CN109943974A - 基于聚羟基脂肪酸酯/明胶电纺纳米纤维的神经导管材料的制备方法 - Google Patents

基于聚羟基脂肪酸酯/明胶电纺纳米纤维的神经导管材料的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于聚羟基脂肪酸酯/明胶电纺纳米纤维的神经导管材料的制备方法。该神经导管材料是将纺丝溶液通过静电纺丝得到的纳米纤维缠绕在神经导管基材表面而得到,其中,所述纺丝溶液为明胶水溶液、烷基糖苷、有机溶剂和聚羟基脂肪酸酯的混合溶液,所述神经导管基材是在管状模具表面形成的纳米纤维层上涂布透明质酸/壳聚糖水凝胶而获得。本发明中,使烷基糖苷包覆在明胶表面后再与聚羟基脂肪酸酯复合来制备纺丝溶液,提高了纺丝溶液的电纺性能,便于加工以及具有良好的生物相容性。

Description

基于聚羟基脂肪酸酯/明胶电纺纳米纤维的神经导管材料的 制备方法
技术领域
本发明属于医用复合纤维的制备技术领域,具体涉及基于聚羟基脂肪酸酯/明胶电纺纳米纤维的神经导管材料的制备方法。
背景技术
人体创伤在生活中是不可避免的,而且人体创伤在人们的生活中的发生频率逐年增加。并且在人体创伤中,其中外周神经损伤大约占5%,因此,神经修复已成为目前临床及科学界急需解决的重要的问题。目前,临床上常采用的修复外周神经损伤的方法是自体移植,但自体移植受来源以及供区不足的限制。于是,组织工程神经导管便应运而生。
聚羟基烷酸酯(P(3HB-co-4HB)),是一种通过微生物获得的可降解生物聚酯,其生物相容性、可塑性、韧性及降解性能较为突出。由于其可降解性能,以及降解产物为水和二氧化碳,对人体没有伤害的性能,使得其在生物学及组织工程领域应用广泛。
发明内容
本发明的目的是提供一种以聚羟基脂肪酸酯和明胶为主要原料的医用神经导管材料及其制备方法,其成品毒性为零,是一种生物相容性极好的医用材料。
本发明的目的是以如下技术方案来实现的。
一种基于聚羟基脂肪酸酯/明胶电纺纳米纤维的神经导管材料,该神经导管材料是将纺丝溶液通过静电纺丝得到的纳米纤维缠绕在神经导管基材表面而得到,其中,所述纺丝溶液为明胶水溶液、烷基糖苷、有机溶剂和聚羟基脂肪酸酯的混合溶液,所述神经导管基材是在管状模具表面形成的纳米纤维层上涂布透明质酸/壳聚糖水凝胶层而获得。
在上述技术方案中,所述的聚羟基脂肪酸酯为3-羟基丁酸和4-羟基丁酸的共聚物、3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物中的一种或两种。其中,所述P(3HB-co-4HB)优选为:Mn≈7×105g/mol,其中4HB的物质的量分数为15%,所述PHBV的优选为Mw=4.21×105,Mn=1.26×105
在上述技术方案中,所述的透明质酸/壳聚糖水凝胶中所述的透明质酸与壳聚糖的质量比为1:5。所述的透明质酸以及壳聚糖可采用本领域常规使用的的透明质酸以及壳聚糖,本发明中,所述透明质酸的纯度大于95%,所述的壳聚糖的分子量在100~200KDa范围内为好。
在上述技术方案中,所述的明胶水溶液中明胶的质量分数为5~25%,在所述纺丝溶液中所述明胶的质量分数为0.14%~0.71%。本发明中,优选地,所述的明胶的胶强度为100-250g Bloom,优选为240g Bloom。
在上述技术方案中,所述的剂烷基糖苷质量为聚羟基脂肪酸酯质量的40~60%,在所述的纺丝溶液中所述的聚羟基脂肪酸酯的质量百分浓度为2~4%。所述烷基糖苷可选用聚合度n在1.1~3,R为C8~C16烷基的烷基糖苷,优选APG1214。
在上述技术方案中,所述的有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷中的一种。
在上述技术方案中,在神经导管基材表面形成的透明质酸/壳聚糖水凝胶层的厚度为1~3mm。
在上述技术方案中,所述的静电纺丝的条件为:纺丝环境温度28~35℃,相对湿度20~40%,静电纺静电压为15~25kV,喷丝口距接收板距离为15~20cm,流速为1.5~2mL/h。
在上述技术方案中,所述的纳米纤维的平均直径为570~620nm。
本发明还提供上述的神经导管材料的制备方法,包括如下步骤:
(1)将壳聚糖置于水中,搅拌至分散后滴加冰醋酸直至溶液澄清,用pH调节剂将溶液pH值调至7.1~7.4后加入交联剂和透明质酸,搅拌8~12h,制得透明质酸/壳聚糖水凝胶溶液;
(2)明胶水溶液中加入有机溶剂、烷基糖苷,均质15~20min,均质液中加入聚羟基脂肪酸酯,在摇床下振荡10~20h,使其完全溶解后,再次均质15~20min,得纺丝溶液;
(3)将纺丝溶液注入静电纺针筒,进行静电纺丝,使在表面均匀涂布有粘结液的管状模具以100~300rpm的速度旋转,来接收静电纺丝纳米纤维,使纳米纤维缠绕所述管状模具表面,形成纳米纤维层;
(4)将表面形成有纳米纤维层的管状模具浸入步骤(1)制得的透明质酸/壳聚糖水凝胶溶液中,使管状模具表面的纳米纤维层上形成透明质酸/壳聚糖水凝胶层,得神经导管基材;
(5)将步骤(2)制备得到的纺丝溶液再次注入静电纺针筒,进行静电纺丝,使在表面形成有神经导管基材的管状模具以100~300rpm的速度旋转,来接收静电纺丝纤维,使纳米纤维缠绕神经导管基材表面;
(6)退去管状模具,得神经导管材料。
在上述技术方案中,在步骤(1)中所述的交联剂可以采用本领域常规的交联剂,本发明中如可以采用京尼平,所述的pH调节剂可以采用本领域常规的pH调节剂,本发明中如可以采用β-甘油磷酸钠。还有所述交联剂的使用量可以采用本领域常规的使用量,使凝胶交联,在本发明中,交联剂(如京尼平)的使用量约为壳聚糖质量的1%~2%。
在上述技术方案中,步骤(2)中所述的粘结液为蔗糖水溶液,蔗糖水溶液中蔗糖的质量百分含量为50~70%。
在上述技术方案中,在步骤(4)中,将表面形成有纳米纤维层的管状模具浸入步骤(1)制得的透明质酸/壳聚糖水凝胶溶液中,放置一段时间,拿出管状模具以使管状模具表面的纳米纤维层上形成透明质酸/壳聚糖水凝胶层,这一步骤可反复几次,使在纳米纤维层上形成的透明质酸/壳聚糖水凝胶层的厚度达到1~3mm。
在上述技术方案中,在步骤(2)中,在明胶水溶液中加入有机溶剂、烷基糖苷后,均质15~20min,通过均质的过程,烷基糖苷的亲水基包覆在明胶的表面,能够降低共混溶液的表面张力和电导率。在该均质液中加入聚羟基脂肪酸酯,使其完全溶解后,再次均质15~20min,通过该均质的过程,使明胶稳定地分布在连续相聚羟基脂肪酸酯溶液中,能够得稳定的纺丝溶液。
本发明的有益效果:
(1)本发明提供了亲水性物质与亲油性物质的共混制备方法,向纺丝溶液体系中加入特定的乳化剂烷基糖苷,使烷基糖苷包覆在明胶表面后再与聚羟基脂肪酸酯复合来制备共混溶液(纺丝溶液),提高了纺丝溶液的电纺性能。本发明的方法制备得到的共混溶液便于加工以及具有良好的生物相容性。
(2)本发明的神经导管材料包括三层,即依次包括纳米纤维层、透明质酸/壳聚糖水凝胶层以及纳米纤维层,利用水凝胶连接里外静电纺丝纤维,进一步提高了本发明神经导管材料的生物相容性。
附图说明
图1表示复合纤维形状图,图1A为实物照片,图1B为扫描电镜图片。
图2为神经导管的实物照片。
图3为采用CCK8法检测不同材料浸提液对神经细胞增殖影响结果。
图4中a、b分别为复合纤维和神经导管的体外细胞培养SEM图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。下述实施例中,如无特殊说明,所使用的实验方法均为常规方法,所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
以下为实例中所用的原料:
聚羟基脂肪酸酯:Mn≈7×105g/mol,其中4HB的物质的量分数为15%,购自山东意可曼科技有限公司;
明胶:胶强度~240g Bloom,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
烷基糖苷:APG1214,购自山东优索化工科技有限公司;
透明质酸:纯度为97%,分子量776.64,购自上海麦克林生化科技有限公司;
壳聚糖:分子量150KDa,购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例1
聚羟基脂肪酸酯/明胶复合纤维的神经导管材料,按照如下方法制备得到:
(1)室温下,称取0.17g透明质酸粉末与0.51g壳聚糖,将壳聚糖置于50g去离子水中放入4℃的低温反应器中搅拌均匀后,向溶液中滴加稀释后的冰醋酸直至溶液澄清,用β-甘油磷酸钠将溶液pH调至7.1后加入5mg京尼平和0.17g透明质酸搅拌12h,制得CS-HA注射水凝胶溶液,待用;
(2)使管状模具(塑料管)表面浸渍在质量百分浓度为70%的蔗糖粘结液,使粘结液均匀布于管状模具表面;
(3)配置质量百分浓度为5%的明胶水溶液,抽取1mL,加入0.4g烷基糖苷和32.34g三氯甲烷,在超声波细胞粉碎机里均质15min,向均质后的混合溶液中加入1g聚羟基脂肪酸酯,放入摇床中振荡溶解12h,将混合溶液再一次在超声波细胞粉碎机均质15min,得纺丝溶液;
(4)将一部分纺丝溶液注入静电纺针筒,纺丝液在环境温度35℃,相对湿度20%,20kV静电压,喷丝口距接收板距离为20cm,流速为2.0mL/h的条件下进行静电纺丝,使在表面均匀涂布有粘结液的管状模具以100rpm的速度旋转,来接收静电纺丝纤维,使纳米纤维缠绕管状模具表面,形成纳米纤维层;将得到的该纳米纤维层以下称为复合纤维或复合纤维膜;
(5)将表面形成有纳米纤维层的管状模具浸入步骤(1)制得的透明质酸/壳聚糖水凝胶溶液中,放置一段时间,拿出管状模具,以使在管状模具表面的纳米纤维层上形成厚度为1mm的透明质酸/壳聚糖水凝胶层,得神经导管基材;
(6)将步骤(3)制备得到的一部分纺丝溶液注入到静电纺针筒中,进行静电纺丝,使在表面形成有神经导管基材的管状模具以100rpm的速度旋转,来接收静电纺丝纤维,使纳米纤维缠绕神经导管基材表面;
(7)用水溶的方法退管,得到神经导管材料。
图1为步骤(4)得到的复合纤维的实物照片(图1A)和扫描电镜照片(图1B),从实物图可以看出纤维表面光滑,从扫描电镜图片可以看出纤维形态良好,静电纳米纤维的直径分布比较均匀集中,直径在560-580nm之间。
图2为退去管状模具后得到的神经导管的实物照片。图2中可见,神经导管为一个直径为12mm的光滑的管状材料。
实施例2
聚羟基脂肪酸酯/明胶复合纤维的神经导管材料,按照如下方法制备得到:
(1)室温下,称取0.17g透明质酸粉末与0.51g壳聚糖,将壳聚糖置于50g去离子水中放入4℃的低温反应器中搅拌均匀后,向溶液中滴加稀释后的冰醋酸直至溶液澄清,用β-甘油磷酸钠将溶液pH调至7.1后加入10mg京尼平和0.17g透明质酸搅拌12h,制得CS-HA注射水凝胶溶液,待用;
(2)使管状模具(塑料管)表面浸渍在质量百分浓度为60%的蔗糖粘结液,使粘结液均匀布于管状模具表面;
(3)配置质量百分浓度15%的明胶水溶液,抽取1mL,加入0.4g烷基糖苷和32.34g三氯甲烷,在超声波细胞粉碎机里均质15min,向均质后的混合溶液中加入1g聚羟基脂肪酸酯,放入摇床中振荡溶解12h,将混合溶液再一次在超声波细胞粉碎机均质15min;
(4)将一部分纺丝溶液注入静电纺针筒,纺丝液在环境温度35℃,相对湿度20%,20kV静电压,喷丝口距接收板距离为20cm,流速为2.0mL/h的条件下进行静电纺丝,使在表面均匀涂布有粘结液的管状模具以100rpm的速度旋转,来接收静电纺丝纤维,使纳米纤维缠绕管状模具表面,形成纳米纤维层;
(5)将表面形成有纳米纤维层的管状模具浸入步骤(1)制得的透明质酸/壳聚糖水凝胶溶液中,放置一段时间,拿出管状模具,以使在管状模具表面的纳米纤维层上形成厚度为2mm的透明质酸/壳聚糖水凝胶层,得神经导管基材;
(6)将步骤(3)制备得到的一部分纺丝溶液注入到静电纺针筒中,进行静电纺丝,使在表面形成有神经导管基材的管状模具以100rpm的速度旋转,来接收静电纺丝纤维,使纳米纤维缠绕神经导管基材表面;
(7)用水溶的方法退管,得到神经导管材料。
在扫描电镜下可以看出,得到的静电纳米纤维表面光滑,直径在580-600nm之间。
实施例3
聚羟基脂肪酸酯/明胶复合纤维的神经导管材料,按照如下方法制备得到:
(1)室温下,称取0.17g透明质酸粉末与0.51g壳聚糖,将壳聚糖置于50g去离子水中放入4℃的低温反应器中搅拌均匀后,向溶液中滴加稀释后的冰醋酸直至溶液澄清,用β-甘油磷酸钠将溶液pH调至7.1后加入5mg京尼平和0.17g透明质酸搅拌12h,制得CS-HA注射水凝胶溶液,待用;
(2)使管状模具(塑料管)表面浸渍在质量百分浓度为70%的蔗糖粘结液,使粘结液均匀布于管状模具表面;
(3)配置质量百分浓度20%的明胶水溶液,抽取1mL,加入0.6g烷基糖苷和32.34g三氯甲烷,在超声波细胞粉碎机里均质15min,向均质后的混合溶液中加入1g聚羟基脂肪酸酯,放入摇床中振荡溶解12h,将混合溶液再一次在超声波细胞粉碎机均质15min;
(4)将一部分纺丝溶液注入静电纺针筒,纺丝液在环境温度35℃,相对湿度20%,20kV静电压,喷丝口距接收板距离为20cm,流速为2.0mL/h的条件下进行静电纺丝,使在表面均匀涂布有粘结液的管状模具以100rpm的速度旋转,来接收静电纺丝纤维,使纳米纤维缠绕管状模具表面,形成纳米纤维层;
(5)将表面形成有纳米纤维层的管状模具浸入步骤(1)制得的透明质酸/壳聚糖水凝胶溶液中,放置一段时间,拿出管状模具,以使在管状模具表面的纳米纤维层上形成厚度为1mm的透明质酸/壳聚糖水凝胶层,得神经导管基材;
(6)将步骤(3)制备得到的一部分纺丝溶液注入到静电纺针筒中,进行静电纺丝,使在表面形成有神经导管基材的管状模具以100rpm的速度旋转,来接收静电纺丝纤维,使纳米纤维缠绕神经导管基材表面;
(7)用水溶的方法退管,得到神经导管材料。
在扫描电镜下可以看出,得到的静电纳米纤维表面光滑,直径在590-610nm之间。
实施例4
1)分别选取实施例1制备得到的复合纤维膜和神经导管0.15g,分别用酒精和PBS分别清洗5分钟,重复3次,风干后加入1.5mL纯培养液,在细胞培养箱里放置24小时,吸取浸泡液放置在2mL的离心管中,分别得复合纤维膜浸提液和神经导管浸提液,备用;
2)将RSC96大鼠雪旺细胞,在RPMI-1640中培养一日后,用胰酶处理后收集细胞,并以0.5×103个/孔的浓度种植在96孔细胞培养板中,置于37℃,5%CO2的培养箱中培养24h后,吸出旧的细胞培养液,换入新的细胞培养液(100μL/孔),分别加入备用的复合纤维膜浸提液、神经导管浸提液,分别作为复合纤维组、神经导管组,不加的为空白组,每组设6个复孔,在相同条件下分别培养12h、24h、36h、48h、72h、96h。取出细胞培养板,在各孔中加110μLCCK8聚培养基混合液,在细胞培养箱中放置30min后用酶标仪在450nm下测定各孔的吸光度,取6个复孔的平均值并通过与空白组比较来判断细胞毒性。各组在不同时间段的平均吸光度值(A450)如图3所示。
采用浸提液法对生物医用材料进行毒性试验,以细胞的相对增殖度为标准划分安全等级(表1)。相对增殖度用下式(Ⅰ)来算出。
表1细胞增值率百分率与细胞毒性等级的对应关系
由图3细胞增殖结果对比空白组可以看出复合纤维和神经导管不具有细胞毒性,而有促进细胞增长、分化的作用,可以认为该材料具有良好的细胞相容性和生物安全性,能作为医用材料,其安全等级为0。
实施例5
1)分别取实施例1制备得到的复合纤维膜和神经导管1.5cm,用75%乙醇浸泡5分钟进行消毒,然后用无菌PBS清洗,每次5分钟,重复三次,风干后备用;
2)将备用的复合纤维膜和神经导管放入12孔细胞培养板中,每孔大约接种1×103个/孔浓度接种RSC96雪旺细胞,放入细胞培养箱培养72小时作为SEM电镜观察的标本,培养72小时后,先吸出旧培养液,然后用PBS洗三次,用4%戊二醛固定4小时,随后进行乙醇梯度脱水各10min,50%叔丁醇和纯叔丁醇各处理10分钟,最后用冻干机冷冻干燥,喷金后用扫描电镜观察
细胞在材料上的粘附能力及形态,SEM电镜图如图4,其中,图4a、图4b分别为复合纤维膜和神经导管的体外细胞培养SEM图。由图可见,两个材料表面均粘附了许多细胞,其中,神经导管的细胞数量明显多,细胞伸出了为数众多的伪足且细胞呈现出扁平的形态,紧密地贴附在材料表面,说明神经导管材料的生物相容性良好,有利于细胞的生长、粘附,使得细胞生长状态良好。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于这里的实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于聚羟基脂肪酸酯/明胶电纺纳米纤维的神经导管材料,该神经导管材料是将纺丝溶液通过静电纺丝得到的纳米纤维缠绕在神经导管基材表面而得到,其中,所述纺丝溶液为明胶水溶液、烷基糖苷、有机溶剂和聚羟基脂肪酸酯的混合溶液,所述神经导管基材是在管状模具表面形成的纳米纤维层上涂布透明质酸/壳聚糖水凝胶而获得。
2.根据权利要求1所述的神经导管材料,其特征在于,所述的聚羟基脂肪酸酯为3-羟基丁酸和4-羟基丁酸的共聚物、3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的神经导管材料,其特征在于,所述的透明质酸/壳聚糖水凝胶中所述的透明质酸与壳聚糖的质量比为1:5。
4.根据权利要求1所述的神经导管材料,其特征在于,所述的明胶溶液中明胶的质量百分浓度为5~25%,在所述纺丝溶液中所述明胶的质量百分浓度为0.14%~0.71%。
5.根据权利要求1所述的神经导管材料,其特征在于,所述的烷基糖苷质量为聚羟基脂肪酸酯质量的40~60%,在所述的纺丝溶液中所述的聚羟基脂肪酸酯的质量百分浓度为2~4%。
6.根据权利要求1所述的神经导管材料,其特征在于,所述的有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷中的一种。
7.根据权利要求1所述的神经导管材料,其特征在于,所述的静电纺丝的条件为:纺丝环境温度28~35℃,相对湿度20~40%,静电压为15~25kV,喷丝口距接收板距离为15~20cm,流速为1.5~2mL/h。
8.根据权利要求1所述的神经导管材料,其特征在于,所述的纳米纤维的平均直径为570~620nm。
9.如权利要求1~8的任一项所述的神经导管材料的制备方法,包括如下步骤:
(1)将壳聚糖置于水中,搅拌至分散后滴加冰醋酸直至溶液澄清,用pH调节剂将溶液pH值调至7.1~7.4后加入交联剂和透明质酸,搅拌8~12h,制得透明质酸/壳聚糖水凝胶溶液;
(2)明胶水溶液中加入有机溶剂、烷基糖苷,均质15~20min,均质液中加入聚羟基脂肪酸酯,在摇床下振荡10~20h,使其完全溶解后,再次均质15~20min,得纺丝溶液;
(3)将纺丝溶液注入静电纺针筒,进行静电纺丝,使在表面均匀涂布有粘结液的管状模具以100~300rpm的速度旋转,来接收静电纺丝纳米纤维,使纳米纤维缠绕所述管状模具表面,形成纳米纤维层;
(4)将表面形成有纳米纤维层的管状模具浸入步骤(1)制得的透明质酸/壳聚糖水凝胶溶液中,使管状模具表面的纳米纤维层上形成透明质酸/壳聚糖水凝胶层,得神经导管基材;
(5)将步骤(2)制备得到的纺丝溶液再次注入静电纺针筒,进行静电纺丝,使在表面形成有神经导管基材的管状模具以100~300rpm的速度旋转,来接收静电纺丝纤维,使纳米纤维缠绕神经导管基材表面;
(6)退去管状模具,得神经导管材料。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中所述的交联剂为京尼平,所述的pH调节剂为β-甘油磷酸钠;在步骤(2)中所述的粘结液为蔗糖质量百分含量为50~70%的蔗糖水溶液。
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