CN113274556A - 一种水凝胶人工血管及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种水凝胶人工血管及其制备方法和应用。所述水凝胶人工血管由内到外依次包括水凝胶内皮细胞层、水凝胶平滑肌细胞层和水凝胶成纤维细胞层。本发明成功提取了猪脂肪来源的水凝胶；并种植了3种血管细胞进去，从而成功形成了三层血管结构；且也已经搭建出模拟血流的体外循环泵，可以模拟真实血管收缩舒张的能力，并将该人工血管植入兔子的颈动脉模型中，用来验证体内的通畅性。

Description

一种水凝胶人工血管及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水凝胶人工血管及其制备方法和应用。
背景技术
心血管疾病现如今是全世界高致死率的疾病之一，其中冠状动脉粥样硬化心脏病(冠心病)是最为棘手的后天疾病之一。而冠心病往往因为血管中存在斑块从而堵塞血管影响心脏的供血，严重地会引起心肌梗死和猝死。冠状动脉搭桥手术，就是通过移植血管跨越狭窄的部分，但是人体的自体动脉血管来源有限。现如今的解决方案主要有人工血管替换自体血管。大口径的人工血管(>6mm)由聚四氟乙烯制造的人工血管可以在大口径血管置换手术中取得了很好的效果，但是小口径人工血管(<6mm)仍然存在着很容易堵塞的情况。
目前，小口径人工血管的制备方法主要有脱细胞基质、自卷曲人工血管、仿生生物材料等。脱细胞基质的方法主要将血管模具植入动物皮下数月，然后取出进行脱细胞处理；自卷曲人工血管的方法主要是通过制备高分子薄膜，用芯轴将薄膜卷曲成管状形成人工血管；而仿生生物材料主要是通过水凝胶、可降解高分子通过交联的方法形成管状的人工血管。因此，针对小口径的人工血管的制备，需要更多的优化来提高其通畅性。
近年来的临床研究显示，大多数方法作为支架直接植入宿主组织中，通过重塑过程形成通畅的人工血管。但是血流与移植物的复杂作用会引起炎症反应，从而引起移植血管的堵塞。真实的血管往往具有三层结构，内层是内皮细胞，中层是平滑肌细胞，外层是成纤维细胞。内皮细胞可以防止血栓形成，平滑肌细胞提供血管收缩膨胀时的张力，成纤维细胞提供外部支撑力。真实的血管结构有利于长期稳定，因此模拟真正的血管结构对于人工血管来说是有价值的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种水凝胶人工血管及其制备方法和应用。所述水凝胶人工血管是一种生物相容性高，不易堵塞的血管，选用猪脂肪来源提取的水凝胶，具有来源广、价格便宜等优势；且脱细胞后的细胞基质用于形成水凝胶，再加入三种血管细胞培养后，形成三层结构的仿生血管，具有很好的抗凝以及对仿生血管的支撑作用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种水凝胶人工血管，所述水凝胶人工血管由内到外依次包括水凝胶内皮细胞层、水凝胶平滑肌细胞层和水凝胶成纤维细胞层。
由于现有的技术都是只模拟了一层或者两层的血管结构，没有模拟三层，并且这些小口径血管的体内通畅性并不高，而本发明模拟了真正血管的三层结构，通过脂肪来源的水凝胶构建了具有三层细胞结构的人工血管，3种细胞分层混入水凝胶中，形成三层细胞结构的仿生人工血管，从而提高小口径人工血管的通畅性。
优选地，所述水凝胶人工血管的口径小于6mm，例如可以是5.9mm、5.8mm、5.6mm、5.5mm、5.2mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm等，优选为2-3mm。
其中，水凝胶人工血管的口径指的是不包括血管的厚度的内径值(直径)。
优选地，所述水凝胶内皮细胞层、所述水凝胶平滑肌细胞层或所述水凝胶成纤维细胞层的厚度各自独立地为0.5-1.0mm，例如可以是0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm等。
优选地，所述水凝胶人工血管的制备原料包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和水凝胶。
优选地，所述水凝胶由以下制备方法制备得到：
(a)将猪的脂肪组织冻融后，与水混合匀浆，离心，得到沉淀物一；
(b)将步骤(a)得到的沉淀物一浸泡于表面活性剂溶液中，震荡后洗涤，再浸泡于醇溶液中，得到除脂产物；
(c)将步骤(b)得到的除脂产物浸泡于缓冲溶液中，洗涤，离心，得到沉淀物二；
(d)将步骤(c)得到的沉淀物二浸泡于胃蛋白酶盐溶液中，搅拌，再调节pH，得到所述水凝胶。
在本发明中，所述水凝胶由上述特定的制备方法制备得到，由于是猪来源的脂肪，比较容易获得，且制备方式简单，容易大批量生产；同时猪脂肪来源的细胞外基质与人体很相似，具有很好的力学强度和生物安全性，脱细胞后的细胞基质用于形成水凝胶，再加入三种血管细胞培养后，能很好地形成三层结构的仿生血管，相较一般基质具有很好的抗凝以及对仿生血管的支撑作用。
优选地，步骤(a)中，所述冻融的温度为-90～-70℃，例如可以是-90℃、-85℃、-80℃、-75℃、-70℃等，所述冻融的次数为1-5次，例如可以是1次、2次、3次、4次、5次等，所述冻融的时间为8-10h，例如可以是8h、8.5h、9h、9.5h、10h等。其中，需将剥离猪的脂肪组织，用清水洗净后将其放入绞肉机内搅碎再进行冻融。
优选地，步骤(a)中，所述猪的脂肪组织与水的体积比为(1-3):1，例如可以是1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1等。
优选地，步骤(a)中，所述匀浆的转速为4000-5000rpm，例如可以是4000rpm、4200rpm、4400rpm、4600rpm、4800rpm、5000rpm等，所述匀浆的时间为5-15min，例如可以是5min、7min、9min、11min、13min、15min等。
优选地，步骤(a)中，所述离心的转速为1000-1500rpm，例如可以是1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm、1500rpm等，所述离心的时间为5-15min，例如可以是5min、7min、9min、11min、13min、15min等。
优选地，步骤(b)中，所述沉淀物一、表面活性剂溶液和醇溶液的质量比为1:(0.5-0.6):(3-4)；
其中，“0.5-0.6”例如可以是0.5、0.52、0.54、0.56、0.58、0.6等；
其中，“3-4”例如可以是3、3.2、3.4、3.6、3.8、4等。
优选地，步骤(b)中，所述表面活性剂溶液为Triton-X100溶液，优选为0.5-2wt％(例如可以是0.5wt％、0.6wt％、0.8wt％、1wt％、1.2wt％、1.5wt％、2wt％等)的Triton-X100溶液。
优选地，步骤(b)中，所述震荡的转速为1000-1500rpm，例如可以是1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm、1500rpm等，所述震荡的时间为0.5-2h，例如可以是0.5h、0.8h、1h、1.2h、1.5h、2h等。
优选地，步骤(b)中，所述洗涤采用超纯水，所述洗涤的次数在3次以上，例如可以是3次、4次、5次等，每次洗涤的时间为20-40min，例如可以是20min、25min、30min、35min、40min等，每次洗涤的超纯水用量为10-15mL，例如可以是10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL等。
优选地，步骤(b)中，所述醇溶液为异丙醇。
优选地，步骤(b)中，所述浸泡于醇溶液的温度为10-40℃，例如可以是10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃等，所述浸泡于醇溶液的时间为8-24h，例如可以是8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h等。
优选地，步骤(c)中，所述除脂产物和缓冲溶液的质量比为1:(3-4)，例如可以是1:3、1:3.2、1:3.4、1:3.6、1:3.8、1:4等。
优选地，步骤(c)中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，优选为4-5wt％(例如可以是4wt％、4.2wt％、4.4wt％、4.6wt％、4.8wt％、5wt％等)的磷酸盐缓冲液。
优选地，步骤(c)中，所述缓冲溶液中还包括脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)，优选为所述缓冲溶液中包括50-150U/mL(例如可以是50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、110U/mL、120U/mL、130U/mL、140U/mL、150U/mL等)的脱氧核糖核酸酶和50-150μg/mL(例如可以是50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120μg/mL、130μg/mL、140μg/mL、150μg/mL等)的核糖核酸酶。
优选地，步骤(c)中，所述洗涤采用超纯水，所述洗涤的次数在3次以上，例如可以是3次、4次、5次等，每次洗涤的时间为20-40min，例如可以是20min、25min、30min、35min、40min等，每次洗涤的超纯水用量为10-15mL，例如可以是10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL等。
优选地，步骤(c)中，所述离心的转速为1000-1500rpm，例如可以是1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm、1500rpm等，所述离心的时间为5-10min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min等。
优选地，步骤(d)中，所述沉淀物二和胃蛋白酶盐溶液的质量体积比为(5-20)mg:(0.5-2)mL；
其中，“5-20”例如可以是5、6、8、10、12、14、16、18、20等；
其中，“0.5-2”例如可以是0.5、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2等。
优选地，步骤(d)中，所述胃蛋白酶盐溶液包括：0.5-2mg/mL(例如可以是0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL等)的胃蛋白酶、0.005-0.02mol/L(例如可以是0.005mol/L、0.01mol/L、0.015mol/L、0.02mol/L等)的HCl，溶剂为水。
优选地，步骤(d)中，所述搅拌的转速为1000-1500rpm，例如可以是1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm、1500rpm等，所述搅拌的温度为5℃以下，例如可以是5℃、4℃、3℃、2℃、1℃等，所述搅拌的时间为60-80h，例如可以是60h、65h、68h、70h、72h、75h、80h等。
优选地，步骤(d)中，所述调节pH为调节pH至6.8-7.2，例如可以是6.8、6.9、7、7.1、7.2等。
优选地，步骤(d)中，所述调节pH采用NaOH溶液和磷酸盐缓冲液，优选为0.05-0.2mol/L(例如可以是0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L等)的NaOH溶液和4-5wt％(例如可以是4wt％、4.2wt％、4.4wt％、4.6wt％、4.8wt％、5wt％等)磷酸盐缓冲液。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的水凝胶人工血管的制备方法，所述水凝胶人工血管的制备方法包括以下步骤：
(1)分别培养内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞；
(2)将培养得到的内皮细胞进行消化后，与水凝胶混合，进行培养，形成水凝胶内皮细胞层；
(3)将培养得到的平滑肌细胞进行消化后，与水凝胶混合，包裹于水凝胶内皮细胞层的外层，进行培养，形成水凝胶平滑肌细胞层；
(4)将培养得到的成纤维细胞进行消化后，与水凝胶混合，包裹于水凝胶平滑肌细胞层的外层，进行培养，形成水凝胶成纤维细胞层。
优选地，步骤(1)中，所述培养均采用DMEM培养基。
优选地，所述DMEM培养基中还包括胎牛血清和双抗。
优选地，所述胎牛血清的添加量为所述DMEM培养基质量的5-15％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。
优选地，所述双抗的添加量为所述DMEM培养基质量的0.5-2％，例如可以是0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％等。
优选地，步骤(1)中，所述培养均在1-10％(例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等)的CO2的氛围下进行。
优选地，步骤(1)中，所述内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞培养的温度各自独立地为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，培养的时间各自独立地为36-60h，例如可以是36h、40h、42h、44h、46h、48h、50h、52h、54h、56h、58h、60h等。
优选地，步骤(2)、(3)和(4)中，所述消化均采用添加胰酶溶液的方式进行。
优选地，所述胰酶溶液的浓度为2-3wt％，例如可以是2wt％、2.2wt％、2.4wt％、2.6wt％、2.8wt％、3wt％等。
优选地，步骤(2)、(3)和(4)中，所述消化的温度各自独立地为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，所述消化的时间各自独立地为1-5min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min等。
优选地，步骤(2)、(3)和(4)中，所述消化的终止均采用添加培养基的方式。
优选地，所述终止用培养基为DMEM培养基。
优选地，所述DMEM培养基中还包括胎牛血清和双抗。
优选地，所述胎牛血清的添加量为所述DMEM培养基质量的5-15％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。
优选地，所述双抗的添加量为所述DMEM培养基质量的0.5-2％，例如可以是0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％等。
优选地，步骤(2)、(3)和(4)中，所述消化的具体操作为：将2.5wt％的胰酶取出1mL加入到培养皿里，等待3分钟后，加入培养基终止消化，然后用枪头冲洗消化完毕的细胞。
优选地，步骤(2)中，所述培养得到的内皮细胞和水凝胶的质量比为(0.1-0.2):(10-15)；
其中，“0.1-0.2”例如可以是0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2等；
其中，“10-15”例如可以是10、11、12、13、14、15等。
优选地，步骤(3)中，所述培养得到的平滑肌细胞和水凝胶的质量比为(0.1-0.2):(10-15)；
其中，“0.1-0.2”例如可以是0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2等；
其中，“10-15”例如可以是10、11、12、13、14、15等。
优选地，步骤(4)中，所述培养得到的成纤维细胞和水凝胶的质量比为(0.1-0.2):(10-15)；
其中，“0.1-0.2”例如可以是0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2等；
其中，“10-15”例如可以是10、11、12、13、14、15等。
优选地，步骤(2)、(3)和(4)中，所述培养的温度各自独立地为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，所述培养的时间各自独立地为22-26h，例如可以是22h、23h、24h、25h、26h等。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的水凝胶人工血管在制备体外模拟血流循环装置中的应用。
在本发明中，所述水凝胶人工血管可用于搭建出模拟血流的体外循环泵，模拟真实血管收缩舒张的能力。
第四方面，本发明提供一种所述的水凝胶人工血管在制备体内血管植入装置中的应用。
在本发明中，所述水凝胶人工血管可以植入兔子的颈动脉模型中，用来验证体内的通畅性。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过模拟真实的血管结构，构建了具有三层血管细胞结构(内皮、平滑肌、成纤维)的人工血管，用来提高小口径人工血管的通畅性；
(2)本发明已经搭建出模拟血流的体外循环泵，可以模拟真实血管收缩舒张的能力；且人工血管正在植入兔子的颈动脉模型中，用来验证体内的通畅性。
附图说明
图1为实施例1制备得到的猪脂肪来源的细胞外基质粉末实物图。
图2为实施例1提供的水凝胶人工血管在模具中的实物图。
图3为实施例1提供的水凝胶人工血管脱模具后的实物图。
图4为实施例1提供的水凝胶人工血管中内皮细胞层染色图。
图5为实施例1提供的水凝胶人工血管中平滑肌细胞层染色图。
图6为实施例1提供的水凝胶人工血管中成纤维细胞层染色图。
图7为实施例1提供的水凝胶人工血管中组合染色图。
图8为本发明所述体外血流循环装置示意图。
图9为本发明所述兔子颈动脉置换模型示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述制备例和实施例各组分来源如下所示：
以下各例各组分来源如下所示：
Figure BDA0003078755690000101
制备例1
本制备例提供一种水凝胶，所述水凝胶由以下制备方法制备得到：
(a)将猪的皮下(腹部)脂肪组织，用手术刀剥离，厚度约为2cm，用清水洗净后将其放入绞肉机内搅碎；然后将搅碎的组织放入-80℃冰箱，反复冻融3次，每次冻融的时间为9h；再加入1/2体积的超纯水后放入匀浆机中，以5000rpm处理10min；最后放入离心机中以1200rpm离心10min，只留下最底层的白色沉淀物；
(b)将2g的白色沉淀物置于20g的1wt％Triton-X100水溶液中，以1000rpm的频率震荡1h；然后用超纯水洗涤3次，每次30min，每次洗涤的超纯水用量为10mL；最后放入纯的异丙醇内在37℃下浸泡24h，进一步去除残余的脂质成分；
(c)加入20mL的缓冲液过夜处理，然后用超纯水洗涤3次，每次30min，每次洗涤的超纯水用量为10mL；最后放入离心机中以1200rpm离心10min，收集沉淀物；
其中，所述缓冲液包括：100U/mL的DNase的100mg/mL RNase，溶剂为磷酸盐缓冲液(Solarbio，P1022)；
(d)在1mL的胃蛋白酶盐溶液加入10mg的沉淀物，4℃下以1200rpm搅拌72h，然后加入0.1mol/L的NaOH溶液和磷酸盐缓冲液(Solarbio，P1022)调节pH为7，得到所述水凝胶(如图1所示，该水凝胶干燥后呈现白色粉末状)；
其中，胃蛋白酶盐溶液包括：0.01mol/L的HCl和1mg/mL的胃蛋白酶(Acmec，P93610)，溶剂为水，配置得到的胃蛋白酶盐溶液需过滤除菌。
制备例2
本制备例提供一种水凝胶，与制备例1的区别仅在于，步骤(b)具体为：将2g的白色沉淀物置于20g的1wt％Triton-X100的异丙醇溶液中，以1000rpm的频率震荡1h，然后用超纯水洗涤3次，每次30min，每次洗涤的超纯水用量为10mL去除残余的脂质成分。
制备例3
本制备例提供一种水凝胶，与制备例1的区别仅在于，步骤(b)具体为：将2g的白色沉淀物置于20g的5wt％Triton-X100水溶液中，以1000rpm的频率震荡1h；然后用超纯水洗涤3次，每次30min，每次洗涤的超纯水用量为10mL，去除残余的脂质成分。
制备例4
本制备例提供一种水凝胶，与制备例1的区别仅在于，不再进行步骤(d)，步骤(c)所述磷酸盐缓冲液中还添加1mg/mL的胃蛋白酶，溶剂为水。
制备例5
本制备例提供一种水凝胶，与制备例1的区别仅在于，步骤(d)不再添加10X磷酸盐缓冲液。
对比制备例1
本制备例提供一种水凝胶，所述水凝胶由以下制备方法制备得到：使用5％的PVA溶液反复在冷冻干燥机冻融5次，就可以得到PVA水凝胶。
实施例1
本实施例提供一种水凝胶人工血管，所述水凝胶人工血管的制备方法具体包括以下步骤：
(1)分别培养内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞；
其中，所述培养内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞均使用DMEM培养基(含10％的胎牛血清，1％的双抗)，在37℃下的5％CO2的氛围下培养2天；
(2)将2.5wt％的胰酶取出1mL加入到内皮细胞的培养皿里，静置3min后，加入2mL的DEME(含10％胎牛血清和1％双抗)培养基终止消化，然后用枪头冲洗消化完毕的内皮细胞；取0.1g的消化完毕的内皮细胞，与10g的水凝胶混合，放入模具中，在37℃下培养24h，形成水凝胶内皮细胞层；
(3)将2.5wt％的胰酶取出1mL加入到平滑肌细胞的培养皿里，静置3min后，加入2mL的DEME(含10％胎牛血清和1％双抗)培养基终止消化，然后用枪头冲洗消化完毕的平滑肌细胞；取0.1g的消化完毕的平滑肌细胞，与10g的水凝胶混合，在37℃下培养24h，放入模具中，包裹于水凝胶内皮细胞层的外层，在37℃下培养24h，形成水凝胶平滑肌细胞层；
(4)将2.5wt％的胰酶取出1mL加入到成纤维细胞的培养皿里，静置3min后，加入2mL的DEME(含10％胎牛血清和1％双抗)培养基终止消化，然后用枪头冲洗消化完毕的成纤维细胞；取0.1g的消化完毕的成纤维细胞，与10g的水凝胶混合，在37℃下培养24h，放入模具中，包裹于水凝胶平滑肌细胞层的外层，在37℃下培养24h，形成水凝胶成纤维细胞层；
其中，各层水凝胶均为制备例1提供的水凝胶。
其中，图2、图3为实施例1提供的水凝胶人工血管的实物图，如图2、图3所示，其形状为管状结构，直径约为2mm，长度约1cm；
图4-图7为本实施例提供的水凝胶人工血管中染色图；将实施例1提供的水凝胶人工血管进行冷冻，用冷冻液将人工血管包裹起来，然后放入-20℃冰箱冷冻2h，然后拿去组织切片机切片。切片后，分别用DIO、DII、DID对内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞进行染色，用尼康共聚焦显微镜拍摄得到该组图片；如图4-7所示，所述水凝胶人工血管由内到外依次包括水凝胶内皮细胞层、水凝胶平滑肌细胞层和水凝胶成纤维细胞层，其中水凝胶内皮细胞层的厚度为0.5mm，所述水凝胶平滑肌细胞层的厚度为0.5mm，所述水凝胶成纤维细胞层的厚度为0.5mm。
实施例2
本实施例提供一种水凝胶人工血管，所述水凝胶人工血管的制备方法具体包括以下步骤：
(1)分别培养内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞；
其中，所述培养内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞均使用DMEM培养基(含10％的胎牛血清，1％的双抗)，在37℃下的5％CO2的氛围下培养2天；
(2)将2.5wt％的胰酶取出1mL加入到内皮细胞的培养皿里，静置3min后，加入2mL的DEME(含10％胎牛血清和1％双抗)培养基终止消化，然后用枪头冲洗消化完毕的内皮细胞；取0.15g的消化完毕的内皮细胞，与12g的水凝胶混合，放入模具中，在37℃下培养24h，形成水凝胶内皮细胞层；
(3)将2.5wt％的胰酶取出1mL加入到平滑肌细胞的培养皿里，静置3min后，加入2mL的DEME(含10％胎牛血清和1％双抗)培养基终止消化，然后用枪头冲洗消化完毕的平滑肌细胞；取0.15g的消化完毕的平滑肌细胞，与12g的水凝胶混合，在37℃下培养24h，放入模具中，包裹于水凝胶内皮细胞层的外层，在37℃下培养24h，形成水凝胶平滑肌细胞层；
(4)将2.5wt％的胰酶取出1mL加入到成纤维细胞的培养皿里，静置3min后，加入2mL的DEME(含10％胎牛血清和1％双抗)培养基终止消化，然后用枪头冲洗消化完毕的成纤维细胞；取0.15g的消化完毕的成纤维细胞，与12g的水凝胶混合，在37℃下培养24h，放入模具中，包裹于水凝胶平滑肌细胞层的外层，在37℃下培养24h，形成水凝胶成纤维细胞层；
其中，各层水凝胶均为制备例1提供的水凝胶。
实施例3
本实施例提供一种水凝胶人工血管，所述水凝胶人工血管的制备方法具体包括以下步骤：
(1)分别培养内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞；
其中，所述培养内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞均使用DMEM培养基(含10％的胎牛血清，1％的双抗)，在37℃下的5％CO2的氛围下培养2天；
(2)将2.5wt％的胰酶取出1mL加入到内皮细胞的培养皿里，静置3min后，加入2mL的DEME(含10％胎牛血清和1％双抗)培养基终止消化，然后用枪头冲洗消化完毕的内皮细胞；取0.2g的消化完毕的内皮细胞，与15g的水凝胶混合，放入模具中，在37℃下培养24h，形成水凝胶内皮细胞层；
(3)将2.5wt％的胰酶取出1mL加入到平滑肌细胞的培养皿里，静置3min后，加入2mL的DEME(含10％胎牛血清和1％双抗)培养基终止消化，然后用枪头冲洗消化完毕的平滑肌细胞；取0.2g的消化完毕的平滑肌细胞，与15g的水凝胶混合，在37℃下培养24h，放入模具中，包裹于水凝胶内皮细胞层的外层，在37℃下培养24h，形成水凝胶平滑肌细胞层；
(4)将2.5wt％的胰酶取出1mL加入到成纤维细胞的培养皿里，静置3min后，加入2mL的DEME(含10％胎牛血清和1％双抗)培养基终止消化，然后用枪头冲洗消化完毕的成纤维细胞；取0.2g的消化完毕的成纤维细胞，与15g的水凝胶混合，在37℃下培养24h，放入模具中，包裹于水凝胶平滑肌细胞层的外层，在37℃下培养24h，形成水凝胶成纤维细胞层；
其中，各层水凝胶均为制备例1提供的水凝胶。
实施例4
本实施例提供一种水凝胶人工血管，与实施例1的区别在于，各层水凝胶均为制备例2提供的水凝胶。
实施例5
本实施例提供一种水凝胶人工血管，与实施例1的区别在于，各层水凝胶均为制备例3提供的水凝胶。
实施例6
本实施例提供一种水凝胶人工血管，与实施例1的区别在于，各层水凝胶均为制备例4提供的水凝胶。
实施例7
本实施例提供一种水凝胶人工血管，与实施例1的区别在于，各层水凝胶均为制备例5提供的水凝胶。
对比例1
本实施例提供一种水凝胶人工血管，与实施例1的区别在于，各层水凝胶均为对比制备例1提供的水凝胶。
试验例1
抗凝和支撑测试
对上述实施例1-7和对比例1提供的水凝胶人工血管进行抗凝和支撑测试，具体测试方法具体如下所示：
(1)抗凝：将人工血管放入盛有2mL的SD大鼠血液的试管中，每隔3s将试管倾斜45o，观察血液是否凝固，记录凝血的时间；
(2)支撑：将人工血管放入力学测试仪中测得应力拉伸曲线，得到人工血管的力学参数(杨氏模量)；
具体结果如下表1所示：
表1
项目 凝血的时间 杨氏模量
实施例1 180s 310MPa
实施例2 162s 260MPa
实施例3 156s 240MPa
实施例4 150s 260MPa
实施例5 141s 245MPa
实施例6 153s 230MPa
实施例7 156s 245MPa
对比例1 132s 230MPa
如表1所示，本发明的制备了一种生物相容性高，不易堵塞的血管。该水凝胶人工血管的凝血的时间在140s以上，杨氏模量在230MPa以上，具有很好的抗凝以及对仿生血管的支撑作用。由此说明本发明脱细胞后的细胞基质用于形成水凝胶，再加入三种血管细胞培养3周后，形成三层结构的仿生血管，具有很好的抗凝以及对仿生血管的支撑作用。
试验例2
体外模拟血流循环装置的搭建和体外培养
(1)将单方向的滑轨上安装卡套，能够将注射器放置在上面并牢牢固定住。然后通过蠕动泵和一些管子搭建出一套模拟血流的体外循环装置；
如图8所示，所述体外循环装置包括：蠕动泵，往复注射泵，体外血管培养盒，橡胶管，培养瓶，液压传感器，通过橡胶管将各部分连接，达到模体外模拟真实血流的目的。
(2)然后将实施例1制备得到的三层细胞结构的人工血管放在体外模拟血流循环装置中，接入装置中内径为2mm的橡胶管，通入50mL DMEM(含10％胎牛血清和1％双抗)供给营养然后培养3周，然后取下；
结果发现三种细胞，内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞都具有很好的活性，且人工血管仍具有很好的弹性和力学性能。
试验例3
体内长期植入和功能性验证
将2mm的实施例1提供的水凝胶人工血管植入到兔子的颈动脉模型中(如图9所示)，没有负载细胞的血管作为对照组，进行组织切片。
通过HE，免疫荧光染色来判断血管的重塑进程，来判断模拟真实血管结构的三层细胞结构的人工血管是否能提高通畅性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明所述水凝胶人工血管及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种水凝胶人工血管，其特征在于，所述水凝胶人工血管由内到外依次包括水凝胶内皮细胞层、水凝胶平滑肌细胞层和水凝胶成纤维细胞层。
2.根据权利要求1所述的水凝胶人工血管，其特征在于，所述水凝胶人工血管的口径小于6mm，优选为2-3mm。
3.根据权利要求1或2所述的水凝胶人工血管，其特征在于，所述水凝胶内皮细胞层、所述水凝胶平滑肌细胞层或所述水凝胶成纤维细胞层的厚度各自独立地为0.5-1.0mm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的水凝胶人工血管，其特征在于，所述水凝胶人工血管的制备原料包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和水凝胶；
优选地，所述水凝胶由以下制备方法制备得到：
(a)将猪的脂肪组织冻融后，与水混合匀浆，离心，得到沉淀物一；
(b)将步骤(a)得到的沉淀物一浸泡于表面活性剂溶液中，震荡后洗涤，再浸泡于醇溶液中，得到除脂产物；
(c)将步骤(b)得到的除脂产物浸泡于缓冲溶液中，洗涤，离心，得到沉淀物二；
(d)将步骤(c)得到的沉淀物二浸泡于胃蛋白酶盐溶液中，搅拌，再调节pH，得到所述水凝胶。
5.根据权利要求4所述的水凝胶人工血管，其特征在于，步骤(a)中，所述冻融的温度为-90～-70℃，所述冻融的次数为1-5次，所述冻融的时间为8-10h；
优选地，步骤(a)中，所述猪的脂肪组织与水的体积比为(1-3):1；
优选地，步骤(a)中，所述匀浆的转速为4000-5000rpm，所述匀浆的时间为5-15min；
优选地，步骤(a)中，所述离心的转速为1000-1500rpm，所述离心的时间为5-15min；
优选地，步骤(b)中，所述沉淀物一、表面活性剂溶液和醇溶液的质量比为1:(0.5-0.6):(3-4)；
优选地，步骤(b)中，所述表面活性剂溶液为Triton-X100溶液，优选为0.5-2wt％的Triton-X100溶液；
优选地，步骤(b)中，所述震荡的转速为1000-1500rpm，所述震荡的时间为0.5-2h；
优选地，步骤(b)中，所述洗涤采用超纯水，所述洗涤的次数在3次以上，每次洗涤的时间为20-40min，每次洗涤的超纯水用量为10-15mL；
优选地，步骤(b)中，所述醇溶液为异丙醇；
优选地，步骤(b)中，所述浸泡于醇溶液的温度为10-40℃，所述浸泡于醇溶液的时间为8-24h；
优选地，步骤(c)中，所述除脂产物和缓冲溶液的质量比为1:(3-4)；
优选地，步骤(c)中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，优选为4-5wt％的磷酸盐缓冲液；
优选地，步骤(c)中，所述缓冲溶液中还包括脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶，优选所述缓冲溶液中包括50-150U/mL的脱氧核糖核酸酶和50-150μg/mL的核糖核酸酶；
优选地，步骤(c)中，所述洗涤采用超纯水，所述洗涤的次数在3次以上，每次洗涤的时间为20-40min，每次洗涤的超纯水用量为10-15mL；
优选地，步骤(c)中，所述离心的转速为1000-1500rpm，所述离心的时间为5-10min；
优选地，步骤(d)中，所述沉淀物二和胃蛋白酶盐溶液的质量体积比为(5-20)mg:(0.5-2)mL；
优选地，步骤(d)中，所述胃蛋白酶盐溶液包括：0.5-2mg/mL的胃蛋白酶、0.005-0.02mol/L的HCl，溶剂为水；
优选地，步骤(d)中，所述搅拌的转速为1000-1500rpm，所述搅拌的温度为5℃以下，所述搅拌的时间为60-80h；
优选地，步骤(d)中，所述调节pH为调节pH至6.8-7.2；
优选地，步骤(d)中，所述调节pH采用NaOH溶液和磷酸盐缓冲液的混合液，优选为0.05-0.2mol/L的NaOH溶液和4-5wt％磷酸盐缓冲液的混合液。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的水凝胶人工血管的制备方法，其特征在于，所述水凝胶人工血管的制备方法包括以下步骤：
(1)分别培养内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞；
(2)将培养得到的内皮细胞进行消化后，与水凝胶混合，进行培养，形成水凝胶内皮细胞层；
(3)将培养得到的平滑肌细胞进行消化后，与水凝胶混合，包裹于水凝胶内皮细胞层的外层，进行培养，形成水凝胶平滑肌细胞层；
(4)将培养得到的成纤维细胞进行消化后，与水凝胶混合，包裹于水凝胶平滑肌细胞层的外层，进行培养，形成水凝胶成纤维细胞层。
7.根据权利要求6所述的水凝胶人工血管的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养采用DMEM培养基；
优选地，所述DMEM培养基中还包括胎牛血清和双抗；
优选地，所述胎牛血清的添加量为所述DMEM培养基质量的5-15％；
优选地，所述双抗的添加量为所述DMEM培养基质量的0.5-2％；
优选地，步骤(1)中，所述培养在1-10％的CO2的氛围下进行；
优选地，步骤(1)中，所述内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞培养的温度各自独立地为35-40℃，培养的时间各自独立地为36-60h。
8.根据权利要求6或7所述的水凝胶人工血管的制备方法，其特征在于，步骤(2)、(3)和(4)中，所述消化均采用添加胰酶溶液的方式进行；
优选地，所述胰酶溶液的浓度为2-3wt％；
优选地，步骤(2)、(3)和(4)中，所述消化的温度各自独立地为35-40℃，所述消化的时间各自独立地为1-5min；
优选地，步骤(2)、(3)和(4)中，所述消化的终止均采用添加培养基的方式进行；
优选地，所述终止用培养基为DMEM培养基；
优选地，所述DMEM培养基中还包括胎牛血清和双抗；
优选地，所述胎牛血清的添加量为所述DMEM培养基质量的5-15％；
优选地，所述双抗的添加量为所述DMEM培养基质量的0.5-2％；
优选地，步骤(2)中，所述培养得到的内皮细胞和水凝胶的质量比为(0.1-0.2):(10-15)；
优选地，步骤(3)中，所述培养得到的平滑肌细胞和水凝胶的质量比为(0.1-0.2):(10-15)；
优选地，步骤(4)中，所述培养得到的成纤维细胞和水凝胶的质量比为(0.1-0.2):(10-15)；
优选地，步骤(2)、(3)和(4)中，所述培养的温度各自独立地为35-40℃，所述培养的时间各自独立地为22-26h。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的水凝胶人工血管在制备体外模拟血流循环装置中的应用。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的水凝胶人工血管在制备体内血管植入装置中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410583A (zh) * 2021-12-28 2022-04-29 南方科技大学 一种基于动物脂肪组织来源水凝胶的神经/血管网络及其构建方法和应用
CN116159184A (zh) * 2023-03-14 2023-05-26 青岛安融生物健康科技有限公司 一种人工血管及其体外制备方法

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070128171A1 (en) * 2003-07-01 2007-06-07 Tranquillo Robert T Engineered blood vessels
US20070224677A1 (en) * 2006-03-24 2007-09-27 Thomas Neumann Method for creating perfusable microvessel systems
CN201915100U (zh) * 2010-12-15 2011-08-03 中国人民解放军第四军医大学 生物组织工程血管发生装置
WO2011116125A2 (en) * 2010-03-16 2011-09-22 Organovo, Inc. Multilayered vascular tubes
CN103173353A (zh) * 2011-12-23 2013-06-26 国家纳米科学中心 多层管状结构细胞培养支架及其制备方法和用途
US20130245784A1 (en) * 2010-09-22 2013-09-19 Nanyang Technological University Method for forming a tissue construct and use thereof
US20140100648A1 (en) * 2012-10-08 2014-04-10 Robert G. Matheny Multi-Layer Vascular Prosthesis
CN105983134A (zh) * 2015-03-05 2016-10-05 刘畅 一种人工血管及其制备方法
CN107693846A (zh) * 2017-09-29 2018-02-16 清华大学 一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织及其制备方法
KR101855806B1 (ko) * 2016-11-07 2018-05-10 한국기계연구원 인공 혈관 및 그 제조 방법
CN108245712A (zh) * 2016-12-29 2018-07-06 国家纳米科学中心 细菌纤维素小直径人工血管的制备方法及应用
CN108498867A (zh) * 2018-03-20 2018-09-07 清华大学深圳研究生院 一种制作三维小口径血管模型的方法
CN108525021A (zh) * 2018-04-17 2018-09-14 山西医科大学 基于3d打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤及其制备方法
CN108653815A (zh) * 2017-03-31 2018-10-16 国家纳米科学中心 具有自主调节结构功能的三维卷状结构及其制备方法和应用
CN110408539A (zh) * 2019-07-30 2019-11-05 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 大体积组织工程组织器官内部仿生血管网的构筑方法
CN111471641A (zh) * 2020-02-03 2020-07-31 东华大学 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3d打印制法

Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070128171A1 (en) * 2003-07-01 2007-06-07 Tranquillo Robert T Engineered blood vessels
US20070224677A1 (en) * 2006-03-24 2007-09-27 Thomas Neumann Method for creating perfusable microvessel systems
WO2011116125A2 (en) * 2010-03-16 2011-09-22 Organovo, Inc. Multilayered vascular tubes
CN102883680A (zh) * 2010-03-16 2013-01-16 奥加诺沃公司 多层血管
US20130245784A1 (en) * 2010-09-22 2013-09-19 Nanyang Technological University Method for forming a tissue construct and use thereof
CN201915100U (zh) * 2010-12-15 2011-08-03 中国人民解放军第四军医大学 生物组织工程血管发生装置
CN103173353A (zh) * 2011-12-23 2013-06-26 国家纳米科学中心 多层管状结构细胞培养支架及其制备方法和用途
US20140100648A1 (en) * 2012-10-08 2014-04-10 Robert G. Matheny Multi-Layer Vascular Prosthesis
CN105983134A (zh) * 2015-03-05 2016-10-05 刘畅 一种人工血管及其制备方法
KR101855806B1 (ko) * 2016-11-07 2018-05-10 한국기계연구원 인공 혈관 및 그 제조 방법
CN108245712A (zh) * 2016-12-29 2018-07-06 国家纳米科学中心 细菌纤维素小直径人工血管的制备方法及应用
CN108653815A (zh) * 2017-03-31 2018-10-16 国家纳米科学中心 具有自主调节结构功能的三维卷状结构及其制备方法和应用
CN107693846A (zh) * 2017-09-29 2018-02-16 清华大学 一种具有多层血管结构的仿生血管化软组织及其制备方法
CN108498867A (zh) * 2018-03-20 2018-09-07 清华大学深圳研究生院 一种制作三维小口径血管模型的方法
CN108525021A (zh) * 2018-04-17 2018-09-14 山西医科大学 基于3d打印的含血管及毛囊结构组织工程皮肤及其制备方法
CN110408539A (zh) * 2019-07-30 2019-11-05 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 大体积组织工程组织器官内部仿生血管网的构筑方法
CN111471641A (zh) * 2020-02-03 2020-07-31 东华大学 多片层单元水凝胶包被的仿生毛细血管网的3d打印制法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI, YING ET AL: "Construction of Small-Diameter Vascular Graft by Shape-Memory and Self-Rolling Bacterial Cellulose Membrane", 《ADVANCED HEALTHCARE MATERIALS》 *
WANG, NUOXIN ET AL: "A strategy for rapid and facile fabrication of controlled, layered blood vessel-like structures", 《RSC ADVANCES》 *
YUAN, BO ET AL: "A Strategy for Depositing Different Types of Cells in Three Dimensions to Mimic Tubular Structures in Tissues", 《ADVANCED MATERIALS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410583A (zh) * 2021-12-28 2022-04-29 南方科技大学 一种基于动物脂肪组织来源水凝胶的神经/血管网络及其构建方法和应用
CN114410583B (zh) * 2021-12-28 2024-04-02 南方科技大学 一种基于动物脂肪组织来源水凝胶的神经/血管网络及其构建方法和应用
CN116159184A (zh) * 2023-03-14 2023-05-26 青岛安融生物健康科技有限公司 一种人工血管及其体外制备方法

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