CN110433334B - 3d打印气管c形支架与杂化型支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了3D打印气管C形支架与杂化型支架的制备方法，具体包括多孔气管支架的制备和杂化型支架的制备两个步骤，可成功构建兔气管的局部窗形缺损修补和节段替代模型，术后实验组的受体情况良好，在30d观察点收获时可见管腔通畅，修补或替代处有上皮细胞爬行，远期疗效较使用单一支架材料好。结合负载有生长因子的Pluronic F‑127水凝胶载体，所种植的BMSCs在富含生长因子的水凝胶载体中，利用体内天然环境，实现了向软骨细胞分化。

Description

3D打印气管C形支架与杂化型支架的制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及3D打印气管C形支架与杂化型支架的制备方法。
背景技术
为了避免移植物在术后发生管腔塌陷等并发症，移植物用材料的结构稳定性起着至关重要的作用。单一的气管基质材料无法满足作为临床气管替代物的要求，随着相关研究的推进，气管替代物向着结构仿生化、功能多样化、个体化制造的方向发展。相关领域的研究人员尝试将天然材料与合成材料结合、天然材料与高分子聚合物结合、或记忆合金材料与天然材料结合，以期获得性能优越的气管替代材料，近年来虽然在该方面取得了一定的研究进展，但距离制备出理想的气管替代物仍有很长的路要走。
在研究实验过程中发现，在术中使用传统的单一支架，使用效果受到其自身局限性的影响，因此希望能在此基础上制备出性能更加完善的杂化型支架以帮助重建后气道的生理环境恢复和功能替代。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的不足，提供3D打印气管C形支架与杂化型支架的制备方法，该方法可使移植基质的结构稳定性提高，同时材料表面种植的干细胞可在体内环境中诱导分化。
本发明的技术方案为：3D打印气管C形支架与杂化型支架的制备方法，具体包括两个步骤：
(1)3D打印气管C形支架的制备
选用PCL为材料，打印机的喷头位于旋转轴的正上方，打印喷嘴始终沿着旋转轴方向水平往返移动，先在旋转轴上打印出底层气管支架，然后旋转轴与打印底层时的旋转方向相反进行运动，打印成形第二层气管支架，继而与上一层形成多孔结构，以此重复打印6层，旋转轴滚动的角度为180°时形成C形支架；
表面修饰：将C形支架置于20％Pluronic F-127溶液中浸泡，4℃过夜后第2d取出，室温20℃放置5d后经与PCL的酯基进行聚合缩合的脱水反应，得PCL修饰材料；
(2)杂化型支架的制备
将新西兰兔经耳缘静脉注射空气法处死，无菌原则操作下分离获取气管，将原生气管在4℃蒸馏水中渗透溶解48h，依次进行两次脱细胞循环过程，接着进行京尼平交联处理，术前将经过表面修饰的3D打印C形支架缝合至交联后的脱细胞基质上形成杂化型支架。
进一步地，步骤2中的脱细胞循环过程的具体操作为：4％脱氧胆酸钠溶液浸泡，置于20℃摇床孵育4h；用磷酸盐缓冲液冲洗2遍，然后置于含有50kU/mL DnaseI的1mol/LNaCl中，连续晃动3h，以溶解细胞核并降解DNA，最后用PBS冲洗2遍。
进一步地，步骤2中的京尼平交联处理步骤为：在37℃温度下，脱细胞气管基质浸泡在含1％京尼平浓度的PBS溶液中交联反应1h。
进一步地，步骤1中3D打印时旋转轴滚动的速度为5mm/s，形成的支架孔径为200μm。
进一步地，所述步骤1中打印温度为85-95℃。
进一步地，所述步骤1中打印成型的气管C形支架的层厚为0.08-0.12mm。
本发明的有益效果为：
利用本发明公开的3D打印气管C形支架与杂化型支架的制备方法，可成功构建兔气管的局部窗形缺损修补和节段替代模型，术后实验组的受体情况良好，在30d观察点收获时可见管腔通畅，修补或替代处有上皮细胞爬行。结合负载有生长因子的Pluronic F-127水凝胶载体，所种植的BMSCs在富含生长因子的水凝胶载体中，利用体内天然环境，实现了向软骨细胞分化。
附图说明
图1是本发明公开的3D打印多孔气管支架的制作过程瞬间及各成品展示，其中，1a为3D打印气管支架的制作过程图，1b为3D打印气管C型支架的成品图，1c为3D打印C型支架缝合至交联后的脱细胞基质上的过程，1d为杂化型支架的示意图；
图2是SEM下修饰前后PCL支架的微观结构情况，其中，2a、2c为未经修饰的PCL材料的SEM图，2b、2d为PCL修饰材料的SEM图，2e、2f为高倍镜下的凝胶结构图，放大倍数a、b：×80，c、d：×600，e：×5000，f：×30,000；
图3是材料表面各元素的构成比的EDS分析结果图，其中，3a为未经修饰的PCL材料表面各元素的构成比的EDS分析结果图，3b为PCL修饰材料表面各元素的构成比的EDS分析结果图；
图4是材料表面接种干细胞48h后的SEM图，其中，4a、4b为A1组的结果图，4c、4d为B1组的结果图、4e、4f为C1组的结果图，放大倍数：4a、4c、4e：×1,000，4b、4d、4f：×3,000；
图5是材料周围接种干细胞后染色观察结果图，其中，5a、5d为A1组的染色观察结果图，5b、5e为B1组的染色观察结果图，5c、5f为C1组的染色观察结果图，放大倍数：5a、5b、5c：×40，5d、5e、5f：×100；
图6是窗型缺损修补后各组术中情况图，其中，6a为气管暴露后开窗，构建缺损模型示意图，6b为B2组缝合后的示意图片，6c为C2组缝合后的示意图片，6d为C2组缝合后、添加Pluronic F-127凝胶后的示意图；
图7是补片术后各时间点收获的大体标本照片，其中，7a为B2组30d时收获的大体标本照片，7b为C2组90d时收获的大体标本照片；
图8是补片术后各纤支镜观察气道修补处的状态图，其中，8a为新鲜气管的状态图，8b为B2组30d时的状态图，8c为C2组90d时的状态图，“M”代表气管膜部；
图9是补片术后30d时收获组织后HE染色分析结果图，其中，9a、9b、9c为B2组修补处连续拍照，黑色箭头所指为原生气管上皮，白色箭头所指为术后爬行至基质内表面的新生上皮层；放大倍数×40，9d为C2组的基质外侧可见细胞条带，黑色箭头所指；“C”代表软骨环，放大倍数×200；
图10是补片术后30d时收获组织后免疫组化染色CK-18分析结果图，其中，10b、10c、10d为B2组修补处连续拍照，且10b、10c、10d为10a图的局部分段放大，黑色箭头所指为原生气管上皮，白色箭头所指为术后爬行至基质内表面的新生上皮层；放大倍数10a：×40，10b、10c、10d：×100；
图11是补片术后30d时收获组织后IHC染色II型胶原分析结果图，其中，箭头所指是表达阳性的细胞，“C”是指软骨环，放大倍数11a：×100，11b：×400；
图12是90d时收获补片样本HE染色图和CK-18的IHC染色分析结果图，其中，12a&12b为HE染色图，12c为CK-18染色分析结果图，“C”代表软骨环，黑色箭头所指为原生气管上皮，白色箭头所指为术后爬行至基质内表面的新生上皮层，放大倍数12a、12c：×40，12b：×200；
图13是节段缺损修补各组术中吻合情况图片，其中，13a、13b、13c和13d分别为A3组、B3组、C3组和D3组的吻合情况图片；
图14是节段缺损修补术后收获时的大体照片及术后收获各组组织后HE染色分析结果图，其中，14a：四组样本在各自的观察点收获时的大体照片，14b、14c为D3组30d收获时的照片，14d为A3组HE染色分析结果图，14e为B3组HE染色分析结果图，14f为D3组HE染色分析结果图，黑色箭头指向管腔内表面，“C”代表软骨环，放大倍数×100；
图15是节段缺损修补术后观察点纤支镜观察气道替代处情况及术后30d收获组织后IHC染色CK-18分析结果图，其中，15a为D3组30d时气道替代处情况图，15b为D3组60d时气道替代处情况图，15c、15d为D3组术后30d收获组织后IHC染色CK-18分析结果图，黑色箭头所指为管腔内侧同一部位，放大倍数15c：×40，15d：×400；
图16是三组材料上种植BMSCs在各时间点的OD450值；
图17是补片修复组术后各组动物情况记录表；
图18是节段气管替代术后各组动物情况记录表。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
实施例一：3D打印气管补片与杂化型支架的制备
(1)3D打印气管C形支架的制备
选用PCL为材料，打印机的喷头位于旋转轴的正上方，打印喷嘴始终沿着旋转轴方向水平往返移动，先在旋转轴上打印出底层气管支架，然后旋转轴与打印底层时的旋转方向相反进行运动，打印成形第二层气管支架，继而与上一层形成多孔结构，以此重复打印6层，旋转轴滚动的速度为5mm/s，打印温度为90℃，旋转轴滚动的角度为180°，形成的C形支架的孔径为200μm，气管支架的层厚为0.09mm；
表面修饰：将C形支架置于20％Pluronic F-127溶液中浸泡，4℃过夜后第2d取出，室温20℃放置5d后经与PCL的酯基进行聚合缩合的脱水反应，得PCL修饰材料；
(2)杂化型支架的制备
将新西兰兔经耳缘静脉注射空气法处死，无菌原则操作下分离获取气管，将原生气管在4℃蒸馏水中渗透溶解48h，接着进入第一个脱细胞循环过程：4％脱氧胆酸钠溶液浸泡，置于20℃摇床孵育4h；用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)冲洗2遍，然后置于含有50kU/mL DnaseI的1mol/L NaCl中，连续晃动3h，以溶解细胞核并降解DNA，最后用PBS冲洗2遍，同样的流程再次进行一个脱细胞循环；接着进行京尼平交联处理：在37℃温度下，脱细胞气管基质浸泡在含1％京尼平浓度的PBS溶液中交联反应1h；术前将经修饰的3D打印C形支架缝合至交联后的脱细胞基质上形成杂化型支架。
实施例二：相关性能测试
1、SEM观察和EDS分析
将修饰前后的3D打印气管支架经2.5％戊二醛溶液浸泡固定24h。用PBS漂洗后，将样本用梯度乙醇从低到高浓度依次脱水，经冷冻干燥机真空干燥后喷金，用场发射SEM(S-4800)上机观察。在不同放大倍数下观察各组样本并摄片，同时对材料表面的元素构成比例进行分析。
SEM结果显示，未经修饰的PCL材料表面比较粗糙(图2a,c)，存在很多凹痕。经20％浓度的Pluronic F-127修饰处理后，支架的孔隙之间覆盖有一层较薄的凝胶物质(图2b)，高倍镜下可见材料较之前变得光整、致密，原先的凹痕基本消失(图2d)。对凝胶组织进一步放大观察可以看到凝胶的超微结构，其排列方向有序(图2e)。
EDS结果显示，修饰后C的峰值下降。修饰前PCL表面的C与O质量比为(54.72±0.92)：(45.28±0.92)(图3a)，而经Pluronic F-127修饰后C与O质量比为(50.50±0.46)：(49.50±0.46)(图3b)，统计修饰前后C与O质量比有统计学差异(P<0.05)。这一结果与两个材料的化学式结果也吻合：PCL的分子式为(C6H10O2)n，而Pluronic F-127的分子式为HO·(C2H4O)m·(C3H6O)n·H，从分子式同样可以看出，PCL材料的C元素质量比Pluronic F-127更大。以上结果充分表明了，本实验设计的修饰方案是切实有效的。
2、定性观察及定量评估细胞贴附状态
评价3D打印气管材料的修饰效果实验中分3组，其中，A1组为新鲜原生气管组、B1组为未经修饰3D打印材料组、C1组为经Pluronic F-127修饰的材料组。
收获培养48h后细胞-材料的样本，SEM镜下可见在三组材料上接种BMSCs48h后，细胞贴附生长状态良好，底层多呈长梭形，上层呈串珠样改变，局部呈簇状分布。原生气管组表面干细胞成鹅卵石样排布(图4a)，而3D打印材料的孔隙被干细胞覆盖(图4c,e)。高倍镜下可见各组干细胞形态饱满，伸出伪足。这一现象表明细胞在支架表面迁徙状态十分良好(图4b,d,f)。
CCK-8评估：无菌操作下吸出孔内材料周围的培养基。在避光条件下，在各组待测样本的支架表面缓慢滴加100μL CCK-8工作液(避光条件下1/10比例稀释)，然后继续置于培养箱中反应2h；取出50μL上清液于新的96孔板中，在酶标仪450nm波长下测量OD值，定量评估每种组织上细胞的增殖和贴附情况。分析三组OD值，结果如图16所示：1-5d内细胞持续增殖，5d时的细胞数约为1d时的4倍多；由于细胞间接触抑制等原因，7d时数量有所下降。从图16结果得出，经修饰后的PCL材料组有利于BMSCs的贴附与增殖(P<0.05)。这一结果可能与高倍电镜下看到凝胶的疏松结构有关(图2f)。
3、材料周围干细胞接触毒性检测
将三组支架材料在无菌操作下修剪成大小为0.5cm×0.5cm的片状结构，然后贴于24孔板底的一侧(紧挨孔壁)，材料的外侧壁朝上；吸走材料周围残留的PBS，无菌环境中静置干燥2h，向组织片周围缓慢滴加含10％FBS的DMEM/F12培养基，直至刚好覆盖组织片(滴加过程中避免组织片漂浮)。将孔板移至细胞培养箱，于37℃、5％CO2饱和湿度孵育24h后，吸去培养基。取生长状态良好的第4代BMSCs，达80％融合时消化计数，然后将含有1×104个细胞的细胞悬液接种至组织片周围，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱。培养48h后取出，吸出残余培养基，用Giemsa染液对材料周围的贴壁细胞进行染色，其胞核呈现蓝紫或紫红色，胞质呈现粉红色。同时，本研究针对活细胞进行了荧光染色，可以将正常细胞的核进行染色。其原理为：荧光染料可穿过细胞膜，与细胞核相结合，在荧光激发(510nm波长)下，可以使细胞核发出绿色荧光。
经Giemsa染色后可明显见正常贴壁生长的细胞呈成长梭形，其细胞核被染成紫红或蓝紫色，细胞质成淡蓝色。图中可见A1组的组织周围的BMSCs生长良好(图5a)，荧光下可见明显的簇状集落(图5d)。虽然B1组(图5b)中可见少量圆形或不规则形态的细胞(多为悬浮状态或活力较差)，C1组的干细胞分布较A1组稍稀疏(图5c)。但荧光染色下，两组形态同样条索状排布、细胞核显色清晰(图5e,f)。
4、兔气管局部窗形缺损修补模型构建
4.1手术过程
本节实验中分3组：A2组是自体原生气管修复组、B2组是经Pluronic F-127修饰后的补片支架组、C2组为经Pluronic F-127修饰后补片+接种有干细胞(200μL细胞培养基内含有2×105个细胞)以及含有生长因子TGF-β1的水凝胶载体组。
选取成年(3-4月龄)新西兰兔作为移植对象。用盐酸赛拉嗪(即陆眠宁)注射液按0.15mL/kg肌内注射，麻醉维持直到完成皮肤缝合结束。体位为仰卧位，经碘伏消毒3遍，75％医用乙醇脱碘1遍，铺无菌手术单(3层)。采取颈部前正中切口，游离筋膜和颈部肌肉的间隙，逐层解剖气管周围组织，尽量保留筋膜。从第1软骨环的远端2cm处“开窗”(1cm*0.5cm)。吻合时第1针在对侧开始，采取连续缝合的方式(以减少线结)，待会合后打结于管腔外侧。C2组在缝合后，将富有BMSCs(300ul内含1.5×105个)和终浓度200ng/mL的TGF-β1水凝胶载体置于支架外表面。将术中牵引的气管周围筋膜和肌群恢复原位，将其与吻合口四周缝合，最后采用间断缝合的方式关闭筋膜组织和皮肤切口。
术中用缝线悬吊法，将颈前筋膜和肌肉群保留。A2组系开窗(图6a)切除后立即缝合。B2组由于补片为多孔结构，需要将周围的筋膜和肌肉于吻合口处固定，否则会反复漏气，进而气道及切口处感染(图6b,c)。C2组在覆盖Pluronic F-127水凝胶后(图6d)，需要在吻合口四周进行固定，同时术后取出组织时需要连同附近的组织一起取出，以免表面所种细胞的流失。术后第1周内为预防感染，每天予肌注青霉素(50000U/kg)。术后所有移植组均未使用任何免疫抑制剂治疗。
4.2术后生存情况分析及标本收获
观察各组动物术后的一般生命体征、活动状况，有无喘憋、口唇发绀、鼻翼煽动等症状，记录体重等指标，予以及时的气道管理及术后营养、抗感染等支持治疗。术后30d安乐死动物后收获标本，记录相关指标情况汇总于图17。
A2组系同种异体移植，因排斥反应，术后一般情况较差，于术后3d左右即出现喘憋、口唇发绀等症状，则予以及时安乐死。B2、C2组术后一般情况均良好，在30d时可按时收获(图7a)。同时，本实施例延长了C2组的观察时间点(术后90d，图7b)，以期评估其远期生存情况。
4.3纤支镜观察及镜下常规染色分析
术后30d同样行盐酸赛拉嗪按0.15mL/kg肌内注射，麻醉动物后行纤支镜检查，观察气道内及修补处的情况并拍照。随后耳缘静脉空气栓塞处死动物，获取移植的补片材料(注意保留周围组织)，随后用PBS液反复冲洗。将各组收获的样本组织置于常温下的10％福尔马林(PH＝7.4)浸泡24h固定，接着从低到高浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明制成蜡块(切片4μm)。染色过程简述如下：二甲苯脱蜡2遍，每次10min。然后从高浓度往低梯度乙醇水化(每次8min)，蒸馏水1min，苏木素染液8min。在流水中缓慢冲洗约5min，伊红染液复染1-3min(根据实际染色情况)，继续梯度乙醇脱水、二甲苯2遍透明后封片。镜下观察气管修补处结构的完整性情况，上皮的爬行覆盖，以及是否有炎症细胞等浸润。
三组动物在术后观察点收获标本前，先行支气管纤维镜观察，与原生气管相比(图8a)，30d时补片修复处管腔通畅，未见狭窄，仅局部少量黏液附着，黏膜颜色发白，可能与血运建立未完全有关(图8b)。90d时修补处无气道分泌物附着，黏膜颜色正常，管腔在呼气相时稍有狭窄(图8c)，考虑局部有瘢痕增生引起，但实验动物的一般情况(体重、呼吸频次、心率等指标)均正常。术后30d时收获组织的HE染色，可以观察到于修复处即是位于两段软骨环之间的空白处。B2组修补处有连续的上皮层覆盖(图9a-c：白色箭头所示)。C2组的软骨基质外侧可以见到细胞条带考虑为Pluronic F-127内包裹的干细胞(图9d：箭头所示)。图中可见淡蓝色显影的为缝线。
4.4 IHC染色观察上皮及干细胞分化情况
为了评估补片处上皮细胞的爬行以及种植干细胞的分化情况，用细胞角蛋白Cytokeratin-18(CK-18)和II型胶原抗体的IHC染色，其中一抗(CK-18和II型胶原，稀释比例为1：200)。结果观察到，在修补处有连续的CK-18棕黄色抗原显色覆盖(图10白色箭头所指)。在软骨环的外侧区域，有细胞团块存在(图11a)，术中种植在补片外表面的干细胞。在高倍镜下可见II型胶原表达在干细胞的细胞质(图11b，箭头所指)。
4.5远期疗效评价
为了检测补片材料的远期效果，C2组中有部分实验对象周期观察超过90d。本实施例在第90d时取出标本进行常规HE染色和CK-18的IHC染色分析。镜下可以看到在两个软骨环之间(即修补处)，较30d时相比，有新生腺体组织及血管生成(图12a，b)；CK-18染色同样观察到，管腔内表面有连续的上皮细胞覆盖(图12c)。
5、兔气管节段缺损模型构建
5.1手术过程
本节实验中分为4组：A3组是改良DEM法制备的脱细胞气管组、B3组是在A3组基础上进行1％浓度京尼平37℃交联处理1h后所制备、C3组为经Pluronic F-127修饰后的3D打印支架组、D3组是在B3组基础上，在基质的软骨部缝合上3D打印C型支架，实验涉及气管缝合所用的线是4-0Proline。
同样选取成年新西兰兔作为移植对象。B3和D3组所需使用的京尼平交联处理，参见本团队既往已发表的论文[Sun F,Jiang Y,Xu Y,et al.Genipin cross-linkeddecellularized tracheal tubular matrix for tracheal tissue engineeringapplications[J].Sci Rep.2016,15,6:24429.]，简述如下：在37℃温度下，脱细胞气管基质浸泡在含1％京尼平浓度的PBS溶液交联反应1h。D3组是在术前将3D打印支架缝合至交联后的脱细胞基质(如图1d所示)。
麻醉和气管解剖操作过程同4.1。从气管第1软骨环的远端2cm处切断并用丝线悬吊固定，切除长度共约2cm的气管，注意保护远端气管以防有渗血流入引起术后肺不张及感染。吻合时从后壁向前，第一针从气管膜部与软骨交接处由外向内进针，气管膜部采用连续减张缝合的方式避免撕裂。软骨部同样也是连续缝合，根据口径大小调整进针间距。线结同样留在管腔外侧。各组吻合后的情况如图13所示，后续管理同4.1。
5.2术后生存情况分析及标本收获
同4.2过程。需要注意的是术后A3、B3、C3组由于并发症，无法存活到30d因此需在出现喘憋、口唇发绀等症状，因此予以及时安乐死并收获标本。
A3、B3、C3组由于术后并发症，未能存活至术后30d观察点，因此密切注意其一般情况并干预，记录于图18。将术后各组样本收获后拍照(图14a,b,c)，图14a从左往右可以直观的看到A3、B3、C3、D3组管腔的面积依次增大。其中A3组管腔塌陷严重，B3组次之，C3组由于是多孔结构，术后急性期即出现了并发症。
5.3镜下常规染色分析
对收获的组织进行HE染色观察，镜下可以看到A3组的管腔内侧面有大量炎细胞浸润，同时有很多黄色的坏死组织(图14d)。B3组的内侧炎细胞较A3组少，但这两组由于管腔的力学结构不稳定，因而术后无法满足移植对象的气道功能替代(图14e)。C3组同样是由于PCL的酯溶性，在制蜡过程中溶解，无法行染色观察。D3组的管腔结构完整，内侧可见有上皮细胞爬行；软骨环的外侧可见条索状纤维覆盖(图14f)。
5.4纤支镜观察及IHC染色观察上皮爬行情况
D3组在术后30d时管腔通畅，未见狭窄，局部少量黏液附着，但是移植处黏膜发白，考虑与血运建立未完全有关(图15a)，因此本实施例中继续延长了观察点，在术后2月时收获D3组组织前观察到管腔内径较前缩小，气道无明显分泌物附着，黏膜颜色仍然少许苍白，管腔在呼气相时狭窄明显(图15b)，考虑局部有瘢痕增生引起；但实验动物的体重无明显增加，呼吸时会不时出现喘息，但总体一般情况尚可。因此今后的研究需在内表面种植有上皮则更有利于其远期存活。术后30d时，对D3组样本进行CK-18染色，可以观察到在管腔内侧面有连续的上皮细胞覆盖(图15c&d)。
结论：本实施例制备的经修饰的3D打印C形补片支架可用于兔气管的局部缺损修补模型，纤支镜及显微镜下均可观察到术后30d修补处有上皮细胞爬行附着；结合负载有生长因子的Pluronic F-127水凝胶载体，在体内天然生物反应器内会使种植的BMSCs诱导分化。同时，杂化型移植物可以进行节段气管替代模型构建，术后30d时，可观察到移植处有上皮细胞爬行附着，远期疗效较使用单一支架材料好。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (5)

1.3D打印气管C形支架与杂化型支架的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）3D打印气管C形支架的制备
选用PCL为材料，打印机的喷头位于旋转轴的正上方，打印喷嘴始终沿着旋转轴方向水平往返移动，先在旋转轴上打印出底层气管支架，然后旋转轴与打印底层时的旋转方向相反进行运动，打印成形第二层气管支架，继而与上一层形成多孔结构，以此重复打印6层，旋转轴滚动的角度为180°时形成C形支架；
表面修饰：将C形支架置于20 % Pluronic F-127溶液中浸泡，4℃过夜后第2 d取出，室温20℃放置5 d后经与PCL的酯基进行聚合缩合的脱水反应，得PCL修饰材料；
（2）杂化型支架的制备
将新西兰兔经耳缘静脉注射空气法处死，无菌原则操作下分离获取气管，将原生气管在4℃蒸馏水中渗透溶解48 h，依次进行两次脱细胞循环过程，接着进行京尼平交联处理，术前将经过表面修饰的3D打印C形支架缝合至交联后的脱细胞基质上形成杂化型支架；
步骤1中3D打印时旋转轴滚动的速度为5 mm/s，形成的支架孔径为200 μm。
2.如权利要求1所述的3D打印气管C形支架与杂化型支架的制备方法，其特征在于，步骤2中的脱细胞循环过程的具体操作为：4%脱氧胆酸钠溶液浸泡，置于20℃摇床孵育4 h；用磷酸盐缓冲液冲洗2遍，然后置于含有50 kU/mL DnaseI的1 mol/L NaCl中，连续晃动3 h，以溶解细胞核并降解DNA，最后用PBS冲洗2遍。
3.如权利要求1所述的3D打印气管C形支架与杂化型支架的制备方法，其特征在于，步骤2中的京尼平交联处理步骤为：在37℃温度下，脱细胞气管基质浸泡在含1%京尼平浓度的PBS溶液中交联反应1 h。
4.如权利要求1所述的3D打印气管C形支架与杂化型支架的制备方法，其特征在于，所述步骤1中打印温度为85-95℃。
5.如权利要求1所述的3D打印气管C形支架与杂化型支架的制备方法，其特征在于，所述步骤1中打印成型的气管C形支架的层厚为0.08-0.12 mm。
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