ES2362139A1 - Elaboración de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina, agarosa y colágeno. - Google Patents
Elaboración de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina, agarosa y colágeno. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2362139A1 ES2362139A1 ES200930943A ES200930943A ES2362139A1 ES 2362139 A1 ES2362139 A1 ES 2362139A1 ES 200930943 A ES200930943 A ES 200930943A ES 200930943 A ES200930943 A ES 200930943A ES 2362139 A1 ES2362139 A1 ES 2362139A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- tissue
- collagen
- artificial
- cells
- product resulting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
Abstract
Elaboración de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina, agarosa y colágeno.La presente invención se refiere a un método in vitro de preparación de un tejido artificial que comprende: (a) añadir una composición que comprende fibrinógeno a una muestra de células aisladas; (b) añadir un agente antifibrinolítico; (c) añadir al menos un factor de coagulación, una fuente de calcio, trombina, o cualquier combinación de los anteriores; (d) añadir una composición de un polisacárido; (e) añadir una composición que comprende una proteína tipo colágeno; (f) cultivar células aisladas en o sobre el producto resultante del paso (e), y (g) inducir la nanoestructuración del producto resultante del paso (f). Así mismo, la presente invención se refiere al tejido artificial obtenible por dicho método, a su uso y a la composición farmacéutica que comprende dicho tejido.
Description
Elaboración de tejidos artificiales mediante
ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina, agarosa y
colágeno.
La presente invención se encuadra en el campo de
la biomedicina y, más específicamente, de la ingeniería tisular.
Específicamente, se refiere a un método in vitro de
preparación de un tejido artificial, al tejido artificial obtenible
por dicho método y al uso de este tejido artificial para
incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad
funcional de un tejido o un órgano dañado.
La ingeniería tisular constituye un conjunto de
técnicas y disciplinas que permite diseñar y generar en laboratorio
tejidos artificiales a partir de células madre procedentes de
muestras tisulares obtenidas de biopsias y, por tanto, supone un
enorme avance en el trasplante de órganos y en la medicina
regenerativa. La ingeniería tisular es una de las áreas de la
biotecnología que más se ha desarrollado en los últimos años, debido
a su utilidad potencial para la fabricación in vitro de
tejidos y órganos para su implante en pacientes necesitados de estos
tejidos. No obstante, los tejidos artificiales descritos hasta la
fecha presentan numerosos problemas y complicaciones; algunos de los
cuales se exponen a continuación, empleando como ejemplo, los
tejidos artificiales de piel, córnea, vejiga y uretra.
La vejiga urinaria es el órgano encargado de la
recepción y el almacenamiento de la orina. Situada en el suelo
pélvico, la vejiga urinaria se caracteriza por su capacidad y su
distensibilidad, lo cual permite a ésta almacenar y retener la
orina. La continencia es resultado de la contracción del esfínter
urinario, que cierra la uretra y el cuello vesical evitando la
salida de orina, así como de la relajación y distensión de la vejiga
para almacenar la orina que se va acumulando en ella. Numerosas
patologías congénitas o adquiridas pueden afectar a la integridad de
la vejiga, alterando la función continente de ésta. Por un lado, las
malformaciones de la vejiga suelen asociarse a defectos graves de la
pared vesical que requieren reparación quirúrgica urgente. Por otro
lado, los traumatismos pélvicos, el cáncer vesical y las lesiones
traumáticas de la médula espinal constituyen patologías de gran
frecuencia que requieren el uso de tejidos extravesicales para
reparar la vejiga dañada. En este contexto, actualmente se llevan a
cabo ampliaciones vesicales utilizando intestino
(enterocistoplastia), estómago (gastrocistoplastia) o urotelio
(ureterocistoplastia), siendo muy frecuentes las complicaciones
asociadas a estas técnicas.
Hasta el momento, se han descrito muy pocos
modelos de sustitutos de la vejiga urinaria que presenten utilidad
clínica. Recientemente (Atala et al. Lancet. 2006 Apr
15;367(9518):1241-6), investigadores del
Children's Hospital de Boston lograron implantar un sustituto de
vejiga artificial generado a partir de colágeno y ácido
poliglicólico en siete pacientes con daño vesical grave. Sin
embargo, los modelos de vejiga artificial disponibles para el
tratamiento de los pacientes necesitados de ello, son muy escasos y
presentan multitud de inconvenientes, incluyendo la mala calidad y
la escasa manipulabilidad de los tejidos generados. Además, el
colágeno es un producto que tiende a la contracción y a la pérdida
de volumen cuando se usa en ingeniería tisular, siendo escasa su
consistencia y, por tanto, su manipulabilidad quirúrgica.
La uretra es el conducto por el que se elimina
hacia el exterior la orina almacenada en la vejiga urinaria. Además
de su función excretora en ambos sexos, la uretra cumple una función
reproductiva en el hombre, a permitir el paso del contenido seminal
desde las vesículas seminales durante la eyaculación. Son múltiples
las afecciones congénitas (hipospadias y epispadias principalmente)
o adquiridas (traumatismos, estenosis, etc.) que afectan a su
integridad funcional y que precisan que sea sustituida en mayor o
menor extensión, para conseguir restablecer su función normal (Baird
et al. J Urol. 2005;174:1421-4; Persichetti
et al. Plast Reconstr Surg.
2006;117:708-10).
Tradicionalmente, la reparación de tejidos
lesionados se ha venido haciendo con elementos protésicos
artificiales o tejidos tomados de una parte del propio paciente
(autoinjerto o autotransplante) o de otro individuo (transplante
heterólogo). Actualmente, para la corrección de la mayor parte de
las patologías uretrales, se recurre a colgajos autólogos de tejidos
adyacentes o a injertos libres, principalmente de mucosa oral o
vesical. Sin embargo, la obtención de colgajos locales no siempre es
factible, y la extracción de mucosa oral o vesical no está exenta de
complicaciones y efectos secundarios tanto en la zona donante como
en la zona receptora (Corvin et al. Urologe A.
2004;43(10):1213-6; Schultheiss et al.
World J Urol. 2000;18:84-90). Por otro lado, la
utilización de tejidos heterólogos ha arrojado resultados bastante
pobres en la sustitución de uretra, siendo muy frecuente la
aparición de rechazos inmunológicos del tejido trasplantado.
Hasta la fecha, se han descrito muy pocos
modelos de sustitutos de uretra con probable utilidad clínica,
siendo muy escasos los casos descritos en la literatura en los que
un sustituto uretral ha sido implantado en pacientes. La mayoría de
los modelos descritos hasta la fecha se basan en biomateriales de
colágeno (De Filippo et al. J Urol. 2002 Oct;168(4 Pt
2):1789-92; El-Kassaby et al.
J Urol. 2003 Jan;169(1):170-3; discussion
173) o en piel del propio paciente (Lin et al. Zhonghua Yi
Xue Za Zhi. 2005 Apr 20;85(15):1057-9). Sin
embargo, todos estos modelos presentan numerosos problemas y
complicaciones, y aún no se ha desarrollado ningún sustituto uretral
exento de estos problemas. Por un lado, el colágeno es un producto
que tiende a la contracción y a la pérdida de volumen cuando se usa
en ingeniería tisular, siendo escasa su consistencia y, por tanto,
su manipulabilidad quirúrgica. Por otro, el uso de piel autóloga aún
no ha demostrado suficientemente su capacidad para adaptarse a las
condiciones de la uretra, siendo muy difícil recelularizar
fragmentos de dermis descelularizados.
La córnea es una estructura transparente y
carente de vasos, a través de la cual la luz penetra en el ojo,
constituyendo la principal barrera del globo ocular con el medio
exterior. Por ese motivo, la integridad y el correcto funcionamiento
de la misma son imprescindibles para una correcta función visual. La
patología congénita o adquirida de la córnea constituye uno de los
problemas más frecuentes en oftalmología, siendo numerosas las
causas que provocan una alteración grave de la fisiología y la
estructura corneal. En estos casos, suele ser necesario recurrir a
tratamientos agresivos y no exentos de complicaciones, como son los
implantes de membrana amniótica, los diferentes tipos de
queratoprótesis e incluso el trasplante heterólogo de córnea
(queratoplastia). Sin embargo, el trasplante corneal es una técnica
altamente dependiente de la disponibilidad de córneas procedentes de
donantes cadáveres, lo cual hace que un gran número de personas
permanezcan en lista de espera para trasplante durante periodos de
tiempo muy elevados. Por otro lado, es bien sabido que el trasplante
de órganos procedentes de donante está sujeto a la posibilidad de
rechazo inmunológico cuando estos órganos son implantados, obligando
al paciente a someterse a terapia inmunosupresora durante toda su
vida. Finalmente, el trasplante de cualquier tipo de órgano o
tejido, incluida la córnea, es una técnica sujeta a la posibilidad
de transmisión de todo tipo de enfermedades infecciosas desde el
donante hasta el receptor, incluyendo VIH, hepatitis, herpes,
enfermedades bacterianas y fúngicas, etc. Todos estos problemas y
complicaciones derivadas del implante corneal, hacen necesaria la
búsqueda de alternativas terapéuticas al trasplante heterólogo.
La fabricación en laboratorio de un sustituto
corneal (constructo corneal o córnea artificial) es una de las áreas
que está experimentando mayor auge dentro de la ingeniería tisular,
siendo numerosos los laboratorios que actualmente están intentando
sin demasiado éxito conseguir un sustituto corneal de calidad que
pueda ser utilizado en la clínica humana o para la evaluación de
productos farmacológicos y químicos (Griffith et al.
Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.
Science. 1999;286(5447):2169-72; Orwin et
al. Tissue Eng. 2000;6(4):307-19; Reichl
et al. Int J Pharm. 2003;250:191-201). En tal
sentido, se han desarrollado córneas artificiales de origen animal y
humano. En ambos casos, los modelos desarrollados han utilizado
biomateriales diversos como el colágeno tipo I, fibroína procedente
de la seda (Higa y Shimazaki. Cornea. 2008 Sep;27 Suppl
1:S41-7), quitosán (Gao et al. J Mater Sci
Mater Med. 2008 Dec;19(12):3611-9), ácido
poliglicólico (Hu et al. Tissue Eng. 2005
Nov-Dec;11
(11-12):1710-7) y fibrina con
agarosa (Alaminos et al. Invest Ophthalmol Vis Sci (IOVS).
2006; 47: 3311-3317;
González-Andrades et al. J Tissue Eng Regen
Med. 2009 May 5). De todos estos biomateriales, los mejores
resultados obtenidos hasta ahora son los que tienen por base la
fibrina y la agarosa. Las córneas de colágeno tipo I presentan
tendencia a la pérdida de volumen y a la retracción de las mismas,
con el inconveniente añadido del origen animal del colágeno
utilizado. La fibroína y el quitosán son productos generados a
partir de animales invertebrados, lo cual genera problemas
significativos en relación con la biocompatibilidad. Las córneas de
fibrina y agarosa desarrolladas, por el contrario, tienen la ventaja
de que contienen fibrina procedente de la sangre del mismo paciente,
mientras que la agarosa constituye un producto inerte desde el punto
de vista inmunológico.
La piel es el órgano más extenso del cuerpo
humano, y juega un papel fundamental en el mantenimiento del
equilibrio interno, formando la principal barrera protectora del
organismo frente a cualquier tipo de agresión externa. Existen
numerosas patologías que afectan a la piel, destacando por su
frecuencia las heridas, las úlceras por presión y las quemaduras.
Los tratamientos actuales, basados en el uso de colgajos o injertos
de piel o incluso en el implante de piel procedente de donante,
están asociados a numerosos problemas.
La necesidad de solucionar estos problemas hace
necesaria la búsqueda de alternativas basadas en la generación de
productos de piel artificial humana generados mediante ingeniería
tisular (Horch et al. Burns. 2005 Aug;31
(5):597-602). En concreto, hasta el momento se han
diseñado distintos tipos de piel artificial, incluyendo coberturas
cutáneas sintéticas y biológicas, aunque ninguno de ellos ha logrado
reproducir fielmente la estructura y las funciones de la piel humana
nativa. Por un lado, las coberturas dérmicas sintéticas consisten en
biomateriales no reabsorbibles y exentos de células vivas que se
pueden utilizar como cubiertas temporales o como agentes inductores
de la reparación tisular guiada. Estos tejidos artificiales e
inertes poseen muy poca actividad biológica, por lo que no pueden
ser empleados en lesiones profundas o extensas. Por otro lado, las
coberturas biológicas consisten en la utilización de piel humana
artificial en la que existen células vivas y matrices extracelulares
que tratan de reproducir la estructura de la piel humana normal.
Hasta el momento, la piel humana artificial que mejores resultados
está ofreciendo es la piel artificial generada mediante ingeniería
tisular a partir de células madre de la piel utilizando fibrina
procedente del plasma humano como biomaterial (Meana et al.
Burns 1998; 24: 621-630; Del Rio et al. Hum
Gene Ther. 2002 May 20;13(8):959-68; Llames
et al. Transplantation. 2004 Feb
15;77(3):350-5; Llames et al. Cell
Tissue Bank 2006; 7: 4753.). Aunque estas técnicas supusieron un
gran avance, su utilización clínica es limitada debido al hecho,
fundamentalmente, de su escasa consistencia, su difícil manipulación
y su enorme fragilidad. Uno de los sustitutos de tejido más
consistentes es aquel que combina el uso de fibrina con la agarosa.
Hasta el momento, la agarosa ha sido utilizada para la generación de
sustitutos del cartílago (Miyata et al. J Biomech Eng. 2008
0ct;130(5):051016), la córnea (Alaminos et al. Invest
Ophthalmol Vis Sci (IOVS). 2006; 47: 3311-3317) y la
mucosa oral humana (Alaminos et al. J Tissue Eng Regen Med.
2007 Sep-Oct;1 (5):350-9;
Sánchez-Quevedo et al. Histol Histopathol.
2007 Jun;22(6):631-40), pero no existe
experiencia previa en el uso de este biomaterial para la fabricación
de piel artificial.
La ingeniería tisular es una de las áreas que
está experimentando mayor auge dentro de la biotecnología. Sin
embargo, las desventajas de los tejidos artificiales hasta ahora
existentes hacen necesario el desarrollo de nuevas técnicas que
permitan la obtención de tejidos artificiales que puedan ser
utilizados en la clínica humana o para la evaluación de productos
farmacológicos y químicos, superando las limitaciones hasta ahora
detectadas.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La ingeniería tisular es una de las áreas de la
biotecnología que más se ha desarrollado en los últimos años, debido
a su utilidad para la fabricación in vitro de tejidos y
órganos para su implante en pacientes necesitados de estos tejidos
Sin embargo, las limitaciones de los tejidos artificiales hasta
ahora existentes hacen necesario el desarrollo de nuevas técnicas
que permitan la obtención de tejidos artificiales que puedan ser
utilizados en la clínica humana o para la evaluación de productos
farmacológicos y químicos.
La presente invención proporciona un método
in vitro de preparación de un tejido artificial, al tejido
artificial obtenible por dicho método y al uso de este tejido
artificial para incrementar, restaurar o sustituir parcial o
totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano
dañado.
Un primer aspecto de la invención se refiere a
un método in vitro de preparación de un tejido artificial (de
aquí en adelante, método de la invención) que comprende:
- a)
- añadir una composición que comprende fibrinógeno a células aisladas,
- b)
- añadir un agente antifibrinolítico al producto resultante del paso (a),
- c)
- añadir, al menos, un factor de coagulación, una fuente de calcio, trombina, o cualquier combinación de los anteriores al producto resultante del paso (b),
- d)
- añadir una composición que comprende un polisacárido al producto resultante del paso (c),
- e)
- añadir una composición que comprende una proteína al producto resultante del paso (d),
- f)
- cultivar células aisladas en o sobre el producto resultante del paso (e), y
- g)
- inducir la nanoestructuración del producto resultante del paso (f).
\vskip1.000000\baselineskip
En el paso (a) del método de la invención se
añade una composición que comprende fibrinógeno a células aisladas,
preferiblemente, de un mamífero. Dichas células pueden obtenerse
mediante diferentes procedimientos descritos en el estado de la
técnica, que pueden depender del tipo celular particular del que se
trate. Algunos de estos procedimientos son, por ejemplo, pero sin
limitarse, biopsia, procesado mecánico, tratamiento enzimático (por
ejemplo, pero sin limitarse, con tripsina o colagenasa de tipo I),
centrifugación, lisis eritrocitaria, filtración, cultivo en soportes
o medios que favorezcan la proliferación selectiva de dicho tipo
celular o inmunocitometría. Algunos de estos procedimientos se
describen en detalle en los Ejemplos de esta memoria.
Las células del paso (a) pueden ser células
diferenciadas como, por ejemplo, pero sin limitarse, fibroblastos,
queratocitos o células musculares lisas, o células no diferenciadas
con la capacidad para diferenciarse en dichas células como, por
ejemplo, células madre adultas.
En una realización preferida del método de la
invención, las células del paso (a) son fibroblastos o células no
diferenciadas con la capacidad para diferenciarse en fibroblastos.
Los fibroblastos pueden obtenerse a partir de cualquier tejido u
órgano, sin embargo, preferiblemente, los fibroblastos del paso (a)
proceden del tejido o del órgano en el que va a emplearse como
sustituto el tejido artificial. Por ejemplo, cuando el método de la
invención se emplea para preparar un tejido sustituto de piel o una
piel artificial, los fibroblastos proceden, preferiblemente, de piel
(fibroblásticos dérmicos); cuando se emplea para preparar un tejido
sustituto de vejiga o una vejiga artificial, los fibroblastos
proceden, preferiblemente, de vejiga; cuando se emplea para preparar
un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial los
fibroblastos proceden, preferiblemente, de uretra; o cuando se
emplea para preparar un tejido sustituto de mucosa oral o una mucosa
oral artificial los fibroblastos proceden preferiblemente, de mucosa
oral. No obstante, los fibroblastos pueden obtenerse a partir de
cualquier otro tejido u órgano, como por ejemplo, la mucosa oral, la
pared abdominal o cualquier tejido conjuntivo. Por ejemplo, los
fibroblastos obtenidos a partir de mucosa oral pueden emplearse para
preparar un tejido sustituto de piel o una piel artificial, un
tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial, un tejido
sustituto de uretra o una uretra artificial, o un tejido sustituto
de córnea o una córnea artificial.
En otra realización preferida del método de la
invención, las células del paso (a) son queratocitos o células no
diferenciadas con la capacidad para diferenciarse en queratocitos.
Por ejemplo, cuando el método de la invención se emplea para
preparar un tejido sustituto de córnea o una córnea artificial,
preferiblemente, se emplean queratocitos del estroma corneal.
La posibilidad de que todos los componentes del
tejido artificial sean de origen autólogo permite que el transplante
de dicho tejido pueda realizarse sin que sea necesaria la
inmunosupresión del sujeto transplantado. Sin embargo, los
componentes del tejido artificial también puedan ser de origen
alogénico, es decir, pueden proceder de un individuo diferente a
aquel al que se le va a transplantar el tejido artificial. Incluso
la especie de la cual proceden dichos componentes, puede ser
diferente; en cuyo caso se dice que su origen es xenogénico. Esto
abre la posibilidad de que el tejido artificial esté preparado de
antemano cuando se necesite con urgencia, aunque en este caso sí
sería recomendable proceder a la inmunosupresión del sujeto al que
se transplante el tejido artificial.
Por lo tanto, en una realización preferida, las
células del paso (a) de la invención son de origen autólogo. No
obstante, las células del paso (a) también pueden ser de origen
alogénico o xenogénico.
Mediante la adición a las células del paso (a)
de los diferentes componentes descritos en los pasos (a)-(e) del
método de la invención, y tras dejar reposar el producto resultante
del paso (e) en un soporte, se produce la formación de una matriz
que comprende fibrina, el polisacárido y la proteína añadida en el
paso (e), en la que quedan embebidas dichas células y sobre la cual
y/o en cuyo interior éstas pueden crecer. Preferiblemente, las
células del paso (a) crecen en el interior de dicha matriz.
La formación de una matriz de fibrina tiene
lugar por la polimerización del fibrinógeno inducida por trombina.
El fibrinógeno es una proteína de elevado peso molecular que se
encuentra presente en el plasma sanguíneo. La trombina es una enzima
proteolítica que provoca la ruptura de la molécula de fibrinógeno en
polipéptidos de bajo peso molecular y en monómeros de fibrina.
Dichos monómeros polimerizan en dímeros y posteriormente se unen
entre sí mediante enlaces covalentes, por acción del factor XIII,
previamente activado por la trombina, y en presencia de iones de
calcio.
La composición que comprende fibrinógeno del
paso (a) puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, plasma
sanguíneo. La composición del paso (a) puede asimismo prepararse a
partir de un derivado plasmático, como, por ejemplo, pero sin
limitarse un crioprecipitado o un concentrado de fibrinógeno. Además
de fibrinógeno, la composición del paso (a) puede contener otros
factores de coagulación.
En una realización preferida, la concentración
de fibrinógeno en el producto resultante del paso (e) es de entre
0,5 y 10 g/L. En una realización más preferida, la concentración en
el producto resultante del paso (e) es de entre 1 y 4 g/L. No
obstante, una concentración menor o mayor también podría
emplearse.
En una realización preferida, el fibrinógeno de
la composición del paso (a) o la composición que comprende
fibrinógeno del paso (a) es de origen autólogo. No obstante, el
fibrinógeno de la composición del paso (a) o la composición que
comprende fibrinógeno del paso (a) también puede ser de origen
alogénico o xenogénico.
En una realización preferida de este primer
aspecto de la invención, la composición que contiene fibrinógeno del
paso (a) es plasma sanguíneo. En este caso, la polimerización del
fibrinógeno puede inducirse mediante la adición en el paso (c) de
una fuente de calcio.
En una realización más preferida de este primer
aspecto de la invención, la fuente de calcio del paso (c) es una sal
de calcio como, por ejemplo, pero sin limitarse, cloruro cálcico,
gluconato cálcico o una combinación de ambas. La concentración de la
sal de calcio deberá ser suficiente para inducir la polimerización
del fibrinógeno. En una realización más preferida, la sal de calcio
es cloruro cálcico. En una realización aún más preferida, la
concentración de cloruro de calcio en el producto resultante del
paso (e) es de entre 0,25 y 3 g/L. No obstante, una concentración
menor o mayor también podría emplearse.
El término "factor de coagulación", tal y
como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un
componente, generalmente, una proteína, presente en el plasma
sanguíneo y que interviene en la reacción en cadena que hace posible
la coagulación. Son trece los factores de coagulación, nombrados con
números romanos: I: fibrinógeno; II: protrombina; III: factor
tisular o tromboplastina; IV: calcio; V: proacelerina; VI: factor
inactivo o cimógeno; VII: proconvertina; VIII: factor antihemofílico
A o factor von Willebrand; IX: factor antihemofílico B o factor de
Christmas; X: factor de Stuart-Prower; XI: factor
antihemofílico C; XII: Factor Hageman; XIII: Factor estabilizante de
la fibrina; XIV: Fitzgerald; XV: Fletcher; XVI: plaquetas; y XVII:
Somocurcio. Preferiblemente, el otro factor de coagulación añadido
en el paso (c) del método de la presente invención es el factor
XIII.
El polímero de fibrina puede degradarse mediante
el proceso denominado fibrinólisis. Durante la fibrinólisis, el
plasminógeno es convertido en la enzima activa plasmina, por el
activador tisular del plasminógeno; la plasmina se une a la
superficie de la fibrina a través de sus sitios de unión, para
producir la degradación del polímero de fibrina. Para evitar la
fibrinólisis de la matriz de fibrina, en el paso (b) de la presente
invención se añade un agente antifibrinolítico como, por ejemplo,
pero sin limitarse, ácido épsilon aminocaproico, ácido tranexámico o
aprotinina.
El ácido tranexámico es un producto sintético
derivado del aminoácido lisina con gran afinidad por los sitios de
unión de lisina del plasminógeno; bloquea estos sitios y previene la
unión del plasminógeno activado a la superficie de fibrina,
ejerciendo un efecto antifibrinolítico. El ácido tranexámico tiene
la ventaja, frente a otros agentes antifibrinolíticos de origen
animal, de que no transmite enfermedades. Por tanto, en una
realización preferida, el agente antifibrinolítico es el ácido
tranexámico. En una realización aún más preferida, la concentración
de ácido tranexámico en el producto resultante del paso (e) es de
entre 0,5 y 2 g/L. No obstante, una concentración menor o mayor
también podría emplearse.
Las matrices de fibrina son muy versátiles, por
lo que se han empleado para la elaboración de diferentes tejidos
artificiales, sin embargo, la utilización clínica de las mismas se
ha visto limitada debido al hecho, fundamentalmente, de su escasa
consistencia, su difícil manipulación y su enorme fragilidad. Por
ese motivo, en el paso (d) del método de la invención se añade un
polisacárido. En general, dicho polisacárido se emplea para aportar
resistencia y consistencia al tejido, y es conveniente que sea
soluble en el mismo. Ejemplos de polisacáridos que pueden emplearse
en el paso (d) del método de la presente invención son pero, sin
limitarse, agar-agar, agarosa, alginato, quitosano o
carragenatos, o cualquier combinación de los anteriores.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La agarosa es un polisacárido formado por
galactosas alfa y beta que se extrae de algas de géneros como
Gellidium o Gracillaria. La agarosa, frente a otros
polisacáridos que pueden ser empleados en el paso (d) de la presente
invención, tiene la ventaja de que forma una matriz inerte desde el
punto de vista inmunológico. Por tanto, en una realización
preferida, el polisacárido del paso (d) del método de la invención
es agarosa. Existen diferentes tipos de agarosa que varían en sus
propiedades físicas y químicas como, por ejemplo, la temperatura de
gelificación, la fuerza del gel y/o la porosidad. Preferiblemente,
la agarosa del paso (d) del método de la invención es una agarosa
con un punto de fusión bajo, es decir, una agarosa que se
repolimerice y solidifique a una temperatura, preferiblemente, menor
de 65ºC y, más preferiblemente, menor de 40ºC; de esta manera puede
emplearse para preparar el tejido a temperaturas muy bajas,
minimizando la probabilidad de muerte celular. En una realización
más preferida, la agarosa empleada en el paso (d) del método de la
invención es de tipo VII. En una realización aún más preferida, la
agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, en el producto
resultante del paso (e) está a una concentración, ventajosamente, de
entre 0,1 y 6 g/L, preferiblemente, de entre 0,15 y 3 g/L, y más
preferiblemente, de entre 0,25 y 2 g/L. No obstante, una
concentración menor o mayor también podría emplearse.
El paso (e) del método de la invención comprende
la adición de una composición que comprende una proteína al producto
resultante del paso (d). Ejemplos de proteínas que pueden emplearse
en el paso (e) del método de la presente invención son pero, sin
limitarse, colágeno, reticulina o elastina. Estas proteínas forman
parte de la matriz extracelular del tejido conjuntivo de manera
natural en los tejidos, por lo que las células embebidas en un
tejido artificial obtenido mediante el método de la invención,
encuentran un micro-ambiente más parecido al
fisiológico, mejorando la adhesión, la diferenciación y/o la
supervivencia de dichas células.
Además, la adición de dichas proteínas en el
paso (e) del método de la invención mejora las propiedades físicas
(reológicas, mecánicas o biomecánicas) del tejido artificial
obtenido. En los ejemplos de esta memoria se demuestra que en
tejidos artificiales que comprenden fibrina, agarosa y colágeno,
empleando concentraciones crecientes de colágeno mejora el
comportamiento viscoelástico, lo que se pone de manifiesto por un
aumento del esfuerzo umbral dependiente de la concentración de
colágeno.
Las principales propiedades reológicas de un
material sólido o semisólido son la viscosidad y la elasticidad. La
viscosidad es la resistencia que ofrece un fluido a la deformación
tangencial, y sería equivalente a la consistencia o la rigidez. La
elasticidad es la propiedad mecánica de ciertos materiales de sufrir
deformaciones reversibles cuando se encuentran sujetos a la acción
de fuerzas exteriores, y de recuperar la forma original cuando cesan
estas fuerzas exteriores. El análisis de estos parámetros se realiza
mediante reometría, técnica física que utiliza instrumentos
denominados reómetros.
El esfuerzo umbral es la energía necesaria para
provocar una deformación irreversible en un sólido o un fluido.
Normalmente, todos los materiales presentan una región elástica, en
la que el esfuerzo aplicado provoca una deformación totalmente
reversible cuando cesa el esfuerzo. Si ese esfuerzo supera un límite
(módulo elástico), la deformación pasa a ser irreversible, entrando
en una región plástica. Finalmente, si el esfuerzo supera el módulo
plástico, el material se rompe (punto de fractura).
El problema principal de los biomateriales
clásicos es la falta de consistencia: estos biomateriales se parecen
más a un gel que a un tejido sólido, dificultando notablemente su
aplicación clínica. Los tejidos artificiales obtenidos mediante el
método de la invención son más resistentes, consistentes, rígidos,
elásticos y, en suma, manejables y manipulables quirúrgicamente,
pudiendo incluso suturarse.
El colágeno es una proteína de fácil
disponibilidad en la naturaleza y que biológicamente se caracteriza
por su baja inmunicidad y elevada actividad tisular. El colágeno
forma las fibras colágenas, que son flexibles, pero ofrecen gran
resistencia a la tracción. En la presente invención se demuestra que
los tejidos artificiales de fibrina, agarosa y colágeno presentan
una mayor densidad fibrilar a nivel del estroma, un mejor
comportamiento viscolástico y un esfuerzo umbral creciente según se
aumenta la concentración de colágeno, y más elevado que los tejidos
artificiales de colágeno. Por tanto, en una realización preferida la
proteína añadida en el paso (e) es colágeno.
En una realización preferida, el colágeno
añadido en el paso (e) se selecciona de la lista que comprende:
colágeno tipo I, colágeno tipo II, colágeno tipo III, colágeno tipo
IV, colágeno tipo V, colágeno tipo VI, colágeno tipo VII, colágeno
tipo VIII, colágeno tipo IX, colágeno tipo X, colágeno tipo XI,
colágeno tipo XII, colágeno tipo XIII o cualquier combinación de los
anteriores. En una realización más preferida, el colágeno añadido en
el paso (e) se selecciona de la lista que comprende: colágeno tipo
I, colágeno tipo II, colágeno tipo III, colágeno tipo IV, colágeno
tipo V, colágeno tipo IX o cualquier combinación de los anteriores.
La selección de un tipo particular de colágeno en el paso (e) del
método de la invención depende del tejido artificial que se desee
preparar y se realiza en función de las características de cada
colágeno que son conocidas en el estado de la técnica.
Por ejemplo, la función principal del colágeno
tipo I es la de resistencia al estiramiento, y se encuentra
abundantemente en la dermis, el hueso, el tendón y la córnea. Así,
en la presente invención se demuestra que la adición de colágeno
tipo I en el paso (e) otorga excelentes propiedades al tejido
artificial cuando se quiere preparar, por ejemplo, pero sin
limitarnos un tejido sustituto de córnea o una córnea artificial.
Por tanto, en una realización preferida el colágeno es colágeno tipo
I.
\newpage
En una realización aún más preferida, el
colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, en el producto
resultante del paso (e) está a una concentración, ventajosamente, de
entre 0,5 y 5 g/L, preferiblemente, de entre 1,8 y 3,7 g/L, y más
preferiblemente, de entre 2,5 y 3 g/L. No obstante, una
concentración menor o mayor también podría emplearse.
En una realización particular, el colágeno
utilizado es un atelocolágeno, es decir un colágeno del cual se han
eliminado las regiones terminales de estructura no helicoidal
denominadas telopéptidos. Estos telopéptidos pueden hacer que el
colágeno que sea insoluble y son portadores de los principales
determinantes antigénicos del colágeno. El atelocolágeno se obtiene,
por ejemplo, mediante tratamiento proteásico con pepsina.
En una realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
0,5 y 10 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente,
agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/L, y la concentración del
colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 0,5 y 5
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
0,5 y 10 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente,
agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/L, y la concentración
del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 0,5 y 5
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
0,5 y 10 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente,
agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/L, y la concentración
del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 0,5 y 5
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
0,5 y 10 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente,
agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/L, y la concentración del
colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 1,8 y 3,7
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
0,5 y 10 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente,
agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/L, y la concentración
del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 1,8 y
3,7 g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
0,5 y 10 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente,
agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/L, y la concentración
del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 1,8 y
3,7 g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
0,5 y 10 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente,
agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/L, y la concentración del
colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 2,5 y 3
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
0,5 y 10 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente,
agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/L, y la concentración
del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 2,5 y 3
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
0,5 y 10 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente,
agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/L, y la concentración
del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 2,5 y 3
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
1 y 4 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente, agarosa
de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/L, y la concentración del
colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 0,5 y 5
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
1 y 4 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente, agarosa
de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/L, y la concentración del
colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 0,5 y 5
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
1 y 4 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente, agarosa
de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/L, y la concentración del
colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 0,5 y 5
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
1 y 4 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente, agarosa
de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/L, y la concentración del
colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 1,8 y 3,7
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
1 y 4 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente, agarosa
de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/L, y la concentración del
colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 1,8 y 3,7
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
1 y 4 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente, agarosa
de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/L, y la concentración del
colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 1,8 y 3,7
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
1 y 4 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente, agarosa
de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/L, y la concentración del
colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 2,5 y 3
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de
entre 1 y 4 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente,
agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/L, y la concentración
del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 2,5 y 3
g/L.
En otra realización preferida, en el producto
resultante del paso (e), la concentración de fibrinógeno es de entre
1 y 4 g/L, la concentración de la agarosa, preferiblemente, agarosa
de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/L, y la concentración del
colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 2,5 y 3
g/L.
En una realización preferida, el método de la
invención además de los pasos (a)-(g) descritos comprende un paso
adicional entre el paso (b) y el paso (c) en el que se añade una
proteína. Ejemplos de proteínas que pueden emplearse en el paso (d)
del método de la presente invención son pero, sin limitarse,
fibronectina, laminina, colágeno tipo VII o entactina, o cualquier
combinación de los anteriores. La adición de estas proteínas entre
el paso (b) y el paso (c) favorece la adhesión de las células del
paso (f) al producto resultante del paso (e).
La fibronectina es una glicoproteína presente en
la matriz extracelular (MEC) de la mayoría de los tejidos celulares
animales desempeñando un importante papel en la adhesión de las
células a la matriz. En una realización más preferida, la proteína
añadida entre el paso (b) y el paso (c) del método de la invención
es fibronectina. El objeto de esta adición es la de favorecer la
adhesión de las células del paso (f) al producto resultante del paso
(e). Por ejemplo, cuando el método de la invención se emplea para
preparar un tejido sustituto de córnea o una córnea artificial, la
adición de fibronectina minimiza el desprendimiento de las células
del epitelio corneal añadidas en el paso (f), lo que supone una
importante ventaja con respecto a otros métodos descritos en el
estado de la técnica. En una realización aún más preferida, la
concentración de fibronectina en el producto resultante del paso (e)
es de entre 0,25 y 1 g/L. No obstante, una concentración menor o
mayor también podría emplearse.
Una vez realizados los pasos (a)-(e) del método
de la invención, el producto resultante del paso (e) se deja reposar
en un soporte para que se produzca la formación de la matriz que
comprende la fibrina, el polisacárido y la proteína añadida en el
paso (e), y que tiene embebidas las células del paso (a). Soportes
que pueden ser empleados son, por ejemplo, pero sin limitarse,
placas de cultivo tisular o insertos porosos de cultivo celular.
Preferiblemente, dichos soportes estarán en condiciones de
esterilidad.
El paso (f) del método de la invención consiste
en cultivar células aisladas, preferiblemente, de un mamífero, en o
sobre el producto resultante del paso (e). Dichas células pueden
obtenerse mediante diferentes procedimientos descritos en el estado
de la técnica y que pueden depender del tipo celular particular del
que se trate. Algunos de estos procedimientos son, por ejemplo, pero
sin limitarse, biopsia, procesado mecánico, tratamiento enzimático
(por ejemplo, pero sin limitarse, con tripsina o colagenasa de tipo
I), centrifugación, lisis eritrocitaria, filtración, cultivo en
soportes o medios que favorezcan la proliferación selectiva de dicho
tipo celular o inmunocitometría. Algunos de estos procedimientos se
describen en detalle en los Ejemplos de esta solicitud de
patente.
Las células del paso (f) pueden ser células
diferenciadas como, por ejemplo, pero sin limitarse, células
epiteliales, o células no diferenciadas con la capacidad para
diferenciarse en dichas células como, por ejemplo, células madre
adultas.
En una realización preferida, las células
diferenciadas del paso (f) son células epiteliales, como, por
ejemplo, pero sin limitarse, queratinocitos, células del epitelio de
la mucosa oral, células del epitelio de la vejiga, células del
epitelio de la uretra, células del epitelio corneal o células
endoteliales vasculares.
Preferiblemente, los células epiteliales del
paso (f) proceden del tejido o del órgano en el que va a emplearse
como sustituto el tejido artificial. Por ejemplo, cuando el método
de la invención se emplea para preparar un tejido sustituto de piel
o una piel artificial, las células epiteliales proceden,
preferiblemente, de la epidermis de la piel, es decir, son
queratinocitos; cuando se emplea para preparar una tejido sustituto
de vejiga o una vejiga artificial, las células epiteliales proceden,
preferiblemente, del epitelio de la vejiga o urotelio; cuando se
emplea para preparar un tejido sustituto de uretra o una uretra
artificial las células epiteliales proceden, preferiblemente, del
epitelio de la uretra; cuando se emplea para preparar un tejido
sustituto de córnea o una córnea artificial preferiblemente, las
células epiteliales son células del epitelio corneal; cuando se
emplea para preparar un tejido sustituto de mucosa oral,
preferiblemente, las células epiteliales proceden, preferiblemente,
del epitelio de la mucosa oral.
Sin embargo, las células epiteliales del paso
(f) también pueden obtenerse a partir de un tejido u órgano distinto
del tejido o del órgano en el que va a emplearse como sustituto el
tejido artificial. Por ejemplo, cuando el método de la invención se
emplea para preparar un tejido sustituto de piel o una piel
artificial, un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial,
un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial, o un tejido
sustituto de córnea o una córnea artificial las células epiteliales
del paso (f) pueden ser células del epitelio de la mucosa oral. O,
por ejemplo, cuando el método de la invención se emplea para
preparar un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial, o
cuando se emplea para preparar un tejido sustituto de uretra o una
uretra artificial, las células epiteliales pueden ser
queratinocitos.
Uno de los problemas que se asocian a la
generación de tejido artificial en laboratorio es la obtención de un
número significativo de células diferenciadas, por lo que con
frecuencia, se considera como una fuente alternativa el uso de
células madre, con capacidad para diferenciarse a dichas células. Se
entiende por "célula madre" aquella que tiene una elevada
capacidad para dividirse y diferenciarse morfológica y
funcionalmente en distintos tipos de células más especializadas.
Durante el proceso de diferenciación, una célula indiferenciada
modifica su fenotipo y morfología para convertirse en una célula
diferenciada, con una estructura y función especializada.
Las células madre se pueden clasificar
atendiendo a su potencialidad, es decir, a su capacidad para
diferenciarse en distintos tipos celulares en: (a) totipotenciales:
capaces de diferenciarse tanto en tejido embrionario como en tejido
extraembrionario; (b) pluripotenciales con capacidad para
diferenciarse a cualquiera de los tejidos procedentes de las tres
capas embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo); (c)
multipotenciales: capaces de diferenciarse a distintos tipos
celulares derivados de una misma capa embrionaria (endodermo,
mesodermo o ectodermo); y (d) unipotenciales: capacidad para formar
un único linaje celular.
Según su origen, las células madre se han
dividido en: (a) embrionarias: de la masa celular interna del
blastocisto en el estadio del embrión preimplantatorio o de la
cresta gonadal, y que son totipotenciales o pluripotenciales; y (b)
adultas: en el adulto, el feto y el cordón umbilical, y que son
multipotenciales o unipotenciales. Dentro de las células madre
adultas, nos encontramos con las células madre mesenquimales, que se
encuentran repartidas en el tejido conectivo de diversos órganos,
como, por ejemplo, pero sin limitarse, la médula ósea, la sangre
periférica, el tejido adiposo o el cordón umbilical. En una
realización preferida, las células madre adultas son células madre
adultas de la médula ósea, del tejido adiposo o del cordón
umbilical.
El cordón umbilical constituye una interesante
fuente de células madre adultas, debido a que, a diferencia de las
células madre adultas obtenidas de otras fuentes; (a) su método de
obtención no es invasivo ni doloroso; y (b) su capacidad
proliferativa y su potencial de diferenciación no disminuye como
consecuencia del proceso de envejecimiento. Entre las diferentes
fuentes de células madre del cordón umbilical destacan las llamadas
células madre de la gelatina de Wharton del cordón umbilical, por:
(a) su gran capacidad de proliferación y a su rapidez de expansión
en cultivo; y (b) la baja expresión del Complejo Mayor de
Histocompatibilidad de clase I y ausencia de expresión del Complejo
Mayor de Histocompatibilidad de clase II, lo que las convierte en
buenas candidatas para la terapia celular alogénica.
Por tanto, en otra realización preferida, las
células del paso (f) son células madre de la gelatina de Wharton del
cordón umbilical. Estas células expresan en su superficie diversos
marcadores característicos de las células mesenquimales como, por
ejemplo, SH2, SH3, CD10, CD13, CD29, CD44, CD54, CD73, CD90, CD105 o
CD166, y son negativos para marcadores del linaje hematopoyético,
como por ejemplo, CD31, CD34, CD38, CD40 o CD45. Las células madre
de la gelatina de Wharton del cordón umbilical pueden diferenciarse,
por ejemplo, a condroblastos, osteoblastos, adipocitos, precursores
neurales, cardiomiocitos, células del músculo esquelético, células
endoteliales o hepatocitos.
Las células madre adultas pueden ser
caracterizadas mediante la identificación de proteínas de superficie
y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de su
estado indiferenciado, mediante diferentes procedimientos que son
conocidos en el estado de la técnica como, por ejemplo, pero sin
limitarse, inmunocitometría, análisis inmunocitoquímico, análisis
por northern blot, RT-PCR, análisis de
expresión génica en microarrays, estudios proteómicos o
análisis por differential display.
Las células madre pueden ser inducidas a
diferenciarse in vitro para dar lugar a células que expresen,
al menos, una o más características propias de células
diferenciadas. Ejemplos de células diferenciadas a las que pueden
diferenciarse las células madre, pero sin limitarse, son
fibroblasto, queratinocito, célula del urotelio, célula del epitelio
de la uretra, célula del epitelio corneal, célula del epitelio de la
mucosa oral, condroblasto, osteoblasto, adipocito o neurona. En una
realización preferida de la invención, la célula diferenciada a
partir de la célula madre multipotente de la invención expresa una o
más características propias de una célula diferenciada seleccionada
de la lista que comprende: fibroblasto, queratinocito, célula del
urotelio, célula del epitelio de la uretra, célula del epitelio
corneal, célula del epitelio de la mucosa oral, condroblasto,
osteoblasto, adipocito o neurona.
Las células diferenciadas pueden ser
caracterizadas mediante la identificación de proteínas de superficie
y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de su
estado diferenciado, mediante diferentes procedimientos que son
conocidos en el estado de la técnica como, por ejemplo, pero sin
limitarse, inmunocitometría, análisis inmunocitoquímico, análisis
por northern blot, RT-PCR, análisis de
expresión génica en microarrays, estudios proteómicos o
análisis por differential display.
En una realización preferida, las células del
paso (f) de la invención son de origen autólogo. No obstante, las
células del paso (f) también pueden ser de origen alogénico o
xenogénico.
Sobre el producto resultante del paso (e) y/o en
su interior las células del paso (f) son capaces de proliferar.
Preferiblemente, las células del paso (f) proliferan sobre la
superficie del producto resultante del paso (e).
Las células del paso (f) se dejan proliferar
hasta que alcanzan un número adecuado hasta que alcanzan,
típicamente, al menos, un 70% de confluencia, ventajosamente, al
menos, un 80% de confluencia, preferiblemente, al menos, un 90% de
confluencia, más preferiblemente, al menos, un 95% de confluencia
y, aún más preferiblemente, al menos, un 100% de confluencia.
Durante el tiempo que las células se mantienen en cultivo, el medio
de cultivo en el que se encuentran puede ser parcial o totalmente
reemplazado por medio nuevo para reemplazar ingredientes agotados y
eliminar metabolitos y catabolitos potencialmente dañinos.
Para la correcta diferenciación de algunos tipos
celulares puede ser necesario un paso adicional. Por ejemplo, en el
caso de las células del epitelio de la mucosa oral, los
queratinocitos o las células del epitelio corneal, puede ser
necesario exponer la superficie epitelial al aire para promover la
correcta estratificación y maduración del epitelio manteniendo la
matriz que comprende las células del paso (a) sumergida en medio de
cultivo (técnica aire líquido).
Por tanto, en una realización preferida, el
método de la invención, además de los pasos (a)-(g) descritos
anteriormente comprende un paso adicional en el que el producto
resultante del paso (f) se expone al aire. En general, el método de
la invención incluye este paso cuando se emplea para obtener un
tejido artificial que sirva para reemplazar a un tejido natural cuyo
epitelio se encuentra expuesto normalmente al contacto con el aire
como, por ejemplo, pero sin limitarnos, la piel, la córnea, la
mucosa oral, la uretra o la vagina. Preferiblemente, este paso se
realiza cuando se prepara un tejido sustituto de piel o una piel
artificial, o cuando se prepara un tejido sustituto de córnea o una
córnea artificial, o cuando se prepara un tejido sustituto de mucosa
oral o una mucosa oral artificial.
Una de las innovaciones más importantes del
método de la invención consiste en la existencia de un paso (g) en
el que se induce la nanoestructuración del producto resultante del
paso (f). La expresión "nanoestructuración", tal y como se
utiliza en la presente descripción, se refiere a una modificación
estructural consistente en la generación de enlaces de tamaño
inferior a una micra entre las fibras de fibrina y entre éstas y las
moléculas de agarosa.
En una realización preferida, la inducción de la
nanoestructuración del paso (g) comprende la deshidratación y/o la
compresión mecánica del producto resultante del paso (f). El
objetivo del paso (g) es generar una modificación estructural entre
las fibras de fibrina y las moléculas de agarosa del tejido
artificial para alcanzar niveles óptimos de consistencia y
elasticidad, que no se obtienen mediante otros métodos descritos en
el estado de la técnica. El resultado final es una modificación
irreversible de las fibras que genera unas cualidades biomecánicas
muy favorables para la manipulación quirúrgica y el implante
clínico.
El término "deshidratación" se refiere a
una eliminación parcial y/o total del fluido intersticial del
producto resultante del paso (f). Por ejemplo, la cantidad de fluido
intersticial eliminado del producto resultante del paso (f) puede
ser de, al menos, un 50%, al menos, un 60%, al menos, un 70%, al
menos, un 80%, al menos, un 90% o, al menos, un 99% del fluido
intersticial contenido originalmente en el producto resultante del
paso (f).
La deshidratación del producto resultante del
paso (f) puede conseguirse por medio de cualquier procedimiento
físico o químico. En una realización preferida, la deshidratación
del producto resultante del paso (f) comprende un procedimiento
seleccionado de la lista que comprende: drenaje, evaporación,
succión, presión capilar, ósmosis o electro-ósmosis.
El líquido intersticial puede ser eliminado
mediante la inclinación del producto resultante del paso (f); el
líquido intersticial es entonces drenado debido al efecto de la
gravedad y el gradiente.
El líquido puede ser eliminado mediante succión,
Por ejemplo, aplicando vacío mediante una bomba mecánica a la
superficie donde se encuentra el producto resultante del paso
(f).
El líquido intersticial puede ser eliminado
mediante evaporación, por ejemplo, incubando el producto resultante
del paso (f) en condiciones que promueven la evaporación, por
ejemplo, a una presión menor que la presión atmosférica y/o a una
temperatura mayor que la temperatura ambiente.
El líquido intersticial también puede ser
eliminado empleando un agente osmótico con tendencia a absorber agua
como, por ejemplo, pero sin limitarse, una solución de cloruro
sódico hiperosmolar, separando al producto resultante del paso (f)
de esta solución mediante una membrana semipermeable, una esponja u
otro material secante.
En una realización preferida, el líquido
intersticial puede ser eliminado mediante presión capilar, por
ejemplo, mediante la aplicación de un material absorbente al
producto resultante del paso (f). Algunos ejemplos de material
absorbente que podrían ser empleados en el paso (g) de la invención,
pero sin limitarse, son papel de filtro, papel 3M de la casa
comercial Whatman, fibra de celulosa, o tela absorbente.
Preferiblemente, el material absorbente estará esterilizado.
El tiempo requerido para la deshidratación
dependerá del procedimiento o procedimientos empleados, y puede ser
determinado con facilidad por un experto en la materia. La idoneidad
del tejido artificial obtenido mediante la aplicación de un
determinado procedimiento de deshidratación durante un determinado
periodo de tiempo puede comprobarse mediante diversos métodos de
evaluación conocidos en el estado de la técnica como, por ejemplo,
pero sin limitarse, los descritos en los ejemplos de esta
memoria.
El líquido intersticial también puede ser
eliminado mediante la compresión mecánica del producto resultante
del paso (f). La compresión mecánica del producto resultante del
paso (f) además puede servir para dar al producto resultante del
paso (f) una forma definida deseada.
La compresión del producto resultante del paso
(f) puede realizarse mediante cualquier procedimiento descrito en el
estado de la técnica. Puede emplearse un procedimiento de compresión
"estático", donde el producto resultante del paso (f) permanece
estacionario como, por ejemplo, pero sin limitarse, la aplicación de
una carga estática (por ejemplo, un peso muerto), un hidráulico o
una leva. También puede emplearse un procedimiento de compresión
"dinámico", donde el producto resultante del paso (f) se mueve
durante la compresión como, por ejemplo, mediante la aplicación de
uno o más rodillos o mediante la extrusión a través de un orificio
constrictor.
La compresión mecánica del producto resultante
del paso (f) puede realizarse mediante extrusión, por ejemplo,
mediante el paso del producto resultante del paso (f) a través de un
orificio que lo constriña, por ejemplo, una cámara cónica. La cámara
cónica puede tener paredes porosas, de manera que permitiría la
eliminación del fluido intersticial del producto resultante del paso
(f) mientras éste pasa a su través.
La compresión del producto resultante del paso
(f) puede realizarse mediante la centrifugación del producto
resultante del paso (f). Por ejemplo, el producto resultante del
paso (f) puede colocarse sobre un tubo con el fondo poroso, de
manera que, además de la compresión mecánica, se produciría la
eliminación del líquido intersticial del producto resultante del
paso (f).
La compresión del producto resultante del paso
(f) puede realizarse mediante la aplicación de un globo en su
interior para comprimir el producto resultante del paso (f) contra
una superficie sólida. La superficie sólida puede, por ejemplo,
formar un tubo alrededor del producto resultante del paso (f),
permitiendo la formación de un tejido artificial tubular.
En una realización preferida, la compresión del
producto resultante del paso (f) comprende la aplicación de un peso
encima del producto resultante del paso (f), de manera que se ejerce
una acción mecánica de presión sobre el tejido. Resulta evidente que
cuanto mayor sea el peso menor será el tiempo necesario para obtener
un tejido artificial con las características apropiadas. El peso
empleado para la compresión puede tener una superficie plana o puede
colocarse sobre un material que tenga una superficie plana, por
ejemplo, plástico, cerámica, metal o madera.
En la figura 1 de la presente memoria se muestra
un esquema no limitativo de cómo puede realizarse la
nanoestructuración del producto resultante del paso (f) mediante su
deshidratación y compresión. En dicho esquema puede observarse como
la nanoestructuración puede obtenerse situando el producto
resultante del paso (f) entre dos papeles de filtro estéril, y
colocando sobre el mismo un peso de aproximadamente 250 g
(equivalente a aproximadamente 2.000 N/m^{2}) sobre una superficie
plana de vidrio estéril durante aproximadamente 10 minutos; entre el
tejido y el papel de filtro sobre el que se coloca el peso se puede
disponer un material poroso para evitar que el producto resultante
del paso (f) se adhiera al papel de filtro. El material empleado
para evitar la adherencia debe ser poroso para permitir la salida de
agua desde el tejido hacia el agente deshidratante: dicho material
poroso empleado para evitar la adherencia puede ser, por ejemplo,
pero sin limitarse, una membrana de policarbonato, nylon, vidrio,
cerámica o metal perforado.
En una realización preferida, la compresión del
producto resultante del paso (f) comprende la aplicación de una
presión sobre el mismo. Preferiblemente, la magnitud de la presión
es de entre 1.000 y 5.000 N/m^{2}, más preferiblemente, de entre
1.500 y 2.500 N/m^{2} y, aún más preferiblemente, de
aproximadamente 2.000 N/m^{2}. La aplicación de dicha presión
puede hacerse manual, automática o
semi-automáticamente. El tiempo que se necesita
ejercer la presión depende de la magnitud de la presión aplicada y
puede ser determinado con facilidad por un experto en la materia.
Resulta evidente que cuanto mayor sea la presión menor será el
tiempo necesario para obtener un tejido artificial con las
características apropiadas. La idoneidad del tejido artificial
obtenido mediante la aplicación de una determinada magnitud de
presión durante un determinado periodo de tiempo puede comprobarse
mediante diversos métodos de evaluación conocidos en el estado de la
técnica como, por ejemplo, pero sin limitarse, los descritos en los
ejemplos de esta memoria.
Para inducir la nanoestructuración del producto
resultante del paso (f) pueden emplearse uno o más procedimientos,
de manera secuencial o simultánea. El tiempo requerido para la
nanoestructuración puede ser menor de 12 horas, menor de 6 horas,
menor de 3 horas, menor de 1 hora, menor de 30 minutos, menor de 10
minutos, menor de 2 minutos o menor de 1 minuto. El tiempo requerido
para la nanoestructuración dependerá del procedimiento o
procedimientos empleados, y puede ser determinado con facilidad por
un experto en la materia. La idoneidad del tejido artificial
obtenido mediante la aplicación de un determinado procedimiento
durante un determinado periodo de tiempo puede comprobarse mediante
diversos métodos de evaluación conocidos en el estado de la técnica
como, por ejemplo, pero sin limitarse, los descritos en los ejemplos
de esta memoria.
Un segundo aspecto de la presente invención, se
refiere a un tejido artificial obtenible por el método de la
invención anteriormente descrito (de ahora en adelante, tejido
artificial de la invención).
En una realización preferida de este segundo
aspecto de la invención, el tejido artificial de la invención es un
tejido sustituto de piel o una piel artificial.
En otra realización preferida de este segundo
aspecto de la invención, es un tejido sustituto de vejiga o una
vejiga artificial.
\newpage
En otra realización preferida de este segundo
aspecto de la invención, el tejido artificial de la invención es un
tejido sustituto de uretra o una uretra artificial.
En otra realización preferida de este segundo
aspecto de la invención, el tejido artificial de la invención es un
tejido sustituto de córnea o una córnea artificial.
El tejido artificial obtenible por el método de
la invención se puede cortar en el tamaño deseado y/o disponer en
una conformación adecuada para su uso.
Previamente a su uso, puede evaluarse la
idoneidad del tejido artificial de la invención para ejercer su
función, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante cualquiera de los
procedimientos descritos en los ejemplos de la presente
descripción.
Los fármacos y productos químicos deben ser
evaluados antes de su comercialización en animales de
experimentación. A este respecto, son varios los informes y
directivas aprobados por la Unión Europea que tratan de restringir o
incluso prohibir la experimentación con animales en el sector de los
productos cosméticos (Directiva 76/768/CEE del Consejo Europeo
relativa a la aproximación de las legislaciones de los Estados
Miembros en materia de productos cosméticos), y es de esperar que la
prohibición total sea efectiva durante los próximos años. La Unión
Europea apoya todas las medidas cuyo objetivo principal sea el
bienestar de los animales utilizados con fines experimentales y para
lograr métodos científicos de sustitución para reducir al mínimo el
número de animales utilizados en experimentación (Decisión
1999/575/CE del Consejo, de 23 de marzo de 1998, relativa a la
celebración por la Comunidad del Convenio Europeo sobre la
protección de los animales vertebrados utilizados para
experimentación y otros fines científicos-Diario
Oficial L 222 de 24.08.1999).
Por tanto, un tercer aspecto de la invención se
refiere al uso del tejido artificial de la invención para la
evaluación de un producto farmacológico y/o químico.
Una enfermedad infecciosa, inflamatoria,
genética o degenerativa, un daño físico o químico, o una
interrupción del flujo sanguíneo, pueden dar lugar a una pérdida de
células de un tejido o un órgano. Esta pérdida celular conllevaría
una alteración de la función normal de dicho tejido u órgano; y por
consiguiente, conduciría al desarrollo de enfermedades o secuelas
físicas que merman la calidad de vida de la persona. Por tanto, es
importante tratar de regenerar o y restablecer la función normal de
dichos tejidos u órganos. El tejido o el órgano dañado pueden ser
sustituidos por un tejido u órgano nuevo que haya sido fabricado en
el laboratorio mediante técnicas de ingeniería tisular. El objetivo
de la ingeniería tisular es la construcción de tejidos biológicos
artificiales y la utilización con fines médicos de los mismos para
restaurar, sustituir o incrementar las actividades funcionales de
tejidos y órganos enfermos. La utilidad terapéutica de este tipo de
técnicas es prácticamente ilimitada con aplicaciones en todos los
campos. El empleo de las técnicas de ingeniería tisular permite
disminuir las listas de espera de tejidos y órganos, con la
consiguiente disminución de la morbi-mortalidad de
la enfermedad en el receptor. Lógicamente, también tiene como
consecuencia una disminución de la morbi-mortalidad
en los donantes de órganos. Por otra parte, existen numerosas
ventajas asociadas a la utilización de células o tejidos autólogos
en la ingeniería tisular, destacando: (a) una reducción
significativa del número de infecciones del donante al receptor por
agentes infecciosos; y (b) la ausencia de rechazo inmune injerto
contra huésped, por lo que el paciente no tiene necesidad de tomar
tratamiento inmunosupresor, evitándose los efectos secundarios y los
problemas asociados a la inmunodepresión.
Por tanto, un cuarto aspecto de la invención se
refiere al uso del tejido artificial de la invención para
incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad
funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado.
El tejido artificial de la invención puede
emplearse para incrementar, restaurar o sustituir parcial o
totalmente la actividad funcional de cualquier tejido u órgano
enfermo o dañado de un organismo vivo. El tejido o el órgano pueden
ser internos como, por ejemplo, pero sin limitarse, la uretra o la
vejiga, o externos como, por ejemplo, pero sin limitarse, la córnea
o la piel. En una realización preferida, el tejido o el órgano
dañado se seleccionan de la lista que comprende: piel, vejiga,
uretra, córnea, mucosa oral, conjuntiva, pared abdominal,
conjuntiva, tímpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo,
ligamento, tendón, hueso, meninge o vagina. El tejido o el órgano
pueden estar enfermos o dañados como consecuencia de una disfunción,
una lesión o una enfermedad, por ejemplo, pero sin limitarse, una
enfermedad infecciosa, inflamatoria, genética o degenerativa; un
daño físico como un traumatismo o una intervención quirúrgica, un
daño químico o una interrupción del flujo sanguíneo.
Una realización preferida de este quinto aspecto
se refiere al uso del tejido artificial de la invención para
incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad
funcional de una piel. Una realización más preferida refiere al uso
del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o
sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una piel
enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o
una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una herida,
una úlcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una
infección, una contusión, un traumatismo, una causticación o una
malformación congénita.
Una realización preferida de este quinto aspecto
se refiere al uso del tejido artificial de la invención para
incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad
funcional de una vejiga. Una realización más preferida refiere al
uso del tejido artificial de la invención para incrementar,
restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de
una vejiga enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una
lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una
neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una
malformación congénita (como por ejemplo, pero sin limitarse, una
extrofia vesical, una extrofia de cloaca o una microvejiga), una
vejiga neurógena, una incontinencia urinaria, una disfunción
vesical, una infección o una litiasis vesical.
Una realización preferida de este quinto aspecto
se refiere al uso del tejido artificial de la invención para
incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad
funcional de una uretra. Una realización más preferida refiere al
uso del tejido artificial de la invención para incrementar,
restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de
una uretra enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una
lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una
neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una
malformación congénita (como por ejemplo, pero sin limitarse, un
hispospadias o un epispadias) o una estenosis.
Una realización preferida de este quinto aspecto
se refiere al uso del tejido artificial de la invención para
incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad
funcional de una córnea. Una realización más preferida refiere al
uso del tejido artificial de la invención para incrementar,
restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de
una córnea enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una
lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una
úlcera corneal, un queratocono, un queratoglobo, un descematocele,
un traumatismo, una causticación, una insuficiencia límibica, una
queratitis atrófica, una distrofia corneal, una queratopatía
primaria o secundaria, una infección, un leucoma, una queratopatía
bullosa, un fallo endotelial corneal o una neoplasia benigna o
maligna.
Un quinto aspecto de la presente invención se
refiere al uso del tejido artificial de la invención para la
elaboración de un medicamento.
Dicho medicamento es un medicamento de terapia
celular somática. Se entiende por "terapia celular somática" la
utilización de células somáticas vivas, autólogas, alogénicas o
xenogénicas, cuyas características biológicas han sido alteradas
sustancialmente como resultado de su manipulación, para obtener un
efecto terapéutico, de diagnóstico o preventivo, por medios
metabólicos, farmacológicos o inmunológicos. Entre los medicamentos
de terapia celular somática se encuentran, por ejemplo, pero sin
limitarse: células manipuladas para modificar sus propiedades
inmunológicas, metabólicas o funcionales de otro tipo en aspectos
cualitativos o cuantitativos; células clasificadas, seleccionadas y
manipuladas, que se someten posteriormente a un proceso de
fabricación con el fin de obtener el producto terminado; células
manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por ejemplo,
matrices o productos sanitarios biológicos o inertes) que ejercen la
acción pretendida en principio en el producto acabado; derivados de
células autólogas expresadas ex vivo (in vitro) en
condiciones específicas de cultivo; o células modificadas
genéticamente o sometidas a otro tipo de manipulación para expresar
propiedades funcionales homologas o no homologas anteriormente no
expresadas.
Un quinto aspecto de la presente invención se
refiere al uso del tejido artificial de la invención para la
elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o
sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o
un órgano. En una realización preferida, el tejido o el órgano
dañado se seleccionan de la lista que comprende: piel, vejiga,
uretra, córnea, mucosa oral, conjuntiva, pared abdominal,
conjuntiva, tímpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo,
ligamento, tendón, hueso, meninge o vagina.
Una realización preferida de este quinto aspecto
se refiere al uso del tejido artificial de la invención para la
elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o
sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o
un órgano enfermo o dañado como consecuencia de una enfermedad
infecciosa, inflamatoria, genética o degenerativa, un daño físico o
químico o una interrupción del flujo sanguíneo.
Una realización más preferida de este quinto
aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invención para
la elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o
sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una mucosa
oral. Una realización aún más preferida se refiere al uso del tejido
artificial de la invención para la elaboración de un medicamento
para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la
actividad funcional de una mucosa oral enferma o dañada como
consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad
seleccionada de la lista que comprende: una herida, una úlcera, una
quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una
contusión, un traumatismo, una causticación, una malformación
congénita, una pérdida de sustancia o una enfermedad
periodontal.
Una realización más preferida de este quinto
aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invención para
la elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o
sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una piel.
Una realización aún más preferida se refiere al uso del tejido
artificial de la invención para la elaboración de un medicamento
para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la
actividad funcional de una piel enferma o dañada como consecuencia
de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la
lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una
neoplasia benigna o maligna, una infección, una contusión, un
traumatismo, una causticación o una malformación congénita.
Una realización más preferida de este quinto
aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invención para
la elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o
sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una vejiga.
Una realización aún más preferida de este quinto aspecto se refiere
al uso del tejido artificial de la invención para la elaboración de
un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o
totalmente la actividad funcional de una vejiga enferma o dañada
como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad
seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o
maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita
(como por ejemplo, pero sin limitarse, una extrofia vesical, una
extrofia de cloaca o una microvejiga), una vejiga neurógena, una
incontinencia urinaria, una disfunción vesical, una infección o una
litiasis vesical.
Una realización más preferida de este quinto
aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invención para
la elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o
sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una uretra.
Una realización aún más preferida de este quinto aspecto se refiere
al uso del tejido artificial de la invención para la elaboración de
un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o
totalmente la actividad funcional de una uretra enferma o dañada
como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad
seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o
maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita
(como por ejemplo, pero sin limitarse, un hispospadias o un
epispadias) o una estenosis.
Una realización más preferida de este quinto
aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invención para
la elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o
sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una córnea.
Una realización aún más preferida de este quinto aspecto se refiere
al uso del tejido artificial de la invención para la elaboración de
un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o
totalmente la actividad funcional de una córnea enferma o dañada
como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad
seleccionada de la lista que comprende: una úlcera corneal, un
queratocono, un queratoglobo, un descematocele, un traumatismo, una
causticación, una insuficiencia límibica, una queratitis atrófica,
una distrofia corneal, una queratopatía primaria o secundaria, una
infección, un leucoma, una queratopatía bullosa, un fallo endotelial
corneal o una neoplasia benigna o maligna.
Un sexto aspecto de la invención se refiere a
una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de
la invención.
Una realización preferida de este sexto aspecto
de la invención se refiere a una composición farmacéutica que
comprende el tejido artificial de la invención para su uso en
terapia celular somática.
Una realización más preferida de este sexto
aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica
que comprende el tejido artificial de la invención para incrementar,
restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de
un tejido o un órgano.
Una realización preferida de este sexto aspecto
de la invención se refiere a una composición farmacéutica que
comprende el tejido artificial de la invención para incrementar,
restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de
un tejido o un órgano enfermo o dañado como consecuencia de una
enfermedad infecciosa, inflamatoria, genética o degenerativa, un
daño físico o químico o una interrupción del flujo sanguíneo.
Una realización más preferida de este sexto
aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica
que comprende el tejido artificial de la invención para incrementar,
restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de
una piel. Una realización aún más preferida se refiere a una
composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de la
invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o
totalmente la actividad funcional de una piel enferma o dañada como
consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad
seleccionada de la lista que comprende: una herida, una úlcera, una
quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una
contusión, un traumatismo, una causticación o una malformación
congénita.
Una realización más preferida de este sexto
aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica
que comprende el tejido artificial de la invención para incrementar,
restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de
una vejiga. Una realización aún más preferida se refiere a una
composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de la
invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o
totalmente la actividad funcional de una vejiga enferma o dañada
como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad
seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o
maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita
(como por ejemplo, pero sin limitarse, una extrofia vesical, una
extrofia de cloaca o una microvejiga), una vejiga neurógena, una
incontinencia urinaria, una disfunción vesical, una infección o una
litiasis vesical.
Una realización más preferida de este sexto
aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica
que comprende el tejido artificial de la invención para incrementar,
restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de
una uretra. Una realización aún más preferida se refiere a una
composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de la
invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o
totalmente la actividad funcional de una uretra enferma o dañada
como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad
seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o
maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita
(como por ejemplo, pero sin limitarse, un hispospadias o un
epispadias) o una estenosis.
Una realización más preferida de este sexto
aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica
que comprende el tejido artificial de la invención para incrementar,
restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de
una córnea. Una realización aún más preferida se refiere a una
composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de la
invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o
totalmente la actividad funcional de una córnea enferma o dañada
como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad
seleccionada de la lista que comprende: una úlcera corneal, un
queratocono, un queratoglobo, un descematocele, un traumatismo, una
causticación, una insuficiencia límibica, una queratitis atrófica,
una distrofia corneal, una queratopatía primaria o secundaria, una
infección, un leucoma, una queratopatía bullosa, un fallo endotelial
corneal o una neoplasia benigna o maligna.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, la composición farmacéutica comprende el tejido
artificial de la invención, y además, un vehículo farmacéuticamente
aceptable. En otra realización preferida de este aspecto de la
invención, la composición farmacéutica comprende el tejido
artificial de la invención, y además, otro principio activo. En una
realización preferida de este aspecto de la invención, la
composición farmacéutica comprende el tejido artificial de la
invención y, además, junto con un vehículo farmacéuticamente
aceptable, otro principio activo.
Como se emplea aquí, el término "principio
activo", "substancia activa", "substancia
farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó
"ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier
componente que potencialmente proporcione una actividad
farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura,
mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que
afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros
animales.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden utilizarse en un método de tratamiento de forma
aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Muestra un esquema del procedimiento
empleado para la nanoestructuración del tejido artificial.
Figura 2. Muestra la evaluación de los productos
de mucosa oral humana artificial. A. Análisis mediante el
microscópico óptico de los tejidos de fibrina, agarosa y colágeno
(este último a una concentración final de 2,8 g/L) teñidos con
hematoxilina y eosina tras 1, 2, 3 y 4 semanas de desarrollo en
cultivo y del estroma de la mucosa oral humana utilizada como
control. B. Análisis mediante el microscopio electrónico de barrido
de los tejidos artificiales basados en fibrina, agarosa y colágeno
con una concentración final preferida de colágeno de 2,8 g/L (A) en
comparación con los tejidos artificiales de fibrina, agarosa y
colágeno con una concentración final de colágeno de 3,8 g/L (B), de
fibrina, agarosa y colágeno con una concentración final de colágeno
de 1,9 g/L (C), o de colágeno a una concentración final de 5,6 g/L
en ausencia de fibrina y agarosa (D) y del estroma de la mucosa oral
humana normal utilizada como control (E). C. Esfuerzo umbral de los
tejidos artificiales basados en fibrina, agarosa y colágeno con una
concentración final preferida de colágeno de 2,8 g/L (A) en
comparación con los tejidos artificiales de fibrina, agarosa y
colágeno con una concentración final de colágeno de 3,8 g/L (B), de
fibrina, agarosa y colágeno con una concentración final de colágeno
de 1,9 g/L (C), o de colágeno a una concentración final de 5,6 g/L
en ausencia de fibrina y agarosa (D).
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos específicos que se
proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la
naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen
solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como
limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los
ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el
campo de aplicación de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Para establecer cultivos primarios de células
epiteliales (células epiteliales de la mucosa oral) y estromales
(fibroblastos), se utilizan biopsias de mucosa oral normal
procedente de donantes humanos o de animales de laboratorio,
utilizando los siguientes métodos y protocolos:
- Obtención de una biopsia de la mucosa oral y
transporte al laboratorio en suero fisiológico estéril.
- Aislamiento y cultivo de células epiteliales y
estromales utilizando técnicas estándar de digestión enzimática
(tripsina o dispasa para aislamiento epitelial y colagenasa para el
estroma) o de explante tisular.
- Cultivo en medios específicos para células
epiteliales o estromales hasta alcanzar la confluencia celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los cultivos se mantienen en un incubador
a 37ºC con un 5% de CO_{2} en ambiente húmedo siguiendo protocolos
estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada
3 días hasta que las células alcanzan la confluencia en cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
1- Generación de sustitutos del estroma tisular
con células estromales inmersas en su espesor. Para preparar 20 ml
de sustituto estromal:
a.-Preparar 10 ml de colágeno tipo I líquido
tomando un volumen de colágeno líquido concentrado a 6,4 mg/ml de
8,81 ml. Añadir 1,1 ml de PBS 10X y ajustar el pH a 7,4\pm0,2
mediante la adición de aproximadamente 90 \muL de NaOH. Para
elevar el pH se suele emplear NaOH a una concentración de entre 0,1
y 1 M, aunque también pueden emplearse otros productos. Mezclar
mediante agitación suave y mantener en hielo para evitar la
gelificación prematura.
b.- Preparar 10 ml de una mezcla de fibrina y
agarosa procediendo del siguiente modo:
- -
- Obtención de 7,6 ml de plasma sanguíneo humano procedente de donación (posibilidad de origen autólogo).
- -
- Adición de 150.000 células estromales previamente cultivadas y resuspendidas en 750 \mul de medio de cultivo DMEM.
- -
- Adición de 150 \mul de ácido tranexámico para evitar la fibrinolisis del gel de fibrina.
- -
- Adición de 1 ml de ClCa2 al 1% para inducir la reacción de coagulación y generar una red de fibras de fibrina.
- -
- Adición rápida de 0,5 ml de agarosa tipo VII al 2% disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusión y mezclado suave mediante agitación. La concentración final de agarosa en la mezcla será del 0,1%. El rango de concentraciones de agarosa que permite productos de mucosa oral viables oscila entre y 0,025% y 0,3% y deberá establecerse en relación con el paciente objeto de su utilización.
c.- Mezclar ambas soluciones (de colágeno y de
fibrina-agarosa) en proporción variable en
dependencia del producto que se quiera generar. En todos los casos,
mezclar lo más rápidamente posible ambas soluciones, manteniendo la
solución de colágeno en frío hasta el momento exacto de la
mezcla.
- -
- Para generar el producto A (2,8 g/L de colágeno, 1,25 g/L de fibrina y 0,5 g/L de agarosa), añadir 10 ml de la solución de colágeno y 10 ml de la solución de fibrina-agarosa.
- -
- Para generar el producto B (3,8 g/L de colágeno, 0,6 g/L de fibrina y 0,25 g/L de agarosa), añadir 15 ml de la solución de colágeno y 5 ml de la solución de fibrina-agarosa.
- -
- Para generar el producto C (1,9 g/L de colágeno, 1,9 g/L de fibrina y 0,75 g/L de agarosa), añadir 5 ml de la solución de colágeno y 15 ml de la solución de fibrina-agarosa.
d.- Alicuotar lo antes posible en insertos
porosos de cultivo celular o en placas de Petri estériles.
e.- Dejar polimerizar en reposo durante al menos
30 min en incubador a 37ºC.
2- Desarrollo de una capa de epitelio en la
superficie del sustituto estromal mediante subcultivo de las células
epiteliales de la mucosa oral sobre el sustituto estromal. Cubrir
con medio de cultivo específico para células epiteliales.
3- Mantener en incubador a 37ºC con un 5% de
CO_{2} en ambiente húmedo siguiendo protocolos estándar de cultivo
celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 días hasta que las
células epiteliales alcanzan la confluencia en la superficie del
sustituto estromal (alrededor de una semana).
4- Exponer la superficie epitelial al aire
(técnica aire líquido) manteniendo el sustituto estromal sumergido
en medio de cultivo para promover la estratificación y la maduración
del epitelio (alrededor de una semana).
5- Extraer el tejido artificial de la superficie
de cultivo y proceder a su deshidratación parcial depositando el
mismo sobre un papel de filtro estéril de 3-5 mm de
espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio estéril.
Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con
alcohol 70% sobre la superficie del sustituto estromal para evitar
que la capa epitelial del sustituto tisular se adhiera al papel de
filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro estéril de
3-5 mm de grosor sobre el sustituto estromal
cubierto por tela. Depositar un fragmento plano de vidrio estéril en
su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso
sobre éste (Figura 1) Todo el proceso se ha de llevar a cabo en
campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
El objetivo de este proceso es reducir significativamente los
niveles de hidratación del producto para alcanzar niveles óptimos de
consistencia y elasticidad.
6- Una vez deshidratado el tejido, cortarlo a
medida dándole la forma deseada, utilizando hilo de sutura
quirúrgica monofilamento. Hemos de destacar que el deshidratado del
tejido resulta en adecuados niveles de consistencia y elasticidad,
permitiendo llevar a cabo la sutura sin ninguna dificultad.
\vskip1.000000\baselineskip
1- Generación de sustitutos del estroma tisular
con células estromales inmersas en su espesor. Para preparar 20 ml
de sustituto estromal:
- -
- Tomar 17,62 ml de colágeno líquido concentrado a 6,4 mg/ml; añadir 1,45 ml de PBS 10X y ajustar el pH a 7,4\pm0,2 mediante la adición de aproximadamente 180 \muL de NaOH. Para elevar el pH se suele emplear NaOH a una concentración de entre 0,1 y 1 M, aunque también pueden emplearse otros productos. Mezclar mediante agitación suave y mantener en hielo para evitar la gelificación prematura.
- -
- Adición de 150.000 células estromales previamente cultivadas y resuspendidas en 750 \mul de medio de cultivo DMEM.
- -
- Alicuotar lo antes posible en insertos porosos de cultivo celular o en placas de Petri estériles.
- -
- Dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min en incubador a 37ºC.
2- Desarrollo de una capa de epitelio en la
superficie del sustituto estromal mediante subcultivo de las células
epiteliales de la mucosa oral sobre el sustituto estromal. Cubrir
con medio de cultivo específico para células epiteliales.
3- Mantener en incubador a 37ºC con un 5% de
CO_{2} en ambiente húmedo siguiendo protocolos estándar de cultivo
celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 días hasta que las
células epiteliales alcanzan la confluencia en la superficie del
sustituto estromal (alrededor de una semana).
4- Exponer la superficie epitelial al aire
(técnica aire líquido) manteniendo el sustituto estromal sumergido
en medio de cultivo para promover la estratificación y la maduración
del epitelio (alrededor de una semana).
5- Extraer el tejido artificial de la superficie
de cultivo y proceder a su deshidratación parcial depositando el
mismo sobre un papel de filtro estéril de 3-5 mm de
espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio estéril.
Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con
alcohol 70% sobre la superficie del sustituto estromal para evitar
que la capa epitelial del sustituto tisular se adhiera al papel de
filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro estéril de
3-5 mm de grosor sobre el sustituto estromal
cubierto por tela. Depositar un fragmento plano de vidrio estéril en
su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso
sobre éste (Figura 1). Todo el proceso se ha de llevar a cabo en
campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10
minutos.
6- Una vez deshidratado el tejido, cortarlo a
medida dándole la forma deseada, utilizando hilo de sutura
quirúrgica monofilamento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la evaluación de los productos
obtenidos según el protocolo anterior. Las concentraciones de
fibrina, agarosa y colágeno para cada uno de los productos
elaborados se indican a continuación:
- A.-
- fibrina (1,25 g/L), agarosa (0,5 g/L) y colágeno (2,8 g/L).
- B.-
- fibrina (0,6 g/L), agarosa (0,25 g/L) y colágeno (3,8 g/L).
- C.-
- fibrina (1,9 g/L), agarosa (0,75 g/L) y colágeno (1,9 g/L).
- D.-
- fibrina (0 g/L), agarosa (0 g/L) y colágeno (5,6 g/L).
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis microscópico reveló que los tejidos
artificiales generados mediante ingeniería tisular presentaban
analogía estructural con los tejidos nativos utilizados como
control. En concreto, se pudo apreciar un estroma compuesto por
numerosas fibras entre las que se disponían las células estromales,
mostrando adecuados niveles de proliferación celular. En comparación
con otros modelos previamente descritos (especialmente, los modelos
de fibrina y de fibrina con agarosa), los tejidos de fibrina,
agarosa y colágeno presentan mayor densidad fibrilar a nivel del
estroma. Todo ello sugiere que los productos tisulares construidos
en base al protocolo arriba expuesto, son compatibles con los
tejidos humanos nativos normales.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de las propiedades biomecánicas de
los productos tisulares construidos en base al protocolo arriba
expuesto mediante un reómetro. Los resultados se muestran en la
figura 2C y revelan que el mejor tejido es el producto A seguido del
C, siendo el B muy similar al D (colágeno sólo). Por tanto, el
análisis realizado demostró una mejora del comportamiento
viscoelástico y un esfuerzo umbral creciente según se aumenta la
concentración de colágeno, y más elevado que el mostrado por los
tejidos artificiales de colágeno.
Los datos presentados en estos ejemplos muestran
que las propiedades físicas de los tejidos de fibrina, agarosa y
colágeno son óptimas y similares a las de los tejidos humanos
normales utilizados como control, lo que supone una mejora con
respecto a los tejidos artificiales descritos con respecto a su
utilización clínica.
Claims (34)
1. Método in vitro de preparación de un
tejido artificial que comprende:
- a)
- añadir una composición que comprende fibrinógeno a una muestra de células aisladas,
- b)
- añadir un agente antifibrinolítico al producto resultante del paso (a),
- c)
- añadir, al menos, un factor de coagulación, una fuente de calcio, trombina, o cualquier combinación de los anteriores al producto resultante del paso (b),
- d)
- añadir una composición de un polisacárido al producto resultante del paso (c),
- e)
- añadir una composición que comprende una proteína tipo colágeno al producto resultante del paso (d),
- f)
- cultivar células aisladas en o sobre el producto resultante del paso (e), y
- g)
- inducir la nanoestructuración del producto resultante del paso (f).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1 donde la
proteína añadida en el paso (e) es colágeno.
3. Método según la reivindicación 2 donde el
colágeno es colágeno tipo I.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 donde la inducción de la nanoestructuración
del paso (g) comprende la deshidratación y/o la compresión mecánica
del producto resultante del paso (f).
5. Método según la reivindicación 4 donde la
deshidratación del producto resultante del paso (f) comprende un
procedimiento seleccionado de la lista que comprende: drenaje,
evaporación, succión, presión capilar, ósmosis o
electro-ósmosis.
6. Método según la reivindicación 5 donde la
deshidratación del producto resultante del paso (f) mediante presión
capilar comprende la aplicación de un material absorbente sobre el
producto resultante del paso (f).
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6 donde la compresión mecánica del paso (g)
comprende un procedimiento seleccionado de la lista que comprende:
aplicación de una carga estática, aplicación de u hidráulico,
aplicación de una leva, aplicación de uno o más rodillos, aplicación
de un globo, extrusión o centrifugación.
8. Método según la reivindicación 7 donde la
aplicación de una carga estática del paso (g) comprende la
colocación de un peso sobre el producto resultante del paso (f).
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 que además comprende un paso entre el paso
(b) y el paso (c) en el que se añade una proteína.
10. Método según la reivindicación 9 donde la
proteína añadida entre el paso (b) y el paso (c) es
fibronectina.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 donde entre el paso (f) y el paso (g) hay un
paso adicional en el que el producto resultante del paso (f) se
expone al aire.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 donde la composición que contiene
fibrinógeno del paso (a) es plasma sanguíneo.
13. Método según la reivindicación 12 donde el
plasma sanguíneo es de origen autólogo.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13 donde el agente antifibrinolítico del paso
(b) es ácido tranexámico.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14 donde la fuente de calcio del paso (c) es
una sal de calcio.
16. Método según la reivindicación 15 donde la
sal de calcio del paso (c) es cloruro cálcico.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16 donde el polisacárido del paso (d) es
agarosa.
18. Método según la reivindicación 17 donde la
agarosa es de tipo VII.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18 donde las células del paso (a) son
fibroblastos.
20. Método según la reivindicación 19 donde los
fibroblastos proceden del estroma de un tejido o un órgano
seleccionado de la lista que comprende: mucosa oral, vejiga, o
uretra.
21. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20 donde las células del paso (f) comprenden
células epiteliales.
22. Método según la reivindicación 21 donde las
células epiteliales del paso (f) se seleccionan de la lista que
comprende: células del urotelio, células del epitelio de la uretra,
o células del epitelio de la mucosa oral.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22 donde las células del paso (a) y/o las
células del paso (f) son de origen autólogo.
24.Tejido artificial obtenible por el método
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.
25. Uso del tejido artificial según la
reivindicación 24 para la evaluación de un producto farmacológico
y/o químico.
26. Uso del tejido artificial según la
reivindicación 24 para la elaboración de un medicamento.
27. Uso del tejido artificial según la
reivindicación 26 para la elaboración de un medicamento para
incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad
funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado.
28. Uso del tejido artificial según la
reivindicación 27 donde el tejido o el órgano dañado se selecciona
de la lista que comprende: vejiga, uretra o mucosa oral.
29. Uso del tejido artificial según la
reivindicación 28 para la elaboración de un medicamento para
incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad
funcional de una mucosa oral enferma o dañada como consecuencia de
una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista
que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia
benigna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una
causticación, una malformación congénita, una pérdida de sustancia o
una enfermedad periodontal.
30. Uso del producto de tejido artificial según
la reivindicación 28 donde la vejiga está enferma o dañada como
consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad
seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o
maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita,
una vejiga neurógena, una incontinencia urinaria, una disfunción
vesical, una infección o una litiasis vesical.
31. Uso del producto de tejido artificial según
la reivindicación 28 donde la uretra está enferma o dañada como
consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad
seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o
maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita o
una estenosis.
32. Composición farmacéutica que comprende el
tejido artificial según la reivindicación 24.
33. Composición farmacéutica según la
reivindicación 32 que comprende, además, un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
34. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 32 ó 33 que comprende, además, otro principio
activo.
Priority Applications (11)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200930943A ES2362139B1 (es) | 2009-11-02 | 2009-11-02 | Elaboración de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina, agarosa y colágeno. |
DK10811319.2T DK2471902T3 (en) | 2009-08-25 | 2010-08-25 | Preparation of artificial tissues by tissue engineering with agarose-fibrin biomaterials |
JP2012526090A JP6010460B2 (ja) | 2009-08-25 | 2010-08-25 | フィブリンおよびアガロース生体材料を用いる組織工学による、人工組織の製造 |
EP10811319.2A EP2471902B9 (en) | 2009-08-25 | 2010-08-25 | Production of artificial tissues by means of tissue engineering using agarose-fibrin biomaterials |
PT108113192T PT2471902T (pt) | 2009-08-25 | 2010-08-25 | Produção de tecidos artificiais por meio da engenharia de tecidos utilizando biomateriais de agarose-fibrina |
US13/392,445 US20120269776A1 (en) | 2009-08-25 | 2010-08-25 | Productions of artificial tissues by means of tissue engineering using agarose-fibrin biomaterials |
PCT/ES2010/070569 WO2011023843A2 (es) | 2009-08-25 | 2010-08-25 | Elaboración de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa |
TR2018/09713T TR201809713T4 (tr) | 2009-08-25 | 2010-08-25 | Agaroz-fibrin biyomalzemelerini kullanarak doku mühendisliğiyle yapay doku üretimi. |
ES10811319.2T ES2677945T3 (es) | 2009-08-25 | 2010-08-25 | Producción de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa |
JP2016042311A JP2016165280A (ja) | 2009-08-25 | 2016-03-04 | フィブリンおよびアガロース生体材料を用いる組織工学による、人工組織の製造 |
US16/297,070 US20190247541A1 (en) | 2009-08-25 | 2019-03-08 | Preparation of artificial tissues by means of tissue engineering using fibrin and agarose biomaterials |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200930943A ES2362139B1 (es) | 2009-11-02 | 2009-11-02 | Elaboración de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina, agarosa y colágeno. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2362139A1 true ES2362139A1 (es) | 2011-06-29 |
ES2362139B1 ES2362139B1 (es) | 2012-06-11 |
Family
ID=44320310
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES200930943A Active ES2362139B1 (es) | 2009-08-25 | 2009-11-02 | Elaboración de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina, agarosa y colágeno. |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
ES (1) | ES2362139B1 (es) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023194445A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Servicio Andaluz De Salud | Biomimetic model of non-melanoma skin cancer and uses thereof |
-
2009
- 2009-11-02 ES ES200930943A patent/ES2362139B1/es active Active
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Perka, C., et al. Joint cartilage repair with transplantation of embryonic chondrocytes embedded in collagen-fibrin matrices. Clinical and experimental rheumatology. Enero 2000. Vol. 18, nº 1, páginas 13-22. ISSN 0392-856X. Ver todo el documento, especialmente el apartado Materiales y Métodos. * |
Sanchez-Quevedo, M. C., et al. Histological and histochemical evaluation of human oral mucosa constructs developed by tissue engineering. Histology and histopathology. Junio 2007. Vol. 22, nº 6, páginas 631-640. ISSN 1699-5848 (Electrónico). Ver todo el documento, especialmente los apartados 4 y 5 de Materiales y Métodos y apartados 1 y 2 de Resultados. * |
Shih Yu-Ru, V., et al. Growth of mesenchymal stem cells on electrospun type I collagen nanofibers. Stem cells (Dayton, Ohio). Noviembre 2006. Vol. 24, nº 11, páginas 2391-2397. ISSN 1066-5099. Ver todo el documento, especialmente el apartado Materiales y Métodos. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023194445A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Servicio Andaluz De Salud | Biomimetic model of non-melanoma skin cancer and uses thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2362139B1 (es) | 2012-06-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2677945T3 (es) | Producción de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa | |
Jin et al. | Three-dimensional bioprinting of a full-thickness functional skin model using acellular dermal matrix and gelatin methacrylamide bioink | |
ES2219432T3 (es) | Cabestrillos o parches fasciales artificiales. | |
CN103555655B (zh) | 自脐带羊膜分离和培养干/祖细胞及其分化的细胞的应用 | |
US20080039940A1 (en) | Biological Tissue Sheet, Method Of Forming The Same And Transplantation Method By Using The Sheet | |
RU2498808C2 (ru) | Способ лечения состояния ротовой полости больного (варианты) | |
CN101505796A (zh) | 使用干细胞产物进行软组织修复和再生 | |
JPWO2014104366A1 (ja) | ヒト角膜内皮細胞シート | |
Nosrati et al. | Stem cell-based therapeutic strategies for corneal epithelium regeneration | |
CN105874060A (zh) | 间皮细胞在组织生物工程和人造组织中的用途 | |
Qi et al. | Construction and characterization of human oral mucosa equivalent using hyper-dry amniotic membrane as a matrix | |
WO2018069563A1 (es) | Membranas bioartificiales de rigidez y viscoelasticidad controlada para su utilización en ingeniería tisular | |
CN111450319B (zh) | 一种仿生的预脉管化材料及其制备方法和应用 | |
CN108126246A (zh) | 基于复合干细胞的人工皮肤构建方法 | |
Zheng et al. | Ovary-derived decellularized extracellular matrix-based bioink for fabricating 3D primary ovarian cells-laden structures for mouse ovarian failure correction | |
Wang et al. | Hybrid hydrogel composed of hyaluronic acid, gelatin, and extracellular cartilage matrix for perforated TM repair | |
ES2362139B1 (es) | Elaboración de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina, agarosa y colágeno. | |
ES2353990B1 (es) | Elaboracion de tejidos artificiales mediante ingenieria tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa. | |
Grolik et al. | Silicone-modified chitosan membranes for corneal epithelium tissue engineering | |
ES2304321B1 (es) | Procedimiento de obtencion de estructuras tridimensionales para ingenieria tisular. | |
RU2736480C2 (ru) | Способ производства коллаген-ламининового матрикса для заживления язв, ожогов и ран кожи человека | |
Makuloluwa | Development of a Synthetic Substrate for Conjunctival Cell Transplantation | |
Senthilkumar et al. | Engraftment and proliferation of thermoreversible-gelation-polymer-encapsulated human corneal limbal-stem-cells on ocular surface of a cadaver cornea | |
Venugopal et al. | Stem cell–based therapeutic approaches toward corneal regeneration | |
Frazão | The decellularized human chorion membrane as a new biomaterial: characterization and applications |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC2A | Transfer of patent |
Owner name: SERVICION ANDALUZ DE SALUD Effective date: 20110808 |
|
FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2362139 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20120611 |