CN101444645A

CN101444645A - 一种构建粘膜移植物的方法

Info

Publication number: CN101444645A
Application number: CNA2007101711195A
Authority: CN
Inventors: 卢慕峻; 周广东; 王�忠; 曹谊林; 刘伟; 张文杰; 俞斌
Original assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2007-11-28
Filing date: 2007-11-28
Publication date: 2009-06-03

Abstract

本发明公开了了一种口腔粘膜上皮细胞的用途，所述的用途包括：(1)用于制备器官移植中的移植物；或(2)作为种子细胞制备粘膜移植物。本发明还公开了一种移植物的用途，所述的移植物可用于制备修复粘膜缺损的器官移植物。

Description

一种构建粘膜移植物的方法

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及利用口腔粘膜上皮细胞(OKC)构建组织工程化粘膜及其制备方法和用途。

背景技术

膀胱(urinary bladder)疾病临床上很常见，包括膀胱肿瘤、炎症、结核、先天性畸形、神经源性膀胱、医源性损伤等多种病因，会造成膀胱功能障碍或在治疗后产生大面积膀胱缺损。目前临床上常用胃肠道进行全膀胱术后的替代或膀胱扩大术，各种术式的不断改良也使胃肠道成为至今为止临床膀胱替代的首选，但是这种传统的外科修复方式存在“拆东墙补西墙”的缺陷，而且无法避免术后肠粘连、肠梗阻、肠道粘膜吸收引起的电解质紊乱、代膀胱内结石或肿瘤形成等并发症。

从20世纪90年代初开始，国外开始尝试应用组织工程(tissueengineering)方法进行膀胱再生的研究。组织工程技术由于只从体内获取数量较少的种子细胞，经体外培养和大量扩增后，回植修复体内组织和器官的缺损，解决了传统外科修复“拆东墙补西墙”的缺陷，创伤明显较小，是膀胱缺损临床修复的新方向。

但象大多数组织工程器官修复一样，膀胱构建及修复所利用的种子细胞主要来源于自体原位膀胱，包括膀胱平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)和尿路上皮细胞(urothelium，urothelial cell，UC)。在造成临床膀胱缺损最常见的疾病——膀胱癌中，90％以上为尿路上皮肿瘤(urothelialcancers)，或称为移行细胞癌(transitional cell carcinomas)。其肿瘤细胞来源于不同时间和不同部位的膀胱尿路上皮细胞。尿路上皮细胞是一种特殊类型的上皮细胞，以前曾被称为移行上皮细胞。UC分布于整个泌尿集合系统的内腔面，包括肾盂、输尿管、膀胱和后尿道。由于膀胱肿瘤的“多克隆”发病机制，即使膀胱内外观正常的UC也无法作为安全的种子细胞被利用。也就是说，在修复最常见的膀胱肿瘤所造成的缺损时，由于尿路上皮细胞癌“多中心起源”的特点及肿瘤细胞对周围组织的浸润，使得自体膀胱原位获得种子细胞的安全性无法得到保证。同样神经源性膀胱的SMC由于收缩性的异常以及间质性膀胱炎的自体细胞，都不适合作为膀胱组织工程修复的种子细胞来源。同时由于泌尿系肿瘤多器官发病的特点，肾盂、输尿管和尿道粘膜上皮也不是一种良好的选择。

近年来国外已开始利用干细胞(stem cell)作为替代的种子细胞实验尝试修复膀胱壁缺损。包括利用应用人类胚体来源的生殖嵴干细胞(humanembryonic germ cell-derived stem cells)修复大鼠的膀胱部分缺损，利用骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSC)进行大鼠、兔和犬动物模型膀胱缺损的修复重建。然而这些干细胞主要都应用于膀胱平滑肌细胞的替代，未见针对尿路上皮细胞缺损的修复，而且干细胞的获得受到来源有限等多方面的限制。

因此本领域迫切需要提供一种新的适合组织工程膀胱修复的种子细胞。

发明内容

本发明旨在提供一种口腔粘膜上皮细胞的用途。

本发明的另一个目的是提供一种移植物的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种口腔粘膜上皮细胞的用途，所述的用途包括：(1)用于制备器官移植中的移植物；或(2)作为种子细胞制备粘膜移植物。

在另一优选例中，所述的用途是用于制备同种同体、同种异体或异种异体间的粘膜移植物。

在另一优选例中，所述的口腔粘膜上皮细胞在膀胱内环境中具有向尿路上皮细胞表型转化的能力。

在另一优选例中，所述的粘膜包括膀胱粘膜、尿道粘膜、输尿管粘膜、和/或肾盂粘膜；优选膀胱粘膜。

在本发明的第二方面，提供了一种移植物的用途，所述的移植物用于制备可修复具有粘膜缺损的器官的组织工程化器官。

在另一优选例中，所述的器官包括膀胱、尿道、输尿管、和/或肾盂。

本发明提供的移植物含有：

(a)口腔粘膜上皮细胞(Oral keratinocytes，OKC)和

(b)医学上可接受的生物可降解材料。

在另一优选例中，所述的生物可降解材料为片状，并且1cm²医学上可接受的生物可降解材料上有10⁴—10⁸个细胞；优选10⁴—10⁶个细胞。

在另一优选例中，所述的医学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、PLGA、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、透明质酸、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、脱细胞基质，及其共聚物或混合物。

在另一优选例中，所述的医学上可接受的生物可降解材料是膀胱脱细胞基质(Bladder acellular matrix graft，BAMG)。

据此，本发明提供了一种新的适合组织工程膀胱修复的种子细胞及移植物。

附图说明

图1显示了OKC细胞的连续传代情况(40倍放大)；其中

A表示P0细胞培养的第8天，OKC细胞呈“克隆样”生长的情况；

B表示P1代细胞培养的第3天的情况；

C表示P2代细胞培养的第5天的情况；

D表示P3代细胞培养的第7天，OKC细胞达90％融合的情况；

E表示P4代细胞培养的第4天的情况；

F表示P5代细胞培养的第4天，消化去除滋养层3T3细胞的情况。

图2显示了口腔粘膜上皮细胞的鉴定情况；其中

A表示免疫荧光CK14阳性(X100)；B表示CK14阳性(X200)；

C表示免疫组化CK阳性(X100)；D表示CK阳性(X200)。

图3显示了P2代OKC行BrdU标记后免疫组化检测的情况；其中

A表示放大100倍；B表示放大400倍(阳性结果表现为细胞核棕色)。

图4显示了OKC与BAMG复合体外构建5天的情况；其中

A表示放大100倍；B表示放大200倍；C表示放大100倍；D表示放大200倍。

图5显示了OKC+BAMG修复膀胱粘膜缺损的情况；其中

A表示回植前OKC+BAMG的情况(HE，X200)；B表示回植前OKC+BAMG的情况(大体观)；C表示手术回植OKC+BAMG的情况；D表示术后3月取材的情况(大体观)。

图6显示了OKC+BAMG及单纯BAMG修复膀胱粘膜缺损(HE染色)的对比情况；其中

A表示单纯使用BAMG1个月时的情况；B表示单纯使用BAMG3个月时的情况；C表示使用BAMG+OKC1个月时的情况；D表示使用BAMG+OKC3个月时的情况。

图7显示了植入膀胱的OKC细胞表型转归的情况(连续切片)；其中

A表示植入1个月的情况(X200)(BrdU染色阳性)；B表示植入1个月的情况(X200)(UPII染色阳性)；C表示植入3个月的情况(X100)(BrdU染色阳性)；D表示植入3个月的情况(X100)(UPII染色阳性)。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现口腔粘膜瓣具有较薄的粘膜下层和基底血液供应良好的特点，更容易早期血管化；同时较厚的上皮层也增强了植入口腔粘膜瓣的稳定性，使其适合于移植修复尿路上皮层缺损；另外，发明人还首次发现，OKC在膀胱内环境中可以向尿路上皮细胞表型转化。因此，利用这些特性，发明人将口腔粘膜上皮或称口腔角质上皮细胞(oral keratinocytes，OKC)作为种子细胞修复膀胱粘膜层缺损，完成了本发明。

如本文所用，“口腔粘膜上皮细胞(oral keratinocytes，OKC)”或“口腔角质上皮细胞(oral keratinocytes，OKC)”可互换使用。

如本文所用，膀胱脱细胞基质(bladder acellular matrix grafts，BAMG)为支架材料。

术语“接种”指将细胞均匀分布于支架材料上的过程。可以使用本领域常规的方法，包括但不限于，将混匀的细胞悬液滴加在支架材料上，或将混匀的细胞悬液涂布在支架材料上。

术语“自体移植”指将所需生物活体材料(如OKC)从某个体中取出并再施用于同一个体的过程。

OKC

本发明将OKC作为修复膀胱粘膜缺损的种子细胞，其中优选来自自体的OKC。

可以利用本领域公认的方法分离获得OKC，一种优选的方法是采用dispase酶消化口腔上皮组织，用机械法分离出上皮层，再经过胰酶的消化处理为单细胞。

OKC细胞培养可以采用3T3细胞作为滋养层或不用滋养层直接接种在培养皿上。两种体系分别采用不同的培养液。

采用3T3细胞作为滋养层时，以FAD为培养液，即DMEM培养液和F12培养液3：1混合，还包含表皮生长因子，腺嘌呤，氢化可的松，胰岛素等成分；或采用DMEM和KSFM以1：1—1：3混合，并含有0-10％血清。

不用滋养层时，采用单纯的KSFM培养液，不含血清。

本发明的一个优选的获得OKC的方法包括步骤：

a.用dispase酶消化口腔上皮组织，机械法分离上皮和皮下组织；

b.将口腔粘膜上皮剪碎后用胰酶消化，过滤后离心获得单细胞悬液；

c.用3T3细胞作为滋养层细胞，FAD或DMEM—KSFM混合液作为培养液，体外培养和扩增OKC。

d.或不用滋养层细胞，单纯KSFM作为培养液，体外培养和扩增OKC。

在另一优选例中，步骤(a)前还包括步骤：去除口腔粘膜皮下脂肪，将组织块剪成0.5×0.5cm²大小，粘膜面朝下置于培养皿中，dispase酶浸没口腔粘膜组织块。

在另一优选例中，步骤(a)中所用dispase酶浓度为2.4u/ml Dispase酶原液以1：1—1：5稀释。

在另一优选例中，步骤(a)中dispase酶消化时间为4℃过夜或37℃1—2h。

在另一优选例中，步骤(b)中所述的胰酶浓度选自0.01-5(w/v)％，优选0.1-0.3％，更优选0.25％；消化时间为1—60分钟，优选4-8分钟，更优选5分钟。

在另一优选例中，步骤(b)过滤网孔为25-100μm。

在另一优选例中，步骤(c)中贴壁培养时间为1-72小时。

在另一优选例中，步骤(c)中的FAD培养液为DMEM培养液和F12培养液3：1混合，还包含表皮生长因子，腺嘌呤，氢化可的松，胰岛素等成分。

在另一优选例中，步骤(c)中的培养液DMEM和KSFM以1：1—1：3混合。

在另一优选例中，步骤(c)中含血清0-10％。

在另一优选例中，步骤(d)中的培养液为单纯KSFM，且不含血清。

在另一优选例中，将获得的OKC体外连续培养超过6—8代。

医学上可接受的生物可降解材料

可用于本发明的组织工程化粘膜的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)：

(a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、PLGA、聚羟基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明质酸、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；

(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐以及各种脱细胞基质等；

(c)上述材料的共聚物或复合型材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。

优选的医学上可接受的生物可降解材料是各种脱细胞基质，更优选的是膀胱脱细胞基质。所述的膀胱脱细胞基质可以是同种异体或异种的。

移植物

本发明中OKC-生物可降解材料复合物的细胞接种浓度通常约为5×10⁴—5×10⁸/cm²，优选5×10⁴—5×10⁶/cm²，更优选接种密度为10⁶/cm²。首次接种时间为0.5—6小时，优选4小时。

在本发明的一个优选例中，将OKC接种在脱细胞的膀胱粘膜下组织材料(BAMG)上，并进行细胞—材料复合物体外评价。包括以下步骤：

a.OKC细胞进行细胞标记，包括BrdU和荧光标记；

b.取P2-3代的口腔粘膜上皮细胞，PBS清洗后以0.25％胰酶消化至细胞收缩变园，以含10％胎牛血清的DMEM中止，细胞悬液以1500rpm离心5分钟，弃去上清，重新加入500微升FAD培养液；

c.将细胞悬液充分混匀，以10⁶/cm²密度接种在吸干培养液的BAMG粘膜面上，4小时后添加FAD培养液，后每1—2天更换培养液；

d.体外构建细胞—材料复合物的评价。

细胞—材料复合物经体外培养2—14天(优选为5天)得到本发明提供的可修复粘膜缺损的移植物。可以将所得到的移植物用本领域常规的方法进行回植来修复缺损粘膜。

可以将本发明获得的移植物修复膀胱粘膜、尿道粘膜、输尿管粘膜、和/或肾盂粘膜；其中优选修复膀胱粘膜。

在本发明的一个优选例中，将OKC-BAMG复合物修复膀胱粘膜缺损，并用HE和免疫组化染色，包括采用BrdU、uroplakin II、CK14等抗体研究OKC植入体内后的细胞表型改变：

a.将OKC-BAMG复合物体外培养2—14天后，回植修复膀胱粘膜缺损；

b.将OKC-BAMG复合物取材后连续切片；

c.进行HE和免疫组化染色，包括采用BrdU、uroplakin II、CK14等抗体。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、将口腔粘膜上皮细胞用作构建组织工程化膀胱粘膜上皮层的种子细胞，安全性高、来源充分；

2、口腔粘膜上皮细胞作为种子细胞可广泛用于包括膀胱、尿道、输尿管、肾盂等部位的移植；

3、口腔粘膜上皮细胞在膀胱内环境中具有向尿路上皮细胞表型转化的能力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

口腔粘膜角质上皮细胞(OKC)的分离和体外培养

1.3T3饲养层细胞的制备

采用NIH3T3细胞(购自中科院细胞生物所)作为滋养层细胞。

取冻存的3T3细胞，37℃快速复温。在DMEM液中混匀清洗，1500转/分钟离心5分钟，取细胞沉淀重复一次。计数后以含10％胎牛血清的DMEM培养液接种于10cm直径的培养皿内。3T3细胞达到70％融合时，PBS清洗3次后，以10ug/ml的丝裂霉素C处理细胞4小时。PBS清洗中止处理，加入0.25％胰酶-0.02％EDTA消化成单细胞悬液。

离心后计数，以0.5×10⁶/ml的密度接种于10cm直径的培养皿内，加入FAD条件培养液，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜备用。

2.口腔粘膜角质上皮细胞的分离和原代获取

切取成年长枫杂交猪(购自上海南汇养殖场)口腔颊粘膜瓣约2×2cm²大小，尽量切除皮下组织。

PBS漂洗干净血迹，置入含10％胎牛血清的DMEM中。

以PBS和氯霉素反复清洗，将口腔颊粘膜瓣剪成1×0.5cm²大小，真皮面朝下铺在培养皿内，以2.4u/ml Dispase(1:1稀释)，4℃冷消化16小时。

PBS洗去dispase溶液，以手术器械分离撕下口腔粘膜表皮层。

以眼科剪刀将表皮层剪碎，以0.125％胰酶37℃震荡消化10—15分钟，并用含10％胎牛血清的DMEM中止消化。

细胞悬液以100目金属滤网过滤，1500rpm离心5分钟，弃去上清。

FAD培养液重悬细胞，计数后以4×10⁵/ml的密度接种在生长抑制后的3T3饲养层细胞上。

3.口腔粘膜角质上皮细胞的体外培养和扩增

口腔粘膜角质上皮细胞接种后7—10天首次换液，然后每2—3天更换FAD液一次。

观察OKC细胞生长到多个克隆汇合，3T3细胞被推向细胞的边缘，OKC细胞约达到80—90％融合时，进行细胞传代。

洗尽培养皿内培养液，PBS清洗一次后，加入1:5稀释的中性蛋白酶2.5ml，37℃下作用10分钟，使饲养层细胞先脱落培养皿底。然后加入0.25％胰酶-0.02％EDTA消化OKC细胞约2分钟，观察细胞回缩变圆，含血清条件培养液中止反应。

轻轻吹打后吸取细胞悬液于离心管中，1500转/分钟离心5分钟，弃去上清，加入条件培养液，以1:3比例传代，接种于新培养皿中。

OKC细胞贴壁后更换FAD培养液，观察细胞生长增殖情况。相同方法OKC细胞连续传代至P4—P5代。

4.结果

见图1。

结果表明，原代口腔粘膜角质上皮细胞约5—7天后贴附于3T3滋养层上，细胞呈典型“克隆样”生长。随着OKC细胞的不断分裂和增殖，细胞逐渐由内向外扩展，并把作为滋养层细胞的3T3细胞向周围挤压。

原代培养的OKC细胞生长良好，克隆团相互联汇，至OKC原代细胞获取后12—14天达到80—90％融合。传代后3—4天细胞达80—90％融合，并可以再次传代。细胞在3T3滋养层上扩增5—6代生长良好，未见明显细胞衰老迹象。

实施例2

口腔粘膜角质上皮细胞的鉴定

1.0KC细胞免疫荧光检测

将实施例1中培养的p2代口腔粘膜上皮细胞接种于放置灭菌盖玻片的培养皿中，检测时细胞爬片从培养皿中取出行细胞免疫荧光检测。具体过程如下：

细胞爬片PBS漂洗，2分钟×5次；

4％多聚甲醛固定10—15分钟，PBS漂洗2分钟×5次；

滴加0.25％TritonX-100，5％DMSO-PBS室温10分钟；

PBS漂洗5分钟×3次；

滴加10％羊血清，置于湿盒内37℃30分钟；

吸去羊血清后擦干；

滴加鼠抗人单克隆抗体细胞角蛋白14(cytokeratin14，Abcam)，工作浓度为1:100，置湿盒内4℃过夜；

人成纤维细胞作为阴性对照，空白对照仅滴加PBS液；

第二天PBS振洗3分钟×3次；

滴加二抗为羊抗鼠IgG罗达明(Rodamine，Santa cruz)，置于湿盒内37℃30分钟；

PBS漂洗3分钟×3次后，以Hoechst 33258(Santa cruz)衬染细胞核。

直接在荧光显微镜下观察OKC细胞并拍照。

2.OKC细胞免疫组织化学检测

将实施例1中培养的P2代OKC消化成单细胞悬液，接种在清洁消毒的盖玻片上。至细胞达60％—70％融合时以4％多聚甲醛固定细胞10分钟。PBS漂洗5分钟×3次后，以0.25％TritonX-100(含5％DMSO-PBS)室温下细胞膜通透处理10分钟。

PBS漂洗后滴加3％H₂O₂置于湿盒内37℃下孵育15分钟，去除内源性过氧化物酶。

PBS漂洗后以羊血清37℃封闭内源性非特异抗原30分钟。

弃去羊血清后滴加一抗鼠抗人潘角蛋白抗体(pan cytokeratin，Sigma)(1：100)并4℃过夜。

第二天PBS漂洗后加入二抗羊抗小鼠链霉卵白素—辣根过氧化物酶IgG(Streptoavidin-HRP IgG，Santa Cruz)工作液37℃下孵育45分钟，PBS漂洗后以1：50浓度的二氨基联苯胺(DAB，华美生物工程公司)显色。

光学显微镜下观察并拍照。正常皮肤表皮组织作为阳性对照，猪软骨作为阴性对照，未加一抗的作为空白对照。

3.结果

见图2。P2代的口腔粘膜角质上皮细胞Pan cytokeratin(CK)和cytokeratin 14(CK14)都表达阳性，而少量混杂的3T3细胞为阴性表达。

结果表明，通过酶消化法可以获得纯度较高的OKC细胞，经过体外培养2—3代OKC细胞表型维持正常。

实施例3

口腔粘膜角质上皮细胞的BrdU标记及鉴定

1.口腔粘膜角质上皮细胞的BrdU标记

取实施例1得到的接近50％融合的P2代OKC细胞，培养液中加入1：10005-溴2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo 2-deoxyuridine，BrdU，Sigma)液，在37℃、5％CO2培养箱中放置48小时，至OKC细胞达80—90％细胞融合。

弃去含BrdU的培养液，PBS反复冲洗，加入0.25胰酶-0.02％EDTA消化成单细胞悬液。

接种于干净消毒后的玻璃爬片上进行鉴定。

2.细胞免疫组织化学鉴定(BrdU)

细胞爬片用4％多聚甲醛固定10分钟，PBS漂洗3次。

滴加0.25％TritonX-100，5％DMSO-PBS室温10分钟；PBS漂洗5分钟×3次；滴加0.75/1.5％-PBS H₂O₂37℃15分钟；PBS漂洗3分钟×2次；滴加2M的HCL37℃孵育60分钟；PBS漂洗3分钟×3次；滴加10％羊血清，置于湿盒内37℃30分钟；吸去羊血清并擦干；滴加一抗为鼠抗Brdu抗体(Sigma)(1:100)，置湿盒内4℃过夜。

第二天PBS漂洗5分钟×3次，滴加二抗生物素化羊抗鼠IgG(Santa cruz)；PBS漂洗3分钟×3次；DAB(1:50)显色10分钟；流水冲洗5分钟，细胞核衬染，苏木素染色2分钟，自来水洗，迅速过盐酸酒精分化；自来水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

3.结果

见图3。P2代OKC经过48小时BrdU标记后，约60—70％BrdU表达阳性，表现为细胞核染色为棕色

结果表明，BrdU适合作为OKC的细胞示踪标记。

实施例4

组织工程化口腔粘膜上皮结构的体外构建

1.脱细胞支架材料制备

膀胱脱细胞基质移植物(BAMG)的制备：

取成年猪的膀胱组织全层(购自上海南汇养殖场)，PBS液中漂洗去血迹，将其剪成需要的合适大小。

用玻璃片刮去膀胱粘膜面的尿路上皮层，再用解剖剪去处膀胱浆膜层和绝大部分肌层组织，仅保留膀胱粘膜下层组织。注意保持膀胱粘膜下层的完整性。

再次以PBS漂洗后，加入0.5％SDS振荡24小时，至材料转变为半透明状。再用0.2％Trixon-100和三蒸水4℃下反复振荡漂洗1周以完全去除支架内原有的细胞结构。

切取BAMG材料中央及周边各数块，常规行HE、Masson和免疫组化鉴定。

2.细胞—支架体外接种和培养

切取3×2cm²大小的BAMG，70％酒精浸泡过夜消毒。PBS反复冲洗后改用FAD培养液浸泡预培养过夜。

取实施例1中培养的P2-3代口腔粘膜上皮细胞，PBS清洗后以0.25％胰酶消化至细胞收缩变圆，以含10％胎牛血清的DMEM中止。

细胞悬液以1500rpm离心5分钟，弃去上清，重新加入500微升FAD培养液。

将细胞悬液充分混匀，以10⁶/cm²密度接种在吸干培养液的BAMG粘膜面上。

4小时后添加FAD培养液，然后每1—2天更换培养液。

3.细胞—材料复合物检测

HE检测：

切取以上体外培养2天、5天、8天、和14天的OKC—BAMG复合物1×1cm²大小，PBS漂洗干净后，在10％福尔马林中固定24小时，石蜡包埋。脱蜡后常规HE染色。

免疫组化检测：

取已包埋OKC和BAMG体外构建组织的蜡块连续切片，二甲苯及梯度酒精脱蜡至水；PBS漂洗3次，加3％过氧化氢，室温下孵育10分钟，PBS漂洗3次；0.1％胰蛋白酶37℃消化30分钟，PBS漂洗3次。

正常灭活羊血清37℃孵育30分钟后倾去液体，滴加鼠抗人Pancytokeratin(1:100)，置湿盒内4℃冰箱孵育过夜；弃去一抗后PBS漂洗3次，滴加ENVISION^TM二抗(DAKO)；PBS漂洗3次，1:50DAB显色。

切片显色完毕后苏木精衬染细胞核5分钟，盐酸酒精分化，水洗30分钟，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树酯封片。

4.结果

见图4。OKC接种BAMG材料后2天即可以看到细胞与材料紧密复合，接种后5天OKC细胞呈多层排列。接种后的OKC在BAMG支架上表达Pan cytokeratin阳性

结果表明，组织工程化的口腔粘膜上皮仍能维持正常细胞结构和表型。体外培养5天即能够达到细胞—材料复合物回植体内的需要。

实施例5

自体组织工程OKC修复膀胱粘膜层缺损

1.手术方法

取长枫杂交猪12头(购自上海南汇养殖场)，其中8头为实验组(缝合OKC+BAMG复合物)，4头为对照组(缝合单纯BAMG)。

取猪的下腹部正中切口，切开皮肤、皮下组织、腹直肌及肌鞘，打开腹腔暴露膀胱。

在膀胱前壁正中切开，放尽尿液。

以眼科剪切除3×3cm²大小的膀胱粘膜层。

局部止血后实验组和对照组分别植入实施例4中得到的组织工程化OKC粘膜支架复合物及单纯支架材料。

将组织工程OKC复合物覆盖于膀胱创面上，细胞面朝上，四个边角以3—0丝线固定标记后，以5—0可吸收缝线连续锁边缝合材料。

膀胱内留置F8号造瘘管，固定后以5—0可吸收缝线连续锁边缝合关闭膀胱。逐层关闭切口。

2.术后检测

手术后分别于1月和3月取材检测，行大体观察、HE和免疫组化染色。具体实验步骤同前。

3.结果

见图5。手术后1个月和3个月观察，结果发现12例膀胱容量基本正常，未见膀胱内新生物和结石形成。

实验组中组织工程OKC修复处局部粘膜较周围膀胱粘膜略苍白，对照组局部粘膜充血明显。

两组膀胱壁收缩和舒张性皆基本正常。

实施例6

组织工程OKC体内细胞表型的转归研究

HE染色：

对照组(实施例4中得到的单纯BAMG)植入术后1月仅见支架材料胶原成分，未见其上有明显细胞存在，粘膜下层有大量的炎性细胞浸润。术后3个月支架材料明显变薄，支架上仍未见明显细胞存在，粘膜下层炎性细胞浸润有所减少。

实验组(实施例4中得到的OKC+BAMG)术后1个月移植区域见上皮细胞多层排列，粘膜下层局部较多的炎性细胞浸润。术后3个月上皮细胞层次略增厚，膀胱粘膜形态良好，局部粘膜呈乳头状，已类似正常膀胱粘膜上皮层，粘膜下层炎性细胞浸润明显减少，粘膜下层见较多新生血管(见图6)。

BrdU染色：

术后1个月见膀胱粘膜层的上皮细胞核呈现棕黄色染色，大多数阳性细胞沿基底层分布，部分细胞位于粘膜上皮的中间层和顶层。

术后3个月可见BrdU染色阳性细胞主要位于粘膜上皮的中间层和顶层。提示植入OKC在膀胱内至少存活3个月(见图7)。

结构的管腔细胞膜蛋白II(uroplakin II)染色：

术后1个月BrdU染色阳性区域见uroplakin II在粘膜上皮顶端阳性表达，在连续切片上比较发现BrdU和uroplakin II染色阳性部分重叠。术后3个月在连续切片上，BrdU和uroplakin II染色阳性基本重叠(见图7)。

结果表明，植入膀胱内环境中的OKC部分出现向尿路上皮细胞表型转化。说明OKC可以作为尿路上皮细胞的替代种子细胞，并采用组织工程方法修复膀胱粘膜缺损。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种口腔粘膜上皮细胞的用途，其特征在于，所述的用途包括：(1)用于制备器官移植中的移植物；或(2)作为种子细胞制备粘膜移植物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的用途是用于制备同种同体、同种异体或异种异体间的粘膜移植物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的口腔粘膜上皮细胞在膀胱内环境中具有向尿路上皮细胞表型转化的能力。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的粘膜包括膀胱粘膜、尿道粘膜、输尿管粘膜、和/或肾盂粘膜；优选膀胱粘膜。

5.一种移植物的用途，其特征在于，所述的移植物用于制备可修复具有粘膜缺损的器官的组织工程化器官。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的器官包括膀胱、尿道、输尿管、和/或肾盂。

7.如权利要求1或5任一所述的用途，其特征在于，所述的移植物含有：

(a)口腔粘膜上皮细胞和

(b)医学上可接受的生物可降解材料。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的生物可降解材料为片状，并且1cm²医学上可接受的生物可降解材料上有10⁴—10⁸个细胞；优选10⁴—10⁶个细胞。

9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的医学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、PLGA、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、透明质酸、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、脱细胞基质，及其共聚物或混合物。

10.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的医学上可接受的生物可降解材料是膀胱脱细胞基质。