CN107693846A - 一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织及其制备方法。所述制备方法包括如下步骤：通过铸模法或3D打印方式得到具有分枝状结构的牺牲模；在牺牲膜的表面涂覆或喷涂含致孔剂的聚合物溶液得到聚合物薄膜；去除经上述处理的结构的牺牲膜和致孔剂得到具有表面孔隙的类血管通道结构；在类血管通道结构的通道内灌注种植内皮细胞；在类血管通道结构的表面孔隙内种植平滑肌细胞或成纤维细胞；将经上述处理的类血管通道结构置于模具中，加入含实质细胞的水凝胶溶液，铸模成型即得到仿生血管化软组织。本发明方法可在人工组织内构建具有多层结构的仿生血管。

Description

一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织及其制备方法，属于组织工程和生物制造技术领域。
背景技术
组织工程(Tissue Engineering)是一门前沿交叉科学，其基本原理为通过在体外构建具有一定结构与功能的仿生人工组织，修复、替代病损的组织。虽然组织工程已经在皮肤、骨/软骨、膀胱、血管等领域得到部分应用，但在复杂大块组织的构建上仍然面临巨大的挑战，其中血管化是组织工程的最大挑战之一。对于代谢旺盛的组织如心肌、肝脏，由于细胞具有很高的物质及能量代谢水平，这些组织内部有着复杂而丰富的血管网络。在组织工程支架内，氧和营养物质的传输距离在100μm左右，光靠扩散无法满足支架内部的代谢需求；同时体内移植，宿主血管长入支架至少需要三至五天。因此在支架内体外预血管化，显得十分迫切。
目前血管化是组织工程的研究热点之一。在体外构建血管化组织，必须借鉴天然血管的结构与形成机制。天然血管形成是个涉及多种细胞、生长因子、细胞外基质、氧等相互作用的动态、复杂的过程。天然血管形成主要有两种机制，血管发生(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)，在胚胎发育过程中，先各处形成“血岛”(主要为血管发生)，在出芽、生长、连接、分化(主要为血管新生)，形成复杂分级的血管网络。天然血管分为动、静脉、毛细血管，他们的结构组成与功能各不相同。其中，动静脉可以大、中、小、微动静脉，结构类似，分为内膜、中膜、外膜，分别由内皮层(内皮细胞)，弹性层、平滑层(平滑肌细胞)，结缔组织组成；毛细血管是氧和营养物质主要的交换场所，主要为由单层内皮细胞形成的管腔结构，分为连续、有孔毛细血管以及血窦。
目前常见的体外预血管化策略包括：内皮细胞共培养，构建微流体通道，复合促血管生长因子，灌注培养，体内预血管化，微单元体组装如微水凝胶、细胞微球，血管床等方法。最新的研究包括2016年Nature报道的Milica Radisic课题组构建含微流体通道的水凝胶，通过软光刻与层层堆积的方式成形类血管通道结构，在通道内灌注内皮细胞形成内皮层，在通道外铸模含实质细胞(心肌细胞、肝细胞)的水凝胶，形成血管化的工程组织；以及2016年PNAS报道的Jennifer A.Lewis课题组三维打印血管化大块组织，通过多喷头细胞打印机，同时打印支撑材料(树脂)、多种细胞(干细胞和实质细胞)、牺牲材料(Pluronic F-127)，通过降温流出Pluronic F-127形成类血管通道结构，再灌注种植内皮细胞，培养形成血管化大块组织。这些体外构建的组织血管化程度，多为内皮细胞的自组装，形成初步、简单的内皮细胞管腔结构，离真正成熟、可灌注的分级血管网络，还相差甚远。
目前有一些研究通过从通道周围的实质区域，向通道的内皮层吸引、招募平滑肌细胞、成纤维细胞的方式来构建成熟的血管结构，这种方法效率很低而且需要复杂的生物因子调控。
发明内容
本发明的目的是提供一种在水凝胶内构建具有多层血管结构的仿生血管化软组织的制备方法，具体是，通过构建具有一定壁厚和表面孔隙的通道网络结构，在通道内部灌注种植内皮细胞，在通道表面的孔隙壁内种植平滑肌、成纤维细胞等细胞，然后在通道外铸模含实质细胞的水凝胶。通过本发明方法，可以在人工组织内构建具有多层结构的仿生血管：内皮细胞层+平滑肌层。本发明方法有望构建成熟、可灌注的复杂血管结构，进一步发育形成大块血管化组织，在组织器官修复、药物筛选、病理模型研究等有重要应用。
本发明所提供的具有多层血管结构的仿生血管化软组织的制备方法，包括如下步骤：
(1)通过铸模法或3D打印方式，得到具有分枝状结构的牺牲模；
(2)在所述牺牲膜的表面涂覆或喷涂含有致孔剂的聚合物溶液，得到聚合物薄膜；
(3)去除经步骤(2)处理的结构的所述牺牲膜和所述致孔剂，得到具有表面孔隙的类血管通道结构；
(4)在所述类血管通道结构的通道内灌注种植内皮细胞，以模拟血管结构的内皮层；在所述类血管通道结构的表面孔隙内种植平滑肌细胞或成纤维细胞等细胞，以模拟血管结构的中膜层；
(5)将经步骤(4)处理的所述类血管通道结构置于模具中，加入含有实质细胞的水凝胶溶液，铸模成型即得到仿生血管化软组织。
上述的制备方法中，所述3D打印方式可采用连续挤出工艺、立体光刻工艺和激光微熔覆烧结等工艺中的一种；
所述铸模法具体为：通过制备含所述通道网络结构的PDMS模具，在其中浇铸液态牺牲模材料，通过冷却或者光聚合固化，成形多分支形态的可溶性牺牲模。
制备所述牺牲模的材料为具有较好的可溶性、生物相容性及力学性能的材料，具体可为糖类化合物、聚乙烯醇(PVA,polyvinyl alcohol)、明胶、琼脂糖、碱溶性光敏聚合物等中的至少一种；
所述糖类化合物可为葡萄糖、麦芽糖和蔗糖中至少一种；
所述明胶的分子量可为15000～250000Da，可以是A型明胶，也可以是B型明胶；
所述聚乙烯醇的分子量可为2.5～30万，醇解度为78％～98％；
所述碱溶性光敏聚合物可为二甲基-丙烯酰胺、甲基丙烯酸和聚乙烯基吡咯烷酮的共聚物，三者的质量比为11：11：3。
上述的制备方法中，当制备所述牺牲模的材料为糖类化合物和/或聚乙烯醇(PVA)时，采用如下方法去除所述牺牲膜和所述致孔剂：浸泡于去离子水、蒸馏水或PBS缓冲液中；
当制备所述牺牲模的材料为所述碱溶性光敏聚合物时，采用如下方法去除所述牺牲膜和所述致孔剂：浸泡于NaOH水溶液中；
当制备所述牺牲模的材料为所述明胶和/或琼脂糖时，采用如下方法去除所述牺牲膜和所述致孔剂：利用其“凝胶-溶胶”转变的温敏特性，置于凝胶温度点溶出。
上述的制备方法中，所述分枝状结构可为1～4级分支结构。
上述的制备方法中，所述聚合物溶液采用的聚合物可为聚己内酯(PCL,Polycaprolactone)、聚乳酸(PLA,Polylactic acid)、聚乙醇酸(PGA,Polyglycolide)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA,Poly(Lactide-co-Glycolide))、聚癸二酸丙三醇酯(PGS,Poly(glycerol sebacate))和聚丙交脂-乙交脂共聚物(PLLG,poly(L-lactide-co-glycolide))中至少一种；
所述聚合物溶液采用的溶剂可为六氟异丙醇(HFIP)、1,4二氧六环(1,4-dioxane)、三氯甲烷等有机溶剂；
所述致孔剂可为呈颗粒状的氯化钠，直径可为20μm～250μm；
所述聚合物溶液中，所述聚合物的质量-体积浓度为1.0～200mg/mL，具体可为20～50mg/mL、20mg/mL、25mg/mL或50mg/mL，所述致孔剂的质量-体积浓度为1.0～200mg/mL，具体可为47～200mg/mL、47mg/mL、100mg/mL或200mg/mL。
上述的制备方法中，所述聚合物薄膜的厚度可为50μm～1000μm，具体可为100μm～300μm、100μm、200μm或300μm；
涂覆或喷涂结束后，经干燥即得到所述聚合物薄膜。
上述的制备方法中，所述类血管通道结构的截面为圆形或者方形；
所述类血管通道结构的壁厚为50μm～1000μm，具体可为100μm～300μm、100μm、200μm或300μm，所述表面孔隙的直径为20μm～250μm，具体可为25μm～100μm、50μm～150μm或150μm～250μm，所述表面孔隙与类血管通道结构的通道内贯通，即为一种具有一定壁厚和微观孔隙结构的类血管通道结构。
上述的制备方法中，所述水凝胶可为聚乙二醇(PEG,Poly(ethylene glycol))、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、明胶、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原和白蛋白中至少一种。
上述的制备方法中，所述实质细胞为天然组织器官的实质细胞或干细胞；
所述天然组织器官的实质细胞可为心肌细胞、肝实质细胞、肾细胞等细胞。
本发明方法制备的具有多层血管结构的仿生血管化软组织可用于组织替代物、药物筛选和病理模型研究中。
与现有的技术相比，本发明具有以下优点：
本发明方法可以在人工组织内构建具有多层结构的仿生血管，如：内皮细胞层+平滑肌层。相比而言，目前体外构建的血管化组织内的血管结构仅为内皮细胞自组装形成的初步的管腔结构。本发明方法有望构建成熟、可灌注的复杂血管结构，进一步发育形成大块血管化组织，在组织器官修复、药物筛选、病理模型研究等有重要应用。
附图说明
图1为本发明具有多层血管结构的仿生血管化软组织的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明具有多层血管结构的仿生血管化软组织，包括具有一定壁厚和表面孔隙的类血管通道结构和在通道外铸模水凝胶；所述类血管通道结构具有一定壁厚和表面微观孔隙结构，且这些微观孔隙结构与通道内贯通。
所述类血管通道结构为合成高分子材料(聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚癸二酸甘油酯(PGS)、聚乙二醇(PEG,Poly(ethylene glycol))(PEG)、聚右旋乳酸(PLDA)、左旋聚乳酸(PLLA))中的至少一种。
所述类血管通道结构具有多分叉分级结构，1～4级分支结构，如2级或3级分级结构。
所述类血管通道结构截面可为圆形或者方形，壁厚为50μm～1000μm，直径可为50μm～3000μm。
所述类血管通道结构表面微观孔隙结构的直径可为20μm～250μm。
图1为本发明提供的在水凝胶内构建具有多层血管结构的仿生血管化软组织的制备方法的示意图，包括如下步骤：
1)通过铸模法或者3D打印方式，得到具有分枝状结构的牺牲模；如图1中的步骤1；
2)将上述分枝状结构表面涂覆或喷涂混有致孔剂的聚合物溶液，凝固成膜，如图1中的步骤2；
3)将步骤2)得到的结构置于水溶液中，溶出牺牲模和致孔剂，得到具有一定壁厚和表面孔隙的类血管通道结构，如图1中的步骤3；
4)在通道内灌注种植内皮细胞，模拟血管结构的内皮层；在通道结构的表面孔隙内种植平滑肌细胞或者成纤维细胞等细胞，模拟血管结构的中膜层，如图1中的步骤4；
5)将种有细胞的类血管通道结构置于模具中，加入含实质细胞的水凝胶溶液，铸模成形得到血管化组织结构体，如图1中的步骤5。
步骤1)中，所述牺牲模材料为具有较好的可溶性、生物相容性及力学性能的材料，具体可为糖类化合物、聚乙烯醇(PVA)、明胶、琼脂糖、碱溶性光敏聚合物等中的至少一种；
步骤2)中，所述致孔剂可为氯化钠(NaCl)颗粒，颗粒直径为20μm～250μm；
步骤2)中，表面涂覆的膜厚为50μm～1000μm；
步骤5)中，所述的水凝胶材料，可为胶原、壳聚糖、海藻酸钠、明胶、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原和白蛋白中的至少一种；
步骤5)中，所述实质细胞可为心肌细胞、肝实质细胞、肾细胞等天然组织器官的实质细胞，或者干细胞。
实施例1、制备具有多层血管结构的仿生血管化软组织
将聚乳酸(PLA，分子量为50,000，粘度为1.5dL/g)溶于三氯甲烷(CHCl3)中，配制浓度为50mg/mL的聚乳酸(PLA)溶液，加入氯化钠(NaCl)颗粒(直径在75±25μm)，其中氯化钠(NaCl)：聚乳酸(PLA)＝8：2(wt％)，均匀搅拌得到含氯化钠(NaCl)的聚乳酸(PLA)溶液。
在37℃下将明胶(Gelatin，15k～25kDa，0.15g/ml)溶液加入挤出式3D打印设备的注射器喷头中，按照预设结构生成打印路径，在4℃环境下打印成形具有2级分支形态的结构(直径为500～1500μm)。将打印后的结构，表面均匀涂覆含氯化钠(NaCl)的聚乳酸(PLA)溶液，风干12小时，得到表面厚度为300μm的聚合物薄膜。
将该分支结构放于在37℃下数小时溶出明胶牺牲模，然后用PBS溶液反复清洗溶出氯化钠(NaCl)颗粒，得到含有孔隙壁的类血管通道结构(厚度为300μm)，孔隙壁中的微观孔隙的直径为25μm～100μm。
在类血管通道结构的通道内通过注射泵灌注种植内皮细胞(HUVECs，5×106/ml)，在通道表面的微孔隙内通过微量移液枪种植平滑肌细胞(SMCs，106/ml)，置于培养箱(37℃，5％CO2)中2小时待细胞贴壁。将种有细胞的类血管通道结构置于模具中，倒入含有间充质干细胞(10×106/ml)的聚乙二醇(PEG,Poly(ethylene glycol))溶液，然后用紫外光(Omnicure 2000，320～500nm)照射60秒(100mW/cm2)得到血管化组织结构体。
实施例2、制备具有多层血管结构的仿生血管化软组织
将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，聚乳酸(PLA)与聚乙醇酸(PGA)的摩尔比为75：25，粘度为0.93dl/g)溶于1,4二氧六环(1,4-dioxane)中，配制浓度为20mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，加入氯化钠(NaCl)颗粒(直径在100±25-μm)，其中氯化钠(NaCl)：聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)＝7：3(wt％)，均匀搅拌，得到含氯化钠(NaCl)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶液。
将蔗糖、麦芽糖、葡萄糖按1：12：2的质量比例均匀混合，放入熔融挤出打印设备的喷头料腔中，并在130℃下加热熔化，通过气压控制喷头的连续挤出，按照预设结构生成打印路径，成形具有三级分支形态的结构(直径在300～1500μm)。将打印后的结构，表面均匀涂覆含氯化钠(NaCl)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶液，风干12小时，得到表面厚度为100μm的聚合物薄膜。
将该分支结构浸入PBS溶液中，反复清洗数小时，溶出牺牲模(蔗糖、麦芽糖、葡萄糖)和盐颗粒(氯化钠(NaCl))，得到含有孔隙壁的类血管通道结构(厚度为100μm)，孔隙壁中的微观孔隙的直径为50μm～150μm。
在通道内通过注射泵灌注种植内皮细胞(HUVECs，5×106/ml)，在通道表面的微孔隙内通过微量移液枪种植平滑肌细胞(SMCs，106/ml)，置于培养箱(37℃，5％CO2)中2小时待细胞贴壁。将种有细胞的类血管通道结构置于模具中，倒入含有乳鼠左心室心肌细胞(CMs，5×106/ml)的海藻酸钠溶液(2％，wt％)，然后用50mg/mL CaCl2溶液交联10分钟，得到血管化组织结构体。
实施例3、制备具有多层血管结构的仿生血管化软组织
将聚己内酯(PCL,Polycaprolactone，分子量为45,000)溶于六氟异丙醇(HFIP)中，配制浓度为25mg/mL的PCL溶液，加入氯化钠(NaCl)颗粒(直径在150±25μm)，其中NaCl：PCL＝8：2(wt％)，均匀搅拌，得到含氯化钠(NaCl)的聚己内酯(PCL)溶液。
将碱溶性光敏聚合物(二甲基-丙烯酰胺、甲基丙烯酸和聚乙烯基吡咯烷酮的共聚物，三者的质量比为11:11:3)，通过立体光刻工艺(Stereolithography)成形，按照预设结构生成打印路径，成形具有三级分支形态的结构(直径为200～1000μm)。将打印后的结构，表面均匀涂覆含氯化钠的聚己内酯(PCL)溶液，风干12小时，得到表面厚度为200μm的聚合物薄膜。
将该分支结构浸入NaOH溶液中，溶出牺牲模(碱溶性光敏聚合物)，然后用PBS溶液反复清洗数小时，溶出氯化钠颗粒，得到含有孔隙壁的类血管通道结构(厚度为200μm)，孔隙壁中的微观孔隙的直径为150μm～250μm。
在通道内通过注射泵灌注种植内皮细胞(HUVECs，5×106/ml)，在通道表面的微孔隙内通过微量移液枪种植平滑肌细胞(SMCs，106/ml)，置于培养箱(37℃，5％CO2)中2小时待细胞贴壁。将种有细胞的类血管通道结构置于模具中，倒入含有肝实质细胞(4×106/ml)的基质胶(Matrigel)溶液(2％，wt％)，然后用在37℃静置10分钟凝胶。

Claims (10)

1.一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织的制备方法，包括如下步骤：
(1)通过铸模法或3D打印方式，得到具有分枝状结构的牺牲模；
(2)在所述牺牲膜的表面涂覆或喷涂含有致孔剂的聚合物溶液，得到聚合物薄膜；
(3)去除经步骤(2)处理的结构的所述牺牲膜和所述致孔剂，得到具有表面孔隙的类血管通道结构；
(4)在所述类血管通道结构的通道内灌注种植内皮细胞；在所述类血管通道结构的表面孔隙内种植平滑肌细胞或成纤维细胞；
(5)将经步骤(4)处理的所述类血管通道结构置于模具中，加入含有实质细胞的水凝胶溶液，铸模成型即得到仿生血管化软组织。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：制备所述牺牲模的材料为糖类化合物、聚乙烯醇、明胶、琼脂糖和碱溶性光敏聚合物中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述分枝状结构为1～4级分支结构。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述聚合物溶液采用的聚合物为聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚癸二酸丙三醇酯和聚丙交脂-乙交脂共聚物中至少一种；
所述致孔剂为呈颗粒状的氯化钠；
所述聚合物溶液中，所述聚合物的质量-体积浓度为1.0～200mg/mL，所述致孔剂的质量-体积浓度为1.0～100mg/mL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述聚合物薄膜的厚度为50μm～1000μm。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述类血管通道结构的截面为圆形或者方形；
所述类血管通道结构的壁厚为50μm～1000μm，所述表面孔隙的直径为20μm～250μm。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述水凝胶为聚乙二醇、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、明胶、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原和白蛋白中至少一种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述实质细胞为天然组织器官的实质细胞或干细胞。
9.权利要求1-8中任一项所述方法制备的具有多层血管结构的仿生血管化软组织。
10.权利要求9所述具有多层血管结构的仿生血管化软组织在组织替代物、药物筛选和病理模型研究中的应用。
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