CN110551681A - 模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片及其制备方法和用途，属于微流控芯片技术领域。模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片，由芯片表层和基底键合而成，所述芯片表层包括两个主管道和连接主管道的连接管道，每个主管道一端连接入口、另一端连接出口；一个主管道用于形成三维血管管腔，三维血管管腔由水凝胶多次固化而成；另一个主管道用作样品腔室，一个主管道内的物质可以通过连接管道扩散至另一个主管道内。本发明具有以下优点：该芯片实现了子宫内膜细胞与胚胎的共培养；实现了着床过程中血管生成的体外观察；制备和操作方法简单，有利于实现大规模、高通量的药物筛选。

Description

模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于微流控芯片技术领域，涉及一种用于模拟胚胎着床过程中血管生成的双管道微流控芯片及其制备方法，还涉及应用微流控芯片开展胚胎着床过程中血管生成观察、机理探索与相关药物筛选的方法。
背景技术
目前，全世界有5000-8000万不孕的夫妇，平均每六对育龄夫妇便有一对为生殖问题所困扰。生殖中一个关键的时期就是着床期，这是胚胎可以在子宫着床的唯一的时期，这一时期之前或之后受精卵不能在母体着床，导致受孕失败。在着床过程中，血管生成起着重要的作用。有研究证明，充足的血管生成可以提高子宫的容受性，为胚胎的植入创造一个合适的微环境，是着床成功的前提。胚胎着床前后子宫内膜的血管生成对生殖过程有至关重要的影响，血管生成的数目直接决定胚胎着床的成功率。探索胚胎着床前血管生成的原因与分子机理，可以用于胚胎着床过程的调节。一方面，通过上调血管生成的数目，可以提高体外受精-胚胎移植的成功率；另一方面，通过抑制血管生成也可以实现更紧急的避孕，降低人工流产的数目。目前，对胚胎着床过程中血管生成的探索少之又少，是由于体内胚胎着床过程难以观察，又没有可以很好地模拟着床前血管生成环境的体外模型。人们迫切需要适宜的技术手段，开展胚胎着床过程中血管生成观察、机理探索与相关药物筛选等研究工作，从而实现胚胎着床过程的调节。
微流控芯片是生物芯片的一大分支，主要指通过微加工的方式，在芯片上构建出微米，甚至纳米级别的通道，进而实现液体的控制或样品的处理。目前，微流控芯片主要应用方向为基因分析、蛋白质分析、细胞生物学分析。血管生成的实验模型可以在一定程度上模拟体内的血管生成过程，为血管生成研究提供了强有力的工具。微流控芯片为体外三维血管模型的构建提供了一个新的平台，在微流控芯片上可以形成拥有一定功能的三维血管结构，模拟血管的部分功能，如通过血管出芽观察血管对不同细胞、不同因子的响应。
公开号为CN103215185A的中国发明专利，公开了一种能同时施加力学刺激和化学刺激的微流控装置，用于体外模拟动脉粥样硬化，其包括一个微流控芯片、细胞培养驱动系统和负压产生器，所述细胞培养驱动系统与微流控芯片连接以驱动微流控芯片的微流通道内的液体流动；所述负压产生器与微流控芯片相连以产生负压，该装置可以模拟血管中物理刺激和化学刺激对血管内皮细胞的影响，从而对动脉粥样硬化发生发展进行研究。
公开号为CN106754354A的中国发明专利，公开了一种主动脉夹层瘤血流剪切力诱发血管细胞释放炎症因子影响肺上皮细胞功能的微流控芯片装置。该微流控芯片装置包括贮液槽、减振器、蠕动泵、气压泵控制系统、血管内皮细胞VECs/平滑肌细胞VSMCs联合培养腔、弹性腔A、弹性腔B、阻力阀A、阻力阀B、肺上皮细胞PECs培养腔、硅胶管道和三通；两个培养腔及其外围单元，形成两个相对独立的循环系统，两个循环系统通过共用储液槽实现VECs/VSMCs和PECs的信息通讯。
公开号为CN102728422A的中国发明专利，公开了一种用于量子点细胞毒性检测的三维培养微流控芯片装置，由聚二甲基硅氧烷芯片和玻璃基底键合而成。该芯片分为两部分：主通道和细胞培养腔室。主通道用于模拟血管，细胞培养腔室与主通道有连通但距离不同，用于模拟血管周围不同距离的邻近组织。主通道与细胞培养腔室的高度不同，以使得细胞和三维培养基质的混合物注入细胞培养腔室时不会泄漏到主通道中。
公开号为CN109517737A的中国发明专利，公开了一种微流控芯片和基于该芯片的肿瘤转移模型及模型构建方法和应用，所述微流控芯片包括三层芯片层、两层多孔膜和两层固定板；每层芯片层均设有1个0.1-10mm直径的细胞培养室和宽0.1-10mm、高10-500μm的微流体通道；所述多孔膜的孔径均为0.1-20μm，可用于细胞贴壁和相互交流。肿瘤转移模型的建立方法：采用上述微流控芯片，1)将胶原蛋白灌注入芯片内，包被多孔膜；2)血管内皮细胞灌注入芯片第二层，构建血管腔模型；3)肿瘤细胞灌注入芯片第一层。
公开号为CN103952300A的中国发明专利，公开了一种微流控芯片及细胞趋化运动研究方法。该微流控芯片由玻璃基片、第一膜片和第二膜片组成；第一膜片上有培养单元；第二膜片上有微通道；在第一膜片的培养单元和第二膜片的微通道中间有一层多孔膜；第一膜片上的培养单元个数第二膜片上的微通道数相同；第二膜片上的微通道分别位于第一膜片的培养单元上方。该微流控芯片可以用于研究微通道内的细胞流经多个培养单元过程中发生选择性趋化运动的情况。
公开号为CN104630059A的中国发明专利，公开了一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片及方法。该微流控芯片，用于建立三种细胞共培养模型，通过利用微流控芯片内部的贯通微流道让不同的细胞在不同的区域，其中两种细胞之间是可以通过贯通的微流道进行细胞通讯。
公开号为CN107362844A的中国发明专利，公开了一种基于纳米给药系统筛选的三维实体瘤模型的微流控芯片及其应用。该芯片由键合在一起的基片和盖片组成。盖片的结构为相互连接的三个平行微通道，包括药物灌注和单层血管形成的微通道(1)，细胞外基质的连接通道(2)，和三维肿瘤多细胞球体形成的有许多“U”型槽结构(3)的微通道(4)；基片有一个利于细胞捕获的平行通道(5)。
然而，这些研究大多集中于癌症方向，对胚胎着床过程中血管生成的研究仍十分缺乏。目前的三维血管模型主要针对的是血管的构建以及生长因子、细胞分泌因子对血管生成的影响，以及肿瘤血管生成过程中药物的筛选，尚未建立胚胎着床过程中的血管生成模型，缺乏对胚胎着床过程中的血管生成研究。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片，构建一款体外三维血管的微系统。通过本发明提供的微流控芯片观察在体内的胚胎移植过程中受精卵、子宫内膜细胞以及受精卵子宫内膜细胞共培养等各种因素对血管生成的影响，为进一步探究胚胎植入过程中血管生成的机理打下基础，为体外胚胎培养与发育，体内着床问题的解决奠定基础。另外，通过体外模拟血管生成，进行血管生成相关疾病药物的筛选，是进行疾病治疗的一个重要思路。胚胎着床过程中血管生成的调节包括两个方面：通过上调血管生成的数目，可以提高体外受精-胚胎移植的成功率；通过抑制血管生成也可以实现更紧急的避孕，降低人工流产的数目。因此，本发明提供的微流控芯片，还可以用于筛选提高体外受精-胚胎移植成功率和紧急避孕的两大类药物。本发明的这一发明目的通过以下技术方案实现。
模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片，由芯片表层和基底键合而成，其特征在于，所述芯片表层包括两个主管道和连接主管道的连接管道，每个主管道一端连接入口、另一端连接出口；一个主管道用于形成三维血管管腔，三维血管管腔由水凝胶多次固化而成；另一个主管道用作样品腔室，一个主管道内的物质可以通过连接管道扩散至另一个主管道内。本发明提供的双管道设计的微流控芯片，包括两个主管道和中央的连接管道，其中一个主管道是为形成三维血管管腔而设计，另一个主管道用作样品腔，加入样品以观察其对三维血管的影响，中央的连接管道可以使两主管道保持相对的独立，并实现两主管道间的物质交换。
进一步地，双管道芯片设计的具体尺寸如下：主管道的长度为5～10mm，其中入口与出口均距主管道0.2～1mm，主管道的宽度和高度均为200～1000μm。中央连接管道利用方形的微柱分割成了多个较小的连接管道，每个连接管道的长度和宽度均为200～1000μm，为了防止两主管道间的连通，中央连接管道的高度低于主管道，仅为100～300μm。方形微柱可以对连接管道的水凝胶起到支撑作用，多个体积较小的连接管道，减小了连接管道中水凝胶的体积，使水凝胶更易于固化。为了在中央连接管道处形成固化的水凝胶，需要保持两主管道的独立，但水凝胶结构十分容易被破坏，尤其是在两主管处滴加培养基时，两侧管道出入口的压力差难以保持一致，导致两侧主管道内液体流速不一致，对中央连接管道的冲击力不一致，是造成中央管道水凝胶破坏的主要因素。通过分析这一原因及构建过程，将出入口位置距主管道的距离设为0.5～1mm，一方面，可以减少在入口处加样时两主管道入口处液体混合的情况，同时，在连接管道前有一段较长的主管道，可以减小入口处的液体对中央连接管道的冲击。
进一步地，所述三维血管管腔长度为5～10mm，直径为250-350μm之间。
进一步地，所述芯片表层材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，所述基底材质为玻璃。
本发明的另一目的是提供一种模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片的制备方法，具体技术方案如下。
一种模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据微流控芯片要求设计二维的芯片模板；
(2)在光刻胶基底上涂敷光刻胶，按照步骤(1)设计的芯片模板曝光显影，利用光刻的方法得到芯片模具；
(3)将PDMS预聚物与其固化剂按比例混合，浇注在模具上，使其固化；
(4)将固化的PDMS层剥离，将芯片区域切割下来，并用打孔器在入口和出口处打孔得到PDMS芯片表层，将PDMS芯片表层和玻璃基底仔细清洗后吹干，然后用氧等离子体处理将PDMS芯片和玻璃键合，形成微流控芯片；
(5)将键合完成的微流控芯片灭菌处理；
(6)配制水凝胶；
(7)通过水凝胶多次固化的方式在一个主管道上形成三维血管管腔。
进一步地，步骤(6)所述配制水凝胶，具体是将5×PBS、H2O、浓度为1～5mol/L的NaOH和胶原蛋白I按照比例混合制成水凝胶，浓度为5～10mg/mL，在冰上放置5～20min使其混合均匀，用HCl和NaOH将pH值调整到7.0-7.5。
进一步地，步骤(7)的具体操作如下：1)在管道内注满FN(纤连蛋白)溶液，在细胞培养箱放置20～40min，纤连蛋白的主要作用是利于水凝胶的附着；2)将FN吸出，在中央管道处充满水凝胶，在细胞培养箱孵育20～40min，使中央管道处的水凝胶固化，中央填充的固化水凝胶结构可以保证两主管道间的物质交换而又避免了两主管道间的连通。3)将芯片取出，在两主管道加入水凝胶，而后迅速将培养液滴加在入口处，利用被动进样的方式，使其冲开凝胶形成管道。将形成管道后的芯片置于细胞培养箱孵育20～40min，管道固化后即形成了三维的空腔结构。4)消化HUVEC细胞，加入ECM重悬，调整细胞浓度至1×107～5×107个/mL。将2.5～5μL的细胞悬浮液滴加在管道入口处，通过被动进样的方式使细胞进入血管管腔中，正置芯片，置于培养箱中孵育20～40min，使细胞在三维管道的下半部分贴壁。5)再次加入细胞，将芯片反转180°，孵育20～40min，采用这种旋转培养的方式，使细胞在管道的上半部分贴壁，形成一个三维的血管管腔结构。6)芯片正置培养36h～48h，每8-10h换一次液，使HUVEC形成良好的细胞连接。
本发明的另一目的是提供一种模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片在胚胎着床血管生成研究中的应用，具体技术方案如下。
(1)在微流控芯片内制备三维血管管腔，并进行实验动物(例如小鼠)取卵与体外培养。
(2)在样品腔室，设置阳性对照组、阴性对照组、胚胎组、子宫内膜组以及共培养组，观察对血管生成影响。在阳性对照组，将50ng/mL的VEGF加入样品腔室，在阴性对照组的样品腔室加入等量的受精卵培养基CZB，培养24h观察对血管生成的作用。在胚胎组，将发育到囊胚期的胚胎放入样品腔室，每个样品腔室放置10个胚胎，培养24h。为防止管道内的液体蒸干，其中每8-10h换一次液。在子宫内膜组，首先，将Ishikawa的培养基换成CZB培养基培养一段时间，并对细胞进行传代，直至观察到Ishikawa在CZB培养基中可以正常增殖。这一操作的主要目的是保证培养基的条件相同，排除掉样本以外其他因素对实验结果的影响。下一步，将Ishikawa自培养皿上消化下来，离心，加入CZB重悬为2×107个/mL的细胞悬液。然后，在样品管道中充满CZB溶液，将Ishikawa细胞悬液加入到样品腔室，正置培养30min。30min后，再次将Ishikawa细胞悬液加入到样品管腔，倒置培养30min，使其形成管腔结构，观察其对血管出芽的影响。在共培养组，首先形成Ishikawa细胞管腔，然后，在每个样品腔中加入10个发育至囊胚期的小鼠胚胎，实现小鼠胚胎与Ishikawa的共培养。
(3)统计分析各组血管出芽结果。
本发明的另一目的是提供一种模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片在药物筛选中的应用，具体技术方案如下。
(1)在微流控芯片内制备三维血管管腔；
(2)将待筛选药物加入样品腔室，与血管管腔共培养，观察药物对血管出芽的影响；
(3)统计分析药物影响后的血管出芽结果。用CCD采集出芽图像，通过计算出芽数目，利用Image J测量出芽长度和出芽面积来评价药物对血管出芽的影响。
进一步地，所述药物为提高体外受精-胚胎移植成功率的药物或者紧急避孕的药物。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及突出性的技术效果：第一、该芯片实现了子宫内膜细胞与胚胎的共培养，并在同一张芯片上完成了胚胎、子宫内膜与血管生成共培养的系统；第二、内皮细胞自主生长形成三维管道，并具有体内血管的结构和功能，通过样本的扩散控制血管生成，可以模拟体内生理过程中的血管生成，通过胚胎着床中血管生成的模拟，实现了着床中血管生成的体外观察；第三，该芯片利用简单的流体控制方法制备，操作简单，有利于实现制备流程的自动化，实现大规模、高通量的药物筛选。
附图说明
图1是本发明芯片的二维设计图。
图2是本发明用于胚胎着床中血管生成观察的实验装置示意图。
附图标记：1-入口，2-主管道，3-连接管道，4-出口，5-血管管腔，6-水凝胶层，7-PDMS芯片表层，8-子宫内膜细胞管腔，9-胚胎，10-玻璃基底。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
本发明提供的一种模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片，如图1所示，由芯片表层和基底键合而成，所述芯片表层包括两个主管道2和连接主管道的连接管道3，每个主管道一端连接入口1、另一端连接出口4；一个主管道用于形成三维血管管腔，三维血管管腔由水凝胶多次固化而成；另一个主管道用作样品腔室，一个主管道内的物质可以通过连接管道扩散至另一个主管道内。所述主管道的长度为7mm，主管道的宽度和高度均为500μm；所述连接管道位于主管道中央，连接管道有三个，连接管道的长度和宽度均为500μm，高度为100μm；入口和出口与主管道的连接距离为0.5mm。所述三维血管管腔长度为7mm，直径为250-350μm之间。所述芯片表层材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，所述基底材质为玻璃。
本发明提供了一种模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片的制备方法，按如下步骤进行：
(1)根据所需功能，进行芯片设计；
(2)根据芯片设计图，利用光刻的方法在SU-8基底上涂敷一层光刻胶，曝光显影后得到设计的模版，经过双次甩胶和光刻，得到双管道的模具；
(3)利用微铸模工艺，将PDMS预聚物与其固化剂按10:1的比例混合，浇注在模具上，80℃烘箱放置1.5h，使其固化；
(4)小心地将固化的PDMS(聚二甲基硅氧烷)层剥离，仔细地将芯片区域切割下来，并用打孔器在出入口处进行打孔，将处理过的PDMS芯片和玻璃仔细清洗，用氮气吹干，然后用氧等离子体处理将PDMS芯片和玻璃进行键合，键合条件为真空表示数40Pa，时间40s，形成微流控芯片；
(5)将键合完成的芯片高温水浴灭菌2h。
(6)将100μL的5×PBS、94μL的H2O、4.5μL浓度为2mol/L的NaOH和301.5μL的胶原蛋白I混合制成500μL水凝胶，浓度为5mg/mL，在冰上放置10min使其混合均匀，用HCl和NaOH将pH值调整到7.0-7.5；
(7)使用水凝胶多次固化的方式，在管道上形成三维血管管腔，具体操作如下：1)在管道内注满FN(纤连蛋白)溶液，在细胞培养箱放置20min，纤连蛋白的主要作用是利于水凝胶的附着；2)将FN吸出，在中央管道处充满水凝胶，在细胞培养箱孵育30min，使中央管道处的水凝胶固化，中央填充的固化水凝胶结构可以保证两主管道间的物质交换而又避免了两主管道间的连通。3)将芯片取出，在两主管道加入水凝胶，而后迅速将培养液滴加在入口处，利用被动进样的方式，使其冲开凝胶形成管道。将形成管道后的芯片置于细胞培养箱孵育30min，管道固化后即形成了三维的空腔结构。4)消化HUVEC细胞，加入ECM重悬，调整细胞浓度至2×107个/mL。将2.5μL的细胞悬浮液滴加在管道入口处，通过被动进样的方式使细胞进入血管管腔中，正置芯片，置于培养箱中孵育30min，使细胞在三维管道的下半部分贴壁。5)再次加入细胞，将芯片反转180°，孵育30min，采用这种旋转培养的方式，使细胞在管道的上半部分贴壁，形成一个三维的血管管腔结构。6)芯片正置培养48h，每8-10h换一次液，使HUVEC形成良好的细胞连接。
本发明提供了一种模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片在胚胎着床血管生成研究中的应用：
(1)制备血管管道，并进行小鼠取卵与体外培养；
(2)在样品腔室，设置阳性对照组，阴性对照组，胚胎组，子宫内膜组以及共培养组，观察对血管生成影响。在阳性对照组，将50ng/mL的VEGF加入样品腔室，在阴性对照组的样品腔室加入等量的受精卵培养基CZB，培养24h观察对血管生成的作用。在胚胎组，将发育到囊胚期的胚胎放入样品腔室，每个样品腔室放置10个胚胎，培养24h。为防止管道内的液体蒸干，其中每8-10h换一次液。在子宫内膜组，首先，将Ishikawa的培养基换成CZB培养基培养一段时间，并对细胞进行传代，直至观察到Ishikawa在CZB培养基中可以正常增殖。这一操作的主要目的是保证培养基的条件相同，排除掉样本以外其他因素对实验结果的影响。下一步，将Ishikawa自培养皿上消化下来，离心，加入CZB重悬为2×107个/mL的细胞悬液。然后，在样品管道中充满CZB溶液，将Ishikawa细胞悬液加入到样品腔室，正置培养30min。30min后，再次将Ishikawa细胞悬液加入到样品管腔，倒置培养30min，使其形成管腔结构，观察其对血管出芽的影响。在共培养组，首先形成Ishikawa细胞管腔，然后，在每个样品腔中加入10个发育至囊胚期的小鼠胚胎，实现小鼠胚胎与Ishikawa的共培养。
(3)统计各组实验对血管出芽的作用。
用于胚胎着床中血管生成观察的实验装置如图2所示，在玻璃基底10上键合PDMS芯片表层7，在两个主管道两端分别设有入口1和出口4。在一个主管道形成血管管腔5，另一个主管道形成子宫内膜细胞管腔8，两个主管道通过连接管道3连接，在主管道和连接管道内有水凝胶层6，在子宫内膜细胞管腔8内放入胚胎9。
本发明提供了一种模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片在药物筛选中的应用：
(1)通过光刻法、模具浇筑法形成PDMS芯片，与玻璃键合形成双管道的微流控芯片；使用水凝胶多次固化的方式，形成水凝胶支撑的三维血管管腔结构。
(2)将药物加入样品腔室，与血管管道共培养，观察药物对血管出芽的影响；
(3)用CCD采集出芽图像，通过计算出芽数目，利用Image J测量出芽长度和出芽面积来评价药物对血管出芽的影响。
为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。但是本发明保护范围不局限于实施例所表达的范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：利用双管道芯片观察胚胎着床中的血管生成原因。
具体制备方法如下：
首先，制备双管道芯片，并进行胚胎着床过程中阳性对照组、阴性对照组、胚胎组、子宫内膜组、胚胎与子宫内膜共培养组。在阳性对照组，将50ng/mL的VEGF加入样品腔室，在阴性对照组的样品腔室加入等量的受精卵培养基CZB，培养24h观察对血管生成的作用。在胚胎组，将发育到囊胚期的胚胎放入样品腔室，每个样品腔室放置10个胚胎，培养24h。为防止管道内的液体蒸干，其中每8-10h换一次液。在子宫内膜组，首先，将Ishikawa的培养基换成CZB培养基培养一段时间，并对细胞进行传代，直至观察到Ishikawa在CZB培养基中可以正常增殖。这一操作的主要目的是保证培养基的条件相同，排除掉样本以外其他因素对实验结果的影响。下一步，将Ishikawa自培养皿上消化下来，离心，加入CZB重悬为2×107个/mL的细胞悬液。然后，在样品管道中充满CZB溶液，将Ishikawa细胞悬液加入到样品腔室，正置培养30min。30min后，再次将Ishikawa细胞悬液加入到样品管腔，倒置培养30min，使其形成管腔结构，观察其对血管出芽的影响。在共培养组，首先形成Ishikawa细胞管腔，然后，在每个样品腔中加入10个发育至囊胚期的小鼠胚胎，实现小鼠胚胎与Ishikawa的共培养。对阳性对照(50ng/mL VEGF)组，阴性对照(CZB)组，胚胎组，Ishikawa组，以及Ishikawa与胚胎共培养组，各进行三组平行实验，每组平行实验包括2-3组样本，24h后，用显微镜观察血管管腔的出芽情况。用CCD采集出芽图像，通过计算出芽数目，利用Image J测量出芽长度和出芽面积来评价VEGF与CZB对血管出芽的影响，当两组实验间的出芽数目，出芽长度与出芽面积这三组统计数据中有两组存在显著差异时，则认为这两组实验在促进血管出芽的作用上存在显著差异。结果证实，胚胎具有促进血管生成的作用，而胚胎与子宫内膜共培养可以更显著地促进血管生成。
实施例2：进行抑制血管生成相关药物的筛选
将Selleck抑制剂平台FDA药物库与血管生成相关的19种抑制剂全部筛选出来。构建双管道三维血管生成芯片，将药物加入到样品腔室，与三维血管共培养24h，观察药物对血管出芽的影响。对每种条件下的样本进行了两组平行实验，并用显微镜(OLYMPUS IX73)获取了每组实验的出芽图像。统计每组的出芽数目。利用Image J软件测量了出芽的长度，利用t检验确定样本之间是否存在显著差异。P值小于0.05被认为差异显著。将可以明显抑制血管生成的药物筛选出来。

Claims (10)

1.模拟胚胎着床血管生成的微流控芯片，由芯片表层和基底键合而成，其特征在于，所述芯片表层包括两个主管道和连接主管道的连接管道，每个主管道一端连接入口、另一端连接出口；一个主管道用于形成三维血管管腔，三维血管管腔由水凝胶多次固化而成；另一个主管道用作样品腔室，一个主管道内的物质能够通过连接管道扩散至另一个主管道内。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述主管道的长度为5～10mm，主管道的宽度和高度均为200～1000μm；所述连接管道位于主管道中央，连接管道有多个，连接管道的长度和宽度均为200～1000μm，高度为100～300μm；入口和出口与主管道的连接距离为0.2～1mm。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述三维血管管腔长度为5～10mm，直径为250-350μm之间。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述芯片表层材质为聚二甲基硅氧烷，所述基底材质为玻璃。
5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据微流控芯片要求设计二维的芯片模板；
(2)在光刻胶基底上涂敷光刻胶，按照步骤(1)设计的芯片模板曝光显影，利用光刻的方法得到芯片模具；
(3)将PDMS预聚物与其固化剂按比例混合，浇注在芯片模具上，使其固化；
(4)将固化的PDMS层剥离，将芯片区域切割下来，并用打孔器在入口和出口处打孔得到PDMS芯片表层，将PDMS芯片表层和玻璃基底仔细清洗后干燥，然后用氧等离子体处理将PDMS芯片和玻璃键合，形成微流控芯片；
(5)将键合完成的微流控芯片灭菌处理；
(6)配制水凝胶；
(7)通过水凝胶多次固化的方式在一个主管道上形成三维血管管腔。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述配制水凝胶，具体是将5×PBS、H2O、浓度为1～5mol/L的NaOH和胶原蛋白I按照比例混合制成水凝胶，浓度为5～10mg/mL，在冰上放置5～20min使其混合均匀，用HCl和NaOH将pH值调整到7.0-7.5。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)的具体操作为：1)在管道内注满FN溶液，在细胞培养箱放置20～40min；2)将FN吸出，在连接管道处充满水凝胶，在细胞培养箱孵育20～40min，使中央管道处的水凝胶固化；3)将芯片取出，在两主管道加入水凝胶，而后迅速将培养液滴加在入口处，利用被动进样的方式，使其冲开凝胶形成管道，将形成管道后的芯片置于细胞培养箱孵育20～40min，管道固化后即形成了三维的空腔结构；4)消化HUVEC细胞，加入ECM重悬，调整细胞浓度至1×107～5×107个/mL，将细胞悬浮液滴加在管道入口处，通过被动进样的方式使细胞进入血管管腔中，正置芯片，置于培养箱中孵育20～40min，使细胞在三维管道的下半部分贴壁；5)再次加入细胞，将芯片反转180°，孵育20～40min，使细胞在管道的上半部分贴壁，形成三维血管管腔结构；6)芯片正置培养36h～48h，每8-10h换一次液，使HUVEC形成良好的细胞连接。
8.根据权利要求1-4任一权利要求所述的微流控芯片在胚胎着床血管生成研究中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在微流控芯片内制备三维血管管腔，并进行实验动物取卵与体外培养；
(2)在样品腔室，设置阳性对照组、阴性对照组、胚胎组、子宫内膜组以及共培养组，观察对血管生成影响；
(3)统计分析各组血管出芽结果。
9.根据权利要求1-4任一权利要求所述的微流控芯片在药物筛选中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在微流控芯片内制备三维血管管腔；
(2)将待筛选药物加入样品腔室，与血管管腔共培养，观察药物对血管出芽的影响；
(3)统计分析药物影响后的血管出芽结果。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物为提高体外受精-胚胎移植成功率的药物或者紧急避孕的药物。
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