CN103977457A - 一种管状组织工程支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种管状组织工程支架及其制备方法。所述管状组织工程支架内部中空,其管壁由多层薄膜通过生物粘合剂粘合而成。所述制备方法包括:在薄膜的单面或双面涂覆生物粘合剂;绕轴卷曲所述薄膜使得薄膜层间通过所述生物粘合剂粘合而成多层薄膜的管壁;抽出轴使得形成内部中空的管状组织工程支架。本发明的方法利用生物粘合剂使薄膜形成管状结构,所述方法直接在平面薄膜上操作,材料选择非常灵活,结构稳定,管径调节灵活,层数及机械强度可调,方便进行各种修饰。此外,所述方法还可制备含有细胞的支架,操作非常简便,便于控制各层细胞的分布。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织工程技术领域,尤其涉及一种管状组织工程支架及其制备方法。
背景技术
管状组织在人体中大量存在。在组织工程中,管状组织的替换占了很大的比例。目前管状组织工程从是否包含细胞的角度而言,分为无细胞支架和含细胞支架。目前临床上大量应用的无细胞支架主要是不可降解的材料,比如涤纶和聚四氟乙烯,虽然这些材料在机械强度和短期效果上令人满意,但是随着材料在体内保留时间的延长,就会出现一些慢性的炎症等与机体不兼容的病理反应。因此现在人们倾向于应用可降解材料进行植入。
可降解材料可以在植入的初期起到支持的作用,随着时间的推移,体内组织逐渐沿着支架生长,从而形成新的有功能的组织。在管状组织成型方法方面,有人直接把可降解薄膜在电纺的时候纺成闭合环形;有人把不同层的薄膜堆叠起来,卷曲后用O型环固定两端;也有人直接把片状薄膜卷曲后,用手术缝合线缝合成管状结构。
现有技术(Yuan B等人,A strategy for depositing different types of cells inthree dimensions to mimic tubular structures in tissues[J].Advanced Materials,2012,24(7):890-896)公开了一种含细胞的层状结构管状工程组织的制备方法,该方法将细胞种植在张力诱导的自卷曲薄膜上,然后在自卷曲力的作用下,形成层状结构。这种方法需要能产生张力的弹性材料,在材料选择方面具有较大的局限性。
现有技术(de Valence S等人,Long term performance of polycaprolactonevascular grafts in a rat abdominal aorta replacement model[J].Biomaterials,2012,33(1):38-47)描述的方法,直接将聚己内酯(Poly(ε–caprolactone),PCL)通过静电纺丝纺在柱状物的表面从而直接形成管状结构。该方法由于直接形成管状结构,在各种细胞和蛋白等的修饰方面不够方便。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供一种管状组织工程支架及其制备方法。所述方法利用生物粘合剂使薄膜形成管状结构,所述方法直接在平面薄膜上操作,材料选择非常灵活,结构稳定,管径调节灵活,层数及机械强度可调,方便进行各种修饰。此外,所述方法还可制备含有细胞的支架,操作非常简便,便于控制各层细胞的分布。
为实现本发明的目的,采用以下技术方案:
在第一方面,本发明提供一种管状组织工程支架,所述管状组织工程支架内部中空,其管壁由多层薄膜通过生物粘合剂粘合而成。
作为本发明的优选方案,所述薄膜的材料为生物可降解材料。所述生物可降解材料作为管状组织工程支架的制备材料,其生物相容性好,不会存在慢性的炎症等与机体不兼容的病理反应,而且体内组织逐渐沿着支架生长,从而形成新的有功能的组织,从而使得管状组织工程支架与体内组织完全融为一体。
优选地,所述薄膜的材料选自聚己内酯(Poly(ε–caprolactone),PCL)、聚乳酸(Polylactic acid,PLA)、聚乙醇酸(Polyglycolic acido,PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、聚癸二酸甘油酯(Poly(GlycerolSebacate),PGS)、聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)、海藻酸盐水凝胶、明胶、透明质酸、白蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、纤维粘连蛋白、壳聚糖或它们的复合材料。上述材料是管状组织工程中常用的材料,已经在许多管状组织工程支架中获得广泛应用,这些材料可以通过商购获得。
作为本发明的优选方案,所述薄膜是通过静电纺丝法、旋涂法、烘干法或水凝胶法制成的薄膜。上述制备薄膜的方法是本领域技术人员熟知的方法,尤其是静电纺丝法在本领域已经获得广泛应用,是最有发展前景的薄膜制备方法。
作为本发明的优选方案,所述生物粘合剂为双组分生物粘合剂或单组分生物粘合剂。所述双组分生物粘合剂的两种组分需要配合使用,单独使用时没有粘合作用。
优选地,所述双组分生物粘合剂为双组分纤维蛋白粘合剂。
优选地,所述双组分纤维蛋白粘合剂的一个组分包括纤维蛋白原和凝血八因子,另一个组分包括凝血酶和氯化钙。
优选地,所述单组分生物粘合剂为遇水或潮湿变粘的生物粘合剂。
优选地,所述单组分生物粘合剂为α-氰基丙烯酸正丁酯或贻贝粘蛋白。
需要说明的是,本发明虽然具体列举了上述生物粘合剂,但是本发明的实施并不是只能依赖于上述生物粘合剂,其它生物粘合剂也可选用,只是上述生物粘合剂能够起到更好的粘合作用。
作为本发明的优选方案,所述薄膜间还包括细胞。这种含有细胞的管状组织工程支架具有更好的生物相容性,其中的细胞能够发挥相应的生理和生物学功能,是目前管状组织工程支架的一个发展趋势。所述细胞典型但非限定性的例子如人脐静脉内皮细胞、人主动脉平滑肌细胞或人主动脉成纤维细胞等。
在第二方面,本发明提供一种制作第一方面所述的管状组织工程支架的方法,所述方法包括:在薄膜的单面或双面涂覆生物粘合剂;绕轴卷曲所述薄膜使得薄膜层间通过所述生物粘合剂粘合而成多层薄膜的管壁;抽出轴使得形成内部中空的管状组织工程支架。
作为本发明的优选方案,所述方法包括:在薄膜的双面分别涂覆双组分生物粘合剂的一种组分;绕轴卷曲所述薄膜使得薄膜层间的双组分生物粘合剂发生作用而粘合成多层薄膜的管壁;抽出轴使得形成内部中空的管状组织工程支架。
作为本发明的优选方案,所述方法包括:在薄膜的单面涂覆遇水或潮湿变粘的单组份生物粘合剂;绕轴卷曲所述薄膜使得形成卷筒状管壁;抽出轴并将所述卷筒状管壁置于水性溶液使得薄膜层间通过所述单组份生物粘合剂粘合形成内部中空的管状组织工程支架。
作为本发明的优选方案,所述在薄膜的单面或双面涂覆生物粘合剂之前,还包括在所述薄膜的一面形成细胞层。
作为本发明的优选方案,通过将微流控芯片的孔道与所述薄膜的一面粘合形成微流通道,然后向所述微流通道注入细胞的方式形成细胞层。
所述微流控芯片可以采用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)制成。具体还可参考Yuan B等人,A strategy for depositing different types of cells inthree dimensions to mimic tubular structures in tissues[J].Advanced Materials,2012,24(7):890-896。
本发明的有益效果为:本发明的管状组织工程支架利用生物粘合剂使薄膜形成管状结构,所述方法直接在平面薄膜上操作,材料选择非常灵活,几乎任何薄膜材料(无论带微结构还是不带微结构)都可以选择;结构稳定,不需要外部物体支撑;管径调节灵活;层数及机械强度可调;方便进行各种修饰(细胞或蛋白等)。此外,所述方法还可制备含有细胞的支架,操作非常简便,便于控制各层细胞的分布。
附图说明
图1为本发明一种实施方式的不含细胞管状组织工程支架的制备过程示意图。
图2为本发明一种实施方式的含细胞管状组织工程支架的制备过程示意图。
图3为本发明实施例1的不含细胞的PLGA管状组织工程支架的制作过程各阶段的照片,其中A为平铺的PLGA薄膜的照片;B为PLGA薄膜两面分别涂覆双组分纤维蛋白粘合剂并放置卷轴的照片;C为PLGA薄膜绕卷轴卷曲后的照片;D为抽出卷轴后的照片。
图4为本发明实施例2的含细胞的PLGA管状组织工程支架的制作过程各阶段的照片,其中A为PDMS芯片放置于PLGA薄膜上的照片;B为细胞分区植入PLGA薄膜上后的照片,从左至右的细胞分区分别是红色DiD染色的人主动脉成纤维细胞、橙色DiI染色的人主动脉平滑肌细胞和绿色DiO染色的人脐静脉内皮细胞;C为PLGA薄膜卷曲后的管状组织工程支架的照片。
图5为本发明实施例3的利用康派特粘合剂制备的细菌纤维素管状支架的照片。
图6为本发明实施例4的利用贻贝粘蛋白粘合剂制备的聚己内酯管状支架的照片。
附图标记说明:图1和图2中,1表示薄膜,2表示轴,3表示分层的管状结构,4表示微流控芯片,5表示细胞层。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式详细描述本发明,本领域技术人员将会理解,这些描述仅仅是为了更清楚地说明本发明,而不能理解为对本发明的限制。
图1示出了本发明一种实施方式的不含细胞管状组织工程支架的制备过程示意图。具体地,将薄膜1(可为完全平的薄膜或带有微结构)的双面分别涂上纤维蛋白粘合剂(也可以是其它双组分生物粘合剂)的一种成分,然后绕着光滑的聚氨酯轴2(也可以是其它材质的轴,直径自由控制)卷曲,卷曲的同时由于纤维蛋白粘合剂的两种成分发生接触而产生成胶反应,从而使得薄膜各层相互粘结,最后将轴2抽出,即形成分层的管状结构3。需要特别指出的是,这里的生物粘合剂除采用双组份纤维蛋白粘合剂及其他双组分生物粘合剂外,还可采用单组份生物粘合剂,比如康派特粘合剂或贻贝粘蛋白粘合剂等。
图2示出了本发明一种实施方式的含细胞管状组织工程支架的制备过程示意图。具体地,首先在薄膜上利用PDMS芯片技术图案化不同的细胞,即通过将微流控芯片4的孔道与所述薄膜1的一面粘合形成微流通道,然后向所述微流通道注入细胞形成细胞层5,其中细胞的位置和轴2向可以被灵活的控制,然后再采用上述卷曲方法,制备含细胞管状组织工程支架,形成分层的管状结构3。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所用的实验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例1:利用纤维蛋白粘合剂制备不含细胞的PLGA管状结构
请参考图3,本实施例制备不含细胞的PLGA管状结构包括以下步骤:
(1)配制20wt%的PLGA电纺溶液(PLGA固体颗粒加入到丙酮和二甲基甲酰胺(二者质量比2:1)的混合溶液中,使得PLGA所占的质量比达到溶液总质量的20%),然后在30kV电压下,电纺10分钟,得到平均厚度约为30微米的静电纺丝薄膜。
(2)把纺丝薄膜剪成适合大小的长方形,长度可以使得3mm外径的轴绕三圈半,宽度根据管长度的需要确定。
(3)利用钴源射线对薄膜进行灭菌(强度10k Bq)。
(4)在生物安全柜中给纺丝薄膜的正面涂覆纤维蛋白粘合剂(杭州普济医药有限公司)的主体胶(主要成分是纤维蛋白原、凝血八因子和PBS溶液),给纺丝薄膜的背面涂覆纤维蛋白粘合剂的催化剂(主要成分是凝血酶和氯化钙的水溶液)。
(5)在纺丝薄膜的一端放置一根外径为3mm的膨体聚四氟乙烯(ePTFE)光滑轴,然后利用镊子小心地将纺丝薄膜绕轴卷曲,当纺丝薄膜两面相互接触时,纤维蛋白粘合剂发生作用,从而固定管状结构,静待3min左右。
(6)卷曲完成后,小心地将ePTFE轴从内层抽出,即得到稳定的不含细胞的管状结构。整个过程中关键步骤的照片如图3所示。
实施例2:利用纤维蛋白粘合剂制备含细胞的PLGA管状结构
请参考图4,本实施例制备含细胞的PLGA管状结构包括以下步骤:
步骤(1)至(3)与实施例1相同。
(4)在生物安全柜内,将制备好的PDMS微流控芯片(已经过乙醇浸泡灭菌30min,并吹干)利用生物粘合剂粘在PLGA纺丝薄膜的表面(孔道形状为三个相互隔开的长方形,形似图2中的PDMS微流控芯片),然后利用移液器向各个孔道中分别注入DiD染料染的人脐静脉内皮细胞、DiI染料染的人主动脉平滑肌细胞和DiO染料染的人主动脉成纤维细胞。
(5)大概2个小时候后,细胞贴壁,此时揭去PDMS微流控芯片,在共聚焦显微镜下观察细胞,发现细胞按照芯片的局限分布在三个长方形内,分别显示红色、橙色和绿色荧光(图4B)。
(6)在生物安全柜中给纺丝薄膜的正面涂覆纤维蛋白粘合剂(杭州普济医药有限公司)的主体胶(主要成分是纤维蛋白原、凝血八因子和PBS溶液),给纺丝薄膜的背面涂覆纤维蛋白粘合剂的催化剂(主要成分是凝血酶和氯化钙的水溶液)。
(7)在纺丝薄膜的一端放置一根外径为3mm的聚氨基甲酸酯(PU)光滑轴,然后利用镊子小心地将纺丝薄膜绕轴卷曲,当纺丝薄膜两面相互接触时,纤维蛋白粘合剂发生作用,从而固定管状结构,静待3min左右。
(8)卷曲完成后,小心地将轴从内层抽出,即得到含有细胞的管状稳定结构。整个过程中关键步骤的照片如图3所示。
实施例3:利用康派特粘合剂制备细菌纤维素管状支架
请参考图5,本实施例利用康派特粘合剂制备细菌纤维素管状支架,包括以下步骤:
(1)制备合适厚度的细菌纤维素薄膜:具体地,将葡糖杆菌(Gluconacetobacter xylinum,ATCC53582)培养在HS培养基(其成分为2%葡萄糖、0.5%酵母提取物、0.5%蛋白胨、0.27%磷酸氢二钠、0.15%柠檬酸)中。HS培养基在121℃灭菌20分钟后,将细菌接种在培养基中,26℃静置培养6天,在气液界面逐渐形成细菌纤维素膜。将细菌纤维素膜浸入去离子水中2-3天,然后在1wt%的氢氧化钠溶液中煮沸30分钟以消除细菌和蛋白。随后,将细菌纤维素膜用去离子水和高纯水清洗若干次直到pH为7.0,随后将细菌纤维素膜在121℃灭菌20分钟,然后将细菌纤维素膜在超净台中风干一至两天待用。
(2)将风干的细菌纤维素薄膜剪成适合大小的长方形,长度可以使得10mm外径的轴绕一圈半,宽度根据管长度的需要确定。
(3)利用钴源射线对薄膜进行灭菌(强度10k Bq)。
(4)在细菌纤维素薄膜干燥的时候,于生物安全柜中给细菌纤维素薄膜的正面涂覆康派特医用粘合剂(北京瞬康医用胶有限公司,主要成份为α-氰基丙烯酸正丁酯)。
(5)在细菌纤维素薄膜的一端放置一根外径为10mm的ePTFE光滑轴,然后利用镊子小心地将细菌纤维素薄膜绕轴卷曲,卷好之后两端稍微用丝线固定(因为康派特医用胶在遇水情况下才会有粘性,所以需要用丝线暂时固定)。
(6)卷曲完成后,小心地将ePTFE光滑轴从内层抽出,立刻把细菌纤维素薄膜管投入到无菌的PBS溶液中几秒钟,康派特粘合剂遇水成胶,撤去丝线,即得到不含细胞的管状稳定结构。结果如图5所示的照片。
实施例4:利用贻贝蛋白粘合剂制备聚己内酯(PCL)管状支架
请参考图6,本实施例利用贻贝蛋白粘合剂制备聚己内酯(PCL)管状支架,包括以下步骤:
(1)配制10wt%的PCL电纺溶液(将PCL固体颗粒加入到二氯甲烷和二甲基甲酰胺(二者质量比3:1)的混合溶液中,使得PCL所占的质量比达到溶液总质量的10%),然后在30kV电压下,电纺10分钟,得到平均厚度约为30微米的静电纺丝薄膜。
(2)将纺丝薄膜剪成适合大小的长方形,长度可以使得1mm外径的轴绕四圈半,宽度根据管长度的需要确定。
(3)利用钴源射线对纺丝薄膜进行灭菌(强度10k Bq)。
(4)在生物安全柜中给纺丝薄膜的正面涂覆Cell-Tak粘合剂(BD公司,主要成份为贻贝粘蛋白)。
(5)在纺丝薄膜的一端放置一根外径为1mm的PU光滑轴,然后利用镊子小心地将纺丝薄膜绕轴卷曲,卷好之后两端稍微用丝线固定(因为Cell-Tek粘合剂在潮湿情况下才会有粘性,所以需要用丝线暂时固定)。
(6)卷曲完成后,小心地将轴从内层抽出,立刻把PCL管投入到无菌的磷酸氢钠溶液(pH8.0)中几秒钟,Cell-Tek粘合剂被中和成胶,撤去丝线,即得到不含细胞的管状稳定结构。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法,但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种管状组织工程支架,其特征在于,所述管状组织工程支架内部中空,其管壁由多层薄膜通过生物粘合剂粘合而成。
2.根据权利要求1所述的管状组织工程支架,其特征在于,所述薄膜的材料为生物可降解材料;
优选地,所述薄膜的材料选自聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚癸二酸甘油酯、聚羟基脂肪酸酯、海藻酸盐水凝胶、明胶、透明质酸、白蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、纤维粘连蛋白、壳聚糖或它们的复合材料。
3.根据权利要求1或2所述的管状组织工程支架,其特征在于,所述薄膜是通过静电纺丝法、旋涂法、烘干法或水凝胶法制成的薄膜。
4.根据权利要求1-3任一项所述的管状组织工程支架,其特征在于,所述生物粘合剂为双组分生物粘合剂或单组分生物粘合剂;
优选地,所述双组分生物粘合剂为双组分纤维蛋白粘合剂;
优选地,所述双组分纤维蛋白粘合剂的一个组分包括纤维蛋白原和凝血八因子,另一个组分包括凝血酶和氯化钙;
优选地,所述单组分生物粘合剂为遇水或潮湿变粘的生物粘合剂;
优选地,所述单组分生物粘合剂为α-氰基丙烯酸正丁酯或贻贝粘蛋白。
5.根据权利要求1-4任一项所述的管状组织工程支架,其特征在于,所述薄膜间还包括细胞。
6.一种制作权利要求1-5任一项所述的管状组织工程支架的方法,其特征在于,所述方法包括:在薄膜的单面或双面涂覆生物粘合剂;绕轴卷曲所述薄膜使得薄膜层间通过所述生物粘合剂粘合而成多层薄膜的管壁;抽出轴使得形成内部中空的管状组织工程支架。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述方法包括:在薄膜的双面分别涂覆双组分生物粘合剂的一种组分;绕轴卷曲所述薄膜使得薄膜层间的双组分生物粘合剂发生作用而粘合成多层薄膜的管壁;抽出轴使得形成内部中空的管状组织工程支架。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述方法包括:在薄膜的单面涂覆遇水或潮湿变粘的单组份生物粘合剂;绕轴卷曲所述薄膜使得形成卷筒状管壁;抽出轴并将所述卷筒状管壁置于水性溶液使得薄膜层间通过所述单组份生物粘合剂粘合形成内部中空的管状组织工程支架。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法,其特征在于,所述在薄膜的单面或双面涂覆生物粘合剂之前,还包括在所述薄膜的一面形成细胞层。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法,其特征在于,通过将微流控芯片的孔道与所述薄膜的一面粘合形成微流通道,然后向所述微流通道注入细胞的方式形成细胞层。
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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