CN108890937A - 一种树枝状通道结构的水凝胶芯片的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种操作简单，成本低廉的树枝状通道结构的水凝胶芯片的制备方法，不仅可用于复杂结构水凝胶芯片的低成本加工，也可用于栓塞微球栓塞行为(如流体动力学性质、形变等)的研究，以便为研发新型栓塞微球、提高栓塞术的适用性提供一定的理论依据。芯片其制备方法采用模板法，通过二次浇筑水凝胶制备具有树枝状通道结构的水凝胶芯片，无需昂贵的光刻和微加工技术和设备，操作简单，成本较低。同时，将具有树枝状通道结构的水凝胶芯片用于栓塞微球的栓塞行为研究，可为肿瘤疾病介入治疗研究提供一种新的栓塞微球体外评价模型。

Description

一种树枝状通道结构的水凝胶芯片的制备方法

技术领域

本发明属于微流控芯片技术及生物医学领域，具体涉及一种树枝状通道结构的水凝胶芯片的制备方法及用于栓塞微球的栓塞行为研究。

背景技术

经导管血管栓塞术是肿瘤介入治疗中公认的有效治疗方法，其在医疗影像设备的辅助下，将栓塞微球经导管注入病变部位的靶供应血管内，使之闭塞，阻断血供和营养，以消除病变器官功能。目前，多种动物模型(如小鼠、兔、猪等)被广泛用于栓塞微球的临床前评价，但是动物实验步骤繁琐、工作量大、周期长、费用高。因此，构建和模拟体内微血管系统的分叉和分级的树枝状网络结构，对于研究栓塞微球在微血管内的栓塞行为及提高栓塞术的适用性具有重要的意义。

随着微加工制造技术的发展，微流控芯片逐渐成为一种新兴的进行构建三维树枝状网络结构模型的平台。目前，常用来进行体外三维网络模型构建的微流控芯片有聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片，聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片和水凝胶芯片。其中，PMMA芯片材质较硬，疏水性强，对水溶液渗透性差。PDMS芯片的制作方式采用软光刻制得，得到的微通道结构一般为矩形，与人体血管的圆形结构存在差异，需要其他方法对制得的通道结构进行改进。同时，PDMS本身的疏水性及对水溶液较差的渗透性限制了其在生物医学方面的应用。近年来，人们逐渐将水凝胶材料用作微流控芯片的基质材料，开展血管疾病及肿瘤疾病等相关生物医学研究。

水凝胶微流控芯片的加工方式多种多样，例如，光刻法，3D打印法，模板法等。光刻法得到的水凝胶通道为矩形，需要进一步采用其他方式改成圆形，步骤较繁琐。近几年关于3D打印法制备水凝胶血管网络的相关报道较多，但该方法打印出的水凝胶通道精度低，表面粗糙，尺寸较大，同时，打印设备昂贵，技术不成熟，增大了水凝胶芯片的打印难度。模板法是采用玻璃、不锈钢针、金属棒等作为模板，通过向模板中浇筑水凝胶，待水凝胶交联后将模板抽出的方法得到具有单通道结构的水凝胶通道。目前，该方法一般只能得到一字型的单通道水凝胶芯片，利用该方法制作复杂树枝状通道结构的水凝胶芯片目前还未有相关报道。同时，利用水凝胶微流控芯片进行栓塞微球研究，尤其是微球的栓塞行为研究分析还处于空白阶段。本申请基于模板法，采用二次浇筑水凝胶的方法制备具有树枝状通道结构的水凝胶芯片，无需昂贵的光刻和微加工技术和设备，操作简单，成本较低。同时，将具有树枝状通道结构的水凝胶芯片用于栓塞微球的栓塞行为研究，可为肿瘤疾病介入治疗研究提供一种新的栓塞微球体外评价模型。

CN 105963050A公开了一种组织工程血管化肝小叶的制造方法，包括以下步骤：用3D打印机打印肝小叶的相容性支持性边框，在所述边框插入七根毛细玻璃管构成肝小叶的成型模具；按细胞浓度10^6cells/mL将HepG2细胞与温敏性水凝胶溶液混匀，填加到所述模具中，用紫外光照射30s-200s，固化交联胶原后抽出毛细玻璃管，形成毛细管道；配置浓度为1*10^7cells/mL的人脐静脉内皮细胞，注入到所述毛细管道中并培养，使其长满毛细管道内壁，从而制得血管化的肝小叶。本方法制得的肝小叶生物相容性好，可用于肝脏类药物的药物筛选、疾病机理研究以及药物在肝脏中代谢过程的研究。

发明内容

为了克服上述不足，本发明提出一种操作简单，成本低廉的树枝状通道结构的水凝胶芯片的制备方法，不仅可用于复杂结构水凝胶芯片的低成本加工，也可用于栓塞微球栓塞行为(如流体动力学性质、形变等)的研究，以便为研发新型栓塞微球、提高栓塞术的适用性提供一定的理论依据。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

为了更加真实地模拟栓塞微球在微血管内的栓塞行为，本申请试图构建一种具有分叉和分级的树枝状通道结构水凝胶芯片，但现有的模板法制备水凝胶芯片过程中，只能形成一字型通道结构；无法有效地构建具有树枝状通道结构的水凝胶微流控芯片。为此，本申请系统尝试了多种水凝胶微流控芯片通道结构的构建方法，经过大规模实验摸索后，提出：采用二次浇注的方式来实现多组模板在同一水平面的固定。结果表明：形成的通道结构较好的分叉结构，能够更真实的模拟微血管网络，进行栓塞微球的体外评价；本方案有效克服了一次浇注法在制备树枝状结构通道时，无法将模板固定于同一水平面，且分叉点处无法进行初步的固定和校对导致最终分叉结构不理想，与真实的微血管结构偏差较大，从而影响微球栓塞行为的实验结果的问题。

本发明的目的之一是提供了一种树枝状通道结构的水凝胶芯片的制备方法，将水凝胶溶液在侧边设置有小孔的模具中进行第一次浇筑至水凝胶液面与模具小孔下沿平齐，将模板置于模具中，校准后，使水凝胶溶液初步固化；再在模具中进行水凝胶溶液的二次浇筑至水凝胶液面完全高于小孔上沿，水凝胶完全固化后去除模板，即得具有树枝状通道结构的水凝胶芯片；

所述模具由基底板和矩形边框组成，基底板为玻璃板，矩形边框为经激光雕刻后的各组件粘合而成。

所述矩形边框的侧面设置有多个小孔，所述小孔位于同一水平面上。

所述模板是横切面为圆形的管状或棒状物，包括：金属泵棒，玻璃毛细管，针头，塑料管，橡胶及复合材料管。模板的直径尺寸可为10μm～2mm。模板可通过打磨或切割等加工方式得到一端有斜面的模板，其倾斜角度与所设计通道结构一致。

优选的，所述水凝胶溶液的质量体积比为0.1～20％。

优选的，所述水凝胶包括:明胶、海藻酸钠、琼脂、活性肽、胶原、肝素、硫酸软骨素、透明质酸、粘多糖、糖蛋白、基质胶、右旋糖、壳聚糖、聚乙二醇二丙烯酸酯或纤维蛋白原。

优选的，所述固化方式为光固化、温度固化或化学固化。

本发明的目的之二是提供了采用任一上述方法制备的树枝状通道结构的水凝胶芯片。

优选的，所述树枝状通道结构为简单的Y形结构，或两种或多种Y形结构组合成的复杂树枝状结构。

优选的，通道结构的分叉角度范围为0°～180°，通道的截面均为圆形，通道的直径范围为10μm～2mm，通道与底边的距离为100μm～1cm，优选的，在200μm左右。

本发明的目的之三是提供了一种栓塞微球在微血管内的栓塞行为的研究模型，包括：上述的树枝状通道结构的水凝胶芯片。

优选的，所述研究模型还包括：硅胶管和连接针，水凝胶通道的出入口端通过连接针与硅胶管相连，硅胶管的另一端与泵体或注射器相连。优选的，所述泵体为微量注射泵或蠕动泵。

优选的，所述研究模型还包括：微球，微球可为聚乙烯醇(PVA)微球，海藻酸钠微球，明胶微球等商品化的栓塞微球，也可为聚苯乙烯(PS)微球，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球，二氧化硅(SiO₂)等商品化的普通微球，微球的粒径范围为10μm～2mm。微球通入的速度为10ml/h～100ml/h；通入的微球浓度为1mg/ml～100mg/ml。

本发明的有益效果

(1)本发明采用二次浇注的方式来实现多组模板在同一水平面的固定。有效克服了一次浇注法在制备树枝状结构通道时，无法将模板固定于同一水平面，且分叉点处无法进行初步的固定和校对导致最终分叉结构不理想，与真实的微血管结构偏差较大，从而影响微球栓塞行为的实验结果的问题。

(2)本发明采用二次浇注成型，一次浇注形成水平基底和固定模板；二次浇注形成分叉通道。

(3)本发明成型方法简单、效率高、实用性强，易于推广。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1本发明水凝胶芯片的整体示意图，其中，1.模板、2.矩形边框、3.基底板；

图2具体实施例1中水凝胶芯片的宏观图、微观图及横切面图；

图3具体实施例3中栓塞微球栓塞于微通道的微观图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

下述实施例中“质量体积比”是指：溶质质量与溶剂体积的比值，以百分数计。

下述实施例中，模具的计算机软件设计、激光雕刻、水凝胶固化等操作的具体条件根据本领域的常规技术手段进行处理即可。本发明提出的基于模板法制备树枝状通道结构的水凝胶芯片的制备方法，具体步骤为：

(1)采用计算机辅助设计软件(如AutoCAD)设计水凝胶芯片的树枝状通道结构及对应模具的结构，生成激光雕刻机可直接读取的设计文件(如二进制BAK文件)，利用激光雕刻机根据所设计的结构在PMMA板上打孔制备相应模具组件，并将各组件粘合成模具；

(2)配制水凝胶材料的溶液，溶液的组成主要为超纯水、交联剂及水凝胶等，通过调节水凝胶的浓度、使用交联剂用量及固化条件，使得到的水凝胶具有一定的透明度及机械强度；

(3)选用不同直径的玻璃毛细管作为通道模板，与所设计的水凝胶通道尺寸相一致，玻璃毛细管的一端经过一定程度的打磨后使用，倾斜角度与所设计的通道结构一致；

(4)将水凝胶溶液在模具中进行第一次浇筑，浇筑高度略低于模具中小孔高度，然后将模板按照所设计的通道结构置于模具中，并在显微镜下校对模板的相对位置，尤其是分叉点处各模板的位置，待水凝胶溶液初步固化，模板位置固定后，在模具中进行水凝胶溶液的二次浇筑，水凝胶完全固化后去除模板，得到具有树枝状通道结构的水凝胶芯片。

(5)水凝胶芯片的入口和出口均依次通过连接针、硅胶管与泵体相连，将栓塞微球通过泵体灌注到水凝胶芯片通道内，研究栓塞微球的栓塞行为。

本发明中，步骤(1)中所述的设计软件选用能输出二进制BAK格式设计文件的三维设计软件，包括：AutoCAD、3DMAX、coreldraw或SolidWorks。

本发明中，步骤(1)中所述设计的树枝状通道结构既可以是简单的Y形结构，也可以是两种或多种Y形结构组合成的复杂树枝状结构(如图1所示)，通道结构的分叉角度范围为0°～180°，通道的截面均为圆形，通道的直径范围为10μm～2mm，通道与底边的距离为100μm～1cm，优选的，在200μm左右。

本发明中，步骤(1)中所述的模具材料为PMMA，PLA，PTFE，ABS树脂，PDMS中的一种或多种，可以采用激光雕刻机进行切割、打孔等加工，模具中孔径范围20μm～3cm，孔与孔间的距离与所设计通道结构对应；小孔与底边的距离为100μm～1cm，优选的，在200μm左右。

本发明中，步骤(2)中所述的水凝胶采用的是明胶、海藻酸钠、琼脂、活性肽、胶原、肝素、硫酸软骨素、透明质酸、粘多糖、糖蛋白、基质胶、右旋糖、壳聚糖、聚乙二醇二丙烯酸酯和纤维蛋白原等可固化的胶状物质中的一种或多种，质量体积比为0.1～20％，交联方式为光固化，温度固化，化学固化中的一种或多种。

本发明中，步骤(3)中所述的模板是横切面为圆形的管状或棒状物，可以为金属棒，玻璃毛细管，针头，塑料管，橡胶及复合材料管中的其中一种或多种，模板的直径尺寸可为10μm～2mm。模板可通过打磨或切割等加工方式的到一端有斜面的模板，其倾斜角度与所设计通道结构一致。

本发明中，步骤(4)中所述的通道制备方法为模板法，即通道结构是由水凝胶材料浇筑模板后移除模板所形成，其中移除模板可通过抽拉或溶解牺牲的方式移除。水凝胶的浇筑方法采用二次浇筑，固化的方式进行。

本发明中，步骤(5)中所述的泵体为微量注射泵或蠕动泵，微球的通入浓度为1mg/ml～100mg/ml，通入速度为10ml/h～100ml/h；微球可为PVA微球，海藻酸钠微球，明胶微球等商品化的栓塞微球，也可为PS微球，PMMA微球，SiO₂等商品化的普通微球；微球的粒径范围为10μm～2mm。

本发明中提供的水凝胶芯片主要是有硅胶管和连接针组成的出入口和水凝胶材料组成树枝状通道构成，通道硅胶管与泵体或注射器相连。

本发明提供的水凝胶芯片透明可视，可在显微镜下实现对微球的实时观测。

本发明提供的体外树枝状通道结构水凝胶芯片可用于栓塞微球的栓塞行为研究，可为肿瘤疾病介入治疗研究提供一种新的栓塞微球体外评价模型。

实施例1

采用AutoCAD设计水凝胶芯片的树枝状通道结构，通道直径400μm，分叉角度为30°；根据通道结构设计PMMA矩形边框各侧面的打孔位置，利用激光雕刻机在相应位置进行打孔，微孔尺寸为800μm，距离底边200μm，并将各侧面粘结成矩形边框，备用。选用内径为300μm、壁厚为100μm的玻璃毛细管为模板，其中一端经过砂纸打磨成倾斜面。配制质量体积比为12.5％的明胶水溶液，加入质量体积比为10％的谷氨酰胺转氨酶(TG酶)，将明胶溶液及TG酶在常温下混合均匀后进行第一次浇筑，待液面与微孔下沿平齐时停止浇注，并将玻璃毛细管置于模具中，拼合成所需的树枝状通道结构，在显微镜下校对玻璃毛细管的相对位置，待水凝胶溶液初步固化后在模具中进行水凝胶溶液的二次浇筑，待水凝胶充满模具时，进行二次固化交联，交联完毕后去除玻璃毛细管，得到具有树枝状通道结构的水凝胶芯片，其宏观图、微观图及横切面图如图2所示。

实施例2

采用AutoCAD设计水凝胶芯片的树枝状通道结构，通道直径600μm，分叉角度为60°；根据通道结构设计PMMA矩形边框各侧面的打孔位置，利用激光雕刻机在相应位置进行打孔，微孔尺寸为1200μm，距离底边200μm，并将各侧面粘结成矩形边框，备用。选用内径为500μm、壁厚为100μm的玻璃毛细管为模板，其中一端经过砂纸打磨成倾斜面。配制质量体积比为12.5％的明胶水溶液，加入质量体积比为10％的TG酶，将明胶溶液及TG酶在常温下混合均匀后进行第一次浇筑，待液面与微孔下沿平齐时停止浇筑，并将玻璃毛细管置于模具中，在显微镜下校对模板的相对位置，待水凝胶溶液初步固化后在模具中进行水凝胶溶液的二次浇筑，水凝胶交联完毕后去除模板，得到具有树枝状通道结构的水凝胶芯片。

实施例3

采用AutoCAD设计水凝胶芯片的树枝状通道结构，通道直径400μm，分叉角度为45°；根据通道结构设计PMMA矩形边框各侧面的打孔位置，利用激光雕刻机在相应位置进行打孔，微孔尺寸为800μm，距离底边200μm，并将各侧面粘结成矩形边框备用。选用内径为300μm、壁厚为100μm的玻璃毛细管为模板，其中一端经过砂纸打磨成倾斜面。配制质量体积比3％的海藻酸钠水溶液，加入质量体积比为10％的氯化钙溶液，将海藻酸钠溶液及氯化钙溶液混合均匀后进行第一次浇筑，待液面与微孔下沿平齐时停止浇筑，并将玻璃毛细管置于模具中，在显微镜下校对模板的相对位置，待水凝胶溶液初步固化后在模具中进行水凝胶溶液的二次浇筑，水凝胶交联完毕后去除模板，得到具有Y形通道结构的水凝胶芯片。将水凝胶芯片的入口和出口均依次通过连接针、硅胶管与注射泵相连，将20mg/ml的PVA栓塞微球水溶液通过注射泵通入到水凝胶芯片通道内，研究栓塞微球的栓塞行为，其栓塞微球栓塞于微通道的微观图如图3所示。

实施例4

采用AutoCAD设计水凝胶芯片的树枝状通道结构，通道直径400μm和600μm，分叉角度为30°和60°的树枝状结构；根据通道结构设计PTFE矩形边框各侧面的打孔位置，利用激光雕刻机在相应位置进行打孔，微孔尺寸为800μm和1000μm，距离底边200μm，并将各侧面粘结成矩形边框，备用。选用内径为300μm、壁厚为100μm及500μm、壁厚为100μm的玻璃毛细管为模板，其中一端经过砂纸打磨成倾斜面。配制质量体积比为20％的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)水溶液，加入质量体积比为5％的光引发剂(2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮)，将PEGDA溶液及光引发剂混合均匀后进行第一次浇筑，待液面与微孔下沿平齐时停止浇筑，并将玻璃毛细管置于模具中，在显微镜下校对模板的相对位置，在紫外灯下水凝胶溶液初步固化后，在模具中进行水凝胶溶液的二次浇筑，水凝胶交联完毕后去除模板，得到具有树枝状通道结构的水凝胶芯片。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种树枝状通道结构的水凝胶芯片的制备方法，其特征在于，将水凝胶溶液在侧边设置有小孔的模具中进行第一次浇筑至水凝胶液面与模具小孔下沿平齐，将模板置于模具中，校准后，使水凝胶溶液初步固化；再在模具中进行水凝胶溶液的二次浇筑至水凝胶液面完全高于小孔上沿，水凝胶完全固化后去除模板，即得具有树枝状通道结构的水凝胶芯片。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水凝胶溶液的质量体积比为0.1～20％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水凝胶包括:明胶、海藻酸钠、琼脂、活性肽、胶原、肝素、硫酸软骨素、透明质酸、粘多糖、糖蛋白、基质胶、右旋糖、壳聚糖、聚乙二醇二丙烯酸酯及纤维蛋白原。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固化方式为光固化、温度固化或化学固化。

5.权利要求1-4任一项所述的方法制备的树枝状通道结构的水凝胶芯片。

6.如权利要求5所述的水凝胶芯片，其特征在于，所述树枝状通道结构为简单的Y形结构，或两种或多种Y形结构组合成的复杂树枝状结构。

7.如权利要求5所述的水凝胶芯片，其特征在于，通道结构的分叉角度范围为0°～180°，通道的截面均为圆形，通道的直径范围为10μm～2mm，通道与底边的距离为100μm～1cm，优选的，在200μm左右。

8.一种栓塞微球在微血管内的栓塞行为的研究模型，其特征在于，包括：权利要求5所述的树枝状通道结构的水凝胶芯片。

9.如权利要求8所述的研究模型，其特征在于，还包括：硅胶管和连接针，水凝胶通道的出口端通过连接针与硅胶管，硅胶管的另一端与泵体或注射器相连。

10.如权利要求8所述的研究模型，其特征在于，还包括：微球，微球可为聚乙烯醇PVA微球，海藻酸钠微球，明胶微球等商品化的栓塞微球，也可为聚苯乙烯PS微球，聚甲基丙烯酸甲酯PMMA微球，二氧化硅SiO₂等商品化的普通微球，微球的粒径范围为10μm～2mm。微球通入的速度为10ml/h～100ml/h；通入的微球浓度为1mg/ml～100mg/ml。