다. 본 발명에 있어서, "슈반세포(Schwann cell)"는 신경 재생을 돕는 역할을 한다. 이 슈반세포를 신경도관에 부착 시키고, 슈반세포가 부착된 신경도관을 손상된 말초신경 또는 중추신경에 연결하면 축삭 재생을 촉진할 수 있다.

특정 양태로서, 바이오 잉크는, 하이드로겔 및 신경재생인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 제1바이오잉크; 및 하이드로겔 및 신경세포로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 제2바이오잉크; 를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 제1바이오잉크는, 신경세포, 신경재생인자 및 하이드로겔을 포함하며, 제2바이오잉크는, 줄기세포, 신경재생인자 및 하이드로겔을 포함할 수 있다. 특정 양태로서, 상기 제1바이오잉크 및 제2바이오잉크에 각각 포함되는 신경재생인자는 서로 다른 종류의 신경재생인자일 수 있다.

한편, 신경세포 또는 줄기세포는, 0.5 내지 50×10⁶ cells/ml 범위 포함될 수 있으며, 0.6 내지 40×10⁶ cells/ml, 0.7 내지 30×10⁶ cells/ml, 0.8 내지 20×10⁶ cells/ml, 0.9 내지 10×10⁶ cells/ml, 1.0 내지 5×10⁶ cells/ml, 또는 2×10⁶ cells/ml 포함될 수 있다.

아울러, 상기 바이오잉크는 신경도관 내의 신경다발을 이루는 것으로, 신경재생물질을 포함할 수 있으며, 상술한 바와 같이, 하이드로겔, 신경재생인자 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 10 내지 1000 nm 범위의 직경을 갖도록 인쇄될 수 있다.

나아가, 삼차원 바이오 프린터는, 적어도 2개의 출력 노즐을 포함하며, 상기 제1바이오 잉크와 제2바이오 잉크는, 각각 분리된 출력 노즐에 의해서 프링팅될 수 있다.

즉, 삼차원 바이오 프린터는 멀티 노즐을 사용하여 프린팅 되는 라인을 서로 다른 물질로 프린팅 할 수 있다. 또한 바이오잉크로 프린팅된 라인은 다공성 고분자 지지체의 일면에 1열 또는 복수의 열로 프린팅할 수 있다. 예를 들면, 제1바이오잉크와 제2바이오잉크를 분리된 노즐에서 토출할 경우, 하이드로겔이 신경재생인자 혹은 신경세포에 미치는 영향을 독립적으로 확인 할 수 있으며, 신경세포 다발과 세포외 기질을 각각 특성에 맞게 배열하여 프린팅 할 수 있다.

나아가, 신경재생인자 및 신경세포에 적합한 하이드로겔의 물성을 조절할 수 있고, 분리된 노즐에서 출력된 신경세포에 대하여 신경재생인자의 측분비효과(paracrine effect)를 제공 할 수 있다.

다음으로, 신경도관을 제조하는 단계에서 제조된 신경도관의 표면에 생체 조직용 접착제를 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 래핑과정을 통해 원통형의 신경도관을 만들고, 이때, 래핑된 부분이 풀리지 않도록 생체 조직용 접착제를 도포할 수 있다. 다른 양태로, 봉합사 또는 기계적 장치를 통해 제조된 신경도관을 고정시킬 수 있다.

이러한 생체 조직용 접착제로는 피브린 글루, 젤라틴 글루, 폴리우레탄계 접착제 및 시아노아크릴레이트계 접착제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.

상술한 신경도관의 제조방법에 의해서 신경도관을 용이하게 제조할 수 있으며, 상기 신경도관은, 중추신경 또는 말초신경 재생을 위한 것일 수 있으며, 제조된 신경도관은 손상된 신경 부위에 이식되어 신경재생 방법 등을 제공할 수 있다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명에 대해 설명하고자 한다. 다만, 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 하기 실시예로 한정하는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1. 바이오 프린팅 기술을 이용한 신경도관 제조 - 1

1 단계: 다공성 고분자 지지체의 제조

PLCL 고분자(폴리(L-락티드-코-카프로락톤)를 HFIP(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol)에 용해시킨 0.05 g/ml(5wt. %) 의 PLCL/HFIP 고분자 용액을 준비하였다.

그리고, 고분자 용액을 금속 바늘을 갖는 5 ml 의 글래스 실린지에 넣고, 고전압 DC 전원 공급기로 21 kV 를 인가하면서 12 시간 동안 0.4 ml/hr 의 토출속도(feed rate)로 맨드럴(mandrel) 위에서 전기 방사하였다.

이때, 바늘 끝에서 맨드럴 사이의 거리는 20 cm로 하였다. 이러한 전기 방사를 통해 내경이 1.5 mm와 300 ㎛의 두께를 갖는 다공성 고분자 지지체를 제조하였다. 제조된 다공성 고분자 지지체를 하루 동안 상온의 진공 상태에 두어 잔여 용액을 제거하였다. 그리고, 상기 원통형의 지지체는 시트형태로 잘라서 사용하였다.

2 단계: 다공성 고분자 지지체의 일면에 바이오 잉크 프린팅

상기 다공성 고분자 지지체의 일면에 삼차원 프린팅을 이용하여 바이오 잉크를 프린팅 하였다. 도 4 실시예에서, 다공성 고분자 지지체의 일면에 바이오 잉크를 한 줄씩 인쇄하는 과정을 보여주는 도면이다.

도 4에 나타난 바와 같이, 다공성 고분자 지지체의 일면에 삼차원 프린팅을 이용하여 바이오 잉크를 한 줄씩 인쇄하였다.

보다 구체적으로, 다공성 고분자 지지체에 신경재생물질인 뉴로트로핀(NGF)과 콜라겐을 함유한 바이오 잉크를 한 줄씩 인쇄하였다.

3 단계: 다공성 고분자 지지체를 도관 형태로 래핑

바이오 잉크를 프린팅한 다공성 고분자 지지체를 도관 형태로 래핑하여, 최종적으로 신경재생물질을 함유하는 바이오 프린팅 신경도관을 제조하였다(도 5참조). 도 5는 실시예에서 제조한 신경재생물질을 함유하는 신경도관을 나타내는 사진이다.

실시예 2. 바이오 프린팅 기술을 이용한 신경도관 제조 - 2

다공성 고분자 지지체에 삼차원 프린팅을 이용하여 콜라겐과 탈세포화 조직유레 하이드로겔(dECM)이 포함된 바이오잉크를 한줄씩 인쇄한 것을 제외하곤, 실시예 1과 동일한 방법으로 신경도관을 제조하였다.

<실험예>

실험예 1. 구조특성

실시예 1에서 제조된 다공성 고분자 지지체의 구조특성을 알아보기 위하여 상기 지지체의 표면을 전자현미경으로 촬영하였다. 그리고, 이를 도 8에 나타내었다.

도 6은 본 발명의 실시예에서 전기방사된 다공성 고분자 지지체의 표면을 전자현미경으로 촬영한 사진이다.

도 6을 참조하면, 다공성 고분자 지지체는 미세한 섬유들이 층층이 겹쳐있는 구조이며, 지름이 약 200 내지 1000 nm 인 나노섬유들이 불규칙하게 얽혀있는 구조인 것을 알 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 실시예의 다공성 고분자 지지체는 미세한 섬유들이 불규칙하게 얽혀 공극을 형성하는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 신경도관은 상기 공극을 통해 도관 내외부간의 체액 교환이 이루어짐으로써, 3D 프린팅 몰드를 이용하여 제조한 신경도관 대비 도관 내외부간의 체액 및 물질, 가스 교환이 용이하게 이루어질 것으로 판단된다.

실험예 2. 신경세포의 생존율 관찰

실시예에서 제조한 신경도관의 신경세포 생존율을 관찰하였다(7 days in vitro). 그리고, 이를 도 7에 나타내었다.

도 7은 신경세포의 생장 결과를 나타내는 도면이다 ((a) 0.25 % 콜라겐, (b) 0.25 % 콜라겐+0.1% dECM).

도 7을 참조하면, 신경유래인자가 함유된 하이드로겔에서의 신경세포의 뉴라이트가 발달하고, 뉴런 간의 네트워킹 또한 복잡한 구조를 형성하고 있는 것을 확인하였다.

특히, 탈세포화 조직유래 하이드로겔의 경우 신경세포가 일반 세포에서 더 잘 분화하고 생착하는 것을 확인할 수 있었다.

이는 신경조직 유래인자가 함유된 하이드로겔 환경이 신경 재생에 효과적일 것으로 예상된다.

Claims

삼차원 바이오 프린터(3D bio-printer)를 이용하여 다공성 고분자 지지체의 일면 또는 양면에 바이오 잉크를 프린팅하는 단계; 및
바이오 잉크가 프린팅된 다공성 고분자 지지체를 도관 형태로 래핑하여 신경도관을 제조하는 단계; 를 포함하며,
상기 바이오 잉크는, 하이드로겔, 신경재생인자 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 신경도관의 제조방법.
제1항에 있어서,
바이오 잉크를 프린팅하는 단계는, 바이오 잉크를 일방향으로 복수개의 라인이 형성되도록 프린팅하는 것을 특징으로 하는 신경도관의 제조방법.
제1항에 있어서,
신경도관을 제조하는 단계는, 상기 신경도관을 튜브형, 권취형 및 섬유다발 형태 중 어느 하나의 형태를 갖도록 래핑하는 것을 특징으로 하는 신경도관의 제조방법.
제1항에 있어서,
신경도관을 제조하는 단계는,
바이오 잉크가 프린팅된 다공성 고분자 지지체를 복수개 준비하고, 상기 복수개의 다공성 고분자 지지체를 적층하는 단계; 및
적층된 복수개의 다공성 고분자 지지체를 다중관 형태로 래핑하는 단계; 를 포함하는 신경도관의 제조방법.
제1항에 있어서,
신경도관을 제조하는 단계 이후,
복수개의 신경도관을 다공성 고분자 지지체로 감싸서 다중관 형태로 래핑하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 신경도관의 제조방법.
제1항에 있어서,
다공성 고분자 지지체는, 생체적합성 고분자와 용매가 혼합된 방사용액을 전기방사 하여 얻어진 시트 형태인 신경도관의 제조방법.
제6항에 있어서,
생체적합성 고분자는, 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락타이드, PLA), 폴리글라이코라이드(PGA), 폴리우레탄(PU), 폴리디옥사논(PDO), 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드-co-아크릴산), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리스티렌(PS) 및 폴리에스테르(polyester)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고분자를 포함하는 것인 신경도관의 제조방법.
제1항에 있어서,
바이오잉크는, 하이드로젤을 포함하며,
상기 하이드로젤은 바이오잉크 조성물 총 중량에 대하여, 5 중량 % 이하의 탈세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix, dECM) 분말을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 신경도관의 제조방법.
제1항에 있어서,
하이드로겔은, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 및 폴리카프로락톤 (PCL), 젤라틴, 알지네이트, 카라기난, 키토산, 하이드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 실리콘, 고무, 아가, 카르복시비닐 공중합체, 폴리디옥솔란, 폴라아크릴아세테이트, 폴리비닐클로라이드, 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin) 마트리젤(Matrigel), 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA) 및 무수말레인산/비닐에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경도관의 제조방법.
제1항에 있어서,
신경재생인자는, 섬유아세포성장인자(FGF), 뼈형성단백질(BMPs), 과립구집락자극인자(G-CSF), 과립대식세포집락자극인자(GM-CSF), 표피생장인자(EGF), 성장분화인자(GDF), 인슐린유사생장인자(IGF), 인터루킨(IL), 이동자극인자(MSF), 대식세포자극단백질(MSP), 뉴로트로핀(NGF), 혈소판유래생장인자(PDGF), 형질전환생장인자(TGF), 혈관내피생장인자(VEGF) 및 신경영양인자군(NTF)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경도관의 제조방법.
제1항에 있어서,
세포는, 신경세포(neuron) 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경도관의 제조방법.
제1항에 있어서,
바이오잉크는, 하이드로겔 및 신경재생인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 제1바이오잉크; 및 하이드로겔 및 신경세포로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 제2바이오잉크; 를 포함하는 신경도관의 제조방법.
제1항에 있어서,
제1바이오잉크는, 신경세포, 신경재생인자 및 하이드로겔을 포함하며,
제2바이오잉크는, 줄기세포, 신경재생인자 및 하이드로겔을 포함하고,
상기 제1바이오잉크 및 제2바이오잉크에 각각 포함되는 신경재생인자는 서로 다른 종류의 신경재생인자인 것을 특징으로 하는 신경도관의 제조방법.
제13에 있어서,
삼차원 바이오 프린터는, 적어도 2 개의 출력 노즐을 포함하며,
상기 제1바이오 잉크와 제2바이오 잉크는, 각각 분리된 출력 노즐에 의해서 프링팅되는 것을 특징으로 하는 신경도관의 제조방법.
제1항에 있어서,
신경도관을 제조하는 단계에서 제조된 신경도관의 표면에 생체 조직용 접착제를 도포하는 단계를 더 포함하는 신경도관의 제조방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 신경도관의 제조방법에 의해서 제조된 신경도관.
제16항에 있어서,
신경도관은, 중추신경 또는 말초신경 재생을 위한 것인 신경도관.