CN108245712A - 细菌纤维素小直径人工血管的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于自卷曲细菌纤维素膜的小直径人工血管的制备方法和应用。一种基于自卷曲细菌纤维素膜的小直径人工血管，包括由自卷曲细菌纤维素膜制成的BC管及从所述BC管内侧到外侧依次种植的内膜细胞、中膜细胞和外膜细胞。本发明的基于自卷曲细菌纤维素膜的小直径人工血管在体内具有较好的生物相容性和通畅性，在血管移植方面具有重要的临床意义和应用前景。

Description

细菌纤维素小直径人工血管的制备方法及应用

技术领域

本发明属于医用材料领域，具体而言，本发明涉及一种细菌纤维素小直径人工血管的制备方法及应用。

背景技术

心血管疾病，是危害人类健康的常见疾病之一，是人类的头号杀手。动脉粥样硬化、冠心病、心绞痛和中风等一些血管疾病会导致人类的突然死亡。人工血管在冠状动脉、周围血管性疾病的手术治疗和药物治疗中应用较多。另外，也应用于由各种疾病导致的血管损伤。

心血管患者比较严重的时候（血管严重狭窄或闭塞）需要进行血管移植手术来辅助治疗。人体自身的血管来源有限，所以，临床上需要大量人工血管作为血管移植物。动脉粥样硬化疾病是致死率较高的疾病，在2009年欧洲的死亡人数中几乎有一半的死亡是由该疾病导致的。在美国，约有4000万人患有某种形式的心血管疾病，动脉粥样硬化疾病导致的死亡占美国死亡人数的一半。心血管疾病占我国死亡总人数的1/4。我国每年有6% - 10%的新生婴儿（1200-1500万）患有先天性心血管疾病。当病人自身的动脉或静脉血管不能工作时，可以利用人工合成的血管或血管假体进行移植。这种移植方法是有效的，可以提高患病者的生活质量。经过半个多世纪的发展，并没有非常理想的人工血管。手术的失败主要由于人造血管表面的促凝性和内膜增生。

在临床应用中，大直径动脉（> 8 mm）假体移植可在长时间内保持血流的通畅，这种大直径的人工血管已取得比较满意的效果。然而小直径血管（< 6 mm）假体产生的效果令人非常失望，很难移植成功，移植后很难长时间保持血流的通畅，易造成血管栓塞。小直径血管的制备在临床有很大需求，也是临床应用中遇到的一大难题。

在国外的研究中，多采用医用高分子材料进行编织制造人工血管。19世纪末Nitze（1987年）用象牙制作小管。Payr和Carrer分别于1900年，1907年用镁和铝制备金属血管，结果产生血栓和出血。50年代末60年代初，我国才开始研究人工血管。开始用尼龙（Nylon）编织人工血管，但尼龙是降解材料，在体内植入后发生破裂被淘汰。现在一般用涤纶（Dacron）编织的人工血管，已在临床上有大量应用（临床治疗如主动脉瘸、狭窄，上下腔静脉切除、更换术等）。

人工血管主要是由尼龙、聚四氟乙稀（PTFE）和涤纶（Dacron）等人工合成的材料制造。一些大、中口径的人工血管应用于全身各处血管的转流手术，这些人工血管在临床应用中已取得比较满意的效果（临床上常用的为聚四氟乙稀和涤纶）。目前已商业化且应用于临床的材料如Dacron®、硅橡胶、聚氨酯和Telfon®。现在新型人工血管材料逐渐出现和使用，如碳涂层血管、蛋白或明胶涂层血管和袖状血管。

细菌纤维素（Bacterial cellulose，BC）又称微生物纤维素（Microbialcellulose，MC），是一种由微生物如醋酸菌属（Acetobacter）、根瘤菌属（Rhizobium）、土壤杆菌属（Agrobacterium）等生产分泌而得的天然水凝胶。BC有与植物纤维素相同的β-（1，4）糖苷键连接的六碳糖长链分子结构，是由纤维素合成酶催化形成，但有植物无可比拟的高机械性能。BC的聚合度（DP = 4000 - 10000）、结晶度（60 - 80%）和含水量（> 99%）都非常高。BC的自组装是由亚纤维到微纤维逐渐形成的宽30 - 100 nm，厚6 -10 nm的三维网络结构。细菌纤维素具有很好的生物相容性、高的持水能力、机械性能、渗透性和低毒性等优点，这使它在人工皮肤、伤口敷料、软骨组织工程材料、神经血管、血管和牙种植材料等方面有很好的应用。

目前，细菌纤维素制备人工血管的方法是将培养基灭菌，接种后在培养的模具中静置培养，得到所需的厚度后取出。静态培养获得的细菌纤维素能够保持很好的形态和完整的表面形貌，但利用管状模具培养出的管状纤维素的壁较薄常需要后期加工（如PVP涂层）、直径较大(一般大于6 毫米)难与小直径血管匹配，培养时间周期较长（5-7天或更长），每个模具只能培养一个管，培养占地面积较大。大量管状纤维素培养取出以后还需要氢氧化钠溶液高温处理容易导致形变。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种制备方法简单、周期短、可重复性高、直径大小可以控制的基于自卷曲细菌纤维素膜的细菌纤维素小直径人工血管的制备方法、应用。

为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种细菌纤维素管，其通过使用圆轴模具将已培养处理后的细菌纤维素膜卷曲制成管。

根据本发明的第一方面的细菌纤维素管，所述细菌纤维素管的直径小于6毫米；

优选地，所述直径小于4毫米；

更优选地，所述直径小于3毫米；

进一步优选地，所述直径为2毫米。

本发明的第二方面提供了前述的细菌纤维素管在制备小直径人工血管中的应用。

根据本发明的第二方面的应用，所述小直径人工血管的直径小于6毫米，优选小于4毫米，更优选小于3毫米，进一步优选为2毫米。

本发明的第三方面提供了一种用于制备小直径人工血管的方法，所述方法包括，

使用前述的细菌纤维素管，在所述细菌纤维素管的内侧到外侧依次种植内膜细胞、中膜细胞和外膜细胞；

优选地：

所述种植利用微流控芯片装置实现；和/或

所述内膜细胞是内皮细胞、所述中膜细胞是平滑肌细胞和/或所述外膜细胞是成纤维细胞；进一步优选地，所述内膜细胞是人脐静脉内皮细胞、所述中膜细胞是人主动脉平滑肌细胞和/或所述外膜细胞是人皮肤成纤维细胞。

本发明的第四方面提供了前述的细菌纤维素管在制备用于减缓或治疗血管损伤的药物或医疗产品中的用途。

本发明的第五方面提供了前述方法制备的小直径人工血管在制备用于减缓或治疗血管损伤的药物或医疗产品中的用途。

所述血管损伤是由血管疾病的手术治疗和药物治疗及各种疾病导致的。其中，所述血管疾病选自以下一种或几种：动脉粥样硬化、冠心病、心绞痛和中风。

本发明的第六方面提供了一种小直径人工血管，所述小直径人工血管包括：

如前所述的细菌纤维素管；和

依次种植在所述细菌纤维素管内侧到外侧的内膜细胞、中膜细胞和外膜细胞。

本发明制备方法简单，周期较短（1-2天），可一次制备较多的纤维素管，可重复性较高。纤维素管的直径大小可以根据圆轴模具进行控制，能更好的与不同直径要求的血管相匹配。管状细菌纤维素能很好地保持形貌，生物相容性较好，能够满足人工血管要求的弹性和延展力，缝合之后不发生渗漏且通畅性良好。细菌纤维素小直径人工血管具有很好的临床应用前景。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1 示出了基于自卷曲细菌纤维素膜的小直径人工血管的制备方法示意图；

图2 示出了基于自卷曲细菌纤维素膜的小直径人工血管移植到兔颈动脉的操作示意；

图3示出了HUVECs细胞，HASMC细胞和HSF细胞在BC管上生长1天和3天的形貌图；

图4示出了基于自卷曲细菌纤维素膜的小直径人工血管移植到兔动脉后3天和21天时的超声图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

图1示出了自卷曲细菌纤维素膜的小直径人工血管的制备方法示意图。包括以下步骤：

（1）培养细菌纤维素膜 （温度30℃；湿度50%-60%；培养菌种为木醋杆菌（ATCC53582）；培养基：葡萄糖2%，酵母粉0.5%，蛋白胨0.5%，柠檬酸0.114%，Na₂HPO₄ 0.27%，由Milli-Q超纯水进行配制。），然后对其进行处理的步骤；

（2）使用圆轴模具（直径：2毫米、3毫米或4毫米；长度：4 厘米）将步骤（1）中已培养处理后的细菌纤维素膜制成BC管的步骤，具体地，该步骤依次包括：湿细菌纤维素膜除去约90%的水；剪裁成4厘米长和宽的正方形，膜一端沿圆轴模具逐渐卷曲；-35℃低温处理后进行冷冻干燥获得细菌纤维素管。

（3）在该BC管的内侧到外侧依次种植内膜细胞、中膜细胞和外膜细胞的步骤。

其中，内膜细胞主要是内皮细胞，中膜细胞主要是平滑肌细胞，外膜细胞主要是成纤维细胞。本发明使用微流控芯片装置在BC管的内侧到外侧依次种植细胞，具体地，微流控芯片装置共有三个孔道，单个孔道的宽度为1.0 cm，长度为4.0 cm。将处理好的细胞悬液用枪头从一端依次种入，从另一端用枪头吸取，使细胞悬液充分填充在管道中，放置在37℃培养箱中培养，细胞贴壁在膜的表面并增殖生长。利用三种不同的细胞来模拟人工血管（内、中和外层）。从BC管的内侧到外侧依次种植HUVECs（人脐静脉内皮细胞）细胞，HASMC（人主动脉平滑肌细胞）细胞和HSF（人皮肤成纤维细胞），从而得到自卷曲细菌纤维素膜的小直径人工血管。

图2示出了基于自卷曲细菌纤维素膜的小直径人工血管移植到兔颈动脉的操作示意。用眼科剪和弯头镊子将皮肤剪开，小心分离肌肉和其他组织（特别小心兔子神经），找到动脉血管。将血管小心剥离出来，并将上面的一些组织剔除干净。用止血夹将血管的两端夹住，用手术剪将血管剪断，用肝素钠生理盐水冲洗干净。将灭菌的BC管取出后，截取0.7-1.0cm长度，直径为1.5 mm左右（与兔子动脉血管吻合，在肝素钠-氯化钠溶液中浸泡10分钟），作为血管移植材料。先用缝合线将其BC管的两个端口缝合，防止接口处贴的不紧密，使血流不畅，引起血栓。用手术缝合线（8-0 聚丙烯手术缝合线）先将BC管的一端缝在血管上，再将另一端缝上，每边缝4-6针。缝合完成后，将止血夹取下来，看缝合处是否会漏血，若有漏血将漏处再缝一针。若不漏，将肌肉组织和外面的皮肤缝合。

图3示出了HUVECs细胞，HASMC细胞和HSF细胞在BC管上生长1天和3天的形貌图。

图4示出了基于自卷曲细菌纤维素膜的小直径人工血管移植到兔动脉后3天和21天时的超声图。从图4可以得出基于自卷曲细菌纤维素膜的小直径人工血管在体内生物相容性较好且可以在3周的时间仍保持通畅性。

本发明制备方法简单，周期较短（1-2天），可一次制备较多纤维素管，可重复性较高。纤维素管的直径大小可以根据圆轴模具进行控制，能更好的与不同直径要求的血管相匹配。管状细菌纤维素能很好地保持形貌，生物相容性较好，能够满足人工血管要求的弹性和延展力，缝合之后不发生渗漏且通畅性良好。

本发明的兔子颈动脉血管移植后可以保持血液的通畅性，这种小直径的管状纤维素在血管移植方面具有重要的临床意义和应用前景。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种细菌纤维素管，其特征在于，使用圆轴模具将已培养处理后的细菌纤维素膜卷曲制成管。

2.根据权利要求1所述的细菌纤维素管，其特征在于，所述细菌纤维素管的直径小于6毫米；

优选地，所述直径小于4毫米；

更优选地，所述直径小于3毫米；

进一步优选地，所述直径为2毫米。

3.权利要求1或2所述的细菌纤维素管在制备小直径人工血管中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述小直径人工血管的直径小于6毫米，优选小于4毫米，更优选小于3毫米，进一步优选为2毫米。

5.一种用于制备小直径人工血管的方法，其特征在于，所述方法包括，

使用权利要求1或2所述的细菌纤维素管，在所述细菌纤维素管的内侧到外侧依次种植内膜细胞、中膜细胞和外膜细胞；

优选地：

所述种植利用微流控芯片装置实现；和/或

所述内膜细胞是内皮细胞、所述中膜细胞是平滑肌细胞和/或所述外膜细胞是成纤维细胞；进一步优选地，所述内膜细胞是人脐静脉内皮细胞、所述中膜细胞是人主动脉平滑肌细胞和/或所述外膜细胞是人皮肤成纤维细胞。

6.权利要求1或2所述的细菌纤维素管在制备用于减缓或治疗血管损伤的药物或医疗产品中的用途。

7.权利要求5所述方法制备的小直径人工血管在制备用于减缓或治疗血管损伤的药物或医疗产品中的用途。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述血管损伤是由血管疾病的手术治疗和药物治疗及各种疾病导致的。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述血管疾病选自以下一种或几种：动脉粥样硬化、冠心病、心绞痛和中风。

10.一种小直径人工血管，其特征在于，所述小直径人工血管包括：

权利要求1或2所述的细菌纤维素管；和

依次种植在所述细菌纤维素管内侧到外侧的内膜细胞、中膜细胞和外膜细胞。