CN112689558A

CN112689558A - 三维水凝胶结构的制备方法以及用于所述水凝胶结构的逐层构建装置

Info

Publication number: CN112689558A
Application number: CN201980060120.1A
Authority: CN
Inventors: 海科·齐默尔曼; 茱莉亚·纽鲍尔; 迈克尔·盖普; 本杰明·费舍尔
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2018-09-14
Filing date: 2019-08-28
Publication date: 2021-04-20
Also published as: JP7154394B2; WO2020052981A1; EP3623136B1; EP3623136A1; KR102515157B1; KR20210059717A; US20210283847A1; JP2022512547A; EP3623136C0; EP3849777A1

Abstract

本发明涉及一种通过层积技术制备三维(优选为多孔型)水凝胶结构的方法，其中所述方法包括以下步骤。提供(S1)液态水凝胶溶液，优选液态藻酸盐溶液，以及(优选为可运输的)样品载体。在温度低于所述水凝胶溶液的凝固点的温度环境下，将所述液态水凝胶溶液逐层施加(S2)到所述样品载体上，以生成冻结的3D层状水凝胶结构。为了有利地增加3D层状水凝胶结构的孔隙率，即所述3D层状水凝胶结构中的小空隙、空腔和/或凹陷所占的比例，根据本发明所述的方法进一步包括干燥(S3)所述冻结的3D层状水凝胶结构的步骤，例如通过冷冻干燥，以生成多孔型3D水凝胶结构。本发明还涉及一种用于三维水凝胶结构的逐层构建装置。

Description

三维水凝胶结构的制备方法以及用于所述水凝胶结构的逐层构建装置

技术领域

本发明涉及一种通过层积技术制备三维(优选为多孔型)水凝胶结构的方法。本发明还涉及一种用于三维水凝胶结构的逐层构建装置。

背景技术

水凝胶为经交联的亲水性聚合物网络，可吸收大量的水或其他液体。由于其生物相容性、似组织机械性能以及与治疗活性成分和/或细胞的易融合性，水凝胶特别适合于生物组织的合成生产，即所谓的“组织工程”。

因此，通常首先创建水凝胶的支架结构，随后或甚至是生产期间的某些情况下，在支架结构上应用活细胞。对此，现有技术中还已知3D打印技术结构的使用，以创建适当的水凝胶支架，用于生产尽可能真实的组织结构，例如合成移植所需的组织结构。例如，B.Fischer等人的科技论文“高空间分辨率温控环境下水凝胶的3D打印”，CDBME，2，109(2016)公开了在-20℃和-15℃之间的温度下通过3D打印机对藻酸盐溶液进行分层施加，以首先创建冻结的水凝胶支架结构，且随后通过胶凝交联并由此稳定。

但是，这方面的问题在于支架结构还必须具有适当的孔隙率，以供水凝胶结构中细胞的生长、营养供应和迁移。为解决这一问题，EP 2 679 669 A1在打印程序之前向水凝胶溶液中另外添加凝胶添加剂，优选明胶。呈散点状分布的明胶液滴可防止现有空间被水凝胶溶液填满，且在水凝胶溶液(胶凝)稳定后，可轻易地洗掉，从而使水凝胶结构出现空隙或孔隙。但是，这种方法的缺点在于，使用水凝胶和凝胶添加剂的混合物后，由于分离工艺，无法保证整个水凝胶支架结构上的均匀孔隙分布。此外，在水凝胶胶凝期间，由于明胶颗粒仍然存在，胶凝溶液向内部扩散的过程受阻，可导致胶凝不均匀或精细结构损失。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种制备三维(优选为多孔型porous)水凝胶结构的方法以及一种装置，可避免先前解决方案所存在的缺点。更具体地说，在这一点上，本发明的目的是提供一种创建多孔水凝胶结构的简单方法，具有可控且特定的孔隙性质。

根据本发明，这些目的通过独立权利要求所述的方法和装置得以实现。独立权利要求的主题是本发明的有利实施例和应用，下文中部分参照附图进行了更详细的解释。

根据本发明所述的一种通过层积技术制备三维(3D)水凝胶结构的方法，其中所述方法包括以下步骤：

提供液态水凝胶溶液，优选液态藻酸盐(alginate)溶液，和样品载体(优选可运输的)。例如，液态水凝胶溶液可为0.3-1.5％藻酸盐水溶液，样品载体优选由导热材料制成。

该方法进一步包括在一温度环境(temperature environment)下，将所述液态水凝胶溶液逐层施加到所述样品载体上，以生成冻结的3D层状水凝胶结构，所述温度环境的温度低于所述水凝胶溶液的凝固点。优选地，逐层施加的方式为在先前施加的层上施加新层，与层积技术中常用的方式相同。在特定情况下，先前施加的层也已经尽可能地冻结。为此，温度环境的温度可以通过冷气体进行调节，例如通过将冷氮气输入样品载体的区域。或者，也可以通过冷液体，例如液氮、换热装置和/或珀耳帖元件装置(Peltier elementdevice)实现温度调节。

为了有利地增加3D层状水凝胶结构的孔隙率，即所述3D层状水凝胶结构中的小空隙、空腔和/或凹陷所占的比例，根据本发明所述的方法进一步包括干燥冻结的3D层状水凝胶结构的步骤，以生成多孔型3D水凝胶结构。逐层施加后，可立即进行该干燥步骤，即在创建完整的3D层状水凝胶结构之后；或者，也可以在分层施加的同时进行干燥。

干燥可以通过冷冻干燥的方式完成。或者，可采用红外(IR)干燥或所谓的临界点或超临界点干燥(CPRD)法进行干燥。例如，也可以组合不同的干燥方法，从而可随着时间的推移连续使用不同的干燥方法。

临界点或超临界点干燥属于干燥形式的一种，其中溶剂(例如CO₂/甲醇/丙酮)的相变受到压力和温度的影响，从液态转变为超临界流体，然后转变为气态，而不是从固态转变为气态(冷冻干燥)或从液态转变为气态(沸腾/煮沸)。优点在于不跨相界，因此避免了干燥所带来的任何潜在负面影响(例如，结构损失)。

而且，干燥(例如，冷冻干燥)也可以称为升华干燥或冻干，可以在多个阶段进行，即主干燥步骤和进一步干燥步骤在不同的环境温度(ambient temperature)和/或环境压力(ambient pressure)下进行。因此，有利地，可以创建干燥且可储存的多孔3D水凝胶结构。在这一点上，“多孔型3D水凝胶结构”一词指通过干燥步骤获得的3D水凝胶结构。3D水凝胶结构的孔隙率的进一步优势在于，以这样的方式，还可以创建均匀的大体积结构，因为在结构的后续胶凝中，胶凝剂可以快速渗透，均匀进入3D水凝胶结构的内部，从而通过胶凝避免在结构实际稳定前发生结构的任何解冻和运行。

为了由此有利地实现3D层状水凝胶结构的精确且可再现的生产，根据本发明的一个方面，可以执行通过用于三维水凝胶结构的逐层构建装置进行逐层施加的步骤。在这一点上，装置也可以称为3D打印装置。对此，该装置可以包括以下特征：用于定量释放液态水凝胶溶液的打印头，例如藻酸盐水溶液，容纳样品载体的支撑件和定位装置，该定位装置配置成在三个空间方向上改变所述打印头相对于所述支撑件的相对位置。在这一点上，相对位置的“改变”可包括打印头相对于固定支撑件的运动、支撑件相对于固定打印头的运动以及两个组件相对于彼此的运动。优选地，水凝胶溶液施加量的定位和/或定量由控制装置控制，在这一点上，水凝胶溶液也可以称为打印介质或油墨。进一步地，此处的打印头可包含计量针(dosing needle)、挤出机模(extruder die)、和/或其他定量装置和/或加热装置，以调节水凝胶溶液的温度。

根据一种变体，逐层施加还可通过手动定量装置来执行，例如，移液管。

根据本发明的另一方面，干燥步骤可包括在减压条件下升华来自所述冻结的3D层状水凝胶结构的至少一部分冷冻水。如果之前的液态水凝胶溶液另外或可选地还包含其他溶剂，而非水，干燥步骤可以另外或可选地还包括在减压条件下升华来自所述冻结的3D层状水凝胶结构的至少一部分适量冷冻溶剂。此处，“减压”一词可更具体地指低于标准压力的低压，即低于1013毫巴，优选为粗真空或高真空。优选地，冻结的3D层状水凝胶结构在升华期间保持冷冻状态和/或保持温度低于室温。有利地是，采用这种方式可以实现3D层状水凝胶结构的温和干燥，其形状和结构大部分得以保留。此外/或者可通过红外干燥、临界点干燥和/或超临界点干燥完成干燥。

根据本发明的另一方面，在逐层施加步骤中，3D水凝胶结构的第一孔隙性质，例如孔隙分布，可通过至少一个第一操作参数进行调节。此外/或者在干燥步骤中，3D水凝胶结构的第二孔隙性质，例如平均孔径，可通过至少一个第二操作参数进行调节。换言之，所需的第一和/或第二孔隙性质可作为第一和/或第二操作参数的函数进行调节，或可以对第一和/或第二操作参数进行具体选择，以达到一定的第一和/或第二孔隙性质。为此，该方法可以例如包括如下步骤：将第一操作参数值设为第一孔隙性质的函数，优选使用之前确定的特征曲线，和/或将第二操作参数值设为第二孔隙性质的函数，优选使用之前确定的特征曲线。第一和第二孔隙性质可以不同或相同。例如，由于冰晶形成过程中的伴生增量，可以通过逐层施加步骤中水凝胶水溶液浓度的降低增加3D水凝胶结构的孔隙性质的孔隙率。而且，在逐层施加和干燥步骤中，在所有情况下，均可调节多个孔隙性质，例如孔隙分布和平均孔径。优选地，第一和/或第二孔隙性质还可在过程中根据位置进行可变地调节。在这一点上，适当参数对孔隙性质的影响可以通过适当的初步实验或测试系列予以确定，其中参数在一定数值范围内变化，且可以观察到对孔隙性质产生的影响。而且，这种相关性也可以采用特征曲线的形式存储。有利地，由此可以具体创建带特定孔隙性质的3D水凝胶结构，且通过孔隙性质的局部变化，尤其是组织转变和/或病理变化，例如伤疤，可以进行复制。

根据这方面的进一步发展，3D水凝胶结构的第一和/或第二孔隙性质可以是孔隙分布、孔隙率、平均孔径、平均孔隙朝向、平均孔隙形态和/或平均孔隙体积。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一和/或第二孔隙性质其实还可以是比表面积和/或其他未明确指定用于表征孔隙性质的数值，优选为统计数值。由于前述数值有助于确定3D水凝胶结构的关键物理性质，例如弹性，所以通过对这些数值进行特异性调节，可以有利地实现水凝胶结构特性的可靠控制。因此，可以采用这种方式创建尽可能真实的组织结构。

根据本发明的另一方面，至少一个第一操作参数可以包括温度环境的温度、温度环境的温度分布和/或温度梯度、氛围(atmosphere)的成分(于该氛围中，液态水凝胶溶液被施加至样品载体上，例如液氮和干冰的混合物)、液态水凝胶溶液的浓度、液态水凝胶溶液的粘度和/或逐层施加速度。例如，通过降低液态水凝胶溶液的浓度，可以实现孔隙率的提高。在这一点上，优选(尤其采用温度和粘度等相关值)在调节3D水凝胶结构的第一孔隙性质时考虑多个这些操作参数。而且，由于前述操作参数易于监测和/或改变，这有利于使得可靠且容易地生产具有特定孔隙性质的3D水凝胶结构成为可能。

根据本发明的另一方面，至少一个第二操作参数可以包括环境温度、环境压力和/或干燥过程的持续时间。此处的环境温度和环境压力的数值可以理解为干燥步骤中样品载体上的局部温度和压力。而且，在同时进行逐层施加和干燥的情况下，环境温度可以与逐层施加步骤中“温度环境的温度"数值相同。优选地，在调节3D水凝胶结构的第二孔隙性质时考虑前面提及的多个操作参数。此处，由于操作参数易于监测和/或改变，这也有利于使得可靠且容易地生产具有特定孔隙性质的3D水凝胶结构成为可能。

如果利用上文描述的3D打印装置执行根据本发明所述的方法，根据本发明的另一方面，至少一个第一操作参数可以包括打印头与样品载体之间的间距和/或打印头与水凝胶溶液最后施加层之间的间距。优选地，这是指在施加新的液态水凝胶溶液层期间与最顶层相关的间距，特别优选为调节的间距。在这一点上，发明人认为通过扩大打印头与水凝胶结构最后施加层之间的间距可以提高水凝胶结构的孔隙率。因此，同样有利于容易且可靠地创建具有特定孔隙性质的3D水凝胶结构。

根据本发明的另一方面，该方法可包括多孔型3D水凝胶结构的机械结构化步骤。换言之，多孔型3D水凝胶结构可以在干燥步骤后进一步进行机械加工。例如，通道可以熔化和/或钻入多孔型3D水凝胶结构，从而，例如，有利地在3D水凝胶结构中模拟血管。在这一点上，还可以说是多孔型3D水凝胶结构的血管形成。此外，多孔型3D水凝胶结构的表面还可以是粗糙和/或研磨表面。此外，例如，可以通过压印(stamp)将特定形状压入多孔型3D水凝胶结构，和/或可以从多孔型3D水凝胶结构中冲压出特定形状。有利地，通过机械结构化，3D水凝胶结构的局部特性可以更进一步变化，从而可创建尽可能真实的组织模型。

根据本发明的另一方面，该方法可包括在干燥环境中储存多孔型3D水凝胶结构的步骤。优选地，在这一点上，环境具有低大气湿度，和/或与干燥剂接触，例如硅胶。或者或此外，储存可以在保护性气体气氛中执行，例如氮气或无氧气体氛围，以防止发生氧化。由于3D层状水凝胶结构的干燥较早，因此可以有利地长时间保持这些结构。在此期间，可以抑制物理和/或化学变化，例如在潮湿条件下发生的水解作用。

此外/或者该方法可包括在低温环境中储存多孔型3D水凝胶结构的步骤。低温环境的温度优选低于-100℃，尤其优选低于-120℃。此外/或者该方法可包括用液体润湿多孔型3D水凝胶结构，优选用水和/或其他溶剂。优选地，该步骤在前述多孔型3D水凝胶结构储存步骤之后立即进行。在这一点上，还可以说是多孔型3D水凝胶结构的再水化。由于多孔型3D水凝胶结构的润湿，可以有利地再次为随后的细胞和/或蛋白质涂层提供潮湿条件。

根据本发明的另一方面，该方法可包括通过多价阳离子(优选Ba²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺和/或Sr²⁺)的化学交联(chemical crosslinking)进行多孔型3D水凝胶结构的胶凝(gelling)的步骤。对此，优选地，在胶凝溶液(例如BaCI₂溶液)浴中孵育多孔型3D水凝胶结构。特别优选地，多孔型3D水凝胶结构的胶凝步骤发生在干燥冻结的3D层状水凝胶结构步骤之后。有利地，因此，胶凝剂还可以快速渗透，均匀进入3D水凝胶结构的内部。或者，干燥步骤还可以发生在多孔型3D水凝胶结构的胶凝之后，或者该方法可包括进一步凝胶干燥步骤，即通过冷冻干燥进一步干燥胶凝后的3D水凝胶结构的步骤。有利地，胶凝后的3D水凝胶结构保质期以这种方式得以再次增加。

此外/或者该方法还包括用蛋白质(优选来自细胞外基质的蛋白质)和/或细胞(优选人体细胞)进行多孔型3D水凝胶结构的涂覆。此处“细胞外基质”一词拟指细胞间隙内所有大分子的集合体。简言之，这可以由细胞外组织的结构成分组成。在这一点上，还可以说是多孔型3D水凝胶结构的活化或官能化。而且，多孔型3D水凝胶结构可以与细胞培养液一起孵育。有利地，可以采用这种方式创建特定患者和/或特定疾病的组织模型，因此例如可在其身上尝试新药。

除了或代替3D水凝胶结构的后期官能化，可以在实际打印之前向水凝胶溶液添加多种添加剂。由于使用的打印物质不再是纯水凝胶溶液，在这一方面，“混合油墨”一词也可用于逐层施加的物质。此处，液态水凝胶溶液可包含以下添加剂中的至少一种：

-致孔剂(porogen)，即成孔的物质(另见EP 114 11 28 B1)，例如盐。因此，致孔剂属于可以具体创建或扩大孔的物质，例如NaCI晶体等盐晶，

-表面活性剂(surfactant)，可对干燥和孔的形成产生影响(例如普朗尼克或吐温)，

-聚乙二醇，

-蛋白质，优选来自细胞外基质的蛋白质，

-细胞，优选人体细胞，

-胶原蛋白，

-明胶，

-膨松剂(bulking agent)，在干燥期间对支架结构具有稳定作用(例如PEG、糖类等)

-水溶液，优选糖和/或食盐溶液，和/或

-用于通过多价阳离子进行化学交联的胶凝剂。

有利地，与随后通过扩散过程的涂层相比，这种方式可以实现水凝胶结构中各种添加剂更均匀的分布。例如，此处后期胶凝剂的一部分(例如BaCI₂)可以在施加过程中整合到结构体中，并通过这种方式实现“由内而外”，在从外面很难进入的地方发生作用。此外，可以专门设计多孔型3D水凝胶结构。例如，将不可胶凝的溶液如糖和/或食盐溶液添加到水凝胶溶液中，以便为血管系统创建空隙或通道。此外/或者该方法除了将上述物质“添加”到水凝胶溶液中之外，还可以包括以下步骤：施加一种或多种纯净形态的上述物质，该纯净形态即不与液态水凝胶溶液结合。

根据本发明的另一方面，液态水凝胶溶液可包含第一添加剂和第二添加剂。第一添加剂通过化学诱导交联进行胶凝，优选为胶原蛋白；第二添加剂通过热诱导交联形成凝胶，优选为明胶。换言之，所施加的介质或混合油墨包括具有三种不同胶凝类型(离子型、化学诱导型和热诱导型)的物质组成。在这一点上，这三种物质随后形成胶凝的过程可以同时、部分同时或有顺序地进行。有利地，由此可以进一步改变或更具体地设计3D水凝胶结构的局部性质。通过这种方式，可以创建尽可能真实的组织模型。

下文描述了用于三维水凝胶结构的逐层构建装置(又称3D打印装置)的有利实施例。如上所述，所述装置包括用于定量释放液体材料(优选液态水凝胶溶液)的打印头、容纳样品载体的支撑件和定位装置，该定位装置配置成在三个空间方向上改变所述打印头相对于所述支撑件的相对位置。在这一点上，相对位置的“改变”可包括打印头相对于固定支撑件的运动、支撑件相对于固定打印头的运动以及两个组件相对于彼此的运动。根据本发明的另一方面，3D打印装置可以另外配有隔热托盘，向其中输入冷气体，优选氮气。换言之，隔热托盘可配置成用于输入冷气体，优选氮气。或者，也可以向隔热托盘中输入冷液体，例如液氮。因此，可以通过简单的方式为执行该方法创造适当的低温环境。此外，用于容纳样品载体的支撑件可以置于隔热托盘的内部，并配置成网格状支撑件。有利地，这样不仅为样品载体提供了良好的机械保持力，而且尽可能少地阻碍流经隔热托盘的制冷剂流动。

有利地，该装置特别适合于执行上述逐层施加液体水凝胶溶液的方法，其中此处公开的装置也具有在描述本文件所述方法的过程中描述的所有特征，反之亦然。这意味着，根据该方法公开的方法特征将结合该装置予以公开和要求保护，根据该装置公开的装置特征也应结合该方法公开和要求保护。此外，3D打印装置本身独立于主题方法之外，也应公开和要求保护。

根据另一方面，该装置的打印头可包含计量针。该计量针由疏水性材料和/或疏水性涂层和/或Parafilm封口膜和/或Nescofilm封口膜包围，以防止形成液滴。或者，也可以使用其他柔性疏水材料，优选由石蜡和聚乙烯制成的材料。有利地，这样可以尽可能防止在计量针上形成液滴。

此外/或者隔热托盘也可以由两层构成，其中第一层的导热率低于第二层。在这一点上，托盘指具有高壁和平坦底部的敞口式容器。此处，优选地，位于外侧的层(又称第一层)的导热率低于位于内侧的层。优选地，第二层与支撑件接触以容纳样品载体。有利地，因此可以相对于环境实现充分隔热，同时有效冷却容纳装置及样品载体。

此外/或者所输入的冷气体的温度可以进行可变地调节。优选地，可以将温度调节和/或调整为一定值。特别优选地，可以通过冷气装置将输入气体(例如氮气)的温度调节在﹣180℃至25℃的范围内。或者，可以可变地调节输入液体、热交换装置和/或珀耳帖元件装置的温度。有利地，通过简单地改变温度，可以具体地调节3D水凝胶结构所得的孔隙性质。

此外/或者样品载体可以由玻璃制成。而且，样品载体可包括薄膜、隔膜和/或多孔材料。优选地，样品载体基本上呈矩形。有利地，通过这种方式，可以实现样品载体与水凝胶结构之间充分的热偶合，同时使得水凝胶结构与样品载体可以容易分离。

附图说明

本发明的上述方面和特征可以任意组合。本发明的其他详情和优点参照附图进行描述。在附图中：

图1：根据本发明实施例的通过层积技术制备三维(3D)水凝胶结构的方法流程图；

图2：根据本发明另一实施例的方法流程图；

图3：根据本发明另一实施例的选定方法步骤示意图；

图4：根据现有技术(顶部)中迄今已知的方法和本发明实施例(底部)的3D水凝胶结构图示形态比较图；

图5：根据现有技术(顶部)中迄今已知的方法和本发明实施例(底部)的3D水凝胶结构照片与显微照片比较图；

图6：根据本发明实施例的用于三维水凝胶结构的逐层构建装置示意图；

图7：图6所示的装置部分详图。

具体实施方式

图1示出了根据本发明实施例的通过层积技术制备三维(3D)水凝胶结构的方法流程图。为此，在步骤S1中，提供液态水凝胶溶液，例如，0.3-1.5％藻酸盐水溶液，以及样品载体4(优选可运输的)。“藻酸盐”指未分支的阴离子多糖链，主要从褐藻获得。在步骤S2中，在温度低于水凝胶溶液的凝固点的温度环境下，将液态水凝胶溶液逐层施加到样品载体4上，以生成冻结的3D层状水凝胶结构1a。通常水凝胶溶液的凝固点，例如，在﹣10℃至0℃之间；液态水凝胶溶液的凝固点也可以通过简单的冷却和观察从液体到固体的相变温度根据实验确定。优选地，如本文件中所述，通过用于三维水凝胶结构的逐层构建装置10进行逐层施加。在步骤S3中，干燥冻结的3D层状水凝胶结构1a，生成多孔型3D水凝胶结构1b。例如，可以通过冷冻干燥进行干燥步骤，冷冻干燥还可以称为升华干燥或冻干。为此，至少一部分冷冻溶剂，例如水，可以在减压条件下(即在低于1013毫巴的压力下)从冻结的3D层状水凝胶结构1a中升华。有利地，这可以增加3D层状水凝胶结构的孔隙率，即3D层状水凝胶结构中的小空隙、空腔和/或凹陷所占的比例，并且另外可以提高该结构的保质期。此外/或者可通过红外干燥、临界点干燥和/或超临界点干燥完成干燥。

图2示出了根据本发明另一实施例的方法流程图。与图1所示的实施例相比，该方法可包括额外的步骤S4，其中多孔型3D水凝胶结构1b通过多价阳离子(例如Ba²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺和/或Sr²⁺)的化学交联进行胶凝。在此程序(又称离子胶凝)中，多价阳离子沉积在聚合物链之间，由此形成聚合物链的缔合，并因此通过静电相互作用的方式形成聚合物链路网。换言之，3D水凝胶结构变得尺寸稳定。为此，优选在胶凝溶液(例如BaCI₂溶液)浴中孵育多孔型3D水凝胶结构1b。优选地，这可以在3D水凝胶结构处于静止冻结的状态进行。因此，有利地，可获得水凝胶的尺寸稳定性支架结构，该支架结构上的活细胞随后可应用于生产组织模型。

图3示出了根据本发明另一实施例的选定方法步骤示意图。在提供液态水凝胶溶液(未进一步详细描述)和载玻片形式的可运输的样品载体4之后，步骤i示意性地示出了在温度低于水凝胶溶液的凝固点的温度环境下，将液态水凝胶溶液逐层施加到样品载体4上，因此对应于前述方法步骤S2。对于逐层施加，在当前情况下，使用用于三维水凝胶结构的逐层构建装置10。该装置包括用于通过计量针7定量释放液态水凝胶溶液的打印头2、容纳样品载体4的网格状支撑件3和定位装置5(未示出)，该定位装置配置成在三个空间方向上改变打印头2相对于支撑件3的相对位置。在这一点上，如此处所示，支撑件3和样品载体4的尺寸可以设置成可将多个样品载体4置于支撑件3上。步骤ii示出了取自3D打印装置的可运输的样品载体4，冻结的3D层状水凝胶结构1a位于其上。此时，样品载体4可以转移至例如冷冻干燥或任何其他干燥类型的器械中。现在进行干燥的下一方法步骤，并同时在3D打印装置中生成进一步冻结的3D层状水凝胶结构1a。步骤iii示出了通过干燥冻结的3D层状水凝胶结构1a生成的多孔型3D水凝胶结构1b，例如通过冷冻干燥，因此对应于方法步骤S3。在干燥程序期间，从冻结的3D层状水凝胶结构1a中除去至少一部分包含的溶剂或水，例如通过升华步骤。如果采用冷冻干燥，则可以降低冻结的3D层状水凝胶结构1a周围的环境压力，优选调节至几毫巴或更少的压力范围。有利地是，因此可以实现冻结的3D层状水凝胶结构1a的温和干燥，在此期间其形状和结构大部分得以保留。步骤iv示出了与样品载体4分离的多孔型3D水凝胶结构1b，该结构可随后进行胶凝、机械结构化和/或储存。

图4阐明了相比现有技术中已知的方法，根据本发明所述的方法在生产尺寸稳定的(即胶凝的)多孔型3D水凝胶结构1b方面的优点。此处的出发点是优选通过层积技术进行生产的冻结的3D层状水凝胶结构1a。如果上文所示的冻结的3D层状水凝胶结构1a按照现有技术中已知的方法立即胶凝，则由于结构中存在溶剂，胶凝溶液仅可缓慢渗透或扩散到3D层状水凝胶结构的内部。因此，冻结区域可以在通过胶凝作用稳定之前进行融化。如右上角的图所示，结果会导致这些区域出现结构损失。如下文所示，这个问题可以通过干燥步骤在很大程度上予以避免。此处，首先干燥冻结的3D层状水凝胶结构1a，例如通过冷冻干燥，在此期间结构中存在的溶剂逸出。在之后的胶凝过程中，胶凝剂，例如BaCI₂，可以均匀地且尽可能不受阻地渗透至结构中。因此，甚至保留了内部的微细孔隙结构，如右上图所示。

图5示出了根据现有技术(顶部)中迄今已知的方法和本发明实施例(底部)的3D水凝胶结构照片与显微照片比较图。此处，图A1示出了通过胶凝前施加3D压力(即采用现有技术中已知的方法)制备的水凝胶结构。在这一点上，箭头指出前面提及的由于融化程序太快导致的结构损失，所述结构损失的放大图参见图A2。在该区域不再存在的多孔结构中，由于熔融过程的液化和相关压缩，细胞在此处几乎不可能生长。相较而言，图A3示出了相同样品中仍然存在足够高(所需的)孔隙率的区域。为始终实现均匀的水凝胶结构，根据本发明的方法包括额外的凝胶干燥步骤。图B1中示出了通过3D打印，然后干燥(此处：冷冻干燥)和胶凝而生成的相应3D水凝胶结构。通过放大四倍(B2)和十倍(B3)可以看出，样品在整个结构中具有足够高的孔隙率，未出现任何压缩区域。

图6示出了根据本发明实施例的用于三维水凝胶结构的逐层构建装置10的示意图。在这一点上，装置10(又称3D打印装置)包括打印头2，该打印头2带用于定量释放液态材料(优选液态水凝胶溶液)的可加热计量针7。为此，液态材料可以例如通过气压推出可加热计量针7。而且，装置10包括隔热托盘6，冷气体输入该隔热托盘6中，例如-50℃的冷氮气。特别优选地，所输入冷气体的温度可以进行可变地调节。对此，隔热托盘6可以位于尽可能水平定向的板8上。此外，装置10包括网格状支撑件3和定位装置5，网格状支撑件置于隔热托盘6的内部，以容纳样品载体4，定位装置5配置成在三个空间方向上改变打印头2相对于支撑件3的相对位置。在这种情况下，定位装置5体现为带导向机构的门状结构，可使打印头2相对于固定支撑件3或固定样品载体4的相对运动成为可能。在这一点上，为了制备冻结的3D层状水凝胶结构，在所有情况下，可通过控制装置对定位装置5进行适当控制，尽量在先前施加的冻结层上施加新的材料层，优选水凝胶溶液，具体的进一步细节未示出。

图7示出了图6所示的装置10的部分详图。此处，应特别参考网格状支撑件3和隔热托盘6。在这一点上，后者由6a、6b两层(内层和外层)构成，在这种情况下，6a、6b每一层在顶部形成一侧开口的空心块。位于外侧的6a层的热导率低于位于内侧的6b层。换言之，外层6a的导热性比内层6b差，即相比内层6b能更好地隔热。而且，此处6a、6b每一层例如具有不同的厚度，尽管6a、6b两层也可以具有相同的厚度，且不脱离本发明的范围。内层6b上也固定有网格状支撑件3，以容纳样品载体4。在这种情况下，该自立式结构包括多个平行设置且带矩形剖面的支撑杆。与隔热托盘6的内层6b一样，各支撑杆也由尽可能导热的材料制成，以保证位于其上的样品载体4可以充分受热。支撑件3的网格状结构不仅为样品载体4提供了良好的机械保持力，而且尽可能少地阻碍流经隔热托盘6的冷气体流动。同时，外层6a确保了内部空间对环境的最佳隔热性。

尽管参考某些示例性实施例对本发明进行了详细描述，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，可在不脱离本发明范围的情况下，作出各种修改，并使用等效项代替。因此，本发明不限于所公开的示例性实施例，还包括在随附权利要求书范围内的所有示例性实施例。更具体地，本发明还要求保护独立于所引用的权利要求之外的从属权利要求的主题和特征。

Claims

1.一种通过层积技术制备三维(3D)水凝胶结构的方法，包括以下步骤：

-提供(S1)液态水凝胶溶液，优选液态藻酸盐溶液，和样品载体(4)；

-在一温度环境下，将所述液态水凝胶溶液逐层施加(S2)到所述样品载体(4)上，以生成冻结的3D层状水凝胶结构(1a)，所述温度环境的温度低于所述水凝胶溶液的凝固点；以及

-干燥(S3)所述冻结的3D层状水凝胶结构(1a)，以生成多孔型3D水凝胶结构(1b)。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逐层施加步骤(S2)通过用于三维水凝胶结构的逐层构建装置(10)执行，包括：

-打印头(2)，用于定量释放所述液态水凝胶溶液；

-支撑件(3)，用于容纳所述样品载体(4)；以及

-定位装置(5)，其被配置成在三个空间方向上改变所述打印头(2)相对于所述支撑件(3)的相对位置。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，

a)所述干燥步骤(S3)通过在减压条件下冷冻干燥和/或升华来自所述冻结的3D层状水凝胶结构(1a)的至少一部分冷冻水来执行；和/或

b)所述干燥步骤(S3)通过红外(IR)干燥或通过临界点干燥法执行。

4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，

a)在所述逐层施加步骤(S2)中，所述3D水凝胶结构的第一孔隙性质通过至少一个第一操作参数进行调节；和/或

b)在所述干燥步骤(S3)中，所述3D水凝胶结构的第二孔隙性质通过至少一个第二操作参数进行调节。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述3D水凝胶结构的所述第一和/或第二孔隙性质为

a)孔隙分布；

b)孔隙率；

c)平均孔径；

d)平均孔隙朝向；

e)平均孔隙形态；和/或

f)平均孔隙体积。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述至少一个第一操作参数包括

a)所述温度环境的所述温度；

b)所述温度环境的温度分布和/或温度梯度；

c)氛围的成分，于所述氛围中所述液态水凝胶溶液被施加在所述样品载体上；

d)所述液态水凝胶溶液的浓度；

e)所述液态水凝胶溶液的粘度，和/或

f)所述逐层施加的速度。

7.根据权利要求4至6任一项所述的方法，其特征在于，所述至少第二操作参数包括

a)环境温度；

b)环境压力；和/或

c)干燥程序的持续时间。

8.根据权利要求4至7任一项所述的方法，如果从属于权利要求2，其特征在于，所述至少一个第一操作参数包括所述打印头(2)与所述样品载体(4)之间的间距和/或所述打印头(2)与水凝胶溶液的最后施加层之间的间距。

9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于以下步骤：

-所述多孔型3D水凝胶结构(1b)的机械结构化，其中优选

a)通道被熔化和/或钻入所述多孔型3D水凝胶结构(1b)；和/或

b)粗糙化或研磨所述多孔型3D水凝胶结构(1b)的表面；和/或

c)通过压印将特定形状压入所述多孔型3D水凝胶结构(1b)。

10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于以下一个步骤：

-在干燥环境和/或保护性气体氛围中存储所述多孔型3D水凝胶结构(1b)；

-在低温环境中存储所述多孔型3D水凝胶结构(1b)，优选温度低于-100℃；和/或

-用液体润湿所述多孔型3D水凝胶结构(1b)，优选用水。

11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于以下一个步骤：

-通过多价阳离子的化学交联进行所述多孔型3D水凝胶结构(1b)的胶凝，所述多价阳离子优选Ba²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺和/或Sr²⁺；和/或

-用蛋白质和/或细胞进行所述多孔型3D水凝胶结构(1b)的涂覆，所述蛋白质优选来自细胞外基质的蛋白质，所述细胞优选人体细胞。

12.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述液态水凝胶溶液包含以下添加剂中的至少一种：

-致孔剂，优选盐晶体，用于影响孔隙形成，

-膨松剂，

-表面活性剂，

-聚乙二醇，

-蛋白质，优选来自细胞外基质的蛋白质，

-细胞，优选人体细胞，

-胶原蛋白和/或明胶,

-水溶液，优选糖和/或食盐的溶液，和/或

-用于通过多价阳离子进行化学交联的胶凝剂。

13.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述液态水凝胶溶液包含第一添加剂和第二添加剂，所述第一添加剂通过化学诱导交联进行胶凝，优选胶原蛋白，所述第二添加剂通过热诱导交联进行胶凝，优选明胶。

14.一种用于三维水凝胶结构的逐层构建装置(10)，包括：

-打印头(2)，用于定量释放液态材料，优选液态水凝胶溶液；

-隔热托盘(6)，其被配置成用于输入冷气体，优选氮气；

-支撑件(3)，优选网格状，置于所述隔热托盘(6)内，以容纳样品载体(4)；以及

15.根据权利要求14所述的装置(10)，其特征在于，

a)所述打印头(2)包括计量针(7)，所述计量针(7)被疏水性材料和/或涂层包围以防止液滴形成；和/或

b)所述隔热托盘(6)由两层(6a、6b)构成，其中第一层(6a)的导热率低于第二层(6b)；和/或

c)输入的冷气体的温度能够可变地调节；和/或

d)所述样品载体(4)由玻璃制成。