CN103477222A - 用于高通量研究细胞相互作用的装置 - Google Patents

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Abstract

本文提供了可用作3D生物测定的微流体装置，例如用于药物筛选、个体化药物、组织工程、创伤愈合以及其他应用。所述装置在小的聚合物块中具有一系列通道(例如，小的流体通道)，其中一个或更多个通道可填充有生物学相关凝胶，例如胶原蛋白，其被柱保持在原位。如本文所示，当细胞如内皮细胞对装置进行铺板时，就能够在凝胶中生长新的血管，所述凝胶厚到足以使得细胞能够以三维生长。另外的通道如流体通道允许药物或生物材料暴露于3D细胞生长。随着细胞如内皮细胞在3D凝胶支架表面上的生长，可对其进行培养和观察，其中例如可测量血管生成的速率和研究癌细胞的内渗和外渗。

Description

用于高通量研究细胞相互作用的装置
相关申请
本申请要求2010年10月19日提交的美国临时申请No.61/394,624和2010年9月29日提交的美国临时申请No.61/387,674的权益。
上述申请的整体教导通过引用并入本文。
政府支持
本发明在由国家科学基金会授予的ERI #0735997和美国国立卫生研究院的NS41590、NS45523和NS49553的政府支持下进行。政府在本发明中享有一定权利。
背景技术
细胞相互作用的研究对于理解很多疾病的发展很重要。用于研究细胞相互作用的装置通常允许细胞在胶原或其他生物相容性凝胶的薄片上的水平单层上生长。这样的装置可用于例如内皮细胞，其最终形成向下生长的血管。向这些装置添加药物使得能够对药物对于从装置的顶端开始的血管形成作用进行定性评估，在这里血管作为凝胶中的孔出现。但是，无法从侧面对血管进行成像。
因此，需要改善允许研究细胞相互作用的装置。
发明内容
本文描述了细胞测定装置，其可用于筛选对活细胞具有影响的试剂。例如，所述装置可用于筛选抗血管生成剂、抗转移剂、伤口愈合剂和组织工程试剂。在一个方面，所述装置允许从侧面观察血管，不是作为孔而是作为锥形，能够更详细地分析试剂(如药物)对于细胞生长(例如癌细胞的侵袭)的影响。
在一些具体方面，所述装置是3D支架微流体装置，其可用于以高通量方式研究多细胞相互作用(例如高通量抗癌药物筛选)。所述装置可用于药物发现和个体化药物。例如，在研究背景下所述装置可用于可帮助阻止人体内癌细胞散布之新药的体外试验，在医疗背景下可用于为特定患者匹配最佳的抗癌症散布的药物。这种装置是对现有装置的改进，在该装置中其允许容易地成像以及定量的(不仅是定性的)结果。
在一个方面，所述装置包含由光学透明材料构成的基底以及(i)一个或更多个流体通道；(ii)一个或更多个流体通道入口(inlet)；(iii)一个或更多个流体通道出口(outlet)；(iii)一个或更多个凝胶笼(gel cage)区；和(iv)多个柱(post)；其中每个凝胶笼区的全部或部分侧邻一个或更多个流体通道的全部或部分，从而产生一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区；以及每个凝胶笼区包含至少一排形成凝胶笼区的柱。
在另一个方面，所述装置还包含至少两个凝胶笼区，其中所述凝胶笼区彼此串联排布在所述装置中。在另一个方面，所述装置还包含至少两个凝胶笼区，其中所述凝胶笼区彼此平行排布在装置中。
在另一个方面，所述装置包含：(i)第一流体通道；(ii)第二流体通道；(iii)一个或更多个流体入口；(iv)一个或更多个流体出口；(v)凝胶笼区，其形成凝胶通道；(vi)凝胶通道入口；和(vii)多个柱。在该装置中，凝胶通道一侧的全部或部分侧邻并且平行于第一流体通道的全部或部分，从而产生第一凝胶通道-流体通道界面区；并且凝胶通道的另一侧的全部或部分侧邻并且平行于第二流体通道的全部或部分，从而产生第二凝胶通道-流体通道界面区。所述凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着凝胶通道的长度，一排沿着凝胶通道在第一凝胶通道-流体通道界面的一侧，另一排沿着凝胶通道在第二凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而形成沿着凝胶通道的长度的凝胶笼区；每个柱为三角形、梯形或其组合。
在又一个方面，所述装置包含所述装置包含：(i)第一流体通道；(ii)第二流体通道；(iii)一个或更多个流体入口；(iv)一个或更多个流体出口；(v)第一凝胶笼区，其形成第一凝胶通道；和(vi)多个柱。在该装置中，第一凝胶通道的一侧的全部或部分侧邻并且平行于第一流体通道的全部或部分，从而产生第一凝胶通道-流体通道界面区；并且第一凝胶通道的另一侧的全部或部分侧邻并且平行于第二流体通道的全部或部分，从而产生第二凝胶通道-流体通道界面区。第一凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着第一凝胶通道的长度，一排沿着第一凝胶通道在第一凝胶通道-流体通道界面的一侧，另一排沿着第一凝胶通道在第二凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而形成沿着凝胶通道的长度的第一凝胶笼区。所述装置还包含：(vii)凝胶通道形式的第二凝胶笼区，从而形成第二凝胶通道；和(viii)凝胶通道形式的第三凝胶笼区，从而形成第三凝胶通道。第二凝胶通道的一侧的全部或部分侧邻并且平行于第一流体通道的全部或部分，从而产生第三凝胶通道-流体通道界面区；并且第二凝胶通道的另一侧的全部或部分侧邻并且平行于第二流体通道的全部或部分，从而产生四凝胶通道-流体通道界面区。第二凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着第二凝胶通道的长度，一排沿着第二凝胶通道在第三凝胶通道-流体通道界面的一侧，另一排沿着第二凝胶通道在第四凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而形成沿着第二凝胶通道的长度的凝胶笼区。另外，第三凝胶通道的一侧的全部或部分侧邻并且平行于第一流体通道的全部或部分，从而产生第五凝胶通道-流体通道界面区；并且第三凝胶通道的另一侧的全部或部分侧邻并且平行于第二流体通道的全部或部分，从而产生第六凝胶通道-流体通道界面区。第三凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着第三凝胶通道的长度，一排沿着第三凝胶通道在第五凝胶通道-流体通道界面的一侧，另一排沿着第三凝胶通道在第六凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而形成沿着第三凝胶通道的长度的凝胶笼区。第一凝胶笼区、第二凝胶笼区和第三凝胶笼区彼此串联。装置中的每个柱为三角形、梯形或其组合。因此，在该实施方案中，每个凝胶笼区都与第一流体通道和第二流体通道接触。
在另一个方面，所述装置包含由光学透明材料构成的基底以及(i)至少三个流体通道；(ii)至少一个流体通道入口；(iii)至少一个流体通道出口；(iii)至少两个凝胶笼区；和(iv)多个柱，其中所述凝胶笼区彼此平行排布。每个凝胶笼区的全部或部分侧邻一个流体通道的全部或部分，从而产生第一凝胶笼区-流体通道界面区、第二凝胶笼区-流体通道界面区和第三凝胶笼区-流体通道界面区；并且每个凝胶笼区包含至少一排形成凝胶笼区的柱。在一个具体方面，每个凝胶笼区形成凝胶通道，并且每个凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着各自凝胶通道的长度，一排沿着凝胶通道的一侧，另一排沿着凝胶通道的对侧，从而形成沿着每个凝胶通道的每个长度的凝胶笼区。
在另一个方面，所述装置包含由光学透明材料构成的基底以及(i)一个或更多个流体通道；(ii)一个或更多个流体通道入口；(iii)一个或更多个流体通道出口；(iii)一个或更多个凝胶笼区；(iv)一个或更多个气体通道，其中所述一个或更多个气体通道的全部或部分侧邻一个或更多个流体通道、一个或更多个凝胶笼区或其组合的至少一侧；和(v)多个柱。每个凝胶笼区的全部或部分侧邻一个或更多个流体通道的全部或部分，从而产生一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区；并且每个凝胶笼区包含至少一排形成凝胶笼区的柱。所述一个或更多个气体通道允许(一种或多种)气体(例如，氮气、氢气、氦、氧化氮、一氧化碳)流过装置以例如除去氧气。
在另一个方面，所述装置包含由光学透明材料构成的基底以及(i)一个或更多个流体通道；(ii)一个或更多个流体通道入口；(iii)一个或更多个流体通道出口；(iii)一个或更多个凝胶笼区；(iv)不能够透过细胞但是可透过由细胞分泌的分子的膜，其中膜的一侧与所述一个或更多个流体通道、所述一个或更多个凝胶通道或其组合接触；和(v)多个柱。每个凝胶笼区的全部或部分侧邻一个或更多个流体通道的全部或部分，从而产生一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区；并且每个凝胶笼区包含至少一排形成凝胶笼区的柱。所述装置还可包含特异性结合由(一种或多种)细胞分泌的一种或多种分子的(一种或多种)捕捉剂，捕捉剂在膜的对侧并且无法穿过膜。
在另一个方面，所述装置包含由光学透明材料构成的基底以及(i)一个或更多个流体通道；(ii)一个或更多个流体通道入口；(iii)一个或更多个流体通道出口；(iii)一个或更多个凝胶笼区；和(iv)多个柱；其中每个流体通道的一部分与每个凝胶笼区的一部分接触，而每个流体通道的其余部分延伸离开一个或更多个凝胶笼区。每个凝胶笼区包含三个柱，其形成“T形”凝胶笼区。
在另一个方面，所述装置包含：(i)第一流体通道；(ii)第二流体通道；(iii)第三流体通道；(iv)一个或更多个流体入口；(v)一个或更多个流体出口；(vi)形成T形凝胶的凝胶笼区；和(vii)多个柱。在该装置中，每个流体通道的一部分与凝胶笼区的一部分接触，而每个流体通道的其余部分延伸离开凝胶笼区。每个凝胶笼区包含三个柱，其形成“T形”凝胶笼区。在一个方面，每个柱形成正方形。在一些具体方面，流体通道为“C”、“V”、“U”形或其组合，其中每个流体通道的中部区域与凝胶笼区接触，而流体通道的每个端延伸离开凝胶笼区(例如，径向地延伸离开凝胶笼区)。
在另一个方面，所述装置包含：(i)第一流体通道；(ii)第二流体通道；(iii)一个或更多个流体入口；(iv)一个或更多个流体出口；(v)椭圆形凝胶笼区；和(vi)多个柱，其中凝胶笼区的一侧侧邻第一流体通道从而产生第一凝胶笼区-流体通道界面，凝胶笼区另一侧侧邻第二流体通道从而产生第二凝胶笼区-流体通道界面。所述凝胶笼区包含位于凝胶笼区中央的两排平行的柱，从而产生中央凝胶室，一排柱沿着第一凝胶笼区-流体通道界面排布成半圆，从而产生第一凝胶室，其一侧侧邻中央凝胶室的一侧；一排柱在第二凝胶笼区-流体通道界面排布成半圆，从而产生第二凝胶室，其侧邻中央凝胶室的另一侧。
在另一个方面，本发明涉及制造装置的方法，其包括：在光学透明材料的第一部分中蚀刻一个或更多个流体通道和一个或更多个凝胶笼区，以及产生一个或更多个入口以允许流通所述一个或更多个流体通道和所述一个或更多个凝胶笼区，从而产生所述装置的顶和壁；以及使光学透明材料的第一部分与形成所述装置之底面的光学透明材料的第二部分结合。
在另一个方面，本发明涉及用于鉴别试剂是血管生成性还是抗血管生成性的方法，其包括：(a)将待评估试剂引入到本文所述装置的一个或更多个流体通道中，其中装置的一个或更多个流体通道包含有内皮细胞，装置的一个或更多个凝胶笼区包含有凝胶，其在装置的凝胶笼区内形成凝胶区；和将装置保持在促使内皮细胞在一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区粘附到凝胶区的条件下。确定在所述试剂存在下进入凝胶区的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物的产生被促进还是被抑制，并且与对照进行比较；其中，如果与对照相比在所述试剂存在下进入凝胶区的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物的产生被促进，那么试剂是血管生成性的，如果与对照相比在所述试剂存在下进入凝胶区的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物的产生被抑制，那么试剂是抗血管生成性的。
在另一个方面，本发明涉及用于鉴别试剂是否可用于癌转移的方法，其包括：(a)将待评估试剂引入到本文所述装置的一个或更多个流体通道中，其中所述装置的一个或更多个流体通道包含有内皮细胞，所述装置的一个或更多个流体或凝胶笼区包含有癌细胞，并且所述装置的一个或更多个笼区包含有凝胶，其在装置的凝胶笼区内形成凝胶区；和(b)将装置保持在促使内皮细胞在一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区粘附到凝胶区的条件下，从而形成内皮细胞层。确定在所述试剂存在下癌细胞能否在凝胶中分散、向内皮细胞层迁移并穿过内皮细胞层或其组合；其中，如果癌细胞未能在凝胶中分散、向内皮细胞层迁移并穿过内皮细胞层或其组合，那么表明该试剂可用于抑制癌转移。
在另一个方面，本发明涉及在体外生长血管的方法，其包括：(a)将内皮细胞引入到所述装置的一个或更多个流体通道中，其中所述装置的一个或更多个凝胶笼区还包含凝胶，其在凝胶笼区形成凝胶笼；和(b)将所述装置保持在促使内皮细胞在一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区粘附到凝胶区并且产生进入凝胶笼的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物的条件下，从而在体外生长血管。
在另一个方面，本发明涉及用于鉴别试剂是神经元细胞的化学吸引剂(chemoattractive agent)或化学排斥剂(chemorepulsive agent)的方法，其包括：(a)将待评估试剂和神经元细胞引入到本文所述装置的一个或更多个流体通道、本文所述装置的一个或更多个凝胶笼区或其组合中；其中所述装置的一个或更多个笼区包含有凝胶，其在所述装置的凝胶笼区内形成凝胶区；和(b)将所述装置保持在神经元细胞在凝胶笼区内增殖的条件下。神经元细胞是朝向试剂或远离试剂扩增；其中，如果神经元细胞朝向试剂扩增，那么试剂是神经元细胞的化学吸引剂，而如果神经元细胞远离试剂扩增，那么试剂是神经元细胞的化学排斥剂。
在另一个方面，本发明涉及鉴别试剂是否可用于治疗癌症的方法，其包括：(a)将待评估试剂引入到本文所述装置的一个或更多个流体通道中，其中所述装置的一个或更多个凝胶笼区包含有凝胶，其形成一个或更多个凝胶笼，并且凝胶笼还包含有癌组织的活检样品；和(b)确定在所述试剂存在下癌组织的运动是否被抑制；其中，如果癌组织的运动被抑制，那么所述试剂可用于治疗癌症。
附图说明
本专利或申请文件包括至少一副彩色附图。该具有彩色附图的专利或专利申请公开的副本经要求并且支付必需费用后由政府提供。
通过本发明所列举实施方案的以下更详细的描述，前述内容将变得明显，如附图中描绘的，其中不同附图中的相同附图文字指示相同部分。附图未必是按规定比例的，其重点替换为说明本发明的实施方案。
图1是装置的一个实施方案的俯视图。对于所示具体实施方案，测量值为约25mm乘75mm乘1mm。内皮细胞接种在顶部通道，并且形成向底部通道延伸的小血管。这种排布使得能够容易地对新生成血管或癌细胞内渗(intervascularization)/外渗(extravascularization)进行显微成像。
图2是图1装置的另一视角。
图3示出了梯形柱，以及柱如何使用锐角来顺应凝胶滴；在柱的两侧放置两滴，表明三角柱；柱的角度由凝胶在基底表面上的接触角确定。
图4示出了具有高度不同的凝胶通道和流体通道的装置。
图5示出了验证数据。
图6A-6C(6A)：使用软光刻技术的装置制造工艺。用SU-8光刻胶旋转涂覆硅晶片(6A)，并且通过透明掩模暴露于紫外线(6B)。将PDMS倾倒在晶片上并且在80℃固化2小时(6C)，剥离交联的PDMS晶片(6D)，将端口穿孔并且与盖玻片结合以封闭通道(6E)。(6B)开发三通道微流体装置的设计以研究在生长因子梯度下3D支架中轴突的转向。将胶原蛋白-1注射到凝胶填充通道中并且进行聚合。将目标化学因子添加到右侧通道，基础培养基添加到左侧通道以产生梯度，神经元细胞放置在细胞通道中以响应梯度(6C)。
图7A-7B.(7A)：装置内整个3D胶原凝胶内的荧光葡聚糖(40kDa；10μM)梯度的慢速归一化图像。(7B)通过平均沿着凝胶区的水平矩形的分析和其在通道中的位置绘制的扩散曲线。示出在24小时时间点的葡聚糖梯度的快照作为参考。
图8A-8B：外部干扰对于装置中梯度重建的影响。(8A)在更换全部通道内的培养基后，葡聚糖梯度在30分钟内完全重建。(8B)即使是在向化学吸引剂储库中加入150μL葡聚糖溶液后，稳定的线性梯度依然保持不变。
图9A-9D：在微流体装置中进行导向因子(guidance cue)运输的模拟。加入导向因子24小时后，装置中跨胶原蛋白支架区的稳态浓度分布(9A)和浓度梯度(9C)；浓度特征谱(9B)和浓度梯度(9D)的空间-时间演化，其分别在(9A)和(9C)中沿虚线所示划分的区域内。
图10A-10B：在微流体装置中接种细胞。(10A)外部干扰之前粘附在细胞通道中的玻璃盖玻片上的罗丹明染色神经元的荧光显微图像。(10B)通过清空左侧的培养基通道和右侧的化学吸引剂通道产生的压差，导致通过细胞通道的强流动和通过凝胶的小流动，使挤在凝胶上细胞增多。接种12小时后，生长进入3D胶原凝胶的轴突和挤在凝胶表面的神经元的荧光显微图像。
图11A-11K：化学吸引剂对于海马神经元的轴突导向。在由左侧通道中的转染成纤维细胞和右侧通道中的正常成纤维细胞释放的神经生长因子-1的存在下培养的罗丹明染色神经元的荧光图像(11A)，和在两侧通道都是正常成纤维细胞的情况下的荧光图像(11B)。外源补充有1μg/mL实验室纯化神经生长因子-1(netrin-1)的培养的DCC转染神经元的共聚焦显微图像(11C)。接受0.1μg/mL实验室纯化神经生长因子-1的罗丹明染色神经元的共聚焦显微图像(11D)，1μg/mL实验室纯化神经生长因子-1(11E)，和10μg/mL实验室纯化神经生长因子-1(11F)、无外源补充(11G)和100ng/mL脑浆(11H)。用于定量转入每个象限的轴突的度量标准(11I)和响应外部化学吸引剂梯度在每个象限内测量的轴突的百分比(11J和11K)。
图12A-12C：装置中slit-2对于海马轴突转向的剂量依赖性作用。响应于由250ng/mL(12A)和62.5ng/mL(12B)slit-2产生的梯度的罗丹明染色神经元的共聚焦显微图像。(12C)：轴突转向的定量表明，与62.5ng/mL slit-2或无添加物对照相比，250ng/mL slit-2显著排斥更多数量的顺梯度轴突。
图13A-13D：(13A)响应于装置中由250ng/mL和62.5ng/mL slit-2产生的梯度，进入3D凝胶支架的DRG神经元(DAPI染色)的迁移。示出未接受slit-2的对照培养中的DRG迁移用作对比。(13B)在向培养基中加入5-氟尿嘧啶(5-FU)抑制神经元迁移后，响应于250ng/mL和无slit-2(对照)的大量DRG轴突生长和转向的荧光显微图像。在slit-2梯度下和对照培养中，每个象限中DRG神经元迁移(13C)和轴突转向(13D)的定量。观察到相对于对照(p＜0.001)，250ng/mL slit-2对于DRG神经元迁移和轴突顺梯度生长具有显著的化学排斥影响。
图14：向装置的顶部加上储库盖以确保相等的压力。化学吸引剂端口盖有化学吸引剂储库(绿色)，培养基和细胞通道端口盖有培养基储库(蓝色)。小的通道连接两个储库以能够平衡压差。
图15A-15C(15A)：使用COMSOL评估沿着Y轴的浓度梯度。具有箭头标记的稳态浓度分布Y轴位置1(黑色)和2(绿色)，沿着其浓度梯度分别划分在(15B)和(15C)中。两个位置的浓度梯度值相对于24小时后位置1的最大浓度梯度值归一化(DC/dx＝l)，以便能够直接定量比较。当在t＝0加入化学吸引剂时，位置1和位置2不存在浓度梯度。但是在更换培养基的过程中24小时后，将观察到建立了稳定的浓度梯度。
图16A-16D：用于研究间隙流(interstitial flow)对肿瘤细胞迁移之影响的微流体细胞培养系统。(16A)微流体装置的示意图。装置包含两个通道(蓝色和绿色)，其被细胞悬浮在I型胶原凝胶(粉色)中的区域分割。通过施加跨凝胶的压力梯度产生一致的流场。为了验证流场，向本体培养基中引入荧光微球，拍摄慢速图像以对珠进行追踪。微流体装置使得细胞能够接近生长培养基和靶组织。装置的示意图示出了培养基通道(箭号)、组织孔(星号)和体细胞孔(箭头)。详细示出了培养基通道(箭号)、组织孔(星号)和体细胞孔(箭头)。(16B)通过追踪荧叠加在计算模型的流速矢量(蓝色)和(16A)中的虚线指示的装置区域的相称图像上的荧光微球(绿色)来观察速度矢量。在(16C)大小和方向(16D)上，实验观察的速度矢量与通过FEM模型预测的速度矢量类似(平均值±SEM，＊＊两种流速之间p＜0.01，计算的0至90°平均角度)。
图17A-17E：间隙流对于细胞迁移的方向的影响。(17A)间隙流场中细胞迁移的样品慢速图像。图像中的流动为3.0μm/秒从上到下。(17B)来源于一个对照装置的样品数据。极坐标直方图表明了一个装置中的群体中细胞的净迁移矢量的角度分布。没有流动的对照装置中细胞随机迁移。(17C)流动改变了迁移矢量角度的分布。在来源于一个装置的该样品数据中，细胞迁移偏好为逆流。为了定量细胞迁移的定向偏好，计算两个度量标准。(17D)流线迁移度量标准是测量沿着流线的迁移偏好，而(17E)方向迁移偏好是测量沿流线迁移的细胞的逆流或顺流迁移偏好。
图18A-18B：间隙流诱导肿瘤细胞迁移方向上的偏好。根据图17A-17E给出的度量标准对细胞评分。“高”和“低”分别指25×104细胞/ml和5×104细胞/ml。(18A)暴露于间隙流的细胞优先沿着流线迁移，这种偏好是流速、细胞密度和CCR7受体活性的函数。在0.3μm/秒的流场中阻断CCR7造成流线迁移得分显著减小(p＜0.01)。在3.0μm/秒的流场中，阻断CCR7具有增加流线迁移得分的相反影响，但仅在低细胞密度(p＜0.05)。(18B)暴露于间隙流的细胞优先逆流或顺流迁移，其为流速、细胞密度和CCR7受体活性的函数。随着流速的增加，方向迁移得分变得更负。对于活化CCR7，增加细胞密度使得方向偏移从顺流反转为逆流(两种流速p＜0.01)，但是当阻断CCR7时，方向偏移得分更负，并且不依赖于细胞密度(平均值±STD，通过平均一个装置中每个细胞的平均得分(n＞15)和平均每个种条件下的3个装置中的得分来计算)。
图19A-19D：S形或蛇形装置的示意图，其包括3个相继布置的凝胶区和共享的同一培养基通道。因此，同一培养基可与凝胶中的至少3种不同细胞类型相互作用。在该实施方案中，两个入口通道合并成一个出口，其可用于恒定流实验。
图20A-20B：96小时后，稳定在CGS2(2.5mg/ml)内的微血管网络。(20A-20B)示出了成熟血管网络的相差和共聚焦显微图像，标记在黄色虚线内。比例尺：20A(300μm)；20B(640μm)。
图21A-21B：108小时后CGS2(2.5mg/ml)内的管腔样成熟组织。(21A-21B)示出了成熟管腔样形成的相差和共聚焦显微图像，标记在包色虚线内。比例尺：21A(300μm)；21B(640μm)。
图22A-22D：初始接种HUVEC后，在96小时的时候3D CGS内的癌转移系统。(22A-22D)相差显微图像和使用现场共聚焦显微镜的慢速镶嵌成像，示出了3D CGS(2.5mg/ml)内HUVEC的血管网络形成，还示出了A549从2D通道开始的迁移。(22C)-(22D)：使用IMARIS的3D可视化图像，示出了初始管腔形成和内渗(intravasation)。比例尺：(22A-22B)(250μm)；(22C)(100μm)；(22C)(50μm)。
图23A-23D：在具有或不具有GM6001的情况下，A549向CGS2的迁移。(23A-23D)和(23C-23D)分别为在具有或不具有GM6001的情况下16小时和18小时的现场共聚焦慢速(time-lapse)图像。A549的迁移用黄线标记。
图24：纳米纤维膜装置的图示，其允许对细胞分泌的分子可视化，其去除了形成微流体装置之“底面”的显微镜载片，并且替换成具有纳米纤维膜的标准ELISA分析物，纳米纤维膜用于将细胞与ELISA分隔。选择纳米纤维膜以允许目标分子通过而确保细胞不会妨害(污染)或以其他方式破坏分析物并且其为针对细胞粘附。最上部的图(上右和左)示出了装置的横截面。标准高通量装置使用PDMS形成微通道的壁和“顶面”，而使用玻璃盖玻片作为“底面(floor)”。可将ELISA分析物在玻璃表面形成图案以便检测目标分子，用作装置之地面的玻璃盖玻片可涂覆有合适抗体(上部左手图像中蓝色“Ys”)。细胞可能难以粘附在这个表面上，并且细胞迁移和其他生物效应可能妨害或破坏涂层，因此在玻璃上安置多孔膜作为“垫子”。为了保持系统不漏水，可包括PDMS环(上右图)。下部图示出了制造的装置。
图25：低氧装置的图示。在我们体内和在微流体装置中，细胞需要氧来生存。基于它们得到的氧的量，细胞的响应通常很不相同；太少(低氧)时其行为异常或死亡，而太多(高氧)时其也可能行为异常或死亡。正常室内氧气浓度为约21％，在体内，其为约2-5％。低氧装置(保持2-5％的氧气水平)是很有前途的研究领域。低氧装置在培养基通道的左侧和/或右侧设置有一个或更多个(例如，2个)通道，这些额外的通道充有氮气。例如，通道顺序可如图所示：氮气通道1-＞培养基通道1-＞凝胶笼-＞培养基通道2-＞氮气通道2。通过使氮气以比室压高的压力流过这些通道，能够持续从PDMS中挤出氧气，使得细胞处于低氧状态。培养基可包含溶解氧，但这一点可以控制，或培养基可具有静态流(不流动)，因此培养基中的氧气缓慢被细胞耗尽。
图26A-26B：其中凝胶区平行的多路复用高通量装置。如果将培养基注射到单个培养基端口，这种装置增加了单一培养类型的可利用凝胶或允许包含在凝胶中的不同细胞类型暴露于相同的培养基条件。当通过多个培养基端口注射培养基时，每个凝胶可处于两种不同的培养基条件。在这种模式下，凝胶区1可见到培养基条件1，而凝胶区2可见到培养基条件2和3，等等。这允许在细胞悬浮在凝胶中时快速研究不同培养基条件(例如，药物、压差等)对于细胞类型的影响。培养基通道的分隔确保了在凝胶通道中没有细胞分泌的细胞分泌物的混合。
发明详述
本文提供了可用作3D生物测定微流体装置，例如用于药物筛选、个体化药物、组织工程、创伤愈合等应用。所述装置在小的聚合物块中具有一系列通道(例如，小的流体通道)，其中一个或更多个通道可填充有生物学相关凝胶，例如胶原蛋白，其被柱保持在原位。如本文所示，当用细胞如内皮细胞对所述装置铺板时，新血管在凝胶中生长，所述凝胶足够厚使得细胞能够以三维生长。另外的通道如流体通道允许将药物或生物材料暴露于3D细胞生长。随着细胞如内皮细胞在3D凝胶支架表面上的生长，可对其进行培养和观察，可在3D凝胶中例如测量血管生成的速率和研究癌细胞的内渗(intervascularization)和外渗(extravascularization)。
因此，在一些具体实施方案中，所述装置可用于体外生长新血管，并且容易地改变形成新血管的微环境以用于多种目的。这可用于抗癌散布药物发现的应用、抗癌生长药物发现、组织工程和创伤愈合药物发现、鉴别化学吸引和/或化学排斥剂、向患者匹配上述药物的正确剂量和组合等应用。例如，为了找到适合个体患者的最佳药物，可将患者肿瘤的活检样品与患者内皮细胞或来源于内皮细胞系的细胞的培养物一起放置在所述装置中。还可以在所述装置中放置不同的抗血管生成药和抗转移药，所述装置可有助于确定个体的癌症响应药物的程度。通过例如在同一芯片上将多个这些装置(具有独立或共享的流体通道)串联或平行连接在一起，可得到高通量装置。进一步的修改允许通过注射、通过皮下注射器或通过端口(port)的显微操作器放置来放置整个组织样品，例如活检癌或人组织样品。所述装置还可用于体内组织(例如，血管生成的肌肉)的受控发育。
因此，在一个方面，本发明涉及微流体装置，其包含由光学透明材料构成的基底。所述基底包含一个或更多个流体通道；一个或更多个流体通道入口；一个或更多个流体通道出口；一个或更多个凝胶笼区；和多个柱。在所述装置中，每个凝胶笼区的全部或部分侧邻所述一个或更多个流体通道中的至少一个的全部或部分，从而产生一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区；并且所述多个柱在一个或更多个凝胶笼区内或在一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面内。在另一些方面，凝胶基底表面上的接触角与柱的(一个或更多个)角的内角之和为约180°。
如本文所使用的，“微流体装置”是指具有用于流动和/或包含流体和/或凝胶的区域、通道和/或室的装置，通常为小规模(例如，微升、纳升、皮升)。为了有助于可视化，微流体装置通常由光透明基底构成，本文称作“光学透明材料”。如本领域技术人员将理解的，合适的光学透明材料包括聚合物、塑料和玻璃。合适的聚合物的实例为：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、SU-8和环烯烃共聚物(COC)。在一些具体实施方案中，所述装置全部或部分由生物相容性材料制成，例如，与活物质(例如细胞、组织)相容或对于活物质没有毒性或损害。
区域、通道、室
光学透明材料还包括一个或更多个限定的区域、通道和/或室，用于包含流体、凝胶等。在一个实施方案中，所述装置包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、7080、90、100等或任意数量的适合所述装置预期用途的通道。一些区域、通道和/或式可用于包含(一种或多种)流体(例如细胞培养基)、细胞物质、组合和/或待评估的化合物(例如，药物)，而其他的可用于包含凝胶(例如，生物学相关凝胶，如胶原蛋白或MatrigelTM)。
在一个方面，所述装置包含一个或更多个流体通道，其中每个流体通道具有主要流动方向(流体主要流动的方向)。所述一个或更多个流体通道可具有相同的主要流动方向或不同的主要流动方向。如本领域技术人员将理解的，流体通道的数量将取决于预期用途而不同。在一个实施方案中，所述装置包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、7080、90、100等或任意数量的流体通道。在一个方面，有1个流体通道。在另一个方面，有2个流体通道。在又一个方面，有3个流体通道。
在又一个方面，所述装置包含(一个或更多个；多个)高流体阻力的旁路通道(bypass channel)(或“平衡通道”)，其与装置内的另一些区域或通道连接，用于平衡流体静压(例如，见图1)。可包含旁路通道以帮助平衡压力，例如，在填充后当一个通道具有比另一个更大的保留在其入口的流体滴时。没有旁路通道时，将移动以平衡两个通道之间的压力的全部流体将穿过胶原移动，推动许多细胞进入胶原。尽管一定量的这种由液体静压导致的推动可用于细胞在凝胶中接种(例如，内皮细胞在凝胶培养基界面形成融合单层)，但是在一些情况下，太多可将多层内皮细胞推到凝胶-流体通道界面上。具有多层时，内皮细胞就不能够如它们在环境中的那样作用。旁路通道可提供静压的最初爆发以推动最初的内皮细胞层到凝胶上，然后在另一层形成之前平衡压力。因此，“旁路通道”可用于平衡上游压力以降低/消除穿过胶原基质的间隙流。旁路通道可具有或不具有流控制端口。当一个或更多个培养基端口具有恒定流量输入(例如，泵进一个或更多个培养基端口的培养基，从单个流控制端口的流出)时，流控制端口可允许旁路通道作为培养基的收集器。
高阻力“旁路”通道的主要作用是在主培养基通道中具有流动的长期试验过程中减低间隙流。由于流动通道中小的阻力不对称性，入口端口的培养基储库可以不同速率排出，其随时间改变提供给通道的压头(pressure head)。“旁路”通道有助于将对称压力和流速边界条件施加在装置中流道-凝胶笼区界面存在的地方。
如本领域技术人员将理解的，流体通道可形成多种形状，并且取决于装置的预期用途。例如，(一个或更多个)流体通道的全部或部分可以是线性、弯曲的(蛇形或S形)、径向的(放射状离开或聚集于中心点或区域，例如V形、U形、C形，)、椭圆(例如，圆形)、矩形(例如，正方形)等或其组合。
在其中所述装置包含不止一个流体通道的一些方面，流体通道长度的全部或部分可彼此平行。在另一些方面，流体通道长度的全部或部分可以彼此合并或远离。在另一些方面，流体通道沿着其长度的全部或部分是物理连接的。在另一些方面，一个或更多个流道可连接(例如，通过合并或通过狭窄的高阻力通道)以有助于建立更对称的流体流动穿过装置。在又一些实施方案中，流体通道沿着其长未物理连接，即，流体通道彼此独立。在另一些方面，所述装置包含可包括静态或动态的流体(例如，培养基)流动状态的一个或更多个流体通道。
所述装置还包含一个或更多个流体入口和一个或更多个流体出口。如本领域技术人员将理解的，每个流体通道可具有其自身的流体通道入口和/或流体通道出口，或替代地，一个或更多个流体通道可共享流体通道入口和/或流体通道出口。
所述装置还可包含一个或更多个凝胶笼区，并且同样如本领域技术人员将理解的，凝胶笼区的数量可取决于预期用途而不同。在一些具体方面，所述装置包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、7080、90、100等或任意数量的凝胶笼区。在一个具体方面，所述装置包含1个凝胶笼区。在另一个具体方面，所述装置包含2个凝胶笼区。在又一个具体方面，所述装置包含3个凝胶笼区。所述装置内的多个凝胶笼区可以多种方式组织。例如，所述装置(例如，单个微流体装置)内的多个凝胶笼区可彼此串联和/或平行排布。
与流体通道一样，所述凝胶笼区可以形成多种形状，并且取决于装置的预期用途。例如，(一个或更多个)凝胶笼区的全部或部分可以是线性(例如，凝胶通道)、弯曲的(例如，蛇形或S形)、径向的(例如，放射状离开或聚集于中心点或区域，例如在V形、U形、C形，)、椭圆(例如，圆形)、矩形(例如，正方形)等或其组合。在一个方面，凝胶笼区为凝胶通道的形式。在另一个方面，凝胶笼区为“T”形。在另一些方面，凝胶笼区为正方形的形式。在又一些方面，凝胶笼区为月牙形(例如，半月)的形式。
任选地，所述装置还包含一个或更多个凝胶笼区入口和/或一个或更多个凝胶笼区出口。与流体通道一样，每个笼区可具有其自身的笼区入口和/或笼区出口，或者替选地，一个或更多个凝胶笼区可共享笼区入口和/或笼区出口。另外，装置还可包括单个凝胶通道入口和/或单个笼区出口。
在一些具体实施方案中，每个笼区的全部或部分的侧邻一个或更多个流体通道中的至少一个流体通道的全部或部分，从而产生一个或更多个“凝胶笼区(例如，凝胶通道)-流体通道界面区”。如本文所使用的，“侧邻”是指凝胶笼区在其一个或每个个(例如，两个)侧面具有(一个或更多个)流体通道的全部或部分，也就是说，流体通道的全部或部分位于笼区的一侧或每个侧(例如，第一流体通道的全部或部分侧面沿着第一凝胶笼区的一侧的全部或部分；一流体通道的全部或部分侧面沿着第一凝胶笼区的一侧的全部或部分并且第二流体通道的全部或部分侧面沿着第一凝胶笼区的另一侧)。在一些具体实施方案中，一个或更多个流体通道的全部或部分与一个或更多个笼区的全部或部分接触(例如，直接接触)。在一些具体方面，使流体通道与凝胶通道分开(或使流体通道与凝胶通道勾画开(delineates))的全部是一个或更多个柱。因此，当凝胶存在于一个或更多个凝胶笼区中时，凝胶可以与一个或更多个流体通道中存在的任何流体接触。在一些具体实施方案中，所述凝胶笼区的每个侧都与流体通道接触。在另一些实施方案中，(一个或更多个)所述凝胶笼区的全部或部分的侧邻另外的(一个或更多个)凝胶笼区的全部或部分，从而产生一个或更多个“凝胶笼区-凝胶笼区界面区”。如本领域技术人员将理解的，取决于预期用途，可具有多种界面区，例如：(一个或更多个)凝胶笼区-流体通道界面区、凝胶笼区-凝胶笼区界面区、流体通道-流体通道界面区及其复合(例如，流体通道-凝胶通道-流体通道；流体通道-流体通道-凝胶通道-流体通道-凝胶通道；流体通道-凝胶通道-凝胶通道-流体通道；流体通道-凝胶通道-流体通道-凝胶通道等)。
在一个方面，一个或更多个所述凝胶笼区的整个(全部)长度(或相当一部分长度)侧邻一个或更多个流体通道的整个(全部)长度(或相当一部分长度)。在另一实施方案中，一个或更多个凝胶笼区的全部或部分与一个或更多个流体通道的全部或部分平行。在另一些方面，一个或更多个凝胶笼区的相当一部分长度未侧链一个或更多个流体通道的相当一部分长度。在又一些方面，一个或更多个流体通道与一个或更多个凝胶笼区在界面(例如，凝胶-流体界面区)彼此汇聚(例如，是物理连接的)。
柱
在一个或更多个凝胶笼区内和/或在一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区的边界处(例如，当它们彼此平行时)的是多个“柱(post)”或“微柱(micro-post)”(例如，约0.1mm宽，0.1mm长，0.25mm高)。柱的重要特征包括其形状、尺寸和间距。形状，由于其影响凝胶-液体界面的定向(例如，是否可以将其制作成与柱的外部齐平，以及平坦vs.弯曲)，尺寸是由于其影响制造装置的困难度，而间距是由于其影响在填充凝胶的过程中整个凝胶-流体界面可以支持的压力。
在设计装置时有两个主要目标，尤其是对于用作高流通装置(HTD)：延长凝胶区长度和实现均匀的凝胶-流体界面。较长凝胶区能够在装置中形成较长单层。这转而能够在装置中观察到更多数量的细胞(因此为HTD)，其可产生统计学上更显著的结果。凝胶笼区-流体区界面的不均匀可导致场中的不规则，其导致不可控的细胞观察。如本文所描述的，这两个目标通过柱的设计实现。
凝胶区的延长可通过优化包围凝胶基质的凝胶柱的形状和间距来实现。在凝胶柱的优化问题上有内部权衡。一方面，使用紧密间距的柱导致凝胶笼结实，但是降低了装置的有效面积，并且因此降低了其通量。使用宽间距的柱，尽管从通量角度来看是期望的，但是其可导致装置的凝胶笼易于破裂和潜在的浪费。如本文进一步描述的，优化柱的形状使凝胶弯曲和膨胀效果尽可能小，从而提供用于实验观察的均匀表面。
因为柱降低了装置的可用凝胶长度，所以尽可能降低柱的足迹。但是，当存在于装置中时，柱包围凝胶(例如，胶原蛋白溶液)。总之，有3个主要方面影响柱的性能：整体形状、棱角、表面的粗糙度。表面粗糙度取决于制造工艺。
整体柱形
可将柱形成多种形状，并且将取决于装置的预期用途。例如，柱可以是椭圆形(例如，圆形)、矩形(例如，正方形)、三角形、梯形、六边形、泪珠性形等或其组合。在一个具体方面，柱形状为正方形形状。在另一个方面，柱为三角形形状。在又一方面，柱为梯形形状。在一些具体方面，每个柱的高与宽之比为约1至约4。
如本文所讨论的，取决于装置的大小，柱形状可以为正方形(参见，例如本文描述的蛛形装置(Spider device))。但是，在一些装置中，正方形柱(例如，约100微米乘约100微米，高约120μm)具有一些问题。容易溢出凝胶区，造成从一个或更多个凝胶-培养基界面区(柱之间)喷出进入培养基通道。这通常很严重，足以堵塞整个培养基通道而破坏装置。更常见的是，即使在适当填充的时候也有由表面张力造成的小的膨胀。这对于实验有最小的影响，因为细胞依然可以在它上面形成单层，但是这是一件很烦人的事情。另一个常见问题是未充满。这可产生用于细胞聚集的“凹陷”。细胞的聚集可形成厚的多层细胞，破坏凝胶-培养物界面区。
即使是在合适条件下，膨胀依然占优势。如本文所示，如果柱能够较好顺应表面上凝胶滴的自然形状，那么凝胶的弯曲将可以变平。在凝胶滴周围形成柱需要锐角(小于90度)，因此检验了其三角形及其变化形状。这当然未提供精确角度-液滴大小，因此所使用的角度取决于液滴的大小。
见图3，其解释了需要使用锐角来使柱顺应凝胶滴。如图3所示，在柱的两侧放置2个液滴表明三角形柱形状。柱的精确角度由凝胶在基底表面上的接触角决定。
如本文所使用的，“接触角”是液体/气体界面接触固体表面的角度(图3)。接触角对于任意给定的系统是特定的，由三个界面的相互作用决定。最通常，该概念描述为小的液滴停留在平坦的水平固体表面。液滴的形状由Young关系式决定。接触角在界面条件中具有作用。接触角使用接触角测角仪测量。接触角不限于液体/气体界面，其同样可应用于两种液体或两种气体的界面。
为了本文的目的，来考虑流体滴在固体表面的情况。如果液体非常强烈地粘附在固相表面(例如，水在强亲水的固体上)，液滴将在固体表面完全扩散开并且接触角将接近0°。较不强烈的亲水固体具有高达90°的接触角。在很多高亲水表面，水滴将表现出0°至30°的接触角。如果固体表面是疏水的，接触角将大于90°。在高疏水表面，低能材料的表面(例如，氟化表面)具有高达～120°的接触角。但是，一些具有非常粗糙的表面的材料可具有大于150°的水接触角。
柱棱角的角度
如本文所述，确定了特定微流体装置的最佳柱形状。发现柱棱角的锐角与由凝胶和基底表面形成的接触角可以形成一对补角，其中这两个角的测量度数之和是180°。见图3。也就是说，正确的柱角的锐角是与由凝胶和基底表面形成的接触角互补的角。在一些具体实施方案中，使用具有特定锐角的三角形和/或梯形柱。在另一些实施方案中，使用正方形柱(例如，蛛形装置)。但是，如本领域技术人员将理解的，尽管通过本文的特定柱举例说明了特定的装置，但是如果期望也可使用不同的柱形状。
如本文所讨论的，一般而言，接触角是液滴接触它所停留的表面的角度。疏水表面将造成水滴成为“球状”，而亲水表面将造成水滴扩散开。凝胶主要是水，因此基底的疏水性影响凝胶滴接触基底表面的角度。柱位于基底的凝胶-液体界面上的角与在凝胶滴存在于基底上时其内部接触角是补角(即，这两个角之和的测量度数为180°)。这意味着所使用的柱接触凝胶-流体界面的内角取决于所使用的材料和基底的表面处理，例如暴露于等离子通道或涂覆化学物质或蛋白质如(聚-D-赖氨酸)凝胶组合物。柱任一角的内角是柱角接触凝胶-流体界面的地方。在这种情况下，例如梯形“向内”朝向凝胶通道的中央的角仅“看见”凝胶，而另外两个内角可以“看见”凝胶和培养基。柱使用正确的角度使得凝胶填充更容易，并且能够使得胶原蛋白-培养基界面平坦(其对于正方形或其他形状柱极难实现)。在一个实施方案中，内角小于或等于约90°、约80°、约70°、约60°、约50°、约40°、约30°、约20°。在一个具体实施方案中，内角是约60°。
在一个实施方案中，柱使用三角形形状，其中三角形3个角中的2个形成上述补角。在另一实施方案中，柱使用梯形形状，其在所述装置装载凝胶时允许较好的凝胶流动。尤其是，所述一个或更多个柱为等腰三角形、等腰梯形或其组合的形状。
因此，接触角取决于基底材料(制造装置的材料)和表面处理。例如，使用PDMS，并且进行暴露于pink等离子体(pink plasma)的处理1.5分钟，之后涂覆聚D赖氨酸(一种细胞胶)，对装置进行冲洗和烘干处理，将产生约121°的接触角，其表明集中于装置的凝胶-流体界面的柱角内角为约59°的补角。聚D赖氨酸是大部分亲水表面容易吸收的多肽，并且与细胞非特异性结合。其促进基底对于胶原蛋白的吸附。该装置是疏水表面，水在这样处理的表面上将尽力变得非常高度球样。这对于本领域技术人员将是明显的，对于生产目的，补角可以取整为约60°。
理论上，如果对基底进行旨在具有90°的接触角的表面处理，正方形柱将能够满足。这将是这种凝胶笼概念的极限。但是，选择三角形或梯形，这是因为其能够使得凝胶更好地流过通道。狭窄的凝胶通道难以通过，但是切除三角形的朝向内部的顶点，通道的有效宽度将增加。正确的柱外加合适的表面处理可导致平坦的凝胶界面边界。
在一些具体实施方案中，如梯形柱一样，每个边约0.1mm的三角形柱是常用的。但是，如上文所述，另一些装置(例如，蛛形装置或活检(半月)装置)中，实施方案可以是任何形状，例如，圆形、正方形、钟形或其他任意形状。所述微柱可以间隔0.2mm，尽管其可取决于凝胶厚度、装置结构材料特性、装置表面改性而更长或更短。柱或微柱沿着凝胶笼区形成一种“凝胶笼”。微柱被设计成允许用生物学相关凝胶(例如胶原蛋白或其他任意种类凝胶)填充装置。微柱之间凝胶的表面张力使得凝胶保持在柱内。发现在特定装置中梯形和三角形形状的柱是最有效的，一般使它们“尖”端指向远离细胞而朝向凝胶。尖端依赖于表面接触角的内角，并且这些端指向培养基通道。在一些方面，柱通常在两个连接的平行通道之间成线性，这两个平行通道中一个通道为流体如培养基或细胞物质保留，而另一个通道将填充任意生物学相关凝胶。形状由柱的图案构成，换言之，凝胶笼的形状可不同。装置的一些方面将包括平行的两排三角形柱以使得彼此平行的通道的长分开，形成具有以由通道入口和出口构成剩余两条边的矩形。柱可形成其他形状，如圆形或半圆形，并且可使用任意其他形状的微柱(其本身是任意形状)。
在一个具体实施方案中，所述柱的取向使得凝胶笼区边缘(凝胶-流体(菱角笼区-流体通道)界面)柱间距比朝向凝胶笼区的中央的更近，以使得填充过程中凝胶-流体界面之间的可忍受压降最大化。实例包括具有三角形或梯形柱的装置，其中柱上顶点或指向凝胶笼区中心的点并且柱的基础在流体凝胶界面。
整个空气-凝胶界面的压力由以下给出：ΔP＝γ(1/Rx+1/Rz)，其中ΔP是压降，γ是表面张力，Rx和Rz是凝胶界面的曲率半径。在填充处理中对于压力干扰稳定的凝胶界面是可以承受大ΔP的那些。因此，期望选择使ΔP尽可能大的γ、Rx和Rz。由于γ是凝胶流体性质，其无法显著改变。由于Rz取决于通道的高，所以Rx是唯一剩余的可与柱间距相关的参数。因此，期望使Rx尽可能小，其等于两个相邻柱之间最近点的柱间距的2倍。
会聚的几何形状导致更小的半径，使得压降更高，更好在填充的过程中保持。如本文所使用的，“会聚”是指随着凝胶从凝胶通道的中央向凝胶通道的外部流动，凝胶所接触的柱之间的间距降低。填充后，接触角将产生平坦(更平坦)的凝胶-流体界面。发散几何产生较大半径，其不能够保持填充的高压。
因此，对于疏水面的期望的性质是，随着从凝胶区中心向流体区移动，柱的几何形状是会聚的。这很重要，因为其使得凝胶填充成为一个稳定过程。三角形和梯形柱是在特定装置中实现该效果的柱的实例。在填充的过程中，膨胀发生在装置的上游端，沿着装置的长下降。填充后，(静态流体)压力平衡，额外的膨胀体积遍布整个装置。
表面粗糙度
表面张力使得凝胶保持在凝胶通道的边界内。随着凝胶尝试符合在柱、凝胶和培养基的接触点(柱的外角)的粗糙的柱，柱的粗糙表面可在凝胶表面上产生小应力。这可具有在注射阶段中降低可施加给凝胶而不引起表面张力从柱上“断裂”并且涌进培养基通道的整个压力的影响。换言之，粗糙表面使得更难以适当填充凝胶通道。在一个具体实施方案中，柱由与基底相同的材料制备。
柱的排布
装置中的多个柱可以以不同方向排布在装置中，并且取决于装置的预期用途。例如，装置中多个柱全部或部分可排布成一排、平行的两排或更多排。“T”形、圆形、半圆形、矩形等或其组合。
在一些具体实施方案中，每个凝胶笼区-流体通道界面区或每个凝胶笼区包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着凝胶笼区-流体通道界面区的长，一排沿着凝胶笼区的内界面，另一排沿着凝胶笼区的外界面，从而形成凝胶通道。所述装置的凝胶区由包含2排柱的笼形成，一排在流体-凝胶或凝胶-凝胶界面之间形成边界，另一排在另一不同的流体-凝胶或凝胶-凝胶界面之间形成不同的边界。可改变柱的大小和形状以使得其效果尽可能大。而且，选择柱的尺寸、其间距和其形状以使得凝胶能够填充凝胶区。
因此，本文提供的装置可具有例如：66个位置(柱之间66个区域)，柱间距0.125mm，产生8.25mm的总凝胶区域(例如，总线性区域)。现有装置每个通道仅可具有0.9mm凝胶-流体界面，但是，本文描述的装置任一凝胶通道可具有例如4.125mm，其与现有装置相比总凝胶-流体表面积增加约458％。在一些方面，总凝胶区域为约1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6.0mm、6.5mm、7.0mm、7.5mm、8.0mm、8.5mm、9.0mm、9.5、10mm、15mm、20mm、25mm等。换言之，本文提供的装置可设置有相比于现有装置增加了约50％、75％，100％，125％，150％，175％，200％，225％，250％，275％，300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％、500％、525％、550％、575％、600％、625％、650％、675％、700％、725％、750％、775％、800％、825％、850％、875％、900％、925％、950％、975％、1000％等的凝胶-流体表面面积。在有一些方面，由柱与柱之间距离×位点数量定义的总凝胶区(例如，总线性凝胶区域)可以为约100微米(μm)至10米(m)、约1微米至约1毫米(mm)、约1mm至约1米等。
凝胶笼区特性
在得到合适的柱形状后，就能够确定合适的凝胶笼区的特性。凝胶笼中连续柱之间的距离、凝胶笼(例如，通道)的高和宽以及凝胶笼区的长决定了成功填充凝胶笼区从而制造装置的可能性。
即使具有合适的柱形状，凝胶填充还取决于其他因素。一般而言，在施加用于注射凝胶的压力必须始终小于沿着整个凝胶-培养基界面的任一点的表面张力的前体下指导凝胶填充。如果，例如一个柱有缺陷而造成局部高应力点，那么一旦注射的压力大于这一点可能的最大表面张力，凝胶就会在这个点上从凝胶通道喷出，从而破坏装置。
总的来说，小的注射压力将使凝胶在凝胶通道上流动几毫米，但是随着通道填充部分的延长，流动的阻力就会变大，需要在注射部位有较大压力以继续填充装置。长装置将需要大的压力来完全注射，意味着有较大几率在任一点注射压力大于局部表面张力而造成喷出。可改变一些因素以降低喷出的可能性。见图1，对于装置的尺寸的例子。这仅用于参考，而不反映产品模型的最终尺寸。
柱间距
较近的柱间距在柱之间产生较强表面张力。这意味着，在其他条件相同的情况下，具有密集柱的通道比宽间距柱可填充更大距离。但是，密集柱限制了凝胶-培养基相互作用的量，使得细胞难以在3D凝胶基质中生长。具有对于用户的装置质量(希望较宽凝胶区域)和可生产性(因为宽凝胶区域使得难以成功填充装置)之间的折中。在一个实施方案中，柱与柱直接的间距为约1微米至约500微米、5微米至约450微米、约10微米至约400微米或约50微米至约300微米。在另一些实施方案中，柱之间的间距为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500微米。在一个具体实施方案中，每个柱为约300微米宽，其给出了约120微米的凝胶-培养基界面区。在一个具体实施方案中，柱与柱的间距为约420微米。
凝胶笼区的高度
通道的高度与柱间距相关。在一个方面，通道高度约等于柱间距的量。即使从顶部观察具有相对直的凝胶-培养基界面，但是即使仅从侧面观察，依然有一些弯曲。凝胶依然与装置顶部的“顶面”和底部的“底面”接触，这些对于顶-底维中平坦表面是不正确的角度。在膨胀事件中，从顶部观察时，期望这是与从侧面观察相同的膨胀(相同的弯曲)。在一些膨胀更常见的装置中这更重要，但依然保留在高通量装置中。
较高的装置还更有益于较好的试验结果。细胞趋向于喜欢沿着表面生长，比如装置的顶部和底部的顶面和底面。较高凝胶区有利于细胞探索3D凝胶，而不是粘附在顶部和底部表面。在一个具体实施方案中，所述装置还可包括从培养基通道向凝胶笼区的升高(例如台阶式装置)。在一个方面，流体通道与凝胶笼区之间的升高为约2倍升高、3倍升高、4倍升高等。例如，装置可包括约200μm的高培养基通道，约400μm的高凝胶通道。在另一些实施方案中，一个或更多个流体通道高约10μm、20μm、50μm、100μm、125μm、150μm、175μm、200μm、225μm、250μm、300μm、350μm、400μm和500μm；以及一个或更多个凝胶通道高约20μm、40μm、80μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm和1000μm。较短的培养基通道允许使用较少培养基，其在使用稀有昂贵培养基试剂时能够节省成本。较高凝胶区允许较自由移动以及与装置的机械刚性的“顶面”和“底面”较少相互作用和干扰(例如，见图4)。
凝胶通道的宽度
通常，较宽的凝胶通道较容易填充，而较窄通道具有较高阻力，因此需要更大压力去填充。流体阻力取决于通道的宽度和长度。只要填充装置所需要的压力小于柱内凝胶-培养基界面的表面张力，凝胶就能够连续填充而无喷溅。随着凝胶区变长，填充所需的压力就增加，并且最终匹配柱柱内区的表面张力，造成喷溅。这意味着为了填充长通道，凝胶通道必须较宽(以减小阻力)或柱间距较短(以增加表面张力)。柱间距、通道宽与最大可填充通道长之间相互作用。
凝胶笼区
微型装置的另一些版本使用随机排布的柱，因为那时候不知道怎样的排布最好。柱位于笼的两侧并且沿着周长。例如，3通道装置具有4个不同凝胶通道，每个具有2个柱。在对比时，本文描述的装置可包括两排平行的柱，与凝胶填充孔出口形成矩形凝胶笼的另两个壁。
凝胶
如本文所示，所述装置还可在凝胶通道中包含凝胶，从而在装置中形成凝胶区。可以使用任何能够作为细胞外基质的相关凝胶，例如，胶原蛋白、MatrigelTM、纤连蛋白等。
在一些方面，凝胶区(单个凝胶区)的长度可以为约100微米至约100,000微米。在另一些方面，凝胶区为约500微米、1000微米、5000微米、10,000微米、15,000微米、30,000微米、50,000微米或100,000微米。如本领域技术人员将理解的，装置可具有多个凝胶笼区(例如，彼此串联、彼此平行或其组合)，从而增加单个装置中凝胶区的总长(例如，增加观察面积)。另外，多个凝胶笼区在每个凝胶笼区内可具有相同或类似的凝胶，或者，作为替代的，多个凝胶笼区可具有不同的凝胶(例如，组成不同的凝胶、特性(例如，刚度)不同的凝胶及其组合)。
因此，在另一些方面，装置具有高通量性质。高通量装置满足了对于给定细胞条件增加实验观察结果的需要。平行或平行产生的观察数量的增加对于得到统计学有意义的细胞培养指标而不需要建立太多装置具有重要益处，因此加快了实验研究和筛选进程。另外，单个装置中观察数量的增加使得由装置与装置之间的差异引起的额外差异最小化。
在给定一组条件下实验观察的数量与装置中细胞生长区(通道)的数量成正比，或者，与由培养下的细胞形成的单层的面积成正比。通过允许延长长度凝胶区定位在通道之间，本文所述高通量装置实现了面积的这种增加。
为了使该装置成为真实的高通量，多个这些凝胶区可以彼此串联或平行定外，并且分开的、连接的或混合连通的流体通道可与凝胶区往返流动。
另一些实施方案包括用于放置活检组织的圆形凝胶笼区。该组织可以与凝胶笼区接触放置，并且允许放出的化学信号渗透凝胶，将组织暴露于实验或临床相关药物。凝胶和/或流体通道还可以包括细胞物质，例如，细胞、细胞培养基、组织、生长因子、药物(治疗药物、诊断药物)或其组合。在一些具体实施方案中，凝胶笼区(例如，凝胶通道)和/或流体通道还可包含细胞，例如细胞的悬浮液。这样的细胞的实例包括：癌细胞、神经元细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、干细胞、上皮细胞或其组合。在一些具体实施方案中，细胞被标记物染色以增强成像过程。合适的标记物包括荧光标记物，例如使任何细胞类型的肌动蛋白微丝显像的罗丹明-鬼笔环肽(Invitrogen)，使内皮细胞-细胞连接显像的VE-钙粘素抗体，使细胞核显像的DAPI和表达组成型GFP细胞溶质蛋白以允许实时成像的细胞系。
另一些应用是使用可插入到流体(例如，培养基)通道中的封装细胞。益处是细胞分泌的因子可作用于另一细胞群，同时防止细胞迁移到一起而变得混杂。
还涵盖添加药物/试剂储库和/或必需通道以使它们在装置上(例如在芯片上)混合。
所述装置的具体实施方案
本文微流体装置，其包含光学透明材料，并且还包含一个或更多个流体通道、一个或更多个凝胶笼区和多个柱，其可用于例如研究细胞迁移、癌症转移、血管生成、全活检样品以及发现可用于创伤愈合、癌症(例如，转移)和组织(例如，神经)工程的药物。在这些可替代装置中，排布凝胶笼区和流体通道以促进为它们涉及的特定用途并且较少依赖于柱形状。高通量装置
在一个方面，所述装置包含由光学透明材料构成的基底和(i)一个或更多个流体通道；(ii)一个或更多个流体通道入口；(iii)一个或更多个流体通道出口；(iii)一个或更多个凝胶笼区；和(iv)多个柱；其中，每个凝胶笼区的全部或部分的侧邻一个或更多个流体通道的全部或部分，从而产生一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区；和每个凝胶笼区包含至少一排形成凝胶笼区的柱(例如，见图1)。在另一个方面，所述装置还包含至少两个凝胶笼区，其中凝胶笼区在装置中彼此串联排布。在另一个方面，所述装置还包含至少两个凝胶笼区，其中凝胶笼区在装置中彼此平行排布。
在一个具体方面，每个凝胶笼区形成凝胶通道，并且每个凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着每个凝胶通道的长度，一排沿着凝胶通道的一侧，另一排沿着凝胶通道的对侧，从而形成沿着每个凝胶通道各自的长度的凝胶笼区。
在另一个方面，所述装置包含：(i)第一流体通道；(ii)第二流体通道；(iii)一个或更多个流体入口；(iv)一个或更多个流体出口；(v)凝胶笼区，其形成凝胶通道；(vi)凝胶通道入口；和(vii)多个柱。在该装置中，凝胶通道的一侧的全部或部分的侧邻并且平形着第一流体通道的全部或部分，从而产生第一凝胶通道-流体通道界面区；和凝胶通道的另一侧的全部或部分的侧邻并且平形着第二流体通道的全部或部分，从而产生第二凝胶通道-流体通道界面区。凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着凝胶通道的长度，一排沿着凝胶通道在第一凝胶通道-流体通道界面一侧，另一排沿着凝胶通道在第二凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而形成沿着凝胶通道的长度的凝胶笼区；和每个柱为三角形、梯形或其组合。
蛇形装置
在又一个方面，所述装置包含所述装置包含：(i)第一流体通道；(ii)第二流体通道；(iii)一个或更多个流体入口；(iv)一个或更多个流体出口；(v)凝胶笼区，其形成凝胶通道；和(vi)多个柱(例如，见图19A-19C)。在该装置中，第一凝胶通道的一侧的全部或部分侧邻并且平行于第一流体通道的全部或部分，从而产生第一凝胶通道-流体通道界面区；并且第一凝胶通道的另一侧的全部或部分侧邻并且平行于第二流体通道的全部或部分，从而产生第二凝胶通道-流体通道界面区。第一凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着第一凝胶通道的长度，一排沿着第一凝胶通道在第一凝胶通道-流体通道界面的一侧，另一排沿着第一凝胶通道在第二凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而形成沿着凝胶通道的长度的第一凝胶笼区。所述装置还包含：(vii)凝胶通道形式的第二凝胶笼区，从而形成第二凝胶通道；和(viii)凝胶通道形式的第三凝胶笼区，从而形成第三凝胶通道；第二凝胶通道的一侧的全部或部分侧邻并且平行于第一流体通道的全部或部分，从而产生第三凝胶通道-流体通道界面区；并且第二凝胶通道的另一侧的全部或部分侧邻并且平行于第二流体通道的全部或部分，从而产生四凝胶通道-流体通道界面区。第二凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着第二凝胶通道的长度，一排沿着第二凝胶通道在第三凝胶通道-流体通道界面的一侧，另一排沿着第二凝胶通道在第四凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而形成沿着第二凝胶通道的长度的凝胶笼区。另外，第三凝胶通道的一侧的全部或部分侧邻并且平行于第一流体通道的全部或部分，从而产生第五凝胶通道-流体通道界面区；并且第三凝胶通道的另一侧的全部或部分侧邻并且平行于第二流体通道的全部或部分，从而产生第六凝胶通道-流体通道界面区。第三凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着第三凝胶通道的长度，一排沿着第三凝胶通道在第五凝胶通道-流体通道界面的一侧，另一排沿着第三凝胶通道在第六凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而形成沿着第三凝胶通道的长度的凝胶笼区。装置中的每个柱为三角形、梯形或其组合。因此，在该实施方案中，每个凝胶笼区与第一流体通道和第二流体通道接触。
在一个方面，每个凝胶笼区的柱数量由顶侧的10个和底侧的10个构成。因此，在该方面，所述装置具有总计60个机械柱。
多路装置
在另一个方面，所述装置包含由光学透明材料构成的基底和：(i)至少三个流体通道；(ii)至少一个流体通道入口；(iii)至少一个流体通道出口；(iii)至少两个凝胶笼区；和(iv)多个柱(例如，见图26A-26B)。每个凝胶笼区的全部或部分侧邻一个流体通道的全部或部分，从而产生第一凝胶笼区-流体通道界面区、第二凝胶笼区-流体通道界面区和第三凝胶笼区-流体通道界面区；并且每个凝胶笼区包含至少一排形成凝胶笼区的柱。在一个具体方面，每个凝胶笼区形成凝胶通道，并且每个凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着每个凝胶通道的长度，一排沿着凝胶通道的一侧，另一排沿着凝胶通道的对侧，从而形成沿着每个凝胶通道各自的长度的笼区。
在一个实施方案中，所述装置包含由光学透明材料构成的基底和：(i)第一流体通道；(ii)第二流体通道；(iii)第三流体通道；(iv)至少一个流体通道入口；(v)至少一个流体通道出口；(vi)第一凝胶笼区，其形成第一凝胶通道；(vii)第二凝胶笼区，其形成第二凝胶通道；和(viii)多个柱。第一凝胶通道的一侧的全部或部分侧邻并且平行于第一流体通道的全部或部分，从而产生第一凝胶笼区-流体通道界面区；并且第一凝胶通道的另一侧的全部或部分侧邻并且平行于第二流体通道的全部或部分，从而产生第二凝胶通道-流体通道界面区。第一凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着第一凝胶通道的长度，一排沿着第一凝胶通道在第一凝胶通道-流体通道界面的一侧，另一排沿着第一凝胶通道在第二凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而形成沿着凝胶通道的长度的第一凝胶笼区。第二凝胶通道的一侧的全部或部分侧邻并且平行于第二流体通道的全部或部分，从而产生第三凝胶通道-流体通道界面区；并且第二凝胶通道的另一侧的全部或部分侧邻并且平行于第三流体通道的全部或部分，从而产生第四凝胶通道-流体通道界面区。第二凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着第二凝胶通道的长度，一排沿着第二凝胶通道在第三凝胶通道-流体通道界面的一侧，另一排沿着第二凝胶通道在第四凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而形成沿着第二凝胶通道的长度的第二凝胶笼区。
所述装置还可以包含三个流体通道入口和一个流体通道出口。另外，所述装置还可包含定位在所述三个流体通道入口与所述一个流体通道出口之间的储库。
低氧装置
在另一个方面，所述装置包含由光学透明材料构成的基底和：(i)一个或更多个流体通道；(ii)一个或更多个流体通道入口；(iii)一个或更多个流体通道出口；(iii)一个或更多个凝胶笼区；(iv)一个或更多个气体通道，其中一个或更多个气体通道的全部或部分侧邻一个或更多个流体通道、一个或更多个凝胶笼区或其组合的至少一侧；和(v)多个柱(例如，见图25)。每个凝胶笼区的全部或部分侧邻一个或更多个流体通道的全部或部分，从而产生一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区；每个凝胶笼区包含至少一排形成凝胶笼区的柱。所述一个或更多个气体通道允许(一种或多种)气体(例如，氮气、氢气、氦、氧化氮、一氧化碳)流动通过装置以例如除去氧气。
纳米纤维膜装置
在另一个方面，所述装置包含由光学透明材料构成的基底和：(i)一个或更多个流体通道；(ii)一个或更多个流体通道入口；(iii)一个或更多个流体通道出口；(iii)一个或更多个凝胶笼区；(iv)膜，其不可透过细胞而可透过细胞分泌的分子，其中膜的一侧与一个或更多个流体通道、一个或更多个凝胶通道或其组合接触；和(v)多个柱(例如，见图24)。每个凝胶笼区的全部或部分侧邻一个或更多个流体通道的全部或部分，从而产生一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区；并且每个凝胶笼区包含至少一排形成凝胶笼区的柱。所述装置还可包含与(一种或多种)细胞分泌的一种或多种分子特异性结合的(一种或多种)捕捉剂，捕捉剂在膜的对侧并且无法穿过膜。如本文所使用的，“捕捉剂”是直接或间接特异性识别(例如，结合于)细胞分泌的分子的试剂。如本领域技术人员所理解的，捕获剂包括抗体的全部或抗原部分、链霉亲和素/生物素等。在一个具体方面，捕捉剂存在于载玻片上。在又一个方面，捕获剂能够与所述装置分开(例如，用于进一步分析)。
蛛形装置(spider device)
在另一个方面，所述装置包含由透明材料构成的基底和：(i)一个或更多个流体通道；(ii)一个或更多个流体通道入口；(iii)一个或更多个流体通道出口；(iii)一个或更多个凝胶笼区；和(iv)多个柱；其中每个流体通道的一部分与每个凝胶笼区的一部分接触，而每个流体通道的其余部分延伸离开所述一个或更多个凝胶笼区(见图6A-6C)。每个凝胶笼区包含三个柱，其形成“T形”凝胶笼区。
在另一个方面，所述装置包含：(i)第一流体通道；(ii)第二流体通道；(iii)第三流体通道；(iv)一个或更多个流体入口；(v)一个或更多个流体出口；(vi)形成T形凝胶的凝胶笼区；和(vii)多个柱。在该装置中，每个流体通道的一部分与凝胶笼区的一部分接触，而每个流体通道的其余部分延伸离开凝胶笼区。每个凝胶笼区包含三个柱，其形成“T形”凝胶笼区。在一个方面，每个柱形成正方形。在一些具体方面，流体通道为“C”、“V”、“U”形或其组合，其中每个流体通道的中部区域与凝胶笼区接触，而流体通道的每个端延伸离开凝胶笼区(例如，径向延伸离开凝胶笼区)。
活检或半月形(half-moon)装置
在另一个方面，所述装置包含：(i)第一流体通道；(ii)第二流体通道；(iii)一个或更多个流体入口；(iv)一个或更多个流体出口；(v)椭圆形凝胶笼区；和(vi)多个柱，其中凝胶笼区一侧的侧邻第一流体通道从而产生第一凝胶笼区-流体通道界面，凝胶笼区另一侧的侧邻第二流体通道从而产生第二凝胶笼区-流体通道界面(见图16A)。凝胶笼区包含中心位于凝胶笼区的两排平行的柱，从而产生中心凝胶室，一排柱沿着第一凝胶笼区-流体通道界面排布成半圆，从而产生第一凝胶室，在其一侧是中央凝胶室的一侧；和一排柱在第二凝胶笼区-流体通道界面排布成半圆，从而产生第二凝胶室，其侧邻中央凝胶室的另一侧。
因此，在一些方面，所述装置包含3个毗邻的区：(1)中央凝胶室；(2)侧邻中央凝胶室的两个靶组织室(和/或凝胶室)；和(3)侧邻凝胶区的至少两个培养基通道(例如，并且可从装置的上表面进入，可以使用例如向靶组织室的边孔将细胞可以接种到中央凝胶室中。如实施例3所示，封装在到达胶原凝胶表面的底通道中的神经元延伸轴突进入三维凝胶，并且生长的轴突暴露于垂直其生长方向的化学梯度，以对其响应和转向(turning)进行定量。实验和计算研究表明，在30分钟内可在这些装置中建立线性稳定的化学梯度(chemogradient)，并且持续长达48小时。细胞培养研究表明了化学吸引(神经生长因子1、脑浆)和化学排斥(slit-2)梯度对于培养在这些装置中的海马神经元细胞和背根神经节神经元细胞的巨大影响。这些3通道装置中的稳定梯度不仅可用于筛选适合在疾病/损伤状态下再生神经元通路的潜在药物，还可研究癌细胞转移和细胞-细胞相互作用。
在一个具体方面，装置中的每个笼可包含平行的两排29的58个梯形柱(例如，高通量装置、纳米纤维膜装置)。在另一个方面，装置中的每个凝胶笼区包含2排20的40个梯形柱。在另一个方面，装置中的每个凝胶区包含2排10的20个梯形柱(例如，蛇形装置)。在另一个方面，装置中的每个凝胶区包含2排7的14个梯形柱(例如，低氧装置)。在另一个方面，装置中的每个凝胶区包含2排5的10个梯形柱(例如，多路(multiplexed)装置)。在另一个方面，装置中的每个凝胶区包含16个柱，构型如下：5个柱形成围绕中央凝胶笼的左侧的半圆，3个柱形成中央凝胶笼的左侧，3个柱形成中央凝胶笼的右侧，5个柱形成围绕凝胶笼的右侧的半圆。柱可以是正方形，或者半圆中的柱可具有半径等于半圆半径的圆形外表面(例如，活检或半月装置)。在另一个方面，装置的每个凝胶区包含3个正方形柱(例如，蛛形装置)。
可选组件
可以对大部分装置进行的一个修改是添加一个或更多个凝胶通道，例如第一凝胶通道之外的第二凝胶通道。如图5所示，第二凝胶通道允许将细胞(例如，内皮细胞)培养在培养基通道1中，而凝胶通道1和培养基通道2是干燥的或暂时填充细胞培养基。该技术允许细胞在凝胶表面形成单层而不需要填充另外的通道。这在如果内皮细胞需要数天形成单层时很有用，而放置在第二凝胶或培养基通道中的任何细胞将需要在完全形成的大小的存在下接种。可以某种方式给大部分装置添加第二凝胶通道。
另外，装置可以是多路的以允许多个装置从一个储库或多个储库中抽吸培养基。这允许多个多种从共同源进料，或者也许可以建立两种不同药物的梯度。然后可以从梯度中“拉”出不同药物浓度的组合并且供给不同的细胞培养部位。
另外，可将活检和/或组织样品放置在培养基通道或凝胶通道中。在一个具体实施方案中，活检样品放置在凝胶区。另外，当使用这些“活检”装置时，其通常包含在填充系统或替换培养基的同时将活检样品保持在特定位置的多个柱。在这样的实施方案中，可使用圆形或半圆形凝胶笼。
制作方法
在另一个方面，本发明涉及产生装置方法和通过所述方法产生的装置。在一个实施方案中，将装置制造成两片。顶片(例如，聚合物、玻璃或塑料)具有蚀刻进里面的微通道。该蚀刻可通过例如精密加工、光刻法、热模压、软刻蚀、显微注射模塑或其他制造技术。蚀刻通道制成了通道的“顶面”和“壁”。通道的“底面”由与顶片结合的简单平坦片(例如，聚合物、玻璃或塑料)构成。装置的“底面”由与装置的“顶面”和“壁”所使用的相同或类似材料制成，或者由不同材料制成。结合可以通过多种方式完成，例如环氧树脂或在PDMS和玻璃的情况下，将两片暴露于pink等离子然后将简单地将它们彼此接触放置。
在顶片中产生孔以允许流体流过微通道。这些孔可以位于微通道的末端，或沿着其长的任何地方。在顶片和底片结合后，可需要或可不需要使涂覆用化学物质流过通道。可用聚d-赖氨酸或其他化学物质冲刷通道以促进细胞粘附和稳定凝胶。这对可用或可不用于控制装置的疏水性，因为一些材料需要额外的表面处理以使得细胞培养基能够流过它们。
然后可用凝胶填充装置。凝胶将完全填充“凝胶笼”或“凝胶笼区”。表面张力将保持凝胶不从凝胶笼中溢出。通过凝胶填充端口将凝胶注射到装置中(见图1)。可使用不同压力时间注射特征谱插入凝胶以提高注射凝胶的质量。凝胶可需要最初爆发注射压力以使得凝胶进入通道，然后持续较小压力完成凝胶填充。或者，可从同时凝胶笼两端注射凝胶。然后使得凝胶硬化(在细胞培养箱中1小时)。然后所述装置已准备好用以进行细胞接种。
因此，在一个方面，本发明涉及制造所述装置的方法，其包括：在光学透明材料的第一部分中蚀刻一个或更多个流体通道和一个或更多个凝胶笼区，以及产生一个或更多个入口以允许流过所述一个或更多个流体通道和所述一个或更多个凝胶笼区，从而产生所述装置的顶面和壁；使光学透明材料的第一部分与形成所述装置的底面的光学透明材料的第二部分结合。所述方法还可包括通过所述通道引入涂覆剂。涂覆剂的实例包括聚D-赖氨酸、聚鸟氨酸(Poly Ornathene)、核纤层蛋白(lamin)、胶原或其组合。所述方法还可包括使装置的表面与赋予表面疏水性的试剂接触。这样的试剂的实例包括等离子体。方法还可包括将凝胶引入到一个或更多个凝胶笼区中，从而在装置中产生一个或更多个凝胶区。
装置用途
本文提供的装置可用于多种目的。如本文所述，所述装置的实例可参见图1。第一流体通道平行于并且接触凝胶通道。所述凝胶通道在凝胶与流体通道之间的边界上具有两排平行的三角形柱(本文也称作微柱)以包含凝胶。凝胶通道平行于第一和第二流体通道两者。第二流体通道也与凝胶通道接触。钻孔或以其他方式产生出口以允许流体流进和流出装置。
可将细胞(例如，内皮细胞)通过第一流体通道的一个流体端口引入(例如，注射)到第一流体通道中。然后通过升高第一流体通道的静压，造成穿过凝胶通道的压力梯度，来刺激内皮细胞贴附在凝胶-流体通道边界的壁上。流体将渗透过凝胶通道，将内皮细胞与它们一起卷到凝胶壁上。将细胞培养或长或短的期望天数(例如，3至7天)。如本文所述，内皮细胞产生“芽(sprout)”，其使从第一流体通道进入凝胶的三维圆锥样突出物。这些芽最终内衬有内皮细胞，其模拟血管壁。可从另一(例如，第二)流体通道施加药物以尝试延缓芽的出现或生长，或提高出芽频率和大下。延迟或终止出芽将表明药物是可行的抗血管生成药物，并且是继续抗癌分析的目标。促进出芽将指示新血管生成的良好药物候选，其在创伤愈合和组织工程中具有应用。
另外，可将癌细胞(例如，来自癌症患者癌症活检的解离的细胞)连同(一种或多种)潜在的抗癌症散布药物或抗癌药物组合一起注射到另一流体通道中。如果，在将装置培养数天后，癌细胞未渗透内皮细胞层进入通道区(例如，凝胶笼区，凝胶通道)，那么药物或药物组合不是抗癌药物。在癌细胞是来源于癌症患者的癌症活检的解离细胞的方面，然后药物或药物组合不适合于终止(或治疗)患者的癌症的散布。例如，如果在第一流体通道中注意到癌细胞，那么药物或合并药物不适合于该个体患者(尽管可能在其他人中有效)。
如本领域技术人员将理解的，可产生本文所述装置的实施方案。例如，具有钻入其中之大的端口的圆形凝胶笼可适于放置整个癌症活检样品。可具有任意数量的流体通道-凝胶通道对，全部串联或全部平行，串联和平行，彼此连接和/或相隔。例如，装置可具有第一流体通道、第一凝胶通道、第二流体通道、第二凝胶通道和最后的第三流体通道，通过微柱隔开的每个微柱是相关的。若干凝胶笼可串联或平行连接在一起，在其之间具有单独或公用的流体通道。这将允许一次测试多种癌症药物，或可能允许一种活检样品与多种可能的互不干扰的抗转移药物一起测试。如本文所述，通道未必是直的，并且在其长上可以或可以不逐渐变细。通道高度可以有大幅度的不同，入口和出口数量也一样。
癌症一般开始于身体的特定部位。当其生长时，其必须喂养自身，为了做到这一点，以被称为血管生成的过程诱导新血管在其中生长。当癌症扩散(被称为转移的过程)时，单个癌细胞将与初生肿瘤分离并且通过血管和淋巴管迁移到身体的其他部分。为了进入血流，癌细胞必须钻过血管壁，尤其是穿过排列在血管壁上的内皮细胞。这被称为外渗(extravasation)。在迁移后，癌细胞必须通过血管壁钻回以进入身体的组织，称为内渗(intravasation)。血管生成、外渗和内渗均是抗癌药物的靶标。
本文所述装置可用于多种体外分析，其允许例如在规定的生化条件下内皮细胞形成新血管芽。中央通道允许内皮细胞接种和生长。紧接中央通道的通道可预填充有胶原蛋白(例如，活检装置)。内皮细胞可在中央通道由胶原蛋白制成的侧壁上生长成为单层。然后新血管可从中央通道出芽进入胶原蛋白。这样的装置可允许非常容易地对新药物可能延迟新血管形成的程度或在抗内渗或外渗药物的存在或不存在下癌细胞浸润进入血管的程度进行成像。
在抗血管生成药物发现的实施方案中，可将新抗内渗药物放置在一个外通道中，而标准细胞培养基放在另一外通道中作为对照。装置允许定量评价药物的效力。在抗转移药物发现的实施方案中，可如上所述对装置进行处理，但是接种来源于细胞系或活检的癌细胞。然后装置允许容易地成像(通过后期图像处理)，对钻过新形成的血管芽的癌细胞的数量以及潜在抗转移药物对于过程的延迟程度进行定量分析。
在个体化药物实施方案中，在允许来源于患者或细胞系的内皮细胞形成新血管后，可将活检的癌细胞放置在装置中。然后可在这些装置中测试多种抗内渗药物或抗血管生成药物。由于似乎不同患者响应于不同抗转移药，所以可将这些装置用于检测哪些药物终止该患者的内渗和血管发生，而哪些药物不终止。
在另一个方面，本发明涉及用于鉴别试剂是血管生成性还是抗血管生成性的方法，其包括：(a)将待评估试剂引入到本文所述装置的一个或更多个流体通道中，其中装置的一个或更多个流体通道包含有内皮细胞，所述装置的一个或更多个凝胶笼区包含有凝胶，其在装置的凝胶笼区内形成凝胶区；和将装置保持在促使内皮细胞在一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区粘附到凝胶区的条件下。确定在所述试剂存在下进入凝胶区的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物的产生被促进还是被抑制，并且与对照进行比较；其中，如果与对照相比在所述试剂存在下进入凝胶区的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物的产生被促进，那么试剂是血管生成性的，如果与对照相比在所述试剂存在下进入凝胶区的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物的产生被抑制，那么试剂是抗血管生成性的。在一个具体方面，通过提高包含内皮细胞的流体通道的液体静压来促进内皮细胞粘附到一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区的凝胶区。在另一个方面，通过成像技术确定在所述试剂存在下由内皮细胞产生的进入凝胶区的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物。
在另一个方面，本发明涉及用于鉴别试剂是否可用于癌转移的方法，其包括：(a)将待评估试剂引入到本文所述装置的一个或更多个流体通道中，其中所述装置的一个或更多个流体通道包含有内皮细胞，所述装置的一个或更多个流体或凝胶笼区包含有癌细胞，并且所述装置的一个或更多个笼区包含有凝胶，其在所述装置的凝胶笼区内形成凝胶区；和(b)将所述装置保持在促使内皮细胞在一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区粘附到凝胶区的条件下，从而形成内皮细胞层。确定在所述试剂存在下癌细胞能否在凝胶中分散、向内皮细胞层迁移并穿过内皮细胞层或其组合；其中，如果癌细胞未能在凝胶中分散、向内皮细胞层迁移并穿过内皮细胞层或其组合，那么表明该试剂可用于抑制癌转移。在一个方面，将所述试剂存在下癌细胞是否在凝胶中分散、向内皮细胞层迁移并穿过内皮细胞层或其组合与合适的对照进行比较。在另一个方面，所述癌细胞是来自癌症患者癌活检的解离的细胞。
在另一个方面，本发明涉及在体外生长血管的方法，其包括：(a)将内皮细胞引入到装置的一个或更多个流体通道中，其中装置的一个或更多个凝胶笼区还包含凝胶，其在凝胶笼区形成凝胶笼；和(b)将装置保持在促使内皮细胞在一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区粘附到凝胶区并且产生进入凝胶笼的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物的条件下，从而在体外生长血管。在一个方面，引入内皮细胞的所述一个或更多个流体通道对于所述装置的所述一个或更多个凝胶笼区来说位于中央。
在另一个方面，本发明涉及用于鉴别试剂是神经元细胞的化学吸引剂还是化学排斥剂的方法，其包括：(a)将待评估试剂和神经元细胞引入到本文所述装置的一个或更多个流体通道、本文所述装置的一个或更多个凝胶笼区或其组合中；其中所述装置的一个或更多个笼区包含有凝胶，其在所述装置的凝胶笼区内形成凝胶区；和(b)将所述装置保持在神经元细胞在凝胶笼区内增殖的条件下。神经元细胞是朝向试剂或远离试剂扩增；其中，如果神经元细胞朝向试剂扩增，那么试剂是神经元细胞的化学吸引剂，而如果神经元细胞远离试剂扩增，那么试剂是神经元细胞的化学排斥剂
在另一个方面，本发明涉及鉴别试剂是否可用于治疗癌症的方法，其包括：(a)将待评估试剂引入到本文所述装置的一个或更多个流体通道中，其中所述装置的一个或更多个凝胶笼区包含有凝胶，其形成一个或更多个凝胶笼，并且所述凝胶笼还包含有癌组织的活检样品；和(b)确定在所述试剂存在下癌组织的运动是否被抑制；其中，如果癌组织的运动被抑制，那么所述试剂可用于治疗癌症。在一个方面，所述活检来自个体癌症患者的癌组织，并且所述试剂可用于治疗所述癌症患者的癌组织。
实施例
实施例1：抗转移剂保持癌簇(cancer cluster)不迁移的测试浓度
方法
将来源于人肺癌细胞系A549的红色细胞(red colure cell)用H2B蛋白(m-Cherry)进行转染并且部分地分离，产生40um至70um的随机大小聚集体。通过100微米过滤器抽吸，产生具有100微米半径的聚集体的介质。倾倒通过第二40微米过滤器，产生40um至100um的A549聚集体。然后将细胞在800rpm下离心2分钟，并且抽吸介质。
通过一下步骤制备胶原凝胶：向20微升磷酸盐缓冲溶液(BDBioscience)中加入9微升1M NaOH，然后加入46微升超纯H20。最后，加入125微升2.5mg/mL的I型鼠尾胶原(BD Biosciences)，并且充分混合。
然后将A549聚集体与胶原凝胶混合，产生凝胶内的聚集体混合物。然后将10微升凝胶注射进图1和2所示装置的中央通道，在装置中产生36个不同的凝胶-流体界面。
用分离的GFP蛋白质标记转染人脐静脉内皮细胞，并且流进第一介质通道。向第二通道中加入没有细胞的培养基。第一培养基通道每个柱上培养基小泡的增加产生流体静压梯度，将细胞推向凝胶-培养基界面。使压力梯度保持1小时，之后除去气泡。培养装置，并且在0、12、36、60、84和108小时成像。观察到内皮细胞沿着培养基通道的底部和在凝胶-培养基界面上产生内皮单层。
在对照组中，未向系统添加药物。在实验组中，以100nM、500nM、1000nM、1500nM和2000nM剂量向内皮细胞培养基中加入市售癌症抗转移药易瑞沙(AstraZeneca)、EGFR-TK酶阻断剂。
在100nM和500nM药物浓度的情况下，观察到A549癌细胞聚集体破裂，单个癌细胞开始向内皮细胞单层迁移。在1000nM、1500nM和2000nM的情况下，癌细胞聚集体保持完整，内皮细胞开始侵入胶原。表明1000nM是最小有效剂量，并且是人对象中最小剂量研究的好的起点。结果
已经使用这种装置测试保持癌细胞簇不迁移的抗转移药的必须浓度。
准备装置，注射具有嵌入其中的聚集癌细胞的小球的凝胶。然后向两个流体端口中的一个中注射内皮细胞。然后将细胞培养6天，每日照相。请注意没有第5天的图像。
图5示出了装载有高浓度抗转移药的装置和装载有低浓度药物的装置的两个装置的共聚焦图像。癌细胞核标记有红色荧光分子，而内皮细胞核标记有荧光绿。最初难以观察到梯形柱，但是随着内皮细胞开始形成结构并且环绕在柱上，柱在图形中形成梯形形状的“孔”。
经过6天的过程，图5中的浓度高到足以保持细胞不分离和迁移。在图6中，浓度太低，因此，癌细胞(红色)在第三天开始迁移，并且到第六天，开始进入内皮细胞通道。
因此，也可以进行试验以使得在癌细胞引入第二流体通道之前就存在完整上皮单层(类似于血管)。将装置专门化用于抗转移药物试验的另一些修改包括：减小中央凝胶通道的宽度，使得凝胶仅作为形成内皮细胞的支架，意味着癌细胞将迁移通过较少凝胶以到达内皮细胞壁。
在向第二流体通道引入癌细胞之前存在完整上皮单层(类似于血管)。将装置专门化用于抗转移药物试验的另一些修改包括：减小中央凝胶通道的宽度，使得凝胶仅作为形成内皮细胞的支架，意味着癌细胞将迁移通过较少凝胶以到达内皮细胞壁。
实施例2蛛形装置——研究对于生长因子梯度的轴突响应的高通量试验
研究可扩散或底物结合梯度的轴突引导对于当前技术具有挑战性。本实施例中描述的是本文提供的用于研究化学梯度下轴突引导的微流体装置的一个实施方案的设计、制造和用途。实验和计算研究表明，在30分钟内建立导向因子(guidance cue)的线性梯度，其稳定长达48小时。发现梯度对于尾部干扰(例如培养基的变化和装置的移动)不敏感。评估了神经因子-1(0.1-10μg/mL)和脑浆(0.1μE/mL)对于轴突转向的化学吸引潜力，同时研究了slit-2(62.5或250ng/mL)的化学排斥特性。
将海马或背根神经节(DRG)神经元接种在微通道中并且挤满3D胶原凝胶的表面(图6A-6C)。轴突向三维基质内生长，并且使得导向因子的梯度与轴突生长方向呈直角以影响轴突导向。测量每个轴突的平均转向角并且对在类似条件下培养的多个装置进行平均以定量导向因子梯度的作用。相对于未接受外部导向因子(p＜0.001)的对照培养，在脑髓和神经因子-1(1μg/mL)的存在下测量到显著正转向梯度。由转染的纤维母细胞释放的神经因子-1具有全部化学吸引因子测试(p＜0.001)的最大正转向效果。在250ng/ml浓度时，Slit-2对海马或DRG轴突导向显示出强的化学排斥特性。Slit-2还表现出对于侵入3D胶原凝胶的DRG神经元的类似作用(相对于对照培养p＜0.01)。总结起来，结果表明使用这种微流体装置产生用于研究神经生物学、细胞迁移和增殖、基质重塑以及与其他细胞系的混合培养的稳定化学梯度在癌症生物学、组织工程和再生医学中具有额外应用。
在神经系统发育中，通过指导轴突沿着达到目标的特定路线生长的导向分子的时空调节建立严密控制的复杂神经网络(B.J.Dickson，Science，2002，298，1959)。这个过程取决于生长锥(轴突顶端)的感受和相应环境中在不同长度尺度下操作的吸引和排斥导向因子的化学亲和力(M.Tessier-Lavigne and C.S.Goodman，Science，1996，274，1123)。但是，使导向因子的分布保持在神经系统内的精确性和机理尚不清楚。早期研究表明，在中枢神经系统损伤后，轴突不能够再生并且不能够精确重建失去的神经网络连接(f.C.Wagner Jr and G.J.Dohrmann，Surg.Neurol，1975，3，125)。尽管开发了许多组织工程策略来促进损伤部位的轴突再生(M.B.Bunge，J.Spinal.Cord.Med.，2008，31，262)，但是成功地实际实现这些方法取决于阐明发育的重要导向因子对于轴突响应和转向的作用，尤其是在受伤部位的炎症环境下。
生长因子梯度已经涉及多种生物现象中，包括细胞迁移、神经系统中的轴突生长和导向(G.Curinga and G.M.Smith，Exp.Neurol，2008，209，333)。现在一般接受了轴突生长和导向受到吸引和排斥因子、底物结合的排布和可扩散梯度的一致作用，以促进隧道穿过组织并且与远处目标连接(D.Mortimer，T.，et al，Trends.Neurosci，2008，31，90)。尽管轴突导向的体内研究在鉴别神经发育相关因子中非常有力，但是无法控制神经元周围的微环境和评估生长锥所暴露的多种因子的作用。因此，开发了多种实验和计算技术以在体外研究生长因子对于轴突生长的作用。在一种技术中，嵌入胶原蛋白基质的神经组织外植体暴露于转染细胞释放的导向因子源(H.Chen，et al，Neuron，1998，21，1283)、微珠(B.Gene，et al，PLOSBiology，2004，2，2112)或胶原凝胶上的可扩散微图案梯度(W.J.Rosoff，etal.Nat.Neurosci.，2004，7，678)。这些研究的定量局限于比较外植体的轴突向较高和较低浓度侧的向外生长。尽管这些方法在识别神经元群对于特定因子的总体响应上是成功的，但是它们通常无法区别生物分子梯度对于轴突生长和导向的作用。另外，随着轴突从外植体长出，难以对单独轴突进行跟踪，因为稠密轴突重叠在二维覆盖表面上。在另一些体外测定中，导向因子的不连续(S.Lang，et al，Anal.Bioanal.Chem.，2007，390，809)或连续(S.Dertinger，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2002，99，12542)梯度印在培养神经元和观察轴突生长的表面上。但是，这种技术的局限性包括其仅适合基物结合梯度和2D培养。
一般使用微量移液器转向测定来研究体外轴突导向(Z.Pujic，et al，J.Neurosci.Meth.，2008，170，220)。在这种情况下，微量移液器作为化学吸引剂的连续点来源，通过扩散产生生长因子梯度以指导轴突生长(J.Q.Zheng，et al，Nature，1994，368，140；K.Buck and J.Zheng，J.Neurosci.，2002，22，9358)。但是，通过局部因子递送产生的梯度是空间不均匀的，随着扩散的因子的分子量、微量移液器的高度以及脉冲的持续时间和频率变化显著。在所有上述试验中，通过这些传统方法产生的梯度是不稳定的，难以定量并且经常无法确定的进行时间-空间控制。为了阐明生理相关生长因子梯度的复杂度及其特定的细胞信号过程，需要对胞外基质环境中生长因子的时空分布进行用户定义的控制和在该环境中直接显影细胞的能力。
在过去的几十年里，微流体装置在细胞培养应用中获得普及，因为其为研究细胞对于它们物理和化学化境之变化的响应提供了大的平台(N.Li，A.Tourovskaia and A.Folch，Crit.Rev.Biomed.Eng.，2003，31，423；J.El-Ali，et al，Nature，2006，442，403；A.Folch和M.Toner，Ann.Rev.Biomed.Eng.，2000，2，227)。这些装置也可用于产生具有微米精度、可定量特性和实验重现性的定义明确的2D和3D细胞培养环境。还开发了具有简单几何形状的微流体装置以证明机械约束对于轴突生长的作用(H.Francisco，et al，Biomaterials，2007，28，3398)，然而在这些装置中无法研究轴突的转向和导向。开发了简单的微流体导向混合器以研究底物结合梯度对于神经元生存和生长的作用(G.Li，J.Lui and D.Hoffman-Kim，Ann.Biomed.Eng.，2008，36，889)。因为神经元对于剪切应力敏感(S.S.Margulies，et al.，J.Biomech.，1990，23，823)，这些梯度产生装置有可能不适于研究可扩散因子对于轴突转向的作用。在这个背景下，使用底物因子的表面梯度(L.J.Millet，et al，Lab Chip，2010，10，1525)或密纹基装置在分离轴突与其细胞体和研究轴突生长和转向中可能更有效(A.M.Taylor，et al，Nat.Methods.，2005，2，599；J.W.Park，et al，Nat.Protoc，2006，1，2128)。从这些早期研究可以看出，尽管还不存在这样的微流体系统，通过可扩散的增长因子，在用于研究轴突导向的微流体装置中可产生稳定的生物分子梯度。
在这里描述的是微流体装置的一个实施方案，其可用于研究通过3D体外细胞培养模式中可扩散生长因子的轴突导向。培养在这个装置中的神经元在3D生理结构中延长轴突，并且生长的轴突暴露于与轴突生长的方向垂直的导向因子梯度，使得其成为研究轴突导向的有效技术。这里演示的是使用装置的这个实施方案研究多种化学吸引/排斥导向因子、其递送方式和可变浓度梯度对于海马和DRG神经元轴突长出和转向的作用。装置的这个实施方案也可用于例如研究单独培养或共培养的其他神经元细胞类型。这个装置还可应用于神经科学、发育细胞生物学、先进生物材料和微流体技术的交界。
实验
微流体装置：设计和制造
使用在别处详细描述的光刻法和软印刷技术(Y.N.Xia and G.M.Whitesides，Ann.Rev.Mat.Sci.，1998，28，154)制造微流体装置的这个实施方案。如图6A-6C所示，在AutoCAD中产生装置设计和由CAD文件产生透明掩模并且通过高分辨率打印机(PageWorks，MA)印刷。首先用SU-8光刻胶以120μm厚度旋转涂覆硅片。将印刷有装置的负像的透明掩膜放置在硅片上并且暴露于UV光，其交联曝光区域的光刻胶。然后冲掉未交联光刻胶，产生成层有装置的正浮雕的硅片。通过复制模塑(J.C.McDonald等，Electrophoresis，2000，21，27)聚二甲基硅氧烷(PDMS；DowCorning，USA)和靠着硅母料在80℃固化已脱气弹性体混合物(10∶1，碱：固化剂)2.5小时来制造微流体装置。将聚合的PDMS装置剥去硅掩模，切断单个装置(30mm直径，1cm高)并且使用标准4mm和1mm直径冲孔工具从入口和出口向微流体通道挖下。在细胞培养之前，清洗PDMS晶片并且在120℃高压蒸汽处理35分钟(20分钟灭菌/15分钟干燥)以除去未交联PDMS和对装置灭菌。将玻璃盖片空气除尘并且高压蒸汽处理30分钟(干燥)。将PDMS表面和盖片通过空气等离子体氧化45秒，之后使其结合在一起，封闭通道和完成装置制造。表面处理确保了PDMS与盖片之间的不可逆结合，并且还有助于防止渗漏。为了在填充凝胶支架之前恢复疏水性，将装置在80℃保持过夜。
在PDMS装置中装载胶原凝胶
向表面恢复疏水性的灭菌PDMS晶片(如上所述)中装填2mg/mL分离自鼠尾的I型胶原(BD Biosciences，San Jose，CA；储存在4℃)。通过向10×PBS、1M NaOH和组织培养级水的混合物中添加胶原蛋白储液来制备胶原蛋白溶液，得到2mg/mL pH7.4的溶液。将预装有2μl胶原凝胶溶液的冷的吸管端小心降低进入装置的凝胶装填口，将冷冻凝胶显微注射到装置内直到充满微柱内确定的凝胶区(图6A-6C)。在用于每个实验条件的多个装置中重复该过程。在凝胶注射后，PDMS晶片放置到潮湿容器中以防止水凝胶干燥，使凝胶在湿润培养箱中于37℃下30分钟来使得凝胶聚合。在实验前24小时装填凝胶并且留在保温箱中以使得能够再吸收微通道中的任何气泡。
梯度模拟和可视化
在胶原凝胶聚合后，用细胞培养基装填微流体通道。在静止条件下通过用初始浓度10μM的荧光FITC葡聚糖(40kDa，Invitrogen，CA)稀溶液(图7A-7B)代替化学吸引剂通道中的培养基(图6A-6C)来进行梯度研究。另外的通道用无血清培养基装填。利用Nikon TE300荧光显微镜(Nikon Instruments Inc.，NY，USA)获取荧光强度。通过Hamamatsu照相机(Hamamatsu，Shizuoka，Japan)使用Openlab(Improvision，Waltham，MA)数据采集软件开始半小时每5分钟一次然后3-5小时每半小时一次获得一系列荧光图像。然后将装置放到保温箱中以防止培养基过干，并且通过在获取图像之前将装置在显微镜座上稳定化30分钟的方式来以6小时的间隔进一步获取图像。使用MATLAB(Math Works，Natick，MA)中的自定义书写代码(custom written code)进行慢速荧光图像的图像处理。简单地说，将像素值减去背景强度值然后除以10μM葡聚糖的最大像素值来进行归一化。通过平均沿着凝胶区的水平矩形来对扩散进行分析并且按照其在通道中的位置进行标绘(图7B插图)。利用从系列的第一个图像获得的最大和最小值对每个图像进行归一化。
在COMSOL(Burlington，MA)中开发了扩散-对流-反应有限元模式以定量不同实验条件下的浓度梯度和进行参数分析。在数值模式边界中定义恒定浓度边界条件，以代表控制通道和凝胶填料口的入口的来源条件(C来源)和出口的排出条件(C排出)。对于瞬态模拟，将条件通道中的起始浓度设定为等于入口的起始浓度以模拟特性描述实验。基于实验特性，定义胶原蛋白基质内的生长因子扩散的DGEL＝5.1×10-11m2/秒的扩散系数，其符合Helm等(C.L.Helm等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2005，102，15779)对于2mg/mL胶原凝胶的报道值。包含培养基的通道内的扩散系数设定为DM＝6×10-11m2/秒，符合40kDa分子量蛋白质的Stokes-Einstein关系式。进行模拟的数值网格由约400,000有限元构成。
神经元的分离和培养
按照在别处详细描述的方案(R.Li，Methods.Cell.Biol，1998，57，167；W.E.Thomas，Life.Sci.，1986，38，297；A.V.Kwiatkowski等，Neuron，2007，56，441)从胎龄14.5-16.5天的小鼠获得培养在设备中的原代海马神经元和背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)神经元。将来源于显微解剖皮质的细胞解离并且以终浓度1千万细胞/mL重悬在无血清培养基中。解离和培养1-2天后立刻将神经元接种到装置中(每测试条件n＝10装置)，在引入任何导向因子之前，每天两次替换全部通道中的无血清培养基。全部细胞培养保持在5％CO2和37℃的湿润孵箱中。对于神经因子-1的研究(图11A-11C)，使用试剂盒核转染来转染海马神经元，最大gfp质粒转染有质粒表达DCC(大肠癌中缺失)受体(M.J.Galko and M.Tessier-Lavigne，Science，2000，289，1365)。
导向因子的添加和培养基改变
添加到通道中的神经因子-1获自多种来源：实验室分离(T.Serafmi等，Cell，1994，78，409)的神经因子-1(0.1-10μg/mL)和cDNA转染的稳定成纤维细胞系(K.
Figure BDA00003254031100401
等，J.Neurosci.，2008，28，1099)释放的神经因子-1。也在类似的条件下测试了0.1μg/mL的市售神经因子-1(R&DSystems，Minneapolis，MN)，但是与实验室纯化的神经因子-1相比没有任何额外优点。在试验室中从新鲜整只小鼠脑组织中制备脑浆。简单地说，使用定子转子将脑组织在添加有蛋白酶抑制剂(protease inhibitorcocktail；Roche，USA)的低渗溶液中匀浆，过滤，使用Bradford蛋白质分析测量总蛋白质含量并且稀释至0.1μL/mL浓度。所使用的化学排斥剂是Slit-2(62.5or250ng/mL；R&D Systems，Minneapolis，MN))。对于化学传感(chemosensing)研究，在细胞接种24-48小时后除去全部端口中的培养基，向化学吸引剂通道中引入含有已知浓度导向因子的350μL培养基，其余两个通道中各自引入350μL无血清培养基。对于使用由成纤维细胞释放的神经因子-1的实验，将转染的成纤维细胞(1×105细胞)接种到化学吸引剂通道(来源)中，正常成纤维细胞(未转染，1×105细胞)接种到左侧通道(排出)中。除非转染，否则这些正常成纤维细胞无法固有释放神经因子进入培养基。转染的成纤维细胞释放的神经因子穿过胶原蛋白-1凝胶并且产生梯度。每个一段时间改变培养基以始终保持梯度。以相同方法培养未接受导向因子的对照装置作为测试案例。
轴突长出和转向的表征
使用相差、荧光和共聚焦显微镜表征装置内3D胶原凝胶中的轴突分布和定量轴突转向。使用装配有Hamamatsu相机和Openlab图像获取软件的Nikon TE300显微镜获取荧光和相称图像。在用4％PFA固定(30分钟)后对轴突和细胞核进行染色。将固定样品用IX磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗3次，用0.1％Triton-X处理(1-2分钟)，用IX PBS冲洗，之后在DAPI(用于细胞核)和罗丹明(用于肌动蛋白)的混合物中侵泡(30分钟)，最后用IXPBS的冲洗步骤。使用提供有图像套件(PerkinsElmer Life Science)获软件的旋转盘共聚焦显微镜(Zeiss Axiovert 200M)采集共聚焦图像。获得一系列20光学连续切片(5μm厚)并且对齐堆叠的图像并且使用Imaris(Bitplane，MN)给予3D可视化。使用NeuronJ(E.Meijering等Cytometry.Part.A，2004，58，167)追踪沿着通向生长锥的每个轴突的长的最后100μm段，并且测量这一段关于水平线(0°)产生的角度。在四象限中，Q1中的值(-60°至+60°)反映了朝向导向因子的生长，Q3中的值(120°值240°)反映了转离导向因子(图11J)。对培养在类似条件下的装置中象限1和3中的轴突值计数，通过平均每个实验条件下的全部装置中的数据，使用Mann-Whitney检验计算测试案例和对照培养(无导向因子)之间的统计学显著值。对于DRG的研究，测量迁移进入每个象限的细胞的数目并且使用类似方法进行定量。
结果与讨论
微流体装置的实施
微流体装置具有很多实践中的优势，包括与传统梯度产生技术相比的高通量和低成本实验。此外，微流体装置需要较少量昂贵试剂，其使得能够平行实施多个梯度产生细胞培养环境。本研究描述的微流体装置的这个实施方案提供了在体外研究轴突导向的新平台，并且提供了许多在其他的当前技术中无法得到的特性。(i)制造容易、操作简单并且在实验的重现性上更可靠。(ii)可以将细胞培养在更接近生理的条件下，这是因为细胞包装在组织样结构中并且轴突穿过3D基质生长(图10A-10B)。这些神经元良好的生存和长出表明对于未来培养这些细胞非常有效。(iii)可以在期望的时间点在整个3D凝胶中建立化学梯度以研究轴突生物学。(iv)通过每个装置多个轴突和每个批次多个装置，仅通过一次实验就可以得到统计学显著的数据。(v)容易在3D中追踪轴突和计算转角，因此有利于详细分析和定量。这样的装置提供给了研究响应化学梯度的轴突导向的有效工具。
在该实施方案中，装置具有T形凝胶区和3个通道(图6B)：培养基通道、细胞通道和导向因子通道。因为加入到右侧通道的导向因子扩散穿过凝胶，其他通道作为导向因子的排出，因此在整个凝胶中产生梯度。早期研究表明皮层神经元的初始轴突成长主要朝向侧面，随着进行轴突转向更侧位置(H.B.M.Uylings等，in The cerebral cortex of the rat，ed.B.Kolb，and R.C.Tees，Cambridge，MIT，1990，第35-76页)。因此，相对于细胞体，有目的地将凝胶区设计得足够长以显现增加的轴突成长和相应梯度的最终转向。3个PDMS柱(图6C)为凝胶提供给了结构支持并且防止凝胶外流进入培养基通道。因此，在这种结构中，轴突生长的方向垂直于梯度的方向，使得这成为研究轴突导向的有效设置。另外，在细胞必须通过狭窄通道流通时，有剪切力损伤增加的风险。培养细胞的室比细胞体大数个数量级，极大增加了其生存的机会和降低了在将它们引入装置时其机械活化的趋势。
之前的研究表明3D支架内的细胞存在于更加自然的环境中，其中细胞与三维空间中的其他细胞和ECM接触，因此预期比2D结构更接近引发天然细胞应答(W.M.Saltzman，et al，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，665，259)。由于在3D支架(如同在自然组织中)内表达的细胞基因可通过支架来源的因子(包括细胞粘附分子、生长因子和机械刺激)来调节，所以ECM基支架更可能唤起自然整合素-ECM相互作用和保持天然细胞表型(L.Griffith and M.Swartz，Nat.Rev.，2006，7，211)。在本研究使用2mg/ml的I型胶原蛋白的重建水凝胶产生聚合物基质，其具有50-200nm直径和约0.5-1μm孔径的原纤维(N.Yamamura，et al，Tissue.Eng.，2007，13，1443)。尽管这是不神经系统中的主要细胞外基质组分，但是其他研究者已经成功使用I型胶原蛋白研究2D和3D两种培养中的轴突生长。与基质胶或肽凝胶相比，本人所述研究还表明I型胶原蛋白对于神经元生存和轴突生长没有不利影响。
梯度的建立和稳定
在初步梯度实验中，向装置中加入化学吸引剂，其他全部通道装填相同体积的无血清培养基，以尝试产生梯度。但是，即使在获得平衡后还是能够观察到通过凝胶的对流，这可能是由于侧通道之间的小的压力差异造成的，其可阻止在整个凝胶中形成扩散梯度。因此，为了在侧通道内保持平衡压力，在装置的顶部安装具有两个部分的PDMS容器系统(图14)。填充有化学吸引剂(或化学排斥剂)培养基的储库一部分封闭化学吸引剂通道口，而填充有培养基的另一部分覆盖了另外两个通道。直径1.5mm形状为半圆柱的小通道连接储库的这两个部分以允许平衡压力，从而防止通过凝胶的梯度。图7A示出了在装置中使用40kDa FITC葡聚糖获得的梯度的典型时间依赖快照，从其中得到2天时间内整个凝胶内的浓度曲线(图7B)。观察到建立梯度需要30分钟时间，稳定的梯度可保持长达2天。梯度在最初的30分钟内向左推进，之后来源于化学引诱物通道的化学引诱物在凝胶的入口附近缓慢耗尽，逐渐积累在细胞和培养基通道中。来源于线性梯度的差异明显是由于凝胶区的T形状，但是这是高度可再现的，可通过计算模型预测，并且如需要可在实验解释中进行解释。
Goodhill等的最近研究，通过生长锥的定量梯度检测使用试验和计算方法(G.J.Goodhill，Trends.Neurosci.，1998，21，226；G.J.Goodhill和J.S.Urbach，J.NeurobioL，1999，31，230；J.S.Urbach和G.J.Goodhill，Neurocomputing，1999，26，39)。梯度的倾斜度通过利用来源处的浓度归一化并且表示为百分比的生长锥整个宽度(～10μm)的浓度变化来表征。尽管生长锥可检测低至0.1％的梯度，但是1％的梯度足以诱导一些导向，10％倾斜度将诱导强烈导向(W.J.Rosoff等Nat.Neurosci.，2004，7，678)。由于生长锥在其体内自然环境下暴露于多种梯度，所以其很可能根据浓度和梯度的数量级调整它们的形态和方向导向(J.Xu，W.Rosoff等，Development，2005，132，45)。如果浓度足够高，全部细胞表面受体饱和，那么，那么梯度的数量将不再有影响。另一方面，如果浓度太低，尽管梯度很高，但只有很少受体活化。因此，最好是将浓度水平和梯度对于细胞对生长因子响应的影响解离开来。不管感知到的形变(例如，作为接受器的凝胶填充区和细胞通道)对于在装置中的整个凝胶内均匀线性梯度的保持，预测有限元模型在所研究的浓度有3-4％的倾斜度，其应当引起强烈的轴突转向。为了在持续时间内在这种期间内保持陡峭的梯度，可在实验的过程中使培养基缓慢通过侧通道。这个过程不仅在源通道不断补充化学吸引剂，还防止其在作为接受器的细胞和培养基通道内积累。
对于外部干扰的梯度敏感性
以两种方法测定在实验过程中外部干扰对于梯度建立和稳定的作用：定期更换装置中的培养基，或向装置顶部的化学吸引剂储库中加入150μl葡聚糖溶液。当更换全部通道中的培养基时，清空储库和端口并且替换成新培养基。在更换培养基的过程中监测浓度(图8A)，表明来源于新鲜培养基的较高浓度～30分钟内在整个凝胶中重建梯度，然后其保持稳定。在第二种实验中，向已经包含350μl培养基的化学引诱物储库中加入150μl葡聚糖溶液。这造成这个隔室内压力的显著增加，其通过与储库相连的通道有效平衡，并且不会通过凝胶干扰梯度(图8B)，类似地，当把装置从保温箱(处于平衡)向显微镜转移进行成像时，或当细胞挤到凝胶表面，或当保温箱本身进行振动时，观察到整个凝胶内梯度没有显著变化。因此，这些细节研究表明在装置中形成的梯度具有高确定度，还能够很好从外部干扰中恢复。
尽管具有这些优点，若干不可控变化也可在细胞培养中有助于梯度分布。例如，培养基快速蒸发、PDMS壁或柱附近胶原凝胶的浓度的变化、通道中未清洗的碎片、导向因子与基质的结合等。因此，采取必须的预防措施，以全部试验中在使用前进行好压灭菌和目视检测，使用来源于同一批次的胶原凝胶，以及保持相同的胶原凝胶与神经元之比。
梯度模拟
图9A-9D示出了微流体装置中时间依赖性梯度的有限元模型。计算装置内整个凝胶区的稳态浓度分布(图9A)和这个其余的浓度曲线的空间-时间演化图9B)。在初始条件下，化学吸引剂通道浓度为1，细胞和培养基通道浓度为0。图9C示出了用于比较的整个凝胶区的浓度梯度分布(浓度曲线的斜率)，图9D示出了其时空演化曲线。可以看到，耗费约30分钟建立准稳定浓度梯度，其在42小时内缓慢衰减，之后补充化学吸引剂和培养基。另外，衰减的浓度曲线导致随时间在凝胶区内更均匀的梯度。因此，浓度梯度的确切知识和使用模型完成详细参数研究的能力对于定量生长锥感知的化学吸引剂梯度以解释其转向很重要。
化学吸引剂梯度对于海马轴突导向的作用
实验的目的是使得神经元将其轴突以三维生长进入胶原凝胶，并且如果神经元在靠近凝胶表面时其有较大几率做到这一点。因此，如图10A-10B所示，通过整个凝胶内的压差使细胞挤在凝胶上。将细胞悬液(20μl)放置在细胞通道的入口，而从全部其他端口除去培养基。细胞小滴产生的高压诱导朝向出口流通细胞通道。培养基通道和化学吸引剂通道中的低压产生通过凝胶的小流动，从而使细胞挤在凝胶表面。经过多次重建压差，恢复流动，挤在凝胶上的细胞密度增加。在细胞接种2小时后更新细胞通道中的培养基以清除未包装细胞。
神经因子-1，一种由底板细胞(floor plate cell)产生的可扩散细胞吸引物，通过促进未成熟神经元在长距离范围内的定向迁移在产生复杂的神经连接图案中具有重要作用。一些研究表明神经因子-1通过DCC受体调节合缝处轴突的生长(K.Keino-Masu等，Cell，1996，87，175)，和增加视网膜神经突延长(T.Serafmi，T.等，Cell，1994，78，409；K.J.Mitchell，et al，Neuron，1996，17，203)。另一方面，已经表明神经因子-1对于胚胎脊髓中的少突胶质细胞前体细胞是化学排斥的，通过由DDC构成和UNC-5同系物(UNC5H)的神经生长因子受体复合物进行调节(A.A.Jarjour等，J.Neurosci.，2003，23，3735)。因此，在本研究中，在微流体装置中对通过不同模式递送的神经因子-1对于海马神经元轴突转向和导向进行了体外评估。
当海马神经元培养在无外源导向因子的对照装置中(图11G)时，如预期的，大部分轴突在缺少任何梯度下表现为无轴突转向，在Q1中仅观察到全部轴突的8.3±3.1％，在Q3中12.6±4.3％(n＝151轴突，图11K)。在图11A示出了在右侧通道中培养有神经因子转染的成纤维细胞同时左侧通道中培养有正常成纤维细胞的情况下培养的神经元的轴突导向，而在图11B示出了在两侧通道都培养有正常成纤维细胞的轴突转向。由神经生长因子转染的长纤维细胞分泌的神经生长因子-1(图11A)吸引了全部轴突的43.4±6.5％朝向梯度，仅7.1±3.9％转开(Q1对比Q3的p＜0.001；n＝119轴突)。相比之下，在两侧培养正常成纤维细胞时在整个凝胶内不产生神经生长因子梯度(图11B)，表现为没有优先的轴突转向(Q1对比Q3的p＞0.6；n＝45轴突)。在前者情况下，神经生长因子转染的成纤维细胞可以细胞和培养基通道作为接受器(sink)持续在整个胶原凝胶内补充梯度，尽管在这一点上不知道由这些细胞释放的神经生长因子-1的确切浓度。因此，与未转染的成纤维细胞培养相比，由成纤维细胞释放的神经生长因子-1诱导转向梯度的轴突增加3倍(p＜0.001；图11J)，而与无成纤维细胞的对照相比增加5倍(p＜0.001)。
外源补充1μg/mL实验室纯化的成纤维细胞-1刺激DCC-转染的海马轴突转向梯度(Q1中27.8±6％；Q1对比Q3的p＜0.01；n＝117轴突)(图11C)，是无神经生长因子的对照中转向Q1的轴突百分比的三倍(与对照相比p＜0.001)。然后测试了实验室纯化的神经生长因子的浓度对于轴突对梯度的响应的不同影响。图11D、11E、11F示出了分别在0.1、1和10μg/mL神经生长因子的存在下的培养在海马神经元的代表性荧光图像。对这些图像的定量分析表明，与无神经生长因子的对照相比，0.1和10μg/mL神经生长因子对于轴突转向没有显著的化学吸引作用(分别为n＝138和n＝38轴突)。较高浓度神经生长因子(10μg/mL)可使生长锥受体饱和，抑制轴突转向，这将解释在这个剂量无任何响应的原因，尽管还需要进一步对这个假设进行验证。结论，在这个剂量范围的研究中，1μg/mL神经生长因子对于轴突朝向梯度的转向提供了最明显作用(于全部其他情况相比，1μg/mL神经生长因子p＜0.03)。
当海马神经元培养物添加0.1μg/mL脑浆时(图11H；n＝28轴突)，相对于对照，观察到转向梯度的轴突增加3倍(p＜0.005)。有趣的是注意到，如从两种情况下的Q1和Q3中的轴突百分比显示的，海马神经元以类似方式响应1μg/mL实验室神经生长因子和0.1μg/mL脑浆两者(图11K)。尽管难以鉴别促成这种轴突响应的脑浆混合物中每个种导向因子的组成和浓度，然而其表明这种装置共培养具有已知细胞类型的组织样品的效用。
与2D平面培养系统或微量移液器转向测定相比，这种装置中的细胞培养环境更加地生理性。在生长的神经突起到达凝胶的水平截面时，向装置中加入化学吸引剂，此处梯度与轴突生长方形几乎垂直。生长锥性质极具活力，并且完成三个重要功能——感受环境因子、向细胞体传递信号和相应导向轴突。生长锥迁移由与肌动蛋白上层结构相连的细胞骨架物质的聚合/解聚介导，其涉及在轴突生长、生长锥运动和导向中发挥作用(D.Bentley和A.Toroian-Raymond，Nature，1986，323，712)。导向因子表现为在体外生长锥中诱导向药性响应，其中吸引因子如神经生长因子-1或BDNF(脑源神经营养因子)在梯度方向上延长细胞支架网络(J.Yao，et al，Nat.Neurosci.，2006，9，1265)，由排斥因子如slit-2或脑信号蛋白3A诱导的蛋白质造成细胞支架网络塌陷(M.Piper，et al，Neuron，2006，49，215)。神经生长因子被分泌进入基质环境并且与ECM分子和细胞膜结合，从而决定细胞生长因子扩散的范围和信号(T.E.Kennedy，Biochem.Cell.Biol，2000，78，569)。因此，神经生长因子信号传导可起因于不同神经生长因子受体的活化，DCC(大肠癌缺失)受体主要介导神经生长因子吸引(M.J.Barallobre等，Brain.Res.Rev.，2005，49，22)，UNC-5受体介导神经生长因子排斥(H.M.Cooper等，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，1999，26，749)。由于胶原蛋白-1不是神经系统中ECM的主要组分，与3D胶原蛋白-1支架结合的神经生长因子将可忽略，其不会影响装置中轴突对梯度的感知。该研究的结果也证实海马轴突转向1μg/mL神经生长因子-1梯度由生长锥前缘的DCC受体活化介导，如图11C中DCC受体的亮荧光所示。
slit-2对于海马轴突转向的影响
已经表明slit-2排斥神经元前体细胞从室管膜下区向嗅球迁移(W.Wu，等，Nature，1999，400，331)，通过与Robo受体相互作用排斥培养物中的脊髓运动轴突(H.S等，Cell，1999，96，807)和介导脑中胶质瘤细胞导向。与其Robo跨膜受体对应物一起，slit-2表现出调节中线合缝处轴突的导向(K.Brose等，Cell，1999，96，795)。另外，被slit-2排斥的细胞表现为对神经生长因子无响应性(E.Stein和M.Tessier-Lavigne，Science，2001，291，1928；F.Causeret等，Dev.Biol，2002，246，429)。在不表达slit-2的敲除小鼠中，在体内观察到轴突导向中的多种缺陷(A.S.Plump等，Neuron，2002，33，219)。由于slit-2梯度是神经生物学中充分研究的化学排斥剂，所以在微流体装置中评估了slit-2梯度对于轴突转向的作用。
图12A-12C示出了在两种不同slit-2梯度水平下的海马轴突转向的典型塌陷的3D共聚焦显微镜图像。如在Q3中轴突的百分比(42.6±9.1％)与Q1中的(18.2±4.5％；Q3对比Q1的p＜0.001；n＝64轴突)相比明显的，在较高梯度(右侧通道250ng/mL)，slit-2作为强化学排斥剂(图12A)。相比之下，62.5ng/mL的slit-2未表现出类似的强排斥特性(图12B；n＝51轴突)。slit-2浓度从62.5ng/mL增加至250ng/mL，几乎三倍百分比的轴突转离高浓度(p＜0.001；图12C)。相对于未接受因子的对照(图11G)，250ng/mL slit-2，使得从梯度转下的轴突增加3.4倍(p＜0.001)。但是，需要进一步的研究以对slit-2对于海马轴突转向的这种有趣行为背后的分子机理(例如受体活化)进行理解。
slit-2对于DRG迁移和轴突转向的影响
当DRG外植体接种到细胞通道中时，神经元在装置中过密并且侵略性迁移进入3D胶原凝胶(图13A)。在未接受slit-2的对照培养中，进入Q1和Q3的神经元迁移保持相似，这是因为在支架中没有任何梯度(Q1中18.5±5.1％对比Q3中15±6.5％)。另一方面，添加250ng/mL slit-2使得沿着梯度迁移的DRG神经元显著增加(Q3中74±12.5％；图8C)，相对于对照增加了5倍(与对照相比p＜0.001)，相对于62.5ng/mL slit-2梯度为2.7倍(p＜0.01)。迁移的神经元表现为利用不同的信号通路而不是趋化性生长锥，通过延长多种方法然后选择对于迁移最有利的一种(M.W.Ward等，Mol.Cell.Neurosci.，2005，30，378)。在细胞体前面的迁移DRG神经元的前端(图13A)支持这种在化学梯度下合适的策略。总之，这些结果表明250ng/mL浓度的slit-2对于DRG神经元迁移表现出强的化学排斥作用，需要进一步的研究以引出这些观察结果背后的分子机理。
为了抑制DRG细胞的生长和迁移，并且仅允许神经突延伸进入胶原蛋白支架，加入5-氟尿嘧啶(5-FU，浓度10-5M，Sigma Aldrich，USA)，在抑制细胞迁移和扩增的癌症研究广泛使用的一种嘧啶类似物药物(J.Fried，等，Cancer.Res.，1981，41，2627)。在这些试验中，在第0天将DRG外植体连同5-FU一起接种在细胞通道中，培养24小时后，使用新鲜培养基彻底冲洗全部通道以从凝胶中除去痕量5-FU。由于在这个阶段未观察到迁移进入支架的细胞，通过向右手侧通道加入250ng/mL slit-2来建立梯度。在250ng/mL slit-2的存在(或不存在)下培养，代表性荧光图像表明大量DRG神经元轴突在3D凝胶蛋白支架中生长和转向(图13B)。定量分析表明，70±14.2％DRG轴突被slit-2排斥，相比之下对照培养中为42±8％轴突(相比于对照p＜0.03)。与对照培养相比，在slit-2添加后显著抑制(56％)了转向进入Q1的DRG轴突(相比于对照p＜0.05)。这些结果与250ng/mL slit-2对于装置中海马轴突转向的作用普遍一致(图12A-12C)。
除了其在神经生物学中的研究潜力外，该设备也可用于组织工程和再生医学应用。大量研究报道中枢神经系统(CNS)的损伤可彻底改变表达导向因子及其受体的细胞基因(C.A.Willson等，Cell.Transplant.，2002，11，229)。特别有意思的是，已经认为在脊髓和小脑的损伤后神经生长因子-1及其受体的表达的改变，这可能是这些区域断裂轴突无法再生的原因(R.Wehrle等，Eur.J.Neurosci.，2005，22，2134)。操作这些发育因子，构建其复杂的时空梯度，理解细胞-细胞和细胞-基质的相互作用以及阐明多种导向因子对于修复实验动物模型中损伤CNS的作用将是艰巨并且昂贵的任务。在这些情况下，有利地是在体外的简单廉价的微流体系统中重建细胞微环境和理解每个组分(ECM分子、生长因子梯度、机械刺激、炎症环境等)的作用，来指导设计用于体内有效的轴突再生和导向的组织工程方法(例如，末梢神经移植、可注射水凝胶)。
结论
设计、开发和优化了微流体装置的该实施方案，以研究化学梯度下的轴突导向。这个系统的主要优点包括制造和使用简单，细胞培养在生理的3D环境中和长时间保持稳定梯度。进一步的实验正在进行中，以通过使用外部泵持续地流动培养基和化学吸引剂通过通道来在甚至更长的时间内保持恒定的梯度。在该研究中，仅在体外研究了已知的导向因子如神经生长因子-1、脑浆和slit-2对于海马或DRG轴突转向和DRG神经元迁移的影响。这些装置也可用于筛选新导向分子、研究生长锥形态或识别轴突导向中所涉及的基因。由于新的方法存在在体外将细胞暴露于已知梯度，该系统也可用于其他细胞类型以研究趋化性。最后，这种微流体系统具有优化用于神经组织工程的生物材料、研究癌细胞迁移、干细胞分化成高度专一的神经元细胞和血管生成的应用。
实施例3间隙流通过竞争机理对于肿瘤细胞迁移的方向的影响
间隙流是流体通过组织细胞外基质的对流运输。已经表明这种缓慢的流体流对于细胞如成纤维细胞、癌细胞、内皮细胞和间充质干细胞的形态和迁移具有影响。但是，由于试验程序和设备的局限性，对于细胞检测流动的机理以及细胞应答的细节和动力在很大程度上仍是未知的。设计了微流体细胞培养系统以提供稳定的压力梯度和流体流动，并且允许直接呈现接种在3D I型胶原蛋白支架中的细胞的瞬时应答。这种系统被用于检验间隙流对于癌细胞形态和迁移的影响，以延续表明间质流增加MDA-MB231乳腺癌细胞转移潜能的在先研究(Shields et al.2007.Cancer Cell.11：526-38)。与该在先研究一致，发现在流存在下细胞沿着流线迁移，但是，还表明流场的强度和细胞密度决定了沿流线的迁移定向偏转。尤其是，发现高接种密度或CCR-7受体抑制的细胞逆着而不是顺着流动迁移。这里所提供的进一步证据表明CCR-7依赖性自体趋化性是导致随着流动迁移的机制，但是还表明造成逆着流动迁移的竞争性的非CCR-7依赖性机制。研究细胞浓度、间隙流速和受体活性的影响的实验的数据支持本文的假设，竞争性刺激是由剪切应力介导的。该机理很可能在转移性疾病的进程中具有重要作用。
组织由细胞构成，细胞存在于包含运输营养物和信号分子的间隙流体的细胞外基质(ECM)中(Swartz，MA和Fleury，ME.2007.Annu.Rev.Biomed.Eng.9：229-56；Jain，R.K.1987.Cancer Research.47：3039-3051)。整个组织内的的渗透压和液体静压由生理过程产生，例如向淋巴管的排放、炎症、肿瘤生长或微血管渗漏导致的局部高压以及肌肉收缩各自驱动流体流动通过ECM(Jain，R.K.1987.Cancer Research.47：3039-3051；Boardman，K.C.和Swartz，M.A.2003.Circ.Res.92：801-808)。这术语称作间隙流(interstitial flow)，并且很早就被接受为有助于阻止运输和生理机能(Swartz，MA和Fleury，ME.2007.Annu.Rev.Biomed.Eng.9：229-56；Levick，JR.1987.Q.J.Exp.Phys.72：409-37)。Chary和Jain使用漂白后的荧光恢复直接观察组织间隙的流体流动，并且确定典型的流速约为0.1-2.0μm/秒，较新的研究表明流动可以高达的4.0μm/秒速度(Chary，SR和Jain，RK.1989.Proc.Natl.Acad.Sci.86：5385-89；Dafni，H等，2002.Cancer Research.62：6731-6739)。
间隙流在驱动肿瘤附近的运输中尤其重要，因为肿瘤组织通常表征为间隙压力局部增加，导致肿瘤边缘高的间隙压力梯度(Heldin，C等，2004.Nat.Rev.Cancer.4：806-13)。此外，瘤内高间隙压力已经与癌症患者的不良预后相关联(Curti，B.D.等1993.Cancer Res.53：2204-2207(1993))。因此，已经显示间隙流是转移瘤形成中指导肿瘤细胞迁移的可能因素(Curti，B.D.等，1993.Cancer Res.53：2204-2207(1993)；Chang，S.等，2008.Proc.Nat.Acad.Sci.105：3927-2932；Hofmann，M.等2006.Neoplasia.8：89-95；Leunig，M.等1992.Cancer Research.52：6553-6560)。
Shields等观察到暴露于流的细胞群中转移潜能增加，并且表明这通过自身分泌的CCL21配体与CCR7受体的结合来活化(Shields等2007.Cancer Cell.11：526-38)。这种自分泌的信号机制(术语称作自体趋化性)存在于流场中，其中对流分配自分泌趋化因子产生跨细胞的趋化因子梯度，其转而提供趋化性信号(Fleury，ME等，2006.Biophysical Journal.91：113-21)。
Shields等使用跨孔(transwell)测定来开发自体趋化性模型，通过允许肿瘤细胞上独立刺激的系统研究，其他类似的体外测定提供了对于转移过程和肿瘤细胞迁移的有价值的理解(Curti，B.D.等1993.Cancer Res.53：2204-2207(1993)；Chang，S.等，2008.Proc.Nat.Acad.Sci.105：3927-2932；Griffith，LG和Swartz，MA.2006.Nat.Rev.MCB.7：211-24；Vickerman，V等，2008.Lab on a Chip.8：1468-77；Keenan，T.M.和Folch，A.2007.Lab on a Chip.8：34-57；Keenan，T.M.2006.App.Phys.Letters.89：114103-1-114103-3；Jeon，N.L.，等，2000.Langmuir.16：8311-8316；Friedl，P.等1995.Cancer Research.55：4557-4560；Helm，C等2005.Proc.Nat.Acad.Sci.44：15779-15784；Wang，S和Tarbell，JM.2000.Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.20：2220-2225；Ng，CP和Swartz，MA.2003.Am.J.Phiol.Heart Circ.Physiol.284：H1771-H1777)。但是，跨孔测定的培养条件和成像能力中的局限性导致无法详细理解细胞如何感受和响应间隙流。进一步验证自体趋化性模型和研究其他流动诱导的细胞刺激将明显从以下细胞培养系统中受益，在所述细胞培养系统中，细胞接种在生理相关的3D基质中并且可以在其中定量时间依赖的形态和对于流动迁移响应。已经使用3D培养系统来证明间隙流对于其他细胞类型的影响，例如成纤维细胞(Ng，CP和Swartz，MA.2003.Am.J.Phiol.HeartCirc.Physiol.284：H 1771-HI 777；Boardman，K.C.和Swartz，M.A.2003.Circ.Res.92：801-808)、肌成纤维细胞(Ng，CP.等，2005.J.Cell Science.118：4731-4740)、内皮细胞(Vickerman，V等，2008.Lab on a Chip.8：1468-77；Helm，C，等.2005.Proc.Nat.Acad.Sci.44：15779-15784)和平滑肌细胞(Wang，S和Tarbell，JM.2000.Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.20：2220-2225)。
这里描述的是微流体细胞培养系统，在该系统中可观察和定量生理相关3D基质中细胞迁移的方向偏好和动力，并且该系统用于研究间隙流对于肿瘤细胞迁移的影响。在这里表明，间隙流影响细胞迁移的方向偏好，并且迁移响应是依赖于流速和细胞密度的。另外，通过阻断CCR7通路，提供了支持CCR7依赖性自体趋化性模型在流动方向上的迁移的证据，并且其次，证明了非CDD7依赖性通路刺激细胞逆流迁移。这两个明显独立的机制之间的竞争在很大程度上决定了间隙流影响下的细胞迁移方向。
结果
细胞培养系统设计和验证间隙流场。使用微流体细胞培养系统在3D I型胶原蛋白基质中培养乳腺癌细胞(MDA-MB 231)并且使这些细胞接受受控水平的间隙流。系统包括两个通道，其由包含悬浮在I型胶原蛋白凝胶中单一细胞的区域分隔(图16A)。通过在整个凝胶区域施加流体静压，产生一致的流场。使用FEM软件解决系统几何学的通过多孔介质之流动的Brinkman方程式(图16B)。通过向整个流体中加入荧光微球和使用荧光时间间隔显微镜对微球成像来验证流场(图16B)。发现间隙流的速度是可重复的并且与数值预测一致(图16C)；还观察到所测量的和所预测的速度方向共方向(图16D)。在下文中，每个流场将通过其各自标准值提及，圆形的分别指0.3μm/秒和3.0μm/秒，表示公开的体内间隙流速值的范围。从珠跟踪数据来看，确定2mg/ml I型胶原蛋白凝胶的水利渗透性为1.55×l0-13m2，类似于之前的公布值。
细胞优选地沿所述流排列。将MDA-MB 231人乳腺癌细胞接种在微流体装置中的I型胶原蛋白凝胶中。细胞以3D悬浮在凝胶内并且以3D迁移(图17A)。共聚焦反射显微镜证明随着细胞的迁移而分解胶原蛋白基质，在迁移的过程中在胶原中留下痕迹，因此表明蛋白水解活化迁移机制。当暴露于间隙流时，细胞平行于流线排列。随着时间延长，细胞延长突起并且随后形成与流线平行的多细胞串。40小时后，暴露于3.0μm/秒流速的细胞沿流场的流线排列，86±7％的细胞排列在局部流线的45°内。未暴露于流的细胞保持随机取向，仅有55±2％的细胞排列在局部流线的45°内。
高浓度接种的细胞逆着流动迁移。使用16小时间隔的慢速成像，追踪每个细胞的质量中心。发现细胞迁移速度独立于间隙流量级(0.10μm/秒±0.05)。暴露于间隙流的细胞迁移定向性增加，定向性定义为使用总迁移距离归一化的净迁移距离(对于0.3μm/秒为0.63±0.073，对于3.0μm/秒为0.61±0.071，对比于对照的0.39±0.071)。但是，定义为在8小时内迁移距离大于一个细胞直径的细胞百分比的细胞运动性不受流的影响。
间隙流诱导细胞迁移方向偏好。对照装置和具有3.0μm/秒流速的装置的迁移数据的极坐标直方图清楚表明了流对于迁移矢量方向的影响(图17A-17E)。在具有流的装置中，细胞优先沿着流线迁移。为了定量细胞群的迁移方向，使用了两种度量标准。“流线迁移度量标准”得分，如果细胞在流线的45°内迁移，其具有+1，如果它们在这个区域外迁移，其具有-1(图17D)。+1的细胞群平均得分表明全部细胞沿着流线迁移，0得分对应于完全随机迁移，-1的得分表明全部细胞垂直于流线迁移。为了确定沿着流线的方向偏好，使用“定向迁移度量标准”计算，如果得分的细胞在流动方向上迁移，其具有+1，如果细胞逆着流动迁移，其具有-1(图17E)。如果在流线45°内迁移的全部细胞随着流动迁移，那么细胞群具有+1平均得分；如果细胞随机迁移，得分为0；如果全部细胞逆着流动迁移，得分为-1。
以25×104细胞/ml接种并且暴露于间隙流的细胞优先沿着流线迁移，0.3μm/秒的平均流线迁移得分为0.47±0.06，3.0μm/秒的为0.24±0.04(平均值±STD，图18A)。对于沿着流线迁移的细胞，相比于顺流迁移，较大比例的细胞群逆流迁移并且这种逆流偏好的强度是间隙流速的函数。在间隙流速为0.3μm/秒时，平均定向迁移得分为-0.18±0.15，在3.0μm/秒时，方向偏好进一步增加至-0.40±0.08。对照装置中的细胞没有在任何方向优先迁移(图18B)。这些结果与Shields等报道的那些相反，它们观察到细胞优先随着流动迁移。
在低细胞接种密度，细胞随着流动迁移，为了测试细胞密度对于流动下定向迁移的影响，以25×104和5×104细胞/ml的不同接种密度进行实验。密度的差异对应于细胞间距增加约2倍。细胞间距的增加不影响0.3μm/秒间隙流场中沿着流线的迁移的偏好，但是在较低浓度接种时，3.0μm/秒间隙流场中沿着流线迁移的细胞百分比较小(图18A)。
但是，细胞密度的减小对于迁移方向没有显著影响，即相对于流动造成迁移方向偏好的逆转，如定向迁移度量标准中符号改变所指示的，结果与Shields等的一致。在0.3μm/秒的流速，在25×104细胞/ml时平均定向迁移得分为-0.177±0.15，但是在5×104细胞/ml增加至0.570±0.18。对于3.0μm/秒，在25×104细胞/ml时平均定向迁移得分为-0.401±0.08，但是在5×104细胞/ml增加至0.307±0.16(图18B)。
阻断CCR7信号转导使得逆流迁移的趋势增加。在接种25×104细胞/ml的并且受到0.3μm/秒间隙流的装置中，添加CCR7使得沿流线的迁移偏好减小，使得平均流线迁移度量标准由0.472±0.060降低至0.174±0.070，但是对于3.0μm/秒流场中的细胞几乎没有影响(图18A)。在两种间隙流速下，阻断CCR7使得逆着流动的定向迁移增加(图18B)。
在CCR7信号转导被阻断时，低接种密度的细胞逆流迁移。有趣的是，降低细胞密度和阻断CCR7的联合作用导致沿着流线的迁移偏好中流速依赖的改变。在0.3μm/秒时，通过添加CCR7阻断抗体，5×104细胞/ml的流线迁移得分从0.489±0.122降低至0.201±0.031。但是，在3.0μm/秒，5×104细胞/ml的流线迁移得分从0.088±0.188增加至0.384±0.06。
在以5×104细胞/ml接种的装置中，添加CCR7阻断抗体使得流动方向中的优先迁移完全无效，并且实际上造成逆流优先迁移。在两种流速下平均定向迁移得分急剧减小，在0.3μm/秒从0.570±0.12降低至-0.420±0.19，在3.0μm/秒从0.307±0.16降低至-0.649±0.18(图18B)。
阻断CCR7消除了细胞迁移的接种密度依赖性。当具有CCR7阻断抗体的5×104细胞/ml细胞群与有CCR7阻断抗体的25×104细胞/ml细胞群进行比较时，在方向迁移偏好上没有显著差异。这些数据表明添加阻断抗体消除了细胞浓度对方向迁移偏好的影响。另外，尽管影响不是统计学显著的，但是在流速影响中观察到了一致的趋势。在两种细胞浓度下，流速从0.3μm/秒增加至3.0μm/秒使得沿流线迁移的细胞的百分比增加和使得沿着流线迁移的细胞的逆流迁移偏好增加(图18A-18B)。
讨论
间隙流对于细胞迁移的影响。间隙流影响肿瘤细胞的迁移并且尤其是显著影响迁移的方向。对于具有间隙流的全部培养条件，细胞优先沿着流线迁移。沿着流线迁移的细胞群的相对分数以及沿着流线的逆流和顺流偏好是细胞密度、CCR7活性和间隙流速的函数。
CCR7和自体趋化性。对于3.0μm/秒和0.3μm/秒流场中以5×104细胞/ml和25×104细胞/ml接种的细胞，添加CCR7阻断抗体降低了顺流迁移的趋势。这些数据表明CCR7受体涉及顺流迁移，因此支持Shields等的发现，他们认为CCR7趋化因子受体是负责自体趋化性的信号通路的关键(Shields等2007.Cancer Cell.11：526-38)。自体趋化性是由CCR7趋化因子受体检测并且刺激流动方向的迁移的自体趋化性信号的流动诱导梯度的结果。本文提供的数据证实CCR7涉及肿瘤细胞迁移，并且通过证明CCR7直接涉及顺流迁移来验证了自体趋化性模型。
有趣的是，在没有CCR7阻断抗体的实验中，迁移方向是细胞接种密度的强函数。随着细胞浓度增加，较少细胞顺流迁移，并且产生开始出现在逆流方向上迁移的趋势。预期细胞迁移方向的密度依赖性是自分泌和旁分泌趋化因子浓度场的结果。先前已经在单细胞背景下研究了作为自分泌趋化因子梯度的结果的自体趋化性(Fleury，ME，等，2006.BiophysicalJournal.91：113-21))，但是当在模型中包括临近细胞的影响时，观察到细胞密度的增加降低了与其他细胞逆流的细胞的跨细胞梯度的量级。这是由于单细胞的局部影响被细胞群释放的配体的影响压倒。因此，增加细胞密度使得自分泌跨细胞梯度降低，减弱了自体趋化性的信号并且降低了CCR7介导的顺流迁移的趋势。进一步证实高细胞浓度导致较弱的自体趋化性刺激，以高细胞浓度接种的细胞群和具有阻断的CCR7的细胞群之间的定向迁移趋势类似。
竞争性信号。当阻断CCR7时，全部条件测试的定向迁移得分降低。流线迁移得分的降低对于5×104细胞/ml是显著的，平均定向迁移得分符合从正变为负，反映为迁移偏好从顺流转为逆流。由当CCR7被阻断时两种细胞密度和流速的负定向迁移得分所启发，猜想非CCR7依赖性刺激与CCR7依赖性自体趋化性竞争，并且当CCR7被抑制时刺激细胞逆流迁移。这两种刺激的相对强度控制全部细胞群迁移的定向偏好，并且是细胞密度、间隙流速和CCR7受体可用性的函数。
流线和定向迁移得分提供了对非CCR7依赖性刺激的性质的深刻理解。定向迁移得分随着间隙流速的增加单调降低(变得更负)，这种影响是不依赖CCR7活性和接种密度的。相比之下，低密度细胞的顺流迁移在0.3μm/秒流速时处于峰值，然后在3.0μm/秒时降低。这些数据表明非CCR7依赖性刺激的强度随着间隙流速的增加而增加。另外，当阻断CCR7时，定向迁移得分不依赖细胞接种密度，表明非CCR7依赖性刺激的强度是非细胞密度依赖性的。有趣的是，即使是在低细胞密度和低流速，依然存在逆流迁移刺激，表明刺激是不依赖于细胞-细胞相互作用的。
驱动细胞逆流的刺激是流速依赖但是非细胞密度依赖的。流速诱导的对细胞的应力是流速的函数，并且与自分泌或旁分泌信号刺激相比是不依赖细胞密度的。很早就知道剪切应力在内皮细胞(EC)迁移中具有重要作用(Branemark，P.I.1965.Bibl.Anat.7：9-28；Li，S.，Huang，N.F.和Hsu，S.2005.J.of Cellular Biochem.96：1110-1126；Boardman，K.C.和Swartz，M.A.2003.Circ.Res.92：801-808；Branemark，P.I.1965.Bibl.Anat.7：9-28；Moldovan，N.I等，2000.Circ.Res.87：378-384；Galbraith，C.G.等，1998.Cell.Motil.Cytoskeleton.40：317-330；Helmke，B.P.等，2000.Circ.Res.86：745-752；Wang，N.等，1993.Science.260：1124-1127)。Wang和Tarbell证明小间隙流速可对细胞产生大的剪切应力，这是因为组织中的胞间隙很小(Wang，D.M.和Tarbell，J.M.1995.J.Biomech.Eng.117：358-363)。使用Ganapathy公式，估计渗透率1.5×10-6m2的多孔介质中半径10μm的细胞上的总应力对于3.0μm/秒为0.1Pa，对于0.3μm/秒为0.01Pa(Ganapathy，R.1997.Zeitschrift fiir Angewandte Mathematik undMechanik.77：871-875)。Lawler等证明这种量级的剪切应力影响肿瘤细胞形态，并且发现在食管癌细胞中形成动态水泡，其与通过3D基质的迁移相关联，在剪切应力大于0.05Pa时，随着剪切速率的增加而增加(Lawler，K.等，2006.Am.J.Physiol.Cell Physiol.291：668-677)。
流过3D基质中的细胞导致了跨细胞剪切应力梯度(Pedersen，J.A.等，2010)。在间隙流下3D基质中的细胞：影响细胞外基质在剪切应力和阻力方向上对齐43：900-905)，这种应力导致细胞-基质相互作用中的不对称力，例如上游侧的张力和下游侧的压缩力。已经表明张力可激活整合素和驱动黏着斑聚集(Galbraith，C.G.等，2001.J.Cell Biology.159：695-705；Kong，F.等，2009.J.Cell Biology.185：1275-1284)和整合素介导的间隙流诱导通过3D基质中的成纤维细胞进行基质重塑(Ng，CP.等，2005.J.CellScience.118：4731-4740)。推测流动诱导的应力梯度导致整合素和FA活性的差异，具有更高活性逆流，细胞-基质链接承受张力。预期这个机理类似于Lo等检验的，它们证明跨细胞应变梯度指导细胞朝向增大的张力迁移，推测跨细胞应变梯度导致整合素上张力梯度造成的整合素活性偏差(Lo，C等，2000.Biophysical J.79：144-152)。
Fleury等开发了计算模型，并且表明间隙流使所分泌MMP的分布偏差，导致MMP积累在细胞下游(Fleury，ME等，2006.BiophysicalJournal.91：113-21)。下游MMP浓度的增加可导致基质退化的提高，进一步强化上游细胞-基质连接和促进逆流迁移。共聚焦反射数据表明随着细胞的迁移，细胞在后缘的基质中留下缺口，支持逆流迁移中涉及蛋白质水解的假设。认为定向蛋白质水解是包括FA结构、扩细胞应力分布和成形术分布的很多机理中的一种(Wang，S和Tarbell，JM.2000.Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.20：2220-2225；Cukierman，E.等Science.294：1708-1713)，其在2D和3D中差异显著并且导致我们的数据与Li等人数据之间的差异，他们证明剪切应力造成在细胞的下游边缘黏着斑激酶(FAK)极化募集，形成新黏着斑，并且随后在接种在2D基质上的EC的流动方向上迁移(Li，S，等，2002.Proc.Natl.Acad.Sci.99：3546-3551)。
充分说明，随着通过整合素和趋化因子受体活化的迁移途径在信号级联放大的早期集中，整合素在驱动逆流迁移中的作用变得困难(Li，S.，Huang，N.F.和Hsu，S.2005.J.of Cellular Biochem.96：1110-1126；Lawler，K.等，2006.Am.J.Physiol.Cell Physiol.291：668-677；Shyy，J.，Y.和Chien，S.2001.Circ.Res.91：769-775；Frame，M.C.2002.Biochimica etBiophysica Acta.1602：114-130)。FAK与活化的整合素共定位并且激活Src激酶(Thomas，J.W.等，1998.J.Biol.Chem.273：577-583；Eide，B.L.等，1995.Mol.Cell.Biol.15：2819-1817；Schaller，M.D.等，1994.Mol.Cell.Biol.14：1680-1688)，其调节对于肿瘤细胞迁移很重要的牵引力(Fincham，V.J.和Frame，M.C.1998.EMBO J.17：81-92；Sieg，D.J.等，1998.EMBOJ.17：5933-5947)。如本文所述，Src激酶的特异性抑制剂PP2(Li，S.等，1997.J.Biol.Chem.272：30455-30462；Jalali，S.等，1998.Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.18：227-234)，以及发现细胞随机迁移，没有偏好的逆流或顺流迁移。这些数据与用于下游迁移的CCR7介导的自体趋化性模型一致，因为Src已经涉及在了淋巴细胞中的CCR7通路中(Riol-Blanco，L.等，2005.J.Immunol.174：4070-4080；Bardi，G.，＝等，2003.FEBS Letters.542：79-83)。由于PP2同样阻断逆流迁移，Src涉及逆流迁移。另外，逆流迁移不依赖于细胞密度，所以通过趋化因子受体的旁分泌和自分泌信号很可能刺激Src活化。因此，PP2数据支持本文假设流动诱导应力梯度并且定向蛋白质水解导致整合素活化、FA形成和随后Src活化的偏差。
已经关于癌症治疗的药物运输对间隙流进行了广泛研究(Heldin，C等，2004.Nat.Rev.Cancer.4：806-13)，并且表明在体内间隙流压力(IFP)与宫颈癌患者存活率有关(Milosevic，M.等，2001.Cancer Research.61：6400-6405)，降低间隙流压力使得肿瘤细胞增殖降低(Hofmann，M.，等.2006.Neoplasia.8：89-95)。由于间隙流从肿瘤向周围淋巴流动，所以阻断CCR7和因此抑制流动方向的迁移将降低来自肿瘤的迁移并且可能降低转移形成的可能性。细胞密度和间隙流速随着离开细胞的距离的增加而降低，这两者在肿瘤边缘最高。本文的数据表明在离开肿瘤表面的临界距离存在“逃逸半径”。对于在径向距离小于逃逸半径的细胞，间隙流引导细胞逆流，保持细胞与肿瘤聚集，但是对于位于逃逸半径之外的细胞，间隙流引导细胞顺流向下排向淋巴管。尽管需要进一步建模和体内数据来验证其存在，逃逸半径可以是评估转移性疾病严重程度和确定合适治疗的临界参数。间隙流仅是体内影响肿瘤细胞迁移的许多生物化学和生物物理学刺激中的一种，但是对它的考虑对于理解和治疗转移性疾病以及开发组织工程构想至关紧要。
材料和方法
细胞和装置的制备
以之前描述(Vickerman，V等，2008.Lab on a Chip.8：1468-77；Kothapalli unpublished data)的方法使用软刻蚀制造微流体装置。将聚二甲基硅氧烷(PDMS，Ellsworth Adhesives，MA)以10：1的基础：固化剂混合，倾倒在硅母料上，在80℃孵育过夜。将PDMS从硅母料上切下，切边，并且在水中高压处理。然后将装置干燥高压蒸汽处理并且在烘箱中在80℃干燥过夜。然后将无菌PDMS通过等离子处理来表面活化2分钟(Harrick Plasma，Ithaca，NY)，用聚D-赖氨酸(PDL，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)涂覆，在37℃孵育过夜，用无菌水洗涤并且在80℃干燥过夜。
最初来源于胸腔积液的MDA-MB-231细胞获自American TypeCulture Collection(Manassas，VA)，并且培养在具有10％BS的10×DMEM标准培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。将I型胶原蛋白(BDBiosciences，Bedford，MA)溶液用10×DMEM缓冲，用NaOH滴定至pH8.9，并且恢复至在溶液中终浓度2mg/ml I型胶原蛋白。用0.05％胰蛋白酶/EDTA收取细胞并且在12000RPM离心5分钟。将细胞以期望浓度重悬在培养基中，然后将重悬细胞与I型胶原蛋白溶液混合以得到2.5×l05或0.5×l05细胞/(ml总溶液)。将凝胶-细胞溶液使用微量移液器手工添加到装置中，并且将装置用盖玻片密封。将密封装置放在37℃保温箱中30分钟，使得胶原凝胶在进入培养基之前聚合。
将细胞在37℃孵育过夜。为了施加压力梯度，将外部培养基储库连接到微流体芯片上。储库由改良Nalgene(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)瓶制成，使用聚乙烯(Compagnie de Saint-Gobain，Paris，France)导管将储库连接到装置上。以在整个凝胶内建立期望压力梯度的体积向每个储库加入培养基。使得装置在37℃达到热平衡，之后成像(见详细成像和数据定量的SI Appendix中的Supplementary Method)。
培养基补充有10ng/ml人重组EGF(PeproTech，Rocky Hill，NJ)，对于CCR7阻断，向培养基中以5μg/ml加入人CCR7 MAb(R&DSystems)。
实施例4使用三维微流体系统筛选抗转移性肺癌药物
基质金属蛋白酶(MMP)抑制很可能用作治疗肺癌的有效策略。选择性MMP抑制剂的缺乏和关于特定MMP的准确功能的有限知识依然限制了临床应用。尽管当前可得的MMP抑制剂的临床试验很令人失望，但是当前正在研究第三代MMP抑制剂。它们被特别设计用于仅仅阻断靶MMP，而不伤害抗靶标的那些。但是这绝对强调了对理解MMP的参与水平和活动水平的需要，同时需要开发特异性并且灵敏的定量测定以确定在肺癌转移过程中MMP的活性。
出于开发用于筛选抗转移性肺癌药物的3D微流体系统的目的，探究了长期对成熟微血管网络进行稳定化。多个研究组曾报道应用微流体装置研究癌症转移的重要步骤的焦点在于转移顺序过程中的个别步骤(Strell，C等，Mol Life ScL，64：3306-3316(2007)；Chaw，K.C.等，Lab Chip，7：1041-1047(2007)；Liu，T.等，50：4285-4291(2009))。但是，这些研究没有一个有能力研究转移顺序过程。本文描述的是在3D微流体平台中检验肺癌转移的顺序过程的方法。该方法对于筛选抗转移性肺癌药物和开发特异性MMP抑制剂是商业适用的。
设计包括三个不同的胶原凝胶支架(collagen gel scaffold，CGS)(CGS1(顶部)，CGS2(中部)和CGS3(底部))的沿着蛇形通道的灌注微流体装置，并且如前对于标准微流体方案的描述使用聚二甲基硅氧烷(PDMS，Sylgard 184，Dow Chemical，MI)和软刻蚀进行制造(V.Vickerman等，Lab Chip，2008，8，1468-1477；S.Chung，R.等，LabChip，2009，9，269-275)。见图19A-19D。装置的直径为约350mm，具有2个独立的流道。流道的入口直径为约500μm(w)×150μm(h)，3个CGS的直径为约4,100μm(l)×1,300μm(w)×150μm(h)。在这个特定装置中，有2个在出口合并的独立的流通道(图19A)，3个CGS通过凝胶端口填充有3种不同浓度额I型胶原凝胶(BD Biosciences，MA，USA)。每个CGS包含20个梯形机械柱(图19B)。
产生CGS内的人静脉血管细胞(HUVEC)的血管网络，并且在3DCGS中形成稳定成熟的血管网络。将肺癌细胞(A549)在具有静态条件的通道上共培养。然后可将抗转移性肺癌药应用于装置上，例如作为广谱MMP抑制剂的GM6001，作为抗转移性药物对照的针对MMP2和MMP9的特异性抑制剂，和作为阴性对照的针对MMP7和MMP 13的特异性抑制剂。可定性和定量研究转移的顺序过程(例如，迁移、内渗、外渗)，并且可不使用趋化因子来实施。
结果和讨论
3D CGS中微血管网络的成熟
HUVEC的稳定血管网络的形成依赖于接种密度、VEGF浓度和CGS中的胶原蛋白浓度。在3×106HUVEC/ml、40ng/ml VEGF和2.0-2.5mg/ml胶原蛋白收集3D CGS内HUVEC的稳定的血管网络。图20A-20B表示96小时后CGS2(2.5mg/ml)内的微血管网络。应用VEGF(40ng/ml)以血管形成的信号通路和应用GM6001(24小时后12.5μM)以控制血管稳定化的细胞-基质相互作用。21A-21B所示管腔样形式示出了将3D血管网络应用于抗转移性癌症药物的筛选。
肺癌细胞向CGS内的微血管网络内的迁移
通过在初始HUVEC接种与A549共培养96小时观察更优选的迁移和内渗步骤。图22A-22D表示微流体癌症转移系统的实例，表现出3DCGS(2.0mg/ml)内A549的迁移和内渗的顺序步骤。
应用GM6001作为肺癌细胞的MMP抑制剂。
在培养96小时后在18小时使用GM6001(12.5μM)未表现出A549肺癌细胞从通道向CGS2的迁移。相反，观察到来自无GM6001的同一共培养物的迁移(Figs.23A-23D)。
在不使用任何趋化因子的静态或暂时条件下观察到迁移的顺序步骤和A549的内渗。可使用这种微流体转移系统筛选抗转移性癌症药物以抑制迁移和/或内渗。通过时空控制的多种3D微环境可观察到外渗并且以得到更优选的定量数据。
本文引用的全部专利、公开的申请和参考文献的教导通过引用整体并入本文。
尽管通过参考本发明所列举的实施方案对本发明进行了具体示出和描述，但是本领域技术人员应理解可在本文中进行多种形式和细节中的改变而不脱离通过所附权利要求所涵盖的发明范围。

Claims (76)

1.微流体装置，其包含：
由光学透明材料构成的基底以及还包含：
i)一个或更多个流体通道；
ii)一个或更多个流体通道入口；
iii)一个或更多个流体通道出口；
iv)一个或更多个凝胶笼区；和
v)多个柱；
其中，
每个凝胶笼区的全部或部分侧邻一个或更多个流体通道的全部或部分，从而产生一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区；以及
每个凝胶笼区包含至少一排形成凝胶笼区的柱。
2.根据权利要求1所述的装置，其中每个柱为三角形、梯形或其组合。
3.根据权利要求2所述的装置，其中所述三角形为等腰三角形而所述梯形为等腰梯形。
4.根据权利要求1所述的方法，其中每个凝胶笼区形成凝胶通道，并且每个凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着每个凝胶通道的长度，一排沿着所述凝胶通道的一侧，另一排沿着所述凝胶通道相对侧，从而沿着每个凝胶通道的每个长度形成凝胶笼区。
5.根据权利要求4所述的装置，其中每个凝胶通道的全部或部分平行于所述一个或更多个流体通道的全部或部分。
6.根据权利要求1所述的装置，其中在所述凝胶笼区-流体通道界面处沿着每排柱的柱间距比在所述凝胶笼区内的柱间距小。
7.根据权利要求1所述的装置，其中所述光学透明材料是聚合物、塑料或玻璃。
8.根据权利要求7所述的装置，其中所述聚合物是聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、SU-8和环烯烃共聚物(COC)。
9.根据权利要求1所述的装置，其中所述一个或更多个凝胶笼区包含生物学相关凝胶。
10.根据权利要求10所述的装置，其中所述生物学相关凝胶是胶原蛋白、MatrigelTM、纤连蛋白或透明质酸。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述凝胶还包含细胞、组织或其组合。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述细胞是癌细胞、神经元、内皮细胞、平滑肌细胞、干细胞、上皮细胞或其组合。
13.根据权利要求9所述的装置，其中每个凝胶笼区的长度为约10微米至约100,000微米。
14.根据权利要求1所述的装置，其中所述一个或更多个流体通道包含细胞物质。
15.根据权利要求14所述的装置，其中所述细胞物质是细胞、细胞培养基、组织、生长因子、药物或其组合。
16.根据权利要求15所述的装置，其中所述细胞是癌细胞、神经元、内皮细胞、平滑肌细胞、干细胞、上皮细胞或其组合。
17.根据权利要求15所述的装置，其中所述组织是来源于个体的组织活检样品。
18.根据权利要求15所述的装置，其中所述药物是抗转移药、抗血管生成药、促血管生成药、化学吸引剂、化学排斥剂或其组合。
19.根据权利要求1所述的装置，其中平行的柱排中每个柱的间距为约5微米至约300微米。
20.根据权利要求1所述的装置，其中每个柱为约50至约500微米宽。
21.根据权利要求1所述的装置，其中每个柱为约0.01mm至约1mm高。
22.根据权利要求1所述的装置，其中每个柱为约0.1mm宽、约0.1mm长和约0.25mm高，平行的柱排中每个柱间距离为约0.2mm。
23.根据权利要求1所述的装置，其中所述凝胶笼区-流体通道界面区的长度为约100微米至约100,000微米。
24.根据权利要求1所述的装置，其中所述凝胶笼区的宽度为约10微米至约5000微米。
25.根据权利要求1所述的装置，其中所述两排平行的柱的间距为约5微米至约5000微米。
26.根据权利要求1所述的装置，其中所述一个或更多个流体通道与所述一个或更多个凝胶笼区的长度为约10微米至约10mm。
27.根据权利要求1所述的装置，其中所述一个或更多个流体通道与所述一个或更多个凝胶笼区的高度相似。
28.根据权利要求27所述的装置，其中所述一个或更多个流体通道与所述一个或更多个凝胶笼区的高度为约10微米至约1000微米。
29.根据权利要求1所述的装置，其中所述一个或更多个流体通道与所述一个或更多个凝胶笼区的高度不同。
30.根据权利要求29所述的装置，其中所述一个或更多个流体通道的高度为约200μm，所述一个或更多个凝胶通道的高度为约400μm。
31.根据权利要求1所述的装置，其中所述一个或更多个流体通道的尺寸为约0.2mm高×4mm宽×20mm长。
32.根据权利要求1所述的装置，其尺寸为约7cm长×3cm宽×1cm高。
33.根据权利要求1所述的装置，其还包含一个或更多个压力调节器、流动调节器、储库、梯度生成器、温度调节器或其组合。
34.根据权利要求1所述的微流体装置，其包含：
i)第一流体通道；
ii)第二流体通道；
iii)一个或更多个流体入口；
iv)一个或更多个流体出口；
v)凝胶笼区，其形成凝胶通道；和
vi)多个柱，
其中，所述凝胶通道的一侧的全部或部分侧邻并且平行于所述第一流体通道的全部或部分，从而产生第一凝胶通道-流体通道界面区；
所述凝胶通道的另一侧的全部或部分侧邻并且平行于第二流体通道的全部或部分，从而产生第二凝胶通道-流体通道界面区；
所述凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着所述凝胶通道的长度，一排沿着所述凝胶通道在所述第一凝胶通道-流体通道界面的一侧，另一排沿着所述凝胶通道在所述第二凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而沿着所述凝胶通道的长度形成凝胶笼区；
每个柱为三角形、梯形或其组合。
35.根据权利要求34所述的装置，其中所述第一流体通道与所述第二流体通道接触。
36.高通量装置，其包含以串联、平行或其组合方式连接在一起的至少两个根据权利要求1所述的装置。
37.根据权利要求36所述的高通量装置，其中所述至少两个装置在一个或更多个微芯片上连接在一起。
38.根据权利要求1所述的装置，其包含至少两个凝胶笼区，其中所述凝胶笼区串联排布在所述装置中。
39.根据权利要求34所述的装置，其还包含：
(vii)第二凝胶笼区，其形成第二凝胶通道；和
(viii)第三凝胶笼区，其形成第三凝胶通道，
其中，
所述第二凝胶通道的一侧的全部或部分侧邻并且平行于所述第一流体通道的全部或部分，从而产生第三凝胶通道-流体通道界面区；
所述第二凝胶通道的另一侧的全部或部分侧邻并且平行于所述第二流体通道的全部或部分，从而产生第四凝胶通道-流体通道界面区；
所述第三凝胶通道的一侧的全部或部分侧邻并且平行于所述第一流体通道的全部或部分，从而产生第五凝胶通道-流体通道界面区；
所述第三凝胶通道的另一侧的全部或部分侧邻并且平行于所述第二流体通道的全部或部分，从而产生第六凝胶通道-流体通道界面区；
所述第二凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着所述第二凝胶通道的长度，一排沿着所述第二凝胶通道在所述第三凝胶通道-流体通道界面的一侧，另一排沿着所述第二凝胶通道在所述第四凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而沿着所述第二凝胶通道的长度形成凝胶笼区；
所述第三凝胶通道包含两排平行的柱，其中每排柱都沿着所述第三凝胶通道的长度，一排沿着所述第三凝胶通道在第五凝胶通道-流体通道界面的一侧，另一排沿着所述第三凝胶通道在第六凝胶通道-流体通道界面的另一侧，从而沿着所述第三凝胶通道的长度形成凝胶笼区；
所述第一凝胶笼区、第二凝胶笼区和第三凝胶笼区在所述装置中彼此串联排布；并且
每个柱为三角形、梯形或其组合。
40.根据权利要求1所述的装置，其包含至少两个凝胶笼区，其中所述凝胶笼区平行排布在所述装置中。
41.根据权利要求40所述的装置，其包含：
i)至少三个流体通道；
ii)至少一个流体通道入口；
iii)至少一个流体通道出口；和
iv)至少两个凝胶笼区，
其中所述凝胶笼区彼此平行排布在所述装置中。
42.根据权利要求41所述的装置，其包含至少三个流体通道入口和一个流体通道出口。
43.根据权利要求42所述的装置，其还包含位于所述至少一个流体通道入口与所述流体通道出口之间的储库。
44.根据权利要求1所述的装置，其还包含一个或更多个气体通道，其中所述一个或更多个气体通道的全部或部分侧邻所述一个或更多个流体通道、所述一个或更多个凝胶笼区或其组合的至少一侧。
45.根据权利要求1所述的装置，其还包含膜，所述膜不能够透过细胞但是可透过由细胞分泌的分子，其中所述膜的一侧与所述一个或更多个流体通道、所述一个或更多个凝胶通道或其组合接触。
46.根据权利要求45所述的装置，其还包含捕捉剂，所述捕捉剂与由细胞分泌的一种或多种分子特异性结合，其中所述捕捉剂在所述膜的对侧并且无法穿过所述膜。
47.根据权利要求46所述的装置，其中所述捕获剂可与所述装置分开。
48.根据权利要求47所述的装置，其中所述捕捉剂在载玻片上。
49.根据权利要求48所述的装置，其中所述捕捉剂是抗体，其与所述一个或更多个流体通道、所述一个或更多个凝胶通道或其组合中由细胞所分泌的分子特异性结合。
50.根据权利要求45所述的装置，其中所述膜由聚氨酯构成。
51.根据权利要求1所述的微流体装置，其中，
每个流体通道的一部分与所述一个或更多个凝胶笼区的一部分接触，而每个流体通道的其余部分延伸离开所述一个或更多个凝胶笼区。
52.根据权利要求51所述的装置，其包含三个或更多个流体通道和一个凝胶笼区。
53.根据权利要求52所述的装置，其中所述一个或更多个流体通道为“C”、“V”、“U”形或其组合的形状，其中每个流体通道的中部区域与所述凝胶笼区接触，而每个流体通道的每一端延伸离开所述凝胶笼区。
54.根据权利要求53所述的装置，其中所述一个或更多个流体通道径向地延伸离开所述凝胶笼区。
55.根据权利要求54所述的装置，其中所述凝胶笼区包含生物学相关凝胶。
56.根据权利要求55所述的装置，其中所述凝胶笼区还包含神经元、神经胶质细胞、星形细胞、内皮细胞、干细胞或其组合。
57.根据权利要求52所述的装置，其中所述一个或更多个流体通道包含细胞培养基、神经生长因子或其组合。
58.根据权利要求1所述的微流体装置，其包含：
(i)第一流体通道；
(ii)第二流体通道；
(iii)一个或更多个流体入口；
(iv)一个或更多个流体出口；
(v)椭圆形凝胶笼区；和
(vi)多个柱，
其中，
所述凝胶笼区的一侧侧邻所述第一流体通道从而产生第一凝胶笼区-流体通道界面，所述凝胶笼区另一侧侧邻所述第二流体通道从而产生第二凝胶笼区-流体通道界面；以及
所述凝胶笼区包含位于所述凝胶笼区中央的两排平行的柱，从而产生中央凝胶室，一排柱沿着所述第一凝胶笼区-流体通道界面排布成半圆，从而产生第一凝胶室，其一侧侧邻中央凝胶室的一侧；并且一排柱在第二凝胶笼区-流体通道界面排布成半圆，从而产生第二凝胶室，其侧邻中央凝胶室的另一侧。
59.根据权利要求58所述的装置，其中所述中央凝胶笼区、所述第一凝胶室、所述第二凝胶室或其组合还包含组织。
60.制造根据权利要求1所述的装置的方法，其包括：
a)在光学透明材料的第一部分中蚀刻一个或更多个流体通道和一个或更多个凝胶笼区以及产生一个或更多个入口以允许流通所述一个或更多个流体通道和所述一个或更多个凝胶笼区，从而产生所述装置的顶面和壁；以及
b)使所述光学透明材料的第一部分与形成所述装置之底面的所述光学透明材料的第二部分结合。
61.根据权利要求60所述的方法，其还包括通过所述流体通道、所述凝胶笼区或其组合引入涂覆剂。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述涂覆剂是聚D-赖氨酸、聚鸟氨酸、核纤层蛋白、胶原蛋白或其组合。
63.根据权利要求60所述的方法，其还包括使所述装置的表面与赋予表面疏水性的试剂接触。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述试剂是等离子体。
65.根据权利要求60所述的方法，其还包括向所述一个或更多个凝胶笼区引入凝胶，从而在所述装置内产生一个或更多个凝胶区。
66.一种鉴别试剂是血管生成性还是抗血管生成性的方法，其包括：
a)将待评估试剂引入到根据权利要求1所述装置的一个或更多个流体通道中，其中所述装置的一个或更多个流体通道包含内皮细胞，所述装置的一个或更多个凝胶笼区包含在所述装置的凝胶笼区内形成凝胶区的凝胶；和
b)将所述装置保持在促使内皮细胞在所述一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区粘附到所述凝胶区的条件下；和
c)确定与对照相比在所述试剂的存在下进入所述凝胶区的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物的产生被促进还是被抑制；
其中，如果与对照相比在所述试剂存在下进入所述凝胶区的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物的产生被促进，那么所述试剂是血管生成性的，而如果与对照相比在所述试剂存在下进入所述凝胶的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物的产生被抑制，那么所述试剂是抗血管生成性的。
67.根据权利要求66所述的方法，其中通过提高包含有内皮细胞的所述流体通道的流体静压来促使内皮细胞在所述凝胶笼区-流体通道界面区粘附到所述凝胶区。
68.根据权利要求66所述的方法，其中通过使用成像技术来确定在所述试剂存在下内皮细胞是否产生进入所述凝胶区的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物。
69.鉴别试剂是否可用于癌转移的方法，其包括：
a)将待评估试剂引入到根据权利要求1所述装置的一个或更多个流体通道中，其中所述装置的一个或更多个流体通道包含内皮细胞，所述装置的一个或更多个流体或凝胶笼区包含癌细胞，并且所述装置的一个或更多个笼区包含在所述装置的凝胶笼区形成凝胶区的凝胶；和
b)将所述装置保持在促使内皮细胞在一个或更多个凝胶笼区-流体通道界面区粘附到所述凝胶区的条件下，从而形成内皮细胞层；和
c)确定在所述试剂的存在下癌细胞是否在凝胶中分散、向内皮细胞层迁移并穿过内皮细胞层或其组合；其中，如果癌细胞未在凝胶中分散、向内皮细胞层迁移并穿过内皮细胞层或其组合，那么表明所述试剂可用于抑制癌转移。
70.根据权利要求69所述的方法，其中在所述试剂的存在下癌细胞是否在凝胶中分散、向内皮细胞层迁移并穿过内皮细胞层或其组合是与合适的对照进行比较。
71.根据权利要求69所述的方法，其中所述癌细胞是来源于癌症患者的癌活检样品的解离细胞。
72.在体外生长血管的方法，其包括：
a)将内皮细胞引入到所述装置的一个或更多个流体通道中，其中所述装置的一个或更多个凝胶笼区还包含在其中形成凝胶笼的凝胶；和
b)将所述装置保持在促使内皮细胞在所述凝胶笼区-流体通道界面区粘附到凝胶笼并且产生进入所述凝胶笼的内衬有内皮细胞的圆锥形突出物的条件下，
从而在体外生长血管。
73.根据权利要求72所述的方法，其中引入内皮细胞的所述一个或更多个流体通道对于所述装置的所述一个或更多个凝胶笼区来说位于中央。
74.鉴别试剂是神经元细胞的化学吸引剂还是化学排斥剂的方法，其包括：
a)将待评估试剂和神经元细胞引入到根据权利要求1所述装置的一个或更多个流体通道、根据权利要求1所述装置的一个或更多个凝胶笼区或其组合中；其中所述装置的一个或更多个笼区包含在所述装置的凝胶笼区内形成凝胶区的凝胶；
b)将所述装置保持在神经元细胞在所述凝胶笼区内增殖的条件下；和
c)确定神经元细胞是朝向所述试剂还是远离所述试剂增殖；
其中，如果神经元细胞朝向所述试剂增殖，那么所述试剂是神经元细胞的化学吸引剂，而如果神经元细胞远离所述试剂增殖，那么所述试剂是神经元细胞的化学排斥剂。
75.鉴别试剂是否能用于治疗癌症的方法，其包括：
a)将待评估试剂引入到根据权利要求1所述装置的一个或更多个流体通道中，其中所述装置的一个或更多个凝胶笼区包含形成一个或更多个凝胶笼的凝胶，并且所述凝胶笼还包含癌组织的活检样品；和
b)确定在所述试剂的存在下所述癌组织的运动性是否被抑制；
其中，如果所述癌组织的运动性被抑制，那么所述试剂能用于治疗癌症。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述活检样品来源于癌症患者个体的癌组织，所述试剂可用于治疗所述癌症患者的所述癌组织。
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