CN103349795A - 一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法，所述方法步骤如下：将细胞悬液浮于过滤除菌的海藻酸钠溶液中，并通过滴液发生装置滴入氯化钙溶液中，形成海藻酸钙胶珠；将用生理盐水清洗过后的胶珠置于含膜材的溶液中，使胶珠表面覆上一层膜，形成微胶囊；再将微胶囊表面多余的正电荷进行中和；采用柠檬酸钠溶液使微胶囊内的海藻酸钙胶珠液化，即形成人工细胞；再将人工细胞和水凝胶的混合物固化成型，最后形成人工细胞-水凝胶复合体；将人工细胞-水凝胶复合体置于静态或振荡或微重力的条件下培养，以构建组织工程化组织。本发明能够降低传统支架对高孔隙率及高连通率的要求，且制备方法简单，有利于实现体外构建的大规模生产。

Description

一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法

【技术领域】

本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法。

【背景技术】

组织工程是当前国内外研究的热点领域，其中如何成功构建细胞与支架复合体以形成组织是组织工程研究中的一个关键问题。

当前组织工程组织构建的基本思路是先制备支架材料，然后将种子细胞移植到支架材料上，经过一定时间的培养，在体外或体内构建组织和器官。关于支架材料研究非常广泛，各种合成材料、天然生物材料以及复合材料已经广泛应用，而且通过快速成形技术，已经能够制造出与缺损组织三维结构完全匹配的组织工程支架材料。但是组织构建过程中也暴露出一个问题，如何保证细胞在三维支架材料中的分布且生长不受影响？目前采用的基本思路是提高支架的孔隙率和连通率，一些研究者也探讨了细胞的植入方式或培养方法对提高细胞的分布及生长繁殖的影响，如采用动态、磁力、真空、静电、离心等方式。那么是否可以打破支架制备→注入细胞→培养构建这一传统的组织构建方式，尝试其它有效的构建方式来提高细胞的分布生长繁殖呢？可注射水凝胶目前成为研究者的一个热点，它所采用的构建方式是细胞材料混合→制备支架-细胞复合体→培养构建。

此外，研究者也提出了一些新的组织构建思路。考虑到支架材料自身降解率、降解产物的毒性、对细胞通讯的影响、对周围组织的磨损、对细胞形态的改变等，一些研究者采用了无支架的组织构建方式，即细胞→培养构建。2007年，美、奥、德的研究者在内源性修复的基础上，联合提出了“促生内源性修复”(Facilitated endogenous repair)这一新的组织构建方式，其基本策略是采用分子刺激，例如基因转移，利用内源性组织自身的再生潜力，促发原位再生，其构建方式为分子刺激→组织再生。最近，自下而上(Bottom-up)的组织构建方式也逐渐引起了研究者的兴趣。例如Mcguigan等提出了模板组织构建的策略，将HepG2细胞与胶原混合固化制成亚毫米模板，模板外表面植有内皮细胞，将模板塞入一个大的试管，试管两端连接微泵系统用于培养液的供给。2005年，Malafaya等提出了一种创新性的组织构建方式，利用微球融合作为细胞载体进行组织构建。由于微球载体具有较大的比表面积，因而有利于细胞的黏附生长，这一构建方式近年来引起了一些研究者的关注。

由以上可见，研究者在组织构建的同时，不断探索新的组织构建的方式，而且取得了一些不错的效果，但是不同组织构建方法之间仍然存在着一些问题，例如，体内构建的规模化，微球融合构建的低连通率，无支架培养获得的组织尺寸，水凝胶材料固化对细胞生长空间的影响等等，因此，我们考虑是否可采用这样一种构建方式：参考微球融合的bottom-up构建方式，但是细胞是在微球内部生长，内部环境为液态，细胞的生存空间足够，从而降低组织工程对支架材料孔隙率、连通率的要求。同时考虑到体外组织构建成功有可能促进组织工程产品的规模化、产业化，因此我们设计了一种新的组织工程构建方式：结合水凝胶与bottom-up的概念，利用“人工细胞”为基元体外构建组织。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题，在于提供一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法，能够降低传统支架对高孔隙率及高连通率的要求，且制备方法简单，有利于实现体外构建的大规模生产。

本发明是这样实现的：

一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法，所述方法步骤如下：

步骤10、将细胞悬液浮于过滤除菌的海藻酸钠溶液中，并通过滴液发生装置滴入氯化钙溶液中，形成海藻酸钙胶珠；

步骤20、将用生理盐水清洗过后的胶珠置于含膜材的溶液中，使胶珠表面覆上一层膜，形成微胶囊；再将微胶囊表面多余的正电荷进行中和；

步骤30、采用柠檬酸钠溶液使微胶囊内的海藻酸钙胶珠液化，即形成人工细胞；再将人工细胞和水凝胶的混合物固化成型，最后形成以人工细胞为基本结构单元，水凝胶为填充介质的人工细胞-水凝胶复合体；

步骤40、将人工细胞-水凝胶复合体置于静态或振荡或微重力的条件下培养，以构建组织工程化组织。

进一步地，所述步骤30还可以为：将微胶囊与水凝胶的混合物固化成型后，加入柠檬酸钠，使微胶囊内的海藻酸钙胶珠液化，最后形成以人工细胞为基本结构单元、水凝胶为填充介质的人工细胞-水凝胶复合体。

本发明具有如下优点：

第一、由于生物微胶囊(即人工细胞)及水凝胶通透性较好，降低了传统支架对高孔隙率及高连通率的要求；

第二、生物微胶囊内部为液态环境，同时作为微载体，具有高的比表面积，兼具贴壁培养和悬浮培养的优势，有利于细胞的黏附生长繁殖，从而产生更多细胞外基质逐步构建组织，与生理条件的组织再生更为相仿。同时由于采取体外构建，且目的是使细胞聚集体与产生的ECM自组装形成组织，也降低了传统支架材料对水凝胶体内移植强度性能的要求；

第三、由于微胶囊内部为液态环境，所涉及的支架材料主要只包括微囊膜以及支架形态固定的水凝胶部分，因此采用的材料量相对较少，减小了材料自身对组织构建的影响；

第四、制备方法简单，有利于实现体外构建的大规模生产。

【具体实施方式】

本发明涉及一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法，所述方法步骤如下：

步骤10、将细胞悬液浮于过滤除菌的海藻酸钠溶液中，并通过滴液发生装置滴入氯化钙溶液中，形成海藻酸钙胶珠；

步骤20、将用生理盐水清洗过后的胶珠置于含膜材的溶液中，使胶珠表面覆上一层膜，形成微胶囊；再将微胶囊表面多余的正电荷进行中和；

步骤30、采用柠檬酸钠溶液使微胶囊内的海藻酸钙胶珠液化，即形成人工细胞；再将人工细胞和水凝胶的混合物固化成型，最后形成以人工细胞为基本结构单元，水凝胶为填充介质的人工细胞-水凝胶复合体；

步骤40、将人工细胞-水凝胶复合体置于静态或振荡或微重力的条件下培养，以构建组织工程化组织。

所述步骤30还可以为：将微胶囊与水凝胶的混合物固化成型后，加入柠檬酸钠，使微胶囊内的海藻酸钙胶珠液化，最后形成以人工细胞为基本结构单元、水凝胶为填充介质的人工细胞-水凝胶复合体。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例一：

步骤100、取汇合的正常生长的软骨细胞两瓶，去掉旧培养基，用D-PBS洗涤细胞两次，每次2-3mL，去掉洗涤液。加入胰酶500μL，使其完全覆盖细胞层，置于CO₂培养箱中温育约1min。当细胞将要分离而呈圆颗粒状时，轻拍培养瓶底使细胞脱落，加入4mL完全培养液(含胎牛血清10％，双抗1％的DMEM培养基，上述均为体积分数)混匀形成细胞悬液，终止胰酶的消化作用。计数，细胞总数约1×10⁷个，将细胞悬液转移至无菌的15mL离心管中离心，1000rpm，5min。去除上清，加入0.5mL新鲜完全培养基吹打使细胞重悬。

步骤10、将上述细胞悬液加入到2mL1.5％Alg(海藻酸钠溶液)中混匀，再将海藻酸钠细胞悬液通过高压静电液滴发生装置，调节电压为5.5KV，7号针头，针头与氯化钙溶液液面的距离为2cm，以50mm/h推进速度滴入氯化钙溶液中，制备成包埋细胞的海藻酸钙微胶珠，细胞包埋密度为5×10⁶个/mL。

步骤20、将上述胶珠用生理盐水清洗，然后转入25mL烧杯中，加入0.5％、pH5.5壳聚糖溶液进行成膜反应10min，用枪吹匀，使海藻酸钙胶珠表面形成一层稳定的海藻酸钙/壳聚糖微胶囊膜；将已成膜的微胶囊置于0.5％Alg中中和表面多余正电荷。

步骤30、微胶囊溶液静置，弃上清，用生理盐水清洗一次，再加入1.6％的柠檬酸钠，静置4min，液化核芯(海藻酸钙微胶珠)，即得人工细胞。而后用生理盐水吹打清洗1次。往制得的人工细胞加入一定量的完全培养液混匀成人工细胞悬液，37℃保温。

配制3％的LMP Agarose(低熔点琼脂糖)溶液，在65℃水浴完全溶解后，取出稍冷片刻再放入37℃水浴保温，避免温度过低琼脂糖胶凝。

待人工细胞、琼脂糖溶液恒温在37℃后，快速将二者等体积混合均匀，混合液立即注入聚四氟乙烯孔板模具中，室温自然冷却即可凝胶成型。移除模具，即得到人工细胞-水凝胶复合体。整个过程确保无菌操作，避免细胞染菌。

步骤40、将上述人工细胞-水凝胶复合体置于静态培养条件下培养以构建组织工程化组织。

实施例二：

本实施例与实施例一不同的是：细胞采用肝细胞，水凝胶材料采用丝素蛋白。利用超声波细胞破碎仪，将丝素蛋白溶液在200W功率下，超声1min，将人工细胞与丝素蛋白溶液以体积比1∶2混合均匀，得到的混合物在室温下静置5min，即得到人工细胞-丝素蛋白凝胶复合体。

实施例三：

本实施例与实施例一基本相同，所不同的是培养条件为动态摇床。

实施例四：

本实施例与实施例一基本相同，所不同的是培养条件为微重力。

实施例五：

本实施例与实施例二基本相同，所不同的是培养条件为动态摇床。

实施例六：

本实施例与实施例二基本相同，所不同的是培养条件为微重力。

本发明具有如下优点：

第一、由于生物微胶囊(即人工细胞)及水凝胶通透性较好，降低了传统支架对高孔隙率及高连通率的要求；

第二、生物微胶囊内部为液态环境，同时作为微载体，具有高的比表面积，兼具贴壁培养和悬浮培养的优势，有利于细胞的黏附生长繁殖，从而产生更多细胞外基质逐步构建组织，与生理条件的组织再生更为相仿。同时由于采取体外构建，且目的是使细胞聚集体与产生的ECM自组装形成组织，也降低了传统支架材料对水凝胶体内移植强度性能的要求；

第三、由于微胶囊内部为液态环境，所涉及的支架材料主要只包括微囊膜以及支架形态固定的水凝胶部分，因此采用的材料量相对较少，减小了材料自身对组织构建的影响；

第四、制备方法简单，有利于实现体外构建的大规模生产。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (2)

1.一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法，其特征在于：所述方法步骤如下：

步骤10、将细胞悬液浮于过滤除菌的海藻酸钠溶液中，并通过滴液发生装置滴入氯化钙溶液中，形成海藻酸钙胶珠；

步骤20、将用生理盐水清洗过后的胶珠置于含膜材的溶液中，使胶珠表面覆上一层膜，形成微胶囊；再将微胶囊表面多余的正电荷进行中和；

步骤30、采用柠檬酸钠溶液使微胶囊内的海藻酸钙胶珠液化(，即形成人工细胞；再将人工细胞和水凝胶的混合物固化成型，最后形成以人工细胞为基本结构单元，水凝胶为填充介质的人工细胞-水凝胶复合体；

步骤40、将人工细胞-水凝胶复合体置于静态或振荡或微重力的条件下培养，以构建组织工程化组织。

2.根据权利要求1所述的一种基于人工细胞的组织工程化组织的构建方法，其特征在于：所述步骤30还可以为：将微胶囊与水凝胶的混合物固化成型后，加入柠檬酸钠，使微胶囊内的海藻酸钙胶珠液化，最后形成以人工细胞为基本结构单元、水凝胶为填充介质的人工细胞-水凝胶复合体。