CN117965301A - 一种多器官芯片、制备方法及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种多器官芯片、制备方法及使用方法，属于生物微流控领域。所述多器官芯片包括芯片基体，所述芯片基体中设有培养孔和灌流通道；所述培养孔至少为两个，上方敞口；所述灌流通道为两端开口的封闭管道；所述灌流通道与各个培养孔侧壁底部设有贯通间隙，所述贯通间隙内构建有水凝胶屏障。本发明提供的多器官芯片培养孔与灌流通道平行设置，便于与自动化移液集成、便于显微观察和成像分析，通过在培养孔与灌流通道之间构建水凝胶屏障，有望在多器官芯片构建更加仿生的血管‑器官屏障，从而帮助构建更加逼真的体外生理、病理模型，服务于新药筛选、生理病理研究、精确医疗等领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物微流控技术领域，特别是涉及一种多器官芯片、制备方法及使用方法。
背景技术
器官芯片是基于微流控芯片技术和3D细胞培养技术在体外构建人体器官模型的仿生芯片。目前的研究热点已经从单器官芯片研制和应用转向多器官芯片研制和应用。
多器官芯片通过通道将多个器官芯片或多个相互独立的器官培养腔串连起来。用泵驱动通道中的培养基流动，模拟血流环境，实现血液和器官、器官和器官之间的物质交换。液流流过器官培养腔时，为了提高仿真度，会构建血管-器官屏障结构，常常采用“三明治结构”(Ronaldson-Bouchard,K.,et al.,Amulti-organ chip with matured tissueniches linkedby vascular flow.Nat Biomed Eng,2022.6(4):p.351-371)，即上下模式，上方为开放培养腔(培养孔)，中间一层为培养血管内皮细胞的多孔膜，下方为流体通道。这种结构不利于显微成像；1)难以分辨多孔膜两侧的细胞；2)多孔膜上方培养的细胞/器官难以实现原位高分辨成像；3)难以实时观察纳米药物、免疫细胞、循环肿瘤细胞穿越屏障的行为。
在通道中构建水凝胶“墙”已有报道。MIMETAS公司的芯片含有几个平行的封闭通道，其中一条为水凝胶(I型鼠尾胶原)灌注通道，该通道与两侧平行通道是相通的，但底部有凸起的“相引导”结构限定水凝胶不向侧方通道溢出。通过自发毛细进样实现水凝胶的灌注。这种屏障有两个缺点：凸起的“相引导”结构对屏障两侧的物质交流有一定影响，而且增加了工艺难度；毛细进样时间随凝胶粘度增大而增大，而I型鼠尾胶原是和交联溶液混合后再进样的，随着交联逐渐发生，粘度增大，所以进样长度受到限制，MIMETAS产品水凝胶屏障长度为4.5mm。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种便于与自动化移液集成、便于显微观察和成像分析、能够构建更加仿生的血管-器官屏障的多器官芯片。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种多器官芯片，所述芯片基体中设有培养孔和灌流通道；所述培养孔至少为两个，上方敞口，不同培养孔中用于培养不同的细胞团或类器官，从而模拟不同器官；所述灌流通道为两端开口的封闭管道，用于培养基流通，模拟体内的血液流动；所述灌流通道与各个培养孔侧壁底部设有贯通间隙，所述贯通间隙内构建有水凝胶屏障，用于培养血管内皮细胞形成血管内皮屏障及毛细血管网。
在本发明的一些实施例中，所述灌流通道环绕每个培养孔蜿蜒排布。
在本发明的一些实施例中，所述芯片基体设有与灌流通道连通的灌流通道入口和灌流通道出口。
在本发明的一些实施例中，所述水凝胶屏障的构建原料为用于细胞培养的生物水凝胶；优选地，所述生物水凝胶包括天然水凝胶或工程化活性水凝胶。
在本发明的一些实施例中，所述芯片基体中设有分别与各个培养孔对应的水凝胶通道，所述芯片基体设有分别与各个所述水凝胶通道连通的水凝胶通道入口，用于灌注水凝胶并构建水凝胶屏障。
在本发明的一些实施例中，所述水凝胶通道的上表面接触角θtop，下表面接触角θbot，宽度w和高度h须满足如下条件：
在本发明的一些实施例中，所述培养孔的高度大于所述灌流通道的高度；和/或，所述灌流通道的高度大于所述水凝胶通道的高度。
在本发明的一些实施例中，所述多器官芯片还包括底片，所述芯片基体和底片通过等离子处理键合。
本发明第二方面提供一种上述的多器官芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)制备具有微结构的模具；
2)PDMS倒模得到微流控结构，打出通孔，得到芯片基体；
3)芯片基体和底片键合；
4)构建水凝胶屏障，得到多器官芯片。
在本发明的一些实施例中，步骤4)中，构建水凝胶屏障的方法为自发毛细进样法，包括以下步骤：在基体与底片键合后，立即向水凝胶通道入口滴加水凝胶溶液，靠毛细力自发驱动完成水凝胶溶液进样，固化，形成水凝胶屏障。
在本发明的一些实施例中，步骤4)中，构建水凝胶屏障的方法为固液面吸附法，包括以下步骤：S1、在芯片基体与底片键合后，立即将水凝胶溶液从灌流通道入口施压注入，控制进样速度，使得水凝胶溶液只填充灌流通道和水凝胶通道而不进入培养孔；S2、抽出灌流通道中的水凝胶溶液，而水凝胶通道中的水凝胶溶液由于表面张力的作用而保留，固化，形成水凝胶屏障。
本发明第三方面提供上述的多器官芯片的使用方法，包括以下步骤：
(1)向多器官芯片的灌流通道内注入血管内皮细胞；
(2)向多器官芯片的培养孔内加入细胞团或类器官及其特异的培养基进行培养；
(3)将多器官芯片的灌流通道和外部驱动泵相连，实现灌流溶液的循环灌流。
本发明提供的多器官芯片与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、从芯片设计方面，1)本发明开放的培养孔便于与自动化移液集成，方便培养孔的加样、取样操作；2)不同于现有技术中血管与器官采用上下模式设置，通过多孔膜上下隔开，本发明中血管与器官采用平行模式设置，通过血管-器官屏障结构隔开，便于显微成像，屏障两侧的细胞都易分辨，能高分辨成像，可以实时观察纳米药物、免疫细胞、循环肿瘤细胞穿越屏障的行为；3)本发明中血管-器官屏障采用水凝胶材料构建，利于物质交流，优秀的生物相容性利于细胞生长，胶原本来就是血管外基质的重要组成成分，而且水凝胶中方便混入细胞因子和血管内皮细胞，在水凝胶中诱导分化形成毛细血管网。
2、从水凝胶屏障构建方面，本发明基于同种芯片结构设计，提出两种水凝胶进样方法。两种方法操作简单，而且能够实现水凝胶的准确定位，在微流控通道中形成水凝胶“墙”。水凝胶从芯片上方开孔进样，无需设置相引导结构，通过自发毛细进样或固液面吸附法即可实现，可以通过控制进样量和进样速度利用自动化移液装置完成进样，与人工手动进样相比，操作简单，准确性高，有利于产业化生产和应用。
3、本发明提供的多器官芯片结构和在微流控通道中形成水凝胶“墙”的方法，有望在多器官芯片构建更加仿生的血管-器官屏障，从而帮助构建更加逼真的体外生理、病理模型，服务于新药筛选、生理病理研究、精确医疗等领域。
附图说明
图1为本发明一实施例所述的多器官芯片的结构示意图。
图2为本发明一实施例所述的多器官芯片的3D示意图。
图3为本发明一实施例所述的多器官芯片的剖面示意图，不含水凝胶屏障。
图4为本发明一实施例所述的多器官芯片的剖面示意图。
图5为本发明一实施例水凝胶屏障构建方法流程示意图。
图6为本发明另一实施例水凝胶屏障构建方法流程示意图。
图7为本发明实施例4水凝胶屏障构建方法实物图。
图8为本发明实施例5中HUVEC接种24小时后细胞分布三维图。
附图标记：
1 芯片基体；
2 培养孔；
3 灌流通道；
31 灌流通道入口；
32 灌流通道出口；
4 水凝胶屏障；
41 水凝胶通道；
42 水凝胶通道入口；
5 底片。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例进一步详细描述本发明。但是，应当理解的是，本发明的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限制本发明，且本发明的实施例并不局限于说明书中给出的实施例。实施例中未注明具体实验条件或操作条件的按常规条件制作，或按材料供应商推荐的条件制作。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
在下述实施例中，所使用到的试剂、材料以及仪器如没有特殊的说明，均可商购获得。
本发明提供的多器官芯片，包括芯片基体1，所述芯片基体1中设有培养孔2和灌流通道3；所述培养孔2至少为两个，施加特定培养基以培养不同的细胞团或类器官，从而模拟不同器官；所述灌流通道3用于模拟体内的血液流动，灌流液可为培养基、药物溶液或全血等，实现细胞团或类器官与灌流液，不同细胞团或类器官之间的物质交流；所述灌流通道3与各个培养孔2侧壁底部设有贯通间隙，所述贯通间隙内构建有水凝胶屏障4，水凝胶屏障上可培养血管内皮细胞形成血管内皮屏障，并可进一步在水凝胶中形成毛细血管网。
本发明提供的多器官芯片中，所述培养孔2为开放式，便于与自动化移液集成，方便培养孔的加样、取样操作；所述培养孔2的形状多样，可以为圆柱形、边角圆弧化的长方体、边角圆弧化的正方体等；在本发明的一些实施例中，所述培养孔2为圆柱形，底面直径为3.5～6.4mm。本发明的一些实施例中，所述灌流通道3环绕每个培养孔2蜿蜒排布，不同培养孔2之间通过灌流通道3连通，实现多器官串联；所述培养孔2的串联数量不限，可以为两个、三个、四个、五个、六个或更多，具体可根据需求设计为两器官串联、三器官串联、四器官串联、五器官串联、六器官串联、或更多器官串联。本发明中，所述灌流通道3经过培养孔2时，与培养孔2的孔壁贴合，并通过培养孔2侧壁底部贯通间隙的水凝胶屏障与培养孔2连通。在本发明的一些实施例中，所述灌流通道3底部所在的水平面与所述培养孔2底部所在的水平面相同。本发明中，所述水凝胶屏障4表面可以培养血管内皮细胞形成血管内皮屏障，还可进一步在水凝胶内部混入血管内皮细胞，诱导分化为毛细血管网，这样实现微流控通道的生物功能化，微流控通道即为仿生血管能够实现原位高分辨成像，同时也有利于实时观察纳米药物、免疫细胞、循环肿瘤细胞穿越屏障的行为。
在本发明的一些实施例中，所述芯片基体1设有与灌流通道3连通的灌流通道入口31和灌流通道出口32，所述灌流通道入口31和灌流通道出口32可与外围驱动泵连接，驱动培养基在灌流通道3中循环流动，模拟血管力学微环境和血管物质运输功能。在本发明的一些具体实施例中，所述灌流通道3包括与所述灌流通道入口31连接的导入段、环绕各个培养孔2并通过水凝胶屏障4与对应培养孔2连通的功能段、连接相邻两个功能段的连接段以及与灌流通道出口32连接的导出段。
在本发明的一些实施例中，所述水凝胶屏障的构建原料为用于细胞培养的生物水凝胶；优选地，所述生物水凝胶包括天然水凝胶或工程化活性水凝胶；进一步优选地，所述天然水凝胶选自I型鼠尾胶原或所述工程化活性水凝胶选自甲基丙烯酰化明胶。
在本发明的一些实施例中，所述芯片基体1中设有分别与各个培养孔2对应的水凝胶通道41，所述芯片基体1设有分别与各个所述水凝胶通道41连通的水凝胶通道入口42，用于灌注水凝胶并构建水凝胶屏障4；所述水凝胶通道41包括与水凝胶通道入口42连接的导入段、与对应所述培养孔2侧壁底部的贯通间隙重合的功能段。在本发明的一些具体实施例中，所述水凝胶通道41还包括沿所述培养孔2侧壁方向延伸的延伸段，用作功能段的补充。
在本发明的一些实施例中，所述水凝胶通道41的上表面接触角θtop，下表面接触角θbot，宽度w和高度h须满足如下条件：
接触角(contact angle)是指在气、液、固三相交点处所作的气-液界面的切线，此切线在液体一方的与固-液交界线之间的夹角。本发明所述上表面接触角θtop中“气”为水凝胶通道内气体，“液”为灌注在水凝胶通道中的溶液、“固”为水凝胶通道的上表面；所述下表面接触角θbot中“气”为水凝胶通道内气体，“液”为灌注在水凝胶通道中的溶液、“固”为水凝胶通道的下表面。
发明人在芯片设计过程中发现，水凝胶通道的参数满足上述条件时，能够成功构建水凝胶屏障。
在本发明的一些实施例中，所述培养孔2的高度大于所述灌流通道3的高度；和/或，所述灌流通道3的高度大于所述水凝胶通道4的高度，便于构建水凝胶屏障。
在本发明的一些实施例中，所述多器官芯片还包括底片5，所述芯片基体1和底片5通过等离子处理键合。所述底片5可为PDMS薄膜、玻璃片或其他高分子透光性材料，对芯片基体1底部通道进行封闭。在提供封闭的液体环境的同时，提供高透光性以进行细胞或器官显微观察。
本发明第二方面提供一种上述的多器官芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)制备具有微结构的模具；
2)PDMS倒模得到微流控结构，打出通孔，得到芯片基体1；
3)芯片基体1和底片5键合；
4)构建水凝胶屏障4，得到多器官芯片。
在本发明的一些实施例中，步骤1)中，根据设计的芯片结构，构建三维模型，采用SU8光刻胶制作模具，优选为SU8干膜工艺。
本发明步骤3)中，所述芯片基体1和底片5键合的方式通过表面改性实现，优选地，可为表面等离子体处理键合。在本发明的一些实施例中，步骤3)中，将芯片基体1和用作底片2的PDMS薄膜或玻璃片经过表面等离子处理后键合。
在本发明的一些实施例中，步骤4)中，所述水凝胶屏障的构建原料包括I型鼠尾胶原或GelMA30。所述GelMA30为取代度为30的甲基丙烯酰化明胶，即明胶30％氨基被甲基丙烯酰取代。优选为5％的GelMA30溶液，溶剂为水。
在本发明的一些实施例中，构建水凝胶屏障4的方法包括向水凝胶通道灌注水凝胶溶液的过程；在本发明的一些优选实施例中，所述灌注水凝胶溶液的过程中控制环境温度，避免水凝胶溶液发生聚合并使水凝胶溶液保持低粘度，例如：使用含I型鼠尾胶原水凝胶溶液时，芯片和溶液放置于冰上；使用GelMA30水凝胶溶液时，芯片和溶液放置在37～60℃的热板上。在本发明的一些优选实施例中，所述灌注水凝胶的过程中避免震动或搅拌，以免水凝胶溶液中引入气泡。
在本发明的一些实施例中，步骤4)中，构建水凝胶屏障4的方法为自发毛细进样法，包括以下步骤：在基体1与底片5键合后，立即向水凝胶通道入口42滴加水凝胶溶液，靠毛细力自发驱动在10min内完成水凝胶溶液进样；固化，形成水凝胶屏障；其中，水凝胶通道41的上表面接触角θtop，下表面接触角θbot，宽度w和高度h须满足如下条件：
在本发明的一些实施例中，步骤4)中，构建水凝胶屏障4的方法为固液面吸附法，包括以下步骤：S1、在基体1与底片5键合后，立即将水凝胶溶液从灌流通道入口31施压注入，控制进样速度，使得水凝胶溶液只填充灌流通道3和水凝胶通道41而不进入培养孔2；S2、抽出水凝胶通道41中的水凝胶溶液，而水凝胶通道41中的水凝胶溶液由于表面张力的作用保留，固化，形成水凝胶屏障；其中，水凝胶通道41的上表面接触角θtop，下表面接触角θbot，宽度w和高度h须满足如下条件：
在本发明的一些实施例中，所述水凝胶屏障的构建原料包括I型鼠尾胶原，所述固化为进样完成后，置于适于固化的温度环境下完成固化，具体可以为置于37℃培养箱中放置1小时；所述水凝胶屏障的构建原料包括甲基丙烯酰化明胶，所述固化为进样完成后，于紫外照射固化，具体可以为紫外灯下照射1～2分钟。
在本发明的一些实施例中，采用所述固液面吸附法构建水凝胶屏障4时，所述进样速度在3mm/s以下。
本发明第三方面提供上述的多器官芯片的使用方法，包括以下步骤：
(1)向多器官芯片的所述灌流通道内注入血管内皮细胞，使其在水凝胶屏障上吸附生长，形成内皮细胞单层；
(2)向多器官芯片的所述培养孔加入细胞团或类器官及其特异的培养基进行培养，可根据培养物的需求在培养前对底面进行生物分子包被；
(3)向多器官芯片的所述灌流通道和外部驱动泵相连，实现灌流溶液的循环灌流；其中，所述灌流通道的灌流溶液可为培养基、药物溶液或全血等，实现细胞团或类器官与灌流液，不同细胞团或类器官之间的物质交流。
实施例1
一种多器官芯片，如图1～图4所示，包括芯片基体1和底片5，芯片基体1中设有两个圆柱体培养孔2，所述培养孔2为开放式，芯片基体1设有灌流通道入口31、灌流通道出口32和分别与两个培养孔2相对应的两个水凝胶通道入口42。灌流通道3底部、两个水凝胶通道41与培养孔2底部均在同一水平面上(即底片5的上表面)，培养孔2的高度为6mm，灌流通道3的高度为800μm，所述灌流通道3与各个培养孔2侧壁底部设有贯通间隙，所述贯通间隙内构建有水凝胶屏障4(水凝胶屏障4：长度为600μm，高度为300μm)。灌流通道3经过培养孔2时，与培养孔2的圆柱体侧壁贴合，如图2和图3中所示，培养孔2侧壁底部设有贯通间隙，所述贯通间隙的高度小于所述灌流通道3的高度，所述水凝胶通道41包括与水凝胶通道入口42连接的导入段、与对应所述培养孔2侧壁底部的贯通间隙重合的功能段(即所述水凝胶通道42的高度与所述贯通间隙高度相同)和沿所述培养孔2侧壁方向延伸的延伸段。水凝胶通道41的上表面接触角θtop，下表面接触角θbot，宽度w和高度h满足如下条件：
实施例2
一种如图1～图4所示的多器官芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)根据设计的芯片结构，利用标准光刻工艺在硅片上制作两层结构的模具：先将300μm厚的SU8干膜转移到硅片上，紫外曝光得到第一层图形，SU8后烘完成后将500μm厚的SU8干膜转移到第一层SU8上，然后紫外曝光、后烘、显影得到两层结构的SU8模具；
2)基于SU8模具用PDMS倒模得到微流控结构，得到具有灌流通道3和水凝胶通道41的基体，打出通孔(培养孔2、灌流通道入口31、灌流通道出口32和水凝胶通道入口42)，得到芯片基体1；
3)芯片基体1和底片5键合：将芯片基体1和用作底片2的PDMS薄膜或玻璃片经过表面等离子处理后，迅速键合；
4)采用自发毛细进样法或固液面吸附法构建水凝胶屏障4，得到多器官芯片。
实施例3
以GelMA30为水凝胶屏障4构建原料，采用自发毛细进样法构建多器官芯片中水凝胶屏障4，如图5所示，包括以下步骤：
S1、多器官芯片放置于37～60℃的热板上，以5％GelMA30溶液作为水凝胶溶液进样，基体1与玻璃片底片5经表面等离子处理后，立即将水凝胶溶液滴加在多器官芯片的水凝胶通道入口42，通过自发毛细进样，水凝胶溶液逐渐充满整个水凝胶通道41，并在10min之内完成水凝胶溶液进样(水凝胶屏障4：宽度为600μm，高度为300μm，长度为7.85mm)。
S2、进样完成后，将多器官芯片于紫外灯下照射1-2分钟完成固化，水凝胶屏障4构建完成。
实施例4
以I型鼠尾胶原作为水凝胶屏障4构建原料，采用固液面吸附法构建多器官芯片中水凝胶屏障4的方法，如图6所示，包括以下步骤：
S1、试剂和多器官芯片置于冰上，I型鼠尾胶原(5mg/ml)、PBS和NaHCO3(37g/l)按照8:1:1混合均匀，得到水凝胶，基体1与玻璃片底片5经表面等离子处理后，立即将制得的水凝胶从灌流通道入口31施压注入，进样速度控制在3mm/s以下，水凝胶溶液在表面张力作用下同时填充灌流通道3和水凝胶通道41(浸润)而不进入培养孔2；
S2、抽出水凝胶通道41中的水凝胶，由于表面张力的存在，水凝胶通道41中的水凝胶不会被抽走(水凝胶屏障：宽度为600μm，高度为300μm，长度为7.85mm)；
S3、进样完成后，将多器官芯片在37℃二氧化碳培养箱放置一小时，完成I型鼠尾胶原的交联反应，水凝胶屏障4构建完成。
图7为采用防扩散水凝胶染料(EFL-DYE-ND，苏州永沁泉智能设备有限公司)对5％GelMA30溶液染色后作为水凝胶溶液进样，采用如图6所示的固液面吸附法构建多器官芯片中水凝胶屏障4，得到的结果实物图，可知，本实施例成功构建了水凝胶屏障4。
实施例5
利用人的脐静脉内皮细胞(HUVEC)在水凝胶屏障4上构建血管内皮细胞层，包括以下步骤：
S1、将浓度为3×105～8×105个/ml的HUVEC从灌流通道3注入多器官芯片，并在培养孔中注入HUVEC培养基，然后在二氧化碳培养箱中静置孵育，12小时后往灌流通道3和培养孔2中补充HUVEC培养基。
S2、细胞灌注接种24小时后，灌流通道入口31与与精密隔膜泵出口连接，精密隔膜泵入口与HUVEC培养基储液瓶连接，灌流通道出口32与废液瓶连接，以1μl/min的流速实现灌流通道中HUVEC的灌流培养。
S3、细胞灌注接种24小时后，吸去芯片中的培养基，并用PBS缓冲液冲洗三次；使用LIVE/DEADTM细胞活力/细胞毒性试剂盒(InvitrogenTM，L3224)，按照说明书配制染色液，然后将染色液注入芯片；二氧化碳培养箱中孵育20分钟后，吸去染色液，注入PBS缓冲液；用激光共聚焦显微镜((Leica，LAS X)进行Z序列成像，并进行三维重构，得到图8，可知，本实施例HUVEC成功在灌流通道3底部(图8中水平面)及与灌流通道3相邻一侧的水凝胶屏障4(图8中垂直面)上生长。
上述实施例仅例示性说明本申请的原理及其功效，而非用于限制本申请。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本申请的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本申请所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本申请的权利要求所涵盖。
Claims (11)
1.一种多器官芯片，其特征在于，包括芯片基体，所述芯片基体中设有培养孔和灌流通道；所述培养孔至少为两个，上方敞口，不同培养孔用于培养不同的细胞团或类器官，从而模拟不同器官；所述灌流通道为两端开口的封闭管道，用于培养基流通，模拟体内的血液流动；所述灌流通道与各个培养孔侧壁底部设有贯通间隙，所述贯通间隙内构建有水凝胶屏障，用于培养血管内皮细胞形成血管内皮屏障及毛细血管网。
2.如权利要求1所述的多器官芯片，其特征在于，包括以下特征中的一项或几项：
(1)所述灌流通道环绕每个培养孔蜿蜒排布；
(2)所述芯片基体设有与灌流通道连通的灌流通道入口和灌流通道出口；
(3)所述水凝胶屏障的构建原料为用于细胞培养的生物水凝胶；优选地，所述生物水凝胶包括天然水凝胶或工程化活性水凝胶；
(4)所述芯片基体中设有分别与各个培养孔对应的水凝胶通道，所述芯片基体设有分别与各个所述水凝胶通道连通的水凝胶通道入口，用于灌注水凝胶并构建水凝胶屏障。
3.如权利要求2所述的多器官芯片，其特征在于，所述水凝胶通道包括与水凝胶通道入口连接的导入段、与对应所述培养孔侧壁底部的贯通间隙重合的功能段；和/或，所述天然水凝胶选自I型鼠尾胶原或所述工程化活性水凝胶选自甲基丙烯酰化明胶。
4.如权利要求2或3所述的多器官芯片，其特征在于，所述水凝胶通道的上表面接触角θtop，下表面接触角θbot，宽度w和高度h须满足如下条件：
和/或，所述培养孔的高度大于所述灌流通道的高度；
和/或，所述灌流通道的高度大于所述水凝胶通道的高度。
5.如权利要求1所述的多器官芯片，其特征在于，所述多器官芯片还包括底片，所述芯片基体和底片通过等离子处理键合。
6.一种如权利要求1～5任一项所述的多器官芯片的制备方法，包括以下步骤：
1)制备具有微结构的模具；
2)PDMS倒模得到微流控结构，打出通孔，得到芯片基体；
3)芯片基体和底片键合；
4)构建水凝胶屏障，得到多器官芯片。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下特征中的一项或几项：
(1)步骤1)中，根据设计的芯片结构，构建三维模型，采用SU8光刻胶制作模具；
(2)步骤3)中，将芯片基体和底片经过表面等离子处理后键合；
(3)步骤4)中，所述水凝胶屏障的构建原料包括为用于细胞培养的生物水凝胶；优选为I型鼠尾胶原或甲基丙烯酰化明胶。
(4)步骤4)中，所述构建水凝胶屏障，包括向水凝胶通道灌注水凝胶溶液的过程；所述灌注水凝胶溶液的过程中控制环境温度，避免水凝胶溶液发生聚合；和/或，所述灌注水凝胶的过程中避免震动或搅拌，以免水凝胶溶液中引入气泡。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下特征中的任一项：
(a)步骤4)中，构建水凝胶屏障的方法为自发毛细进样法，包括以下步骤：在芯片基体与底片键合后，立即向水凝胶通道入口滴加水凝胶溶液，靠毛细力自发驱动完成水凝胶溶液进样，固化，形成水凝胶屏障；
(b)步骤4)中，构建水凝胶屏障的方法为固液面吸附法，包括以下步骤：S1、在芯片基体与底片键合后，立即将水凝胶溶液从灌流通道入口施压注入，控制进样速度，使得水凝胶溶液只填充灌流通道和水凝胶通道而不进入培养孔；S2、抽出灌流通道中的水凝胶溶液，而水凝胶通道中的水凝胶溶液由于表面张力的作用保留，固化，形成水凝胶屏障。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括以下特征中的一项或几项：
(ⅰ)特征(a)中，所述水凝胶溶液为包括I型鼠尾胶原与碳酸氢钠溶液的混合液；
(ⅱ)所述水凝胶屏障的构建原料包括I型鼠尾胶原，所述固化为进样完成后，置于适于固化的温度环境下完成固化；所述水凝胶屏障的构建原料包括甲基丙烯酰化明胶，所述固化为进样完成后，于紫外照射固化；
(ⅲ)特征(b)中，所述进样速度在3mm/s以下。
10.一种如权利要求1～5任一项所述的多器官芯片或如权利要求6～9任一项所述的制备方法所得的多器官芯片的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向多器官芯片的灌流通道内注入血管内皮细胞；
(2)向多器官芯片的培养孔内加入细胞团或类器官及其特异的培养基进行培养；
(3)将多器官芯片的灌流通道和外部驱动泵相连，实现灌流溶液的循环灌流。
11.如权利要求10所述的使用方法，其特征在于，包括以下特征中的一项或几项：
(2.1)步骤(2)中，可根据培养物的需求在培养前对底面进行生物分子包被；
(2.2)步骤(2)中，所述外部驱动泵为精密隔膜泵或精密蠕动泵；
(3.1)步骤(3)中，所述灌流溶液包括培养基、药物溶液、全血中的一种或几种。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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