WO2020090771A1 - 人工多層組織培養デバイスと人工多層組織の製造方法 - Google Patents

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WO2020090771A1
WO2020090771A1 PCT/JP2019/042253 JP2019042253W WO2020090771A1 WO 2020090771 A1 WO2020090771 A1 WO 2020090771A1 JP 2019042253 W JP2019042253 W JP 2019042253W WO 2020090771 A1 WO2020090771 A1 WO 2020090771A1
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WO
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flow path
cells
artificial
channel
culture device
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/042253
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English (en)
French (fr)
Inventor
昌治 竹内
ミンハオ ニエ
美咲 池村
Original Assignee
国立大学法人東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology

Definitions

  • the present invention relates to an artificial multilayer tissue culture device and a method for producing an artificial multilayer tissue.
  • the present application claims priority based on US Provisional Application No. 62 / 751,743 filed on October 29, 2018, the content of which is incorporated herein by reference.
  • An artificial multi-layered tissue such as a skin model has a large thickness in the plane direction of each layer. Therefore, in order to observe the cross section of the artificial multilayered tissue, it is necessary to cut the artificial multilayered tissue to prepare a tissue section. However, this work requires a lot of time and cost. Further, there is a problem that the sample is easily broken when the tissue section is prepared. Further, since the artificial multi-layered tissue is cut, there is a problem that it is not possible to observe the time course in the same sample.
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 disclose a device in which medium channels are provided adjacent to each other on both sides of the gel channel, and cells are added from the medium channel to the gel channel and cultured.
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 since the gel channel and the medium channel are formed on the same plane, the cells are not cut off by observing in the normal direction of the plane. It becomes possible to observe.
  • gel channel tissue a tissue composed of multi-layered cells in the medium channel
  • medium a tissue composed of multi-layered cells in the medium channel
  • the medium flow path tissue is composed of epithelial cells
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide an artificial multi-layered tissue culture device and an artificial multi-layered tissue manufacturing method capable of observing the time course of the same sample without producing a tissue section. To do.
  • a first channel is opened in one surface of the first substrate and extends in the first direction, and a first flow path in which the first cells are cultured; and an opening in the one surface in the first direction.
  • a second flow path extending and culturing second cells; a third flow path opening in the one surface and extending in the first direction; at least a medium is supplied; and the first flow path joined to the one surface
  • a second substrate having optical transparency that seals the second flow path and the third flow path, the second flow path being in the first direction with respect to the first flow path.
  • the first flow path is provided on one side of the intersecting second direction via the first partition wall, and the third flow path is provided on the other side of the first flow path on the other side in the second direction via the second partition wall.
  • the first partition wall has a first communication path that connects the first flow path and the second flow path, and the second partition wall connects the first flow path and the third flow path.
  • An artificial multi-layer structure having a second communication path that allows the first communication path to face each other in the first direction and has a facing surface that tapers from the second flow path toward the first flow path.
  • a tissue culture device is provided.
  • the artificial multi-layered tissue culture device of the first aspect of the present invention is prepared, and first cells are cultured in the first channel to form a first tissue layer. And supplying the second cells and the medium to the second flow channel, supplying the medium to the third flow channel, and adjusting the posture of the artificial multi-layered tissue culture device to adjust the first flow rate. Locating the second flow path on the upper side of the passage, arranging the second cell on the first tissue layer exposed in the first communication passage, and arranging the second cell on the first tissue layer Culturing the cells in the medium of the second flow channel is provided, and a method for producing an artificial multi-layered tissue is provided.
  • an artificial multi-layered tissue culture device and a method for producing an artificial multi-layered tissue in which the same sample can be observed over time without producing a tissue section.
  • FIG. 3 is a sectional view taken along the line AA in FIG. 2.
  • FIG. 13 is a partial plan view of the vicinity of first portions 13B and 13C as seen from the ⁇ Z side.
  • FIG. 3 is a partial plan view of an artificial multilayer tissue formed by culturing using the artificial multilayer tissue culture device 1 as viewed from the ⁇ Z side.
  • FIG. 7 is a partial plan view showing the manufacturing process of the artificial multilayered tissue 50.
  • FIG. 7 is a partial plan view showing the manufacturing process of the artificial multilayered tissue 50.
  • 10 is an image of a state in which 10-50 cells of epidermal cells 71 are arranged (seed) on the dermal tissue layer 60. It is the image which imaged the dermal tissue layer 60 and the epidermal layer 70 in the 1st communicating path 16 after 1 day culture
  • FIG. 7 is a partial plan view showing the manufacturing process of the artificial multilayered tissue 50.
  • FIG. 3 is a partial plan view of the artificial multilayer tissue 50 formed by culturing using the artificial multilayer tissue culture device 1, as viewed from the ⁇ Z side.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view of an artificial multilayer tissue observation system SYS having an artificial multilayer tissue culture device 1 according to the first embodiment of the present invention. As shown in FIG. 1, the artificial multilayer tissue observation system SYS includes an artificial multilayer tissue culture device 1 and an observation device 2.
  • the artificial multilayer tissue culture device 1 includes a first substrate 10 and a second substrate 30 each having a rectangular plate shape in plan view.
  • the first substrate 10 and the second substrate 30 have, for example, a rectangular parallelepiped shape joined in the vertical direction with an adhesive or the like.
  • the first substrate 10 is joined to the second substrate 30 on the lower surface (one surface) 10a.
  • the first substrate 10 and the second substrate 30 have, for example, a side length of several mm to several tens of mm.
  • the thickness of the first substrate 10 is, for example, several mm.
  • the thickness of the second substrate 30 is, for example, several hundreds ⁇ m.
  • the material of the first substrate 10 is not particularly limited, but examples thereof include elastomers such as silicone rubber and PDMS (polydimethylsiloxane).
  • the first substrate 10 of the present embodiment is formed of PDMS from the viewpoint of air permeability.
  • the material of the second substrate 30 is not particularly limited, but examples thereof include elastomers such as silicone rubber, PDMS (polydimethylsiloxane), and glass.
  • the second substrate 30 of the present embodiment is formed of PDMS from the viewpoint of light transmission and air transmission.
  • FIG. 2 is a plan view of the first substrate 10 as viewed from above.
  • the first substrate 10 is provided in a substantially central portion in the width direction (the horizontal direction in FIG. 2) and is provided with a first channel FA in which the first cells are cultured, and the first channel FA described above.
  • a second channel FB arranged on one side (left side in FIG. 2) in the width direction and in which the second cells are cultured, and a third cell arranged on the other side (right side in FIG. 2) in the width direction described above.
  • the third flow path FC is provided.
  • the bonding direction of the first substrate 10 and the second substrate 30 (the normal direction of the lower surface 10a) is the Z direction, and the first flow channel FA, the second flow channel FB, and the third flow channel FC are arranged.
  • the width direction will be described as a Y direction (second direction), and the Z direction and a direction orthogonal to the Y direction will be described as an X direction (first direction).
  • the first channel FA is formed to extend in the X direction.
  • An inlet 11A is provided at the ⁇ X side end of the first channel FA.
  • An outlet 12A is provided at the + X side end of the first channel FA.
  • Each of the inlet 11A and the outlet 12A has a circular cross section and extends in the Z direction to penetrate the first substrate 10.
  • An inlet 11B is provided at the ⁇ X side end of the second flow path FB.
  • An outlet 12B is provided at the + X side end of the second flow path FB.
  • Each of the inlet 11B and the outlet 12B has a circular cross section, extends in the Z direction, and penetrates the first substrate 10.
  • the second flow passage FB has a first portion 13B arranged along the X direction in parallel with the first flow passage FA at the center in the X direction, and second portions 14B arranged on both sides of the first portion 13B in the X direction. And have.
  • Each second portion 14B extends in a direction in which the distance in the Y direction from the first flow path FA increases as the distance from the first portion 13B in the X direction increases.
  • An inlet 11C is provided at the ⁇ X side end of the third flow path FC.
  • An outlet 12C is provided at the + X side end of the third flow path FC.
  • the inlet 11C and the outlet 12C each have a circular cross section and extend in the Z direction to penetrate the first substrate 10.
  • the third flow path FC includes a first portion 13C arranged along the X direction in parallel with the first flow passage FA at the center in the X direction, and second portions 14C arranged on both sides of the first portion 13C in the X direction. And have.
  • Each second portion 14C extends in a direction in which the distance in the Y direction from the first flow path FA increases as the distance from the first portion 13C in the X direction increases.
  • FIG. 3 is a sectional view taken along the line AA in FIG.
  • FIG. 4 is a partial plan view of the vicinity of the first portions 13B and 13C as viewed from the ⁇ Z side.
  • the first flow path FA, the second flow path FB, and the third flow path FC are formed by grooves that open to the lower surface 10 a of the first substrate 10. That is, the first flow passage FA, the second flow passage FB, and the third flow passage FC are arranged in the same plane parallel to the XY plane.
  • the first portion 13B of the second channel FB is provided to the first channel FA via the first partition wall 15.
  • the first partition wall 15 has a first communication passage 16 that connects the first flow passage FA and the first portion 13B of the second flow passage FB.
  • the first communication passage 16 is formed by penetrating the first partition wall 15 in the Y direction.
  • the depth of the first communication passage 16 is the same as the depth of the first flow passage FA and the second flow passage FB.
  • the first communication passage 16 has a facing surface 17B located on the second flow path FB side and facing in the X direction, and a second facing surface 18B located on the first flow path FA side and facing in the X direction.
  • the facing surface 17B tapers from the second flow passage FB toward the first flow passage FA.
  • the second facing surface 18B increases in diameter from the tapered end of the facing surface 17B toward the first flow path side FA.
  • the crossing angle between the facing surfaces 17B is not particularly limited, but may be about 90 degrees, for example.
  • the intersection angle between the second facing surfaces 18B is not particularly limited, but for example, an angle at which the solution of the extracellular matrix component supplied to the first channel FA does not leak to the second channel FB due to surface tension is preferable, for example, 60. It is degree.
  • the wall surface of the first partition wall 15 facing the second channel FB and the facing surface 17B are subjected to a surface treatment for suppressing the attachment of the second cells.
  • a surface treatment for suppressing the attachment of the second cells.
  • a solution of 0.2% by weight of Pluronic F-127 dissolved in a serum-free medium is poured into the second flow path and reacted for 1 hour or more.
  • a treatment of pouring the cell suspension into the second flow channel without being dried can be mentioned.
  • the first partition wall 15 has a first air accommodating portion 19B in a region apart from the first flow passage FA, the second flow passage FB, and the first communication passage 16. As shown in FIG. 2, the first air accommodating portion 19B is connected to the air inlet 25B penetrating the first substrate 10 via the air introducing passage 24B and the air is introduced therein. Since the PDMS forming the first substrate 10 has air permeability, the air stored in the first air storage portion 19B passes through the first partition wall 15 to the first flow path FA and the second flow path FA. It can be supplied to the FB and the first communication passage 16.
  • the first air storage portion 19B is provided with a plurality of pillar portions 20B having a rectangular cross section and extending in the Z direction. The plurality of pillars 20B are arranged at intervals in the X direction. The tip end surface of the pillar portion 20B is flush with the lower surface 10a of the first substrate 10.
  • the first portion 13C of the third flow path FC is provided to the first flow path FA via the second partition wall 21.
  • the second partition wall 21 has a second communication path 22 that connects the first flow path FA and the first portion 13C of the third flow path FC.
  • the second communication passage 22 is formed by penetrating the second partition wall 21 in the Y direction.
  • the depth of the second communication passage 22 is the same as the depth of the first flow passage FA and the third flow passage FC.
  • the second communication passage 22 has a facing surface 18C facing in the X direction.
  • the facing surface 18C tapers from the first flow path FA toward the third flow path FC.
  • the intersecting angle between the facing surfaces 18C is not particularly limited, but for example, an angle at which the solution of the extracellular matrix component supplied to the first channel FA does not leak to the third channel FC due to surface tension is preferable, for example, 60 degrees. is there.
  • the wall surface of the first partition wall 15 facing the second flow path FB and the facing surface 17B were subjected to surface treatment for suppressing the attachment of the second cells, but the wall surface of the second partition wall 21 facing the third flow path FC.
  • the surface treatment for suppressing the attachment of the third cells is non-treatment.
  • the second partition wall 21 has a second air accommodating portion 19C in a region apart from the first flow passage FA, the third flow passage FC, and the second communication passage 22. As shown in FIG. 2, the second air accommodating portion 19C is connected to the air inlet 25C penetrating the first substrate 10 via the air introducing passage 24C, and the air is introduced therein. The air stored in the second air storage portion 19C can be supplied to the first flow passage FA, the third flow passage FC, and the second communication passage 22 via the second partition wall 21.
  • the second air storage portion 19C is provided with a plurality of pillar portions 20C having a rectangular cross section and extending in the Z direction. The plurality of pillars 20C are arranged at intervals in the X direction. The tip end surface of the column portion 20C is flush with the lower surface 10a of the first substrate 10.
  • the second substrate 30 is bonded to the lower surface 10a of the first substrate 10 and thus also to the tip surfaces of the first partition wall 15, the second partition wall 21, and the pillar portions 20B and 20C, and is opened to the lower surface 10a.
  • the channel FA, the second channel FB, and the third channel FC are sealed. Since the first partition wall 15 has the first air accommodating portion 19B and the second partition wall 21 has the second air accommodating portion 19C, the strength is reduced, but the tip surfaces of the pillar portions 20B and 20C are the second substrate. By being joined to 30, the strength of the artificial multilayer tissue culture device 1 can be reinforced.
  • the observation device 2 is arranged on the ⁇ Z side of the artificial multilayer tissue culture device 1.
  • the observation device 2 is arranged at a position where the first communication passage 16 and the second communication passage 22 can be observed from the ⁇ Z side.
  • FIG. 5 is a partial plan view of the artificial multi-layered tissue 50 formed by culturing using the artificial multi-layered tissue culturing device 1 as viewed from the ⁇ Z side.
  • the artificial multi-layered tissue 50 includes a dermal tissue layer (first tissue layer) 60 and an epidermal layer (second tissue layer) 70.
  • the dermal tissue layer 60 is formed between the first flow passage FA, the second facing surface 18B of the first communication passage 16 and the facing surface 18C of the second communication passage 22.
  • the dermis tissue layer 60 formed between the second facing surfaces 18B and between the facing surfaces 18C has a second flow path FB side and a second FB side due to the interaction with the second facing surface 18B and the interaction with the facing surface 18C.
  • a curved meniscus that bulges toward the side of the three channels FC is formed.
  • the dermal tissue layer 60 is formed by culturing dermal cells (first cells) 62 in the extracellular matrix component 61.
  • the extracellular matrix component 61 is not particularly limited, but examples thereof include collagen (type I, type II, type III, type V, type XI, etc.), mouse EHS tumor extract (type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, etc.). (Including), gelatin, agar, agarose, fibrin, glycosaminoglycan, hyaluronic acid, proteoglycan, thrombin, aprotinin, alginic acid, and the like.
  • fibroblasts can be used.
  • fibroblasts include cells derived from mammals such as human, mouse and rat, and human-derived fibroblasts are preferable.
  • human-derived fibroblasts human skin fibroblasts (Normal Human Dermal Fibroblasts: NHDF), human lung fibroblasts: Human Pulmonary Fibroblasts (HPF), human heart fibroblasts: Human Cardiac Fibroblasts (HCF), human aorta Adventitial Fibroblasts: Human Aortic Installationitial Fibroblasts (HAoAF), Human Uterine Fibroblasts: Human Uterine Fibroblasts (HUF), Human Villus Mesenchymal Fibroblasts: Human Villamesenchymal Fibroblasts (HVMF), etc., human skin Fibroblasts (NHDF) are preferred.
  • the epidermal layer 70 is formed by seeding and culturing epidermal cells (second cells) 71 together with a medium on the dermis tissue layer 60 exposed in the first communication passage 16 via the second channel FB.
  • epidermal cells 71 for example, epidermal keratinocytes can be used.
  • the epidermal cells include cells derived from mammals such as human, mouse and rat, and human-derived epidermal cells are preferable.
  • human-derived epidermal cells include epidermal keratinocytes and epidermal melanocytes, and epidermal keratinocytes are preferred.
  • Examples of the epidermal keratinocytes include normal human epidermal keratinocytes (NHEK).
  • epidermal melanocytes include normal human epidermal melanocytes (NHEM).
  • the third flow path FC may be a flow path to which only the medium is supplied, or a flow path to which the luminal cells are supplied as the medium and the third cells to form the luminal tissue.
  • the luminal cells include vascular cells.
  • vascular cells examples include vascular epithelial cells and vascular endothelial cells, and vascular endothelial cells are preferred.
  • vascular endothelial cells examples include cells derived from mammals such as humans, mice and rats, and human-derived vascular endothelial cells are preferable.
  • Human-derived vascular endothelial cells include Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC), Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAEC), Human Coronary Endothelial Endothelial HCAEC), Human Saphenous Vein Endothelial Cells (HSaVEC), Human Pulmonary Artery Endothelial Cells (HPAEC), Human Aortic Endothelial Cells (Human) Aortic Endothelial Cells, HAoEC Endothelial Cells (HDMEC), Human Dermal Blood Endothelial Cells (HDBEC), Human Dermal Lymphatic Endothelial Cells (HDLEC), Human Lung Microendothelium (Human Dermal Endothelial Cells) Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells: HPMEC), Human heart microvessels Human Cardiac Microvascular Endothelial Cells (HCMEC), Human Bladder Microvascular Endothelial
  • the method for manufacturing the artificial multilayer tissue 50 comprises preparing the artificial multilayer tissue culture device 1, culturing the dermal cells 62 in the first channel FA to form the dermal tissue layer 60, and The culture medium is supplied to the channel FB and the third channel FC, and the posture of the artificial multi-layered tissue culture device 1 is adjusted so that the epidermis is formed on the second channel FB located above the first channel FA.
  • the second substrate 30 is bonded to the lower surface 10a of the first substrate 10 using an adhesive or the like. This completes the preparation of the artificial multilayer tissue culture device 1.
  • the first communication passage 16 has a rectangular cross section orthogonal to the Y axis.
  • the dermal tissue layer 60 is formed.
  • a mixture (mixed solution) of the extracellular matrix component 61 and the dermal cells 62 is injected into the first channel FA from the inlet 11A shown in FIG. 2 under cooling. To do.
  • the artificial multi-layer tissue culture device 1 be placed in a posture in which the XY plane is parallel to the horizontal plane.
  • the extracellular matrix component 61 in the present embodiment is a mixture of multiple types of gels. Specifically, the extracellular matrix component 61 contains collagen (Atelocollagen; 1.0 mg / mL) and alginate (RGD-alginate; 5.0 mg / mL). Human dermal fibroblasts (NHDF; 5e5 cells / ml) were used as the dermal cells 62.
  • collagen Atelocollagen; 1.0 mg / mL
  • RGD-alginate alginate
  • NHDF Human dermal fibroblasts
  • the extracellular matrix component 61 containing the dermal cell 62 is separated from the first matrix in the first communication passage 16 as shown in FIG. A meniscus that contacts the second facing surface 18B and bulges toward the second flow path FB is formed. Similarly, the extracellular matrix component 61 containing the dermal cells 62 contacts the facing surface 18C of the first communication passage 16 and forms a meniscus that swells toward the third flow path FC.
  • the culture was performed at a temperature of 37 ° C. for 60 minutes.
  • the gelling conditions differ between collagen and alginate, and the above-mentioned incubation causes collagen to gel first.
  • calcium chloride CaCl 2
  • the alginate is gelated by the calcium ions generated in the first channel FA by the addition of calcium chloride.
  • the extracellular matrix component 61 in which collagen and alginate are gelled is formed in the first channel FA.
  • the alginate moves toward calcium ions, when calcium ions (calcium chloride) are added from the second flow passage FB or the third flow passage FC, the alginate is the second flow passage FB or the third flow passage FB. May move to FC. Therefore, it is preferable that the calcium chloride is added from a position (for example, about 3 mm) apart from the first communication passage 16 and the second communication passage 22 in the first flow path FA.
  • the gelled collagen is soft, there is a possibility that when the epidermal cells 71 are seeded on the dermal tissue layer 60 exposed in the first communication passage 16, they fall into the first channel FA.
  • a relatively hard gel such as fibrin may be used to support the epidermal cells 71 without being depressed, but since the fibrin is easily dissolved, the epidermal layer 70 is not formed even when the epidermal cells 71 are cultured. There is a possibility that fibrin will disappear.
  • alginate does not dissolve like fibrin, and while it is harder than collagen, it has the characteristic of having a large contraction. Therefore, in this embodiment, after the collagen solution and the alginate solution are supplied to the first channel FA, the collagen is first gelled to form the matrix of the extracellular matrix. The alginate is gelled in the presence of the collagen gel substrate. Even if a large shrinkage occurs due to gelation of alginate, the collagen gel substrate can alleviate the shrinkage.
  • calcium ions are added after the collagen gels to gel the alginate, thereby ensuring the strength for supporting the seeded epidermal cells 71 and dissolving the extracellular matrix component 61. It is compatible with suppression.
  • the medium MC is injected into the third channel FC and the medium MB containing the epidermal cells 71 in the second channel FB. Inject.
  • the media MB and MC include keratinocyte media.
  • the posture of the artificial multilayer tissue culture device 1 is adjusted so that the second channel FB is the first. It is located above the flow path FA. That is, the artificial multi-layered tissue culture device 1 is set up so that the + Y side is the upper side.
  • the first portion 13B of the second flow path FB is horizontal, and the second portion 14B is in the direction toward the upper side (+ Y side) as the distance from the first portion 13B increases. Lean. Therefore, the epidermal cells 71 located on the upper side of the second portion 14B are guided to the inclined second portion 14B and accumulated in the first portion 13B after settling with respect to the medium MB by their own weight. ..
  • the wall surface of the first partition wall 15 facing the second flow path FB and the facing surface 17B are subjected to a surface treatment for suppressing the adhesion of the epidermal cells 71, the epidermal cells 71 accumulated in the first portion 13B. Can be effectively accumulated and arranged on the dermal tissue layer 60 (extracellular matrix component 61) exposed in the first communication passage 16, as shown in FIG.
  • the epidermal cells 71 are arranged on the dermal tissue layer 60, the cells are incubated, for example, for 1 hour.
  • the epidermal layer 70 is formed on the dermal tissue layer 60 exposed in the first communication passage 16. Is formed.
  • the first partition wall 15 is provided with the first air storage portion 19B
  • the second partition wall 21 is provided with the second air storage portion 19C
  • the first partition wall is provided. 15. Since PDMS forming the second partition wall 21 has air permeability, oxygen can be supplied to the first channel FA, the second channel FB, and the third channel FC via air. .. Therefore, the dermal tissue layer 60 and the epidermal layer 70 can be smoothly formed without causing oxygen deficiency.
  • the second substrate 30 is formed of PDMS, oxygen can be supplied to the first flow channel FA, the second flow channel FB, and the third flow channel FC via the second substrate 30.
  • the dermis tissue layer 60 and the epidermal layer 70 are formed in the same plane parallel to the XY plane, and can be observed using the observation device 2 from the -Z side through the second substrate 30 having a thin plate shape. it can.
  • FIG. 9 shows a state in which the artificial multi-layered tissue culture device 1 is set up with the + Y side facing upward, and 10-50 cells of epidermal cells 71 are arranged (seeded) on the dermal tissue layer 60 exposed in the first communication passage 16. It is the image which imaged.
  • FIG. 10 is an image obtained by imaging the dermal tissue layer 60 and the epidermal layer 70 in the first communication passage 16 after culturing the epidermal cells 71 for one day. As shown in FIGS. 9 and 10, immediately after the epidermal cells 71 are placed on the dermal tissue layer 60, the dermis does not fall to the first flow channel FA side and the extracellular matrix component 61 does not disappear. It was possible to observe how the epidermal layer 70 was formed on the tissue layer 60 in the same sample.
  • FIG. 11 is a fluorescence image obtained by imaging the dermal tissue layer 60 and the epidermal layer 70 shown in FIGS. 9 and 10.
  • FIG. 12 is a fluorescence image of the skin layer 70 taken in the Y direction. As shown in FIG. 11, in the epidermal layer 70 on the dermal tissue layer 60, it was possible to observe that differentiation of the tissue having the thinly imaged nucleus occurred on the surface of the tissue having the clearly imaged nucleus. .. Further, as shown in FIG. 12, the skin layer 70 formed in the first communication passage 16 having a rectangular cross section orthogonal to the Y axis has a substantially rectangular shape when viewed in the Y direction, as shown in FIG. It was possible to observe that it was formed so as to fill the space between them.
  • the first flow path FA, the second flow path FB, and the third flow path FC that are arranged in the same plane with the groove opening to the lower surface 10a. Is formed on the first substrate 10, and the second substrate 30 having optical transparency is bonded to the lower surface 10a, so that the artificial multi-layered tissue 50 of the living body can be observed through the second substrate 30 without making a tissue section. It becomes possible to do.
  • the artificial multi-layered tissue culture device 1 of the present embodiment by changing the medium and continuing the culturing, it is possible to observe the passage of time with a sample of the same artificial multi-layered tissue.
  • collagen and alginate are used as the extracellular matrix component 61 for forming the dermal tissue layer 60, and the collagen is first gelled and then the alginate is gelled.
  • the extracellular matrix component 61 can be prevented from falling into the first flow path FA or disappearing, and the epidermal layer 70 can be formed and observed in a normal state and position.
  • FIGS. 13 to 16 the same components as those of the first embodiment shown in FIGS. 1 to 12 are designated by the same reference numerals, and the description thereof will be omitted.
  • the difference between the second embodiment and the first embodiment described above is that an inlet for seeding epidermal cells is provided.
  • FIG. 13 is a schematic perspective view of an artificial multilayer tissue observation system SYS having the artificial multilayer tissue culture device 1 according to the second embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a plan view of the first substrate 10 according to the second embodiment as viewed from above.
  • FIG. 15 is a partial plan view showing the manufacturing process of the artificial multilayered tissue 50.
  • FIG. 16 is a partial plan view of the artificial multi-layered tissue 50 formed by culturing using the artificial multi-layered tissue culturing device 1 as viewed from the ⁇ Z side.
  • the first substrate 10 has an inlet 26 on the + Y side of the first communication passage 16 for seeding epidermal cells.
  • the inlet 26 is arranged at a position where a part of the inlet 26 intersects with the second flow path FB and penetrates the first substrate 10 in the Z direction. That is, the inlet 26 communicates with the second flow path FB.
  • the length in the Y direction at which the inlet 26 and the second flow path FB intersect is, for example, about 0.2 mm. Other configurations are the same as those in the first embodiment.
  • the artificial multi-layered tissue culture device 1 when the artificial multi-layered tissue 50 is manufactured, after the extracellular matrix component 61 is gelled in the first channel FA, as shown in FIG.
  • the medium MC is injected into the third channel FC in the horizontal state, and the medium MB containing the epidermal cells 71 is injected from the inlet 26 into the second channel FB.
  • the epidermal cells 71 can be injected in a constant number.
  • the artificial multilayer tissue culture device 1 is set up so that the + Y side is the upper side.
  • the epidermal cells 71 injected from the inlet 26 into the second flow path FB settle in the medium MB due to their own weight and are accumulated in the first portion 13B.
  • the wall surface of the first partition wall 15 facing the second flow path FB and the facing surface 17B are subjected to the surface treatment for suppressing the adhesion of the epidermal cells 71, the epidermal cells accumulated in the first portion 13B. 71 can be effectively accumulated and arranged on the dermal tissue layer 60 (extracellular matrix component 61) exposed in the first communication passage 16.
  • the inlet 26 to the second flow path are obtained.
  • the inlet 26 is emptied and filled with air, so that the air-liquid interface 27 is formed at the intersection of the inlet 26 and the medium MB as shown in FIG. Can be formed. Therefore, it becomes possible to promote the differentiation of the epidermal layer 70 by culturing the seeded epidermal cells 71 at a position near the gas-liquid interface. Furthermore, the effect of easily adding a fat-soluble reagent from the inlet 26 is also obtained.
  • an artificial skin tissue is illustrated as an artificial multilayer tissue, but the invention is not limited to this as long as it is a layered tissue.
  • the artificial multi-layered tissue may be, for example, muscle tissue using skeletal muscle cells or cardiomyocytes, or lung tissue using lung cells, instead of the above-mentioned fibroblasts.
  • the extracellular matrix used in the above embodiment does not necessarily have to be present, and only various cells may be accumulated.
  • the artificial multi-layer tissue culture device 1 is provided with one first communication passage 16 and one second communication passage 22, respectively.
  • the passage 16 and the second communication passage 22 may be provided.
  • a plurality of first communication passages 16 and second communication passages 22 are provided in the first portions 13B and 13C of the artificial multi-layered tissue culture device 1 described in the first embodiment, and the epidermal cells 71 are provided in each of the first communication passages 16. It can be cultured under almost the same culture conditions. In this case, by observing the epidermal layers 70 formed in the plurality of first communication passages 16, it is possible to confirm the reproducibility of the formed epidermal layers 70 using one artificial multilayer tissue culture device 1. become.
  • the first communication passages 16 and the second communication passages 22 are also provided.
  • a plurality of pairs of first portions 13B and 13C provided with one passage 22 and second portions 14B and 14C on both sides of the first portions 13B and 13C are provided in the flow direction. May be.
  • first portions 13B and 13C provided with one first communication passage 16 and one second communication passage 22 of the artificial multilayer tissue culture device 1 described in the second embodiment, and the first portions 13B and 13C.
  • a plurality of sets each including the second portions 14B and 14C and the inlet 26 provided near the first communication passage 16 may be provided on both sides in the flow path direction.
  • Epidermal cells 71 for each organ can be seeded.
  • the epidermal layers 70 of different organs can be independently formed and observed on the dermal tissue layer 60 under substantially the same conditions.
  • the present invention can be applied to an artificial multilayer tissue culture device and a method for manufacturing an artificial multilayer tissue.

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Abstract

本発明は、組織切片を作製することなく同じサンプルで時間経過の観察が可能な人工多層組織培養デバイスと人工多層組織の製造方法を提供することを目的とする。　第１基板の一面に開口して第１方向に延び、第１細胞が培養される第１流路（ＦＡ）と、一面に開口して第１方向に延び、第２細胞が培養される第２流路（ＦＢ）と、一面に開口して第１方向に延び、少なくとも培地が供給される第３流路（ＦＣ）と、一面に接合され第１流路、第２流路および第３流路を封止する光透過性を有する第２基板とを有する。第２流路は、第１流路に対して第１方向と交差する第２方向の一方側に第１隔壁（１５）を介して設けられ、第３流路は、第１流路に対して第２方向の他方側に第２隔壁（２１）を介して設けられる。第１隔壁は、第１流路と第２流路とを連通させる第１連通路（１６）を有する。第２隔壁は、第１流路と第３流路とを連通させる第２連通路（２２）を有する。第１連通路は、第１方向に対向し第２流路から第１流路に向けて先細る対向面（１７Ｂ）を有する。

Description

人工多層組織培養デバイスと人工多層組織の製造方法
　本発明は、人工多層組織培養デバイスと人工多層組織の製造方法に関する。
　本願は、２０１８年１０月２９日に出願された米国特許仮出願６２／７５１，７４３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　皮膚モデル等の人工多層組織は、各層の面方向の厚さが大きい。そのため、人工多層組織の断面を観察するためには、人工多層組織を切断し組織切片を作製する必要がある。しかし、この作業は多くの時間とコストを要する。さらに、組織切片を作製する際にサンプルが壊れやすいという問題がある。また、人工多層組織を切断してしまうため、同じサンプルで時間経過を観察することができないという問題がある。
　非特許文献１および非特許文献２には、ゲル流路の両側に媒体流路を隣接して設け、媒体流路からゲル流路に細胞を追加して培養するデバイスが開示されている。
　非特許文献１および非特許文献２に開示されたデバイスでは、ゲル流路および媒体流路が同一平面上に形成されているため、平面の法線方向に観察することにより細胞を切断することなく観察することが可能になる。
MEDICAL SCIENCES, ENGINEERING　"Human 3D vascularized organotypic microfluidic　assays to study breast cancer cell extravasation," by　Jessie S. Jeon, Simone Bersini, Mara Gilardi, Gabriele Dubini,Joseph L. Charest, Matteo Moretti, and Roger D. Kamm, which　appeared in issue 1, January 6, 2015, of Proc Natl Acad Sci USA(112:214－219; first published December 18, 2014; 10.1073/pnas.1417115112) ＡＩＭ　ＢＩＯＴＥＣＨ社、"ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ"、［令和１年１０月１１日検索］、インターネット＜URL： https://www.aimbiotech.com/technology.html＞
　しかしながら、上述したデバイスでは、ゲル流路において細胞組織（以下、ゲル流路組織と呼ぶ）を形成および観察することは可能であるが、媒体流路において多層細胞から構成される組織（以下、媒体流路組織）の形成が困難であり、ゲル流路組織と媒体流路組織から構成される人工多層組織の観察に適しているとはいえない。さらに、媒体流路組織が上皮細胞から構成される場合、上述したデバイスでは、気液界面での組織培養が困難であり、上皮組織の分化制御に適しているとはいえない。
　本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、組織切片を作製することなく同じサンプルで時間経過の観察が可能な人工多層組織培養デバイスと人工多層組織の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明の第１の態様に従えば、第１基板の一面に開口して第１方向に延び、第１細胞が培養される第１流路と、前記一面に開口して前記第１方向に延び、第２細胞が培養される第２流路と、前記一面に開口して前記第１方向に延び、少なくとも培地が供給される第３流路と、前記一面に接合され前記第１流路、前記第２流路および前記第３流路を封止する光透過性を有する第２基板と、を有し、前記第２流路は、前記第１流路に対して前記第１方向と交差する第２方向の一方側に第１隔壁を介して設けられ、前記第３流路は、前記第１流路に対して前記第２方向の他方側に第２隔壁を介して設けられ、前記第１隔壁は、前記第１流路と前記第２流路とを連通させる第１連通路を有し、前記第２隔壁は、前記第１流路と前記第３流路とを連通させる第２連通路を有し、前記第１連通路は、前記第１方向に対向し前記第２流路から前記第１流路に向けて先細る対向面を有することを特徴とする人工多層組織培養デバイスが提供される。
　本発明の第２の態様に従えば、本発明の第１の態様の人工多層組織培養デバイスを準備することと、前記第１流路で第１細胞を培養して第１組織層を形成することと、前記第２流路に前記第２細胞および培地を供給するとともに、前記第３流路に培地を供給することと、前記人工多層組織培養デバイスの姿勢を調整して、前記第１流路の上側に前記第２流路を位置させ、前記第１連通路に露出する前記第１組織層上に前記第２細胞を配置することと、前記第１組織層上に配置した前記第２細胞を前記第２流路の前記培地で培養することと、を含むことを特徴とする人工多層組織の製造方法が提供される。
　本発明によれば、組織切片を作製することなく同じサンプルで時間経過の観察が可能な人工多層組織培養デバイスと人工多層組織の製造方法を提供することができる。本発明によれば、例えば、上皮組織と内皮組織を同時に有する多層組織の構築および観察が可能になる。
本発明の人工多層組織培養デバイスを有する人工多層組織観察システムＳＹＳの概略的な斜視図である。 第１基板１０を上側から視た平面図である。 図２におけるＡ－Ａ線視断面図である。 第１部分１３Ｂ、１３Ｃ近傍を－Ｚ側から視た部分平面図である。 人工多層組織培養デバイス１を用いて培養されて形成された人工多層組織を－Ｚ側から視た部分平面図である。 人工多層組織５０の製造過程を示す部分平面図である。 人工多層組織５０の製造過程を示す部分平面図である。 人工多層組織５０の製造過程を示す部分平面図である。 真皮組織層６０上に、10-50cellsの表皮細胞７１を配置（播種）した状態を撮像した画像である。 10-50cellsの表皮細胞７１で一日培養後の第１連通路１６における真皮組織層６０および表皮層７０を撮像した画像である。 同真皮組織層６０および表皮層７０を撮像した蛍光画像である。 表皮層７０をＹ方向に撮像した蛍光画像である。 本発明の第２実施形態の人工多層組織培養デバイス１を有する人工多層組織観察システムＳＹＳの概略的な斜視図である。 第２実施形態の第１基板１０を上側から視た平面図である。 人工多層組織５０の製造過程を示す部分平面図である。 人工多層組織培養デバイス１を用いて培養されて形成された人工多層組織５０を－Ｚ側から視た部分平面図である。
　以下、図面を参照して本発明の人工多層組織培養デバイスと人工多層組織の製造方法を適用した実施の形態について詳細に説明する。なお、以下の説明で用いる図面は、本発明の実施形態の構成を説明するためのものであり、図示される各部の大きさや厚さや寸法等は、実際の歯ブラシの寸法関係とは異なる場合がある。
［人工多層組織観察システム］
　図１は、本発明の第１実施形態の人工多層組織培養デバイス１を有する人工多層組織観察システムＳＹＳの概略的な斜視図である。
　図１に示すように、人工多層組織観察システムＳＹＳは、人工多層組織培養デバイス１と観察装置２とを備えている。
［人工多層組織培養デバイスの第１実施形態］
　人工多層組織培養デバイス１は、いずれも平面視で矩形板形状の第１基板１０および第２基板３０を備えている。第１基板１０と第２基板３０とは、例えば、接着材等により上下方向に接合された直方体形状である。第１基板１０は、下面（一面）１０ａにおいて第２基板３０と接合されている。
　第１基板１０と第２基板３０とは、例えば、一辺の長さが数ｍｍ～数十ｍｍである。また、第１基板１０の厚さとしては、例えば、数ｍｍである。第２基板３０の厚さとしては、例えば、数百μｍである。
　第１基板１０の素材としては特に限定されないが、例えば、エラストマーであり、シリコーンゴム、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などが挙げられる。本実施形態の第１基板１０は、空気透過性の観点からＰＤＭＳで形成されている。
　第２基板３０の素材としては特に限定されないが、例えば、エラストマーであり、シリコーンゴム、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などやガラスなどが挙げられる。本実施形態の第２基板３０は、光透過性および空気透過性の観点からＰＤＭＳで形成されている。
　図２は、第１基板１０を上側から視た平面図である。
　図２に示すように、第１基板１０は、幅方向（図２中、左右方向）の略中央に設けられ第１細胞が培養される第１流路ＦＡと、第１流路ＦＡの上記幅方向の一方側（図２中、左側）に配置され第２細胞が培養される第２流路ＦＢと、上記幅方向の他方側（図２中、右側）に配置され第３細胞が培養される第３流路ＦＣとを有している。
　なお、以下では、第１基板１０と第２基板３０との接合方向（下面１０ａの法線方向）をＺ方向とし、第１流路ＦＡ、第２流路ＦＢおよび第３流路ＦＣが並ぶ上記幅方向をＹ方向（第２方向）とし、Ｚ方向およびＹ方向と直交する方向をＸ方向（第１方向）として説明する。
　第１流路ＦＡは、Ｘ方向に延びて形成されている。第１流路ＦＡの－Ｘ側端部には、インレット１１Ａが設けられている。第１流路ＦＡの＋Ｘ側端部には、アウトレット１２Ａが設けられている。インレット１１Ａおよびアウトレット１２Ａは、それぞれ断面円形でＺ方向に延び第１基板１０を貫通している。
　第２流路ＦＢの－Ｘ側端部には、インレット１１Ｂが設けられている。第２流路ＦＢの＋Ｘ側端部には、アウトレット１２Ｂが設けられている。インレット１１Ｂおよびアウトレット１２Ｂは、それぞれ断面円形でＺ方向に延び第１基板１０を貫通している。第２流路ＦＢは、Ｘ方向の中央で第１流路ＦＡと平行にＸ方向に沿って配置された第１部分１３Ｂと、第１部分１３ＢのＸ方向両側に配置された第２部分１４Ｂとを有している。各第２部分１４Ｂは、第１部分１３ＢからＸ方向に離れるのに従って、第１流路ＦＡからのＹ方向の距離が大きくなる方向に延びている。
　第３流路ＦＣの－Ｘ側端部には、インレット１１Ｃが設けられている。第３流路ＦＣの＋Ｘ側端部には、アウトレット１２Ｃが設けられている。インレット１１Ｃおよびアウトレット１２Ｃは、それぞれ断面円形でＺ方向に延び第１基板１０を貫通している。第３流路ＦＣは、Ｘ方向の中央で第１流路ＦＡと平行にＸ方向に沿って配置された第１部分１３Ｃと、第１部分１３ＣのＸ方向両側に配置された第２部分１４Ｃとを有している。各第２部分１４Ｃは、第１部分１３ＣからＸ方向に離れるのに従って、第１流路ＦＡからのＹ方向の距離が大きくなる方向に延びている。
　図３は、図２におけるＡ－Ａ線視断面図である。図４は、第１部分１３Ｂ、１３Ｃ近傍を－Ｚ側から視た部分平面図である。
　図３に示すように、第１流路ＦＡ、第２流路ＦＢおよび第３流路ＦＣは、第１基板１０の下面１０ａに開口する溝で形成されている。すなわち、第１流路ＦＡ、第２流路ＦＢおよび第３流路ＦＣは、ＸＹ平面と平行な同一平面内に配置されている。
　第２流路ＦＢの第１部分１３Ｂは、第１流路ＦＡに対して第１隔壁１５を介して設けられている。図４に示すように、第１隔壁１５は、第１流路ＦＡと第２流路ＦＢの第１部分１３Ｂとを連通させる第１連通路１６を有している。第１連通路１６は、第１隔壁１５をＹ方向に貫いて形成されている。第１連通路１６の深さは、第１流路ＦＡおよび第２流路ＦＢの深さと同一である。
　第１連通路１６は、第２流路ＦＢ側に位置しＸ方向に対向する対向面１７Ｂと、第１流路ＦＡ側に位置しＸ方向に対向する第２対向面１８Ｂとを有する。対向面１７Ｂは、第２流路ＦＢから第１流路ＦＡに向けて先細る。第２対向面１８Ｂは、対向面１７Ｂの先細った端部から第１流路側ＦＡに向けて拡径する。
　対向面１７Ｂ同士の交差角度は特に限定されないが、例えば、９０度程度とすることができる。第２対向面１８Ｂ同士の交差角度は特に限定されないが、例えば、第１流路ＦＡに供給された細胞外マトリックス成分の溶液が表面張力によって第２流路ＦＢに漏れない角度が好ましく、例えば６０度である。
　第１隔壁１５における第２流路ＦＢに臨む壁面および対向面１７Ｂには、第２細胞の付着を抑制する表面処理が施されている。当該表面処理としては、一例として、まず無血清培地にPluronic F-127を0.2 wt%溶かした溶液を第２流路に流し込み、１時間以上反応させる。その後、乾燥しないままで細胞懸濁液を第２流路に流し込む処理が挙げられる。
　第１隔壁１５は、第１流路ＦＡ、第２流路ＦＢおよび第１連通路１６と離れた領域に第１空気収容部１９Ｂを有している。図２に示されるように、第１空気収容部１９Ｂは、空気導入路２４Ｂを介して、第１基板１０を貫通する空気インレット２５Ｂに接続され空気が導入される。第１基板１０を形成するＰＤＭＳは、空気透過性を有しているため、第１空気収容部１９Ｂに収容された空気は、第１隔壁１５を介して第１流路ＦＡ、第２流路ＦＢおよび第１連通路１６に供給可能である。第１空気収容部１９Ｂには、矩形断面でＺ方向に延びる柱部２０Ｂが複数設けられている。複数の柱部２０Ｂは、Ｘ方向に間隔をあけて配置されている。柱部２０Ｂの先端面は、第１基板１０の下面１０ａと面一である。
　第３流路ＦＣの第１部分１３Ｃは、第１流路ＦＡに対して第２隔壁２１を介して設けられている。第２隔壁２１は、第１流路ＦＡと第３流路ＦＣの第１部分１３Ｃとを連通させる第２連通路２２を有している。第２連通路２２は、第２隔壁２１をＹ方向に貫いて形成されている。第２連通路２２の深さは、第１流路ＦＡおよび第３流路ＦＣの深さと同一である。
　第２連通路２２は、Ｘ方向に対向する対向面１８Ｃを有する。対向面１８Ｃは、第１流路ＦＡから第３流路ＦＣに向けて先細る。対向面１８Ｃ同士の交差角度は特に限定されないが、例えば、第１流路ＦＡに供給された細胞外マトリックス成分の溶液が表面張力によって第３流路ＦＣに漏れない角度が好ましく、例えば６０度である。
　第１隔壁１５における第２流路ＦＢに臨む壁面および対向面１７Ｂには、第２細胞の付着を抑制する表面処理が施されていたが、第２隔壁２１における第３流路ＦＣに臨む壁面には、第３細胞の付着を抑制する表面処理が非処理である。
　第２隔壁２１は、第１流路ＦＡ、第３流路ＦＣおよび第２連通路２２と離れた領域に第２空気収容部１９Ｃを有している。図２に示されるように、第２空気収容部１９Ｃは、空気導入路２４Ｃを介して、第１基板１０を貫通する空気インレット２５Ｃに接続され空気が導入される。第２空気収容部１９Ｃに収容された空気は、第２隔壁２１を介して第１流路ＦＡ、第３流路ＦＣおよび第２連通路２２に供給可能である。第２空気収容部１９Ｃには、矩形断面でＺ方向に延びる柱部２０Ｃが複数設けられている。複数の柱部２０Ｃは、Ｘ方向に間隔をあけて配置されている。柱部２０Ｃの先端面は、第１基板１０の下面１０ａと面一である。
　第２基板３０は、第１基板１０の下面１０ａに接合されることにより、第１隔壁１５、第２隔壁２１、柱部２０Ｂ、２０Ｃの先端面にも接合され、下面１０ａに開口する第１流路ＦＡ、第２流路ＦＢおよび第３流路ＦＣを封止する。第１隔壁１５は第１空気収容部１９Ｂを有し、第２隔壁２１は第２空気収容部１９Ｃを有しているため強度が小さくなるが、柱部２０Ｂ、２０Ｃの先端面が第２基板３０に接合されることにより、人工多層組織培養デバイス１としての強度を補強することができる。
　観察装置２は、人工多層組織培養デバイス１におけるの－Ｚ側に配置されている。観察装置２は、第１連通路１６および第２連通路２２を－Ｚ側から観察可能な位置に配置されている。
［人工多層組織］
　次に、上記の人工多層組織培養デバイス１を用いて形成される人工多層組織について説明する。
　図５は、人工多層組織培養デバイス１を用いて培養されて形成された人工多層組織５０を－Ｚ側から視た部分平面図である。
　人工多層組織５０は、真皮組織層（第１組織層）６０と表皮層（第２組織層）７０とを含む。真皮組織層６０は、第１流路ＦＡと、第１連通路１６における第２対向面１８Ｂの間と、第２連通路２２における対向面１８Ｃの間とに形成されている。第２対向面１８Ｂの間および対向面１８Ｃの間に形成された真皮組織層６０は、第２対向面１８Ｂとの相互作用、および対向面１８Ｃとの相互作用によって第２流路ＦＢ側および第３流路ＦＣ側に膨らむ曲面のメニスカスを形成している。
　真皮組織層６０は、細胞外マトリックス成分６１中の真皮細胞（第１細胞）６２を培養することにより形成されたものである。細胞外マトリックス成分６１としては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、スロンビン、アプロチニン、アルギン酸などを例示することができる。
　真皮細胞６２としては、例えば、線維芽細胞を用いることができる。線維芽細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来線維芽細胞が好ましい。ヒト由来線維芽細胞としては、ヒト皮膚線維芽細胞（Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF）、ヒト肺線維芽細胞：Human Pulmonary Fibroblasts (HPF)、ヒト心臓線維芽細胞：Human Cardiac Fibroblasts (HCF)、ヒト大動脈外膜線維芽細胞：Human Aortic Adventitial Fibroblasts (HAoAF)、ヒト子宮線維芽細胞：Human Uterine Fibroblasts (HUF)、ヒト絨毛間葉系線維芽細胞：Human Villous Mesenchymal Fibroblasts (HVMF)等が挙げられ、ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）が好ましい。
　表皮層７０は、第１連通路１６に露出する真皮組織層６０上に、第２流路ＦＢを介して培地とともに表皮細胞（第２細胞）７１を播種して培養することにより形成されたものである。表皮細胞７１としては、例えば、表皮角化細胞が使用できる。表皮細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来表皮細胞が好ましい。ヒト由来表皮細胞としては、表皮角化細胞、表皮メラノサイトが挙げられ、表皮角化細胞が好ましい。表皮角化細胞としては、正常ヒト表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocytes：NHEK） が挙げられる。表皮メラノサイトとしては、正常ヒト表皮メラノサイト（Normal Human Epidermal Melanocytes：NHEM）が挙げられる。
　なお、第３流路ＦＣは、培地のみが供給される流路であっても、培地および第３細胞として管腔系細胞が供給されて管腔系組織が形成される流路であってもよい。管腔系細胞としては、血管系細胞が挙げられる。第３流路ＦＣにおいて管腔系細胞を培養することにより、第３流路ＦＣの壁面に管腔層を形成することができる。
　血管系細胞としては、血管上皮細胞、血管内皮細胞等が挙げられ、血管内皮細胞が好ましい。血管内皮細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来血管内皮細胞が好ましい。ヒト由来血管内皮細胞としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC）、 ヒト臍帯動脈内皮細胞（Human Umbilical Artery Endothelial Cells：HUAEC） 、ヒト冠状動脈内皮細胞（Human Coronary Artery Endothelial Cells：HCAEC）、 ヒト伏在静脈内皮細胞（Human Saphenous Vein Endothelial Cells：HSaVEC）、 ヒト肺動脈内皮細胞（Human Pulmonary Artery Endothelial Cells：HPAEC）、 ヒト大動脈内皮細胞（Human Aortic Endothelial Cells：HAoEC）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（Human Dermal Microvascular Endothelial Cells：HDMEC）、 ヒト皮膚血管内皮細胞（Human Dermal Blood Endothelial Cells：HDBEC）、 ヒト皮膚リンパ管内皮細胞（Human Dermal Lymphatic Endothelial Cells：HDLEC）、 ヒト肺微小血管内皮細胞（Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells：HPMEC）、 ヒト心臓微小血管内皮細胞（Human Cardiac Microvascular Endothelial Cells：HCMEC）、 ヒト膀胱微小血管内皮細胞（Human Bladder Microvascular Endothelial Cells：HBdMEC）、 ヒト子宮微小血管内皮細胞（Human Uterine Microvascular Endothelial Cells：HUtMEC）等が挙げられ、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）が好ましい。
［人工多層組織５０の製造方法］
　次に、人工多層組織５０の製造方法について説明する。
　本発明に係る人工多層組織５０の製造方法は、人工多層組織培養デバイス１を準備することと、第１流路ＦＡで真皮細胞６２を培養して真皮組織層６０を形成することと、第２流路ＦＢおよびに第３流路ＦＣにそれぞれ培地を供給することと、人工多層組織培養デバイス１の姿勢を調整して、第１流路ＦＡの上側に位置させた第２流路ＦＢに表皮細胞７１を注入し、第１連通路１６に露出する真皮組織層６０上に表皮細胞７１を配置することと、真皮組織層６０上に配置した表皮細胞７１を第２流路ＦＢの培地で培養することとを含む。
　以下、人工多層組織５０の製造方法について、図６乃至図１０を参照して詳細に説明する。
（人工多層組織培養デバイス１の準備）
　人工多層組織培養デバイス１の準備として、上記第１基板１０の下面１０ａに第２基板３０を接着剤等を用いて接合する。これにより、人工多層組織培養デバイス１の準備が完了する。
　第１基板１０の下面１０ａに第２基板３０が接合されたときに、第１連通路１６は、Ｙ軸と直交する断面が矩形となる。
（真皮組織層６０の形成）
　人工多層組織培養デバイス１の準備が完了すると、真皮組織層６０を形成する。真皮組織層６０を形成することにおいては、まず、細胞外マトリックス成分６１と真皮細胞６２との混合物（混合液）を、冷却化下で図２に示したインレット１１Ａから第１流路ＦＡに注入する。上記混合物をインレット１１Ａから第１流路ＦＡに円滑に注入するためには、人工多層組織培養デバイス１のＸＹ平面が水平面と平行となる姿勢で行うことが好ましい。
　本実施形態における細胞外マトリックス成分６１は、複数種のゲルが混在する。具体的には、細胞外マトリックス成分６１は、コラーゲン（Atelocollagen；1.0mg/mL）およびアルギン酸塩（RGD-alginate；5.0mg/mL）を含んでいる。また、真皮細胞６２としては、ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF；5e5cells/ml）を用いた。
　細胞外マトリックス成分６１と真皮細胞６２との混合物が第１流路ＦＡに注ぎ込まれると、真皮細胞６２を含む細胞外マトリックス成分６１は、図６に示されるように、第１連通路１６における第２対向面１８Ｂに接触し、第２流路ＦＢ側に膨らむメニスカスを形成する。同様に、真皮細胞６２を含む細胞外マトリックス成分６１は、第１連通路１６における対向面１８Ｃに接触し、第３流路ＦＣ側に膨らむメニスカスを形成する。
　この後、湿潤に保ちながら混合物を所定条件で培養（インキュベーション）する。培養条件は、一例として、３７℃の温度下で６０分間行った。
　コラーゲンとアルギン酸塩ではゲル化条件が異なり、上記のインキュベーションにより、まずコラーゲンがゲル化する。コラーゲンがゲル化した後に、インレット１１Ａから第１流路ＦＡに塩化カルシウム（CaCl２）を添加する。塩化カルシウムの添加で第１流路ＦＡに生じたカルシウムイオンにより、アルギン酸塩がゲル化する。これにより、第１流路ＦＡには、コラーゲンとアルギン酸塩がゲル化した細胞外マトリックス成分６１が形成される。
　アルギン酸塩は、カルシウムイオンに向かって移動するため、カルシウムイオン（塩化カルシウム）が第２流路ＦＢまたは第３流路ＦＣから添加された場合、アルギン酸塩が第２流路ＦＢまたは第３流路ＦＣに移動する可能性がある。そのため、塩化カルシウムは、第１流路ＦＡにおける第１連通路１６および第２連通路２２から離れた位置（例えば、３ｍｍ程度）から添加されることが好ましい。
　ここで、ゲル化したコラーゲンは柔らかいため、第１連通路１６に露出した真皮組織層６０上に表皮細胞７１が播種された際に第１流路ＦＡ内に落ち込む可能性がある。一方、落ち込むことなく表皮細胞７１を支持するために、フィブリン等の比較的硬いゲルを用いることも考えられるが、フィブリンは溶けやすいため表皮細胞７１を培養しても表皮層７０が形成される前にフィブリンが消滅する可能性がある。
　一方、アルギン酸塩は、フィブリンのようには溶けず、また、コラーゲンと比較して硬いが、収縮が大きいという特性を有している。そのため、本実施形態では、コラーゲン溶液とアルギン酸塩溶液とを第１流路ＦＡに供給後に、先にコラーゲンをゲル化して細胞外マトリックスの基体を形成する。そして、コラーゲンゲルの基体が存在する状態でアルギン酸塩をゲル化している。アルギン酸塩のゲル化により大きな収縮が発生してもコラーゲンゲルの基体により、収縮を緩和することができる。
　従って、本実施形態では、コラーゲンがゲル化した後にカルシウムイオンを添加してアルギン酸塩をゲル化することにより、播種された表皮細胞７１を支持するための強度確保と、細胞外マトリックス成分６１の溶解抑制とを両立している。
　第１流路ＦＡにおいて、細胞外マトリックス成分６１がゲル化すると、図７に示すように、第３流路ＦＣに培地ＭＣを注入するとともに、第２流路ＦＢに表皮細胞７１を含む培地ＭＢを注入する。培地ＭＢ、ＭＣとしては、例えば、ケラチノサイト培地が挙げられる。
　第３流路ＦＣに培地ＭＣを注入し、第２流路ＦＢに表皮細胞７１を含む培地ＭＢを注入すると、人工多層組織培養デバイス１の姿勢を調整して、第２流路ＦＢが第１流路ＦＡの上側に位置させる。すなわち、＋Ｙ側が上側となるように、人工多層組織培養デバイス１を立てる。
　＋Ｙ側が上側となった人工多層組織培養デバイス１において、第２流路ＦＢの第１部分１３Ｂは水平となり、第２部分１４Ｂは第１部分１３Ｂから離れるのに従って上側（＋Ｙ側）に向かう方向に傾く。従って、第２部分１４Ｂの上側に位置する表皮細胞７１は、自重により培地ＭＢに対して沈降した後に、傾斜している第２部分１４Ｂに導かれて第１部分１３Ｂに集積されることになる。また、第１隔壁１５における第２流路ＦＢに臨む壁面および対向面１７Ｂには、表皮細胞７１の付着を抑制する表面処理が施されているため、第１部分１３Ｂに集積された表皮細胞７１を、図８に示すように、第１連通路１６に露出する真皮組織層６０（細胞外マトリックス成分６１）上に効果的に集積・配置することができる。
　真皮組織層６０上に表皮細胞７１が配置されると、例えば、１時間インキュベーションする。培地ＭＢにより表皮細胞７１が培養されるとともに、培地ＭＣにより真皮細胞６２が培養されることにより、図５に示したように、第１連通路１６に露出する真皮組織層６０上に表皮層７０が形成される。
　真皮細胞６２および表皮細胞７１の培養時には酸素が消費されるが、第１隔壁１５に第１空気収容部１９Ｂが設けられ、第２隔壁２１に第２空気収容部１９Ｃが設けられ、第１隔壁１５、第２隔壁２１を形成するＰＤＭＳが空気透過性を有しているため、第１流路ＦＡ、第２流路ＦＢおよび第３流路ＦＣに空気を介して酸素を供給することができる。そのため、酸素不足を生じさせることなく、円滑に真皮組織層６０および表皮層７０を形成することができる。
　同様に、第２基板３０がＰＤＭＳで形成されているため、第２基板３０を介して第１流路ＦＡ、第２流路ＦＢおよび第３流路ＦＣに酸素を供給することができる。
　これら、真皮組織層６０および表皮層７０は、ＸＹ平面と平行な同一平面内に形成されており、薄板状の第２基板３０を介して－Ｚ側から観察装置２を用いて観察することができる。
　図９は、＋Ｙ側が上側となるように、人工多層組織培養デバイス１を立て、第１連通路１６に露出する真皮組織層６０上に、10-50cellsの表皮細胞７１を配置（播種）した状態を撮像した画像である。
　図１０は、上記の表皮細胞７１を一日培養した後の第１連通路１６における真皮組織層６０および表皮層７０を撮像した画像である。
　図９および図１０に示されるように、表皮細胞７１を真皮組織層６０上に配置した直後から、第１流路ＦＡ側に落ち込むことなく、また、細胞外マトリックス成分６１が消滅することなく真皮組織層６０上に表皮層７０を形成される様子を同一サンプルで観察することができた。
　図１１は、図９および図１０に示した真皮組織層６０および表皮層７０を撮像した蛍光画像である。図１２は、表皮層７０をＹ方向に撮像した蛍光画像である。図１１に示されるように、真皮組織層６０上の表皮層７０において、明瞭に撮像された核を有する組織の表面に、薄く撮像された核を有する組織の分化が生じたことを観察できた。また、Ｙ軸と直交する断面が矩形の第１連通路１６に形成された表皮層７０は、図１２に示すように、Ｙ方向視がほぼ矩形であり、第１連通路１６における対向面１７Ｂ間の空間を埋めるように形成されていることを観察できた。
　以上説明したように、本実施形態の人工多層組織培養デバイス１においては、下面１０ａに開口する溝で同一平面内に配置された第１流路ＦＡ、第２流路ＦＢおよび第３流路ＦＣが第１基板１０に形成され、光透過性を有する第２基板３０が下面１０ａに接合されることにより、組織切片を作製することなく第２基板３０を介して生体の人工多層組織５０を観察することが可能になる。
　また、本実施形態の人工多層組織培養デバイス１においては、培地を交換して培養を継続することにより、同じ人工多層組織のサンプルで時間経過の観察が可能になる。
　また、本実施形態の人工多層組織の製造方法においては、真皮組織層６０を形成するための細胞外マトリックス成分６１としてコラーゲンとアルギン酸塩とを用い、先にコラーゲンをゲル化した後にアルギン酸塩をゲル化することにより、細胞外マトリックス成分６１が第１流路ＦＡに側に落ち込んだり、消滅することを防止でき、正常な状態および位置に表皮層７０を形成して観察することが可能になる。
［人工多層組織培養デバイスの第２実施形態］
　続いて、人工多層組織培養デバイスの第２実施形態について、図１３乃至図１６を参照して説明する。
　これらの図において、図１乃至図１２に示す第１実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略する。
　第２実施形態と上記の第１実施形態とが異なる点は、表皮細胞を播種するためのインレットを設けた点である。
　図１３は、本発明の第２実施形態の人工多層組織培養デバイス１を有する人工多層組織観察システムＳＹＳの概略的な斜視図である。図１４は、第２実施形態の第１基板１０を上側から視た平面図である。図１５は、人工多層組織５０の製造過程を示す部分平面図である。図１６は、人工多層組織培養デバイス１を用いて培養されて形成された人工多層組織５０を－Ｚ側から視た部分平面図である。
　図１３～図１６に示すように、第２実施形態に係る第１基板１０は、第１連通路１６の＋Ｙ側に表皮細胞を播種するためのインレット２６を有している。インレット２６は、第２流路ＦＢと一部が交差する位置に配置されて第１基板１０をＺ方向に貫通している。すなわち、インレット２６は、第２流路ＦＢと連通している。インレット２６と第２流路ＦＢとが交差するＹ方向の長さは、例えば、０．２ｍｍ程度である。
　他の構成は、上記第１実施形態と同様である。
　人工多層組織培養デバイス１において、人工多層組織５０を製造する際には、第１流路ＦＡで細胞外マトリックス成分６１がゲル化した後に、図１５に示すように、人工多層組織培養デバイス１を水平にした状態で第３流路ＦＣに培地ＭＣを注入するとともに、インレット２６から第２流路ＦＢに表皮細胞７１を含む培地ＭＢを注入する。このとき、インレット２６は、第２流路ＦＢと連通しているため、表皮細胞７１を一定的な数で注入することができる。
　その後、＋Ｙ側が上側となるように、人工多層組織培養デバイス１を立てる。これにより、インレット２６から第２流路ＦＢに注入された表皮細胞７１は、自重により培地ＭＢに対して沈降し、第１部分１３Ｂに集積される。このとき、第１隔壁１５における第２流路ＦＢに臨む壁面および対向面１７Ｂには、表皮細胞７１の付着を抑制する表面処理が施されているため、第１部分１３Ｂに集積された表皮細胞７１は、第１連通路１６に露出する真皮組織層６０（細胞外マトリックス成分６１）上に効果的に集積・配置することができる。
　このように、本実施形態の人工多層組織培養デバイス１においては、上記第１実施形態の人工多層組織培養デバイス１と同様の作用・効果が得られることに加えて、インレット２６から第２流路ＦＢに表皮細胞７１を注入した後に、さらに、インレット２６空にして空気で満たすことにより、図１６に示すように、インレット２６と培地ＭＢとの交差部に気液界面（Air-liquid interface）２７を形成することができる。そのため、播種した表皮細胞７１を気液界面の直近の位置で培養し表皮層７０の分化を促進することが可能になる。さらに、脂溶性の試薬もこのインレット２６から添加しやすい効果も得られる。
　以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施形態について説明したが、本発明は係る例に限定されないことは言うまでもない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。
　例えば、上記実施形態では、人工多層組織として人工皮膚組織を例示したが、層状の組織であれば、これに限定されるものではない。人工多層組織としては、例えば、上述した線維芽細胞の代わりに、骨格筋細胞または心筋細胞を用いた筋組織や肺系細胞を用いた肺組織であってもよい。さらに、肝細胞を用いた肝臓組織や腸系細胞を用いた腸組織、膵臓系細胞を用いた膵臓組織等の消化器系組織、腎臓系細胞を用いた腎臓組織等の泌尿器系組織、神経系細胞を用いた神経組織であってもよい。このような組織に本発明を適用する場合には、上記実施形態で用いた細胞外マトリクスは必ずしも存在していなくてもよく、各種細胞のみを集積したものであってもよい。
　また、上記実施形態では、人工多層組織培養デバイス１に第１連通路１６および第２連通路２２がそれぞれ一つずつ設けられる構成を例示したが、この構成に限定されず、複数の第１連通路１６および第２連通路２２が設けられる構成であってもよい。例えば、第１実施形態で説明した人工多層組織培養デバイス１の第１部分１３Ｂ、１３Ｃに複数の第１連通路１６および第２連通路２２を設け、各第１連通路１６で表皮細胞７１をほぼ同一の培養条件で培養することができる。この場合、複数の第１連通路１６において形成された表皮層７０を観察することにより、一つの人工多層組織培養デバイス１を用いて、形成された表皮層７０の再現性を確認することが可能になる。第１実施形態で説明した人工多層組織培養デバイス１において、第１部分１３Ｂ、１３Ｃに第１連通路１６および第２連通路２２を複数設ける構成の他に、第１連通路１６および第２連通路２２が一つずつ設けられた第１部分１３Ｂ、１３Ｃと、当該第１部分１３Ｂ、１３Ｃの両側に第２部分１４Ｂ、１４Ｃとで構成される組を流路方向に複数組設ける構成であってもよい。
　また、第２実施形態で説明した人工多層組織培養デバイス１の第１連通路１６および第２連通路２２が一つずつ設けられた第１部分１３Ｂ、１３Ｃと、当該第１部分１３Ｂ、１３Ｃの両側に第２部分１４Ｂ、１４Ｃと、第１連通路１６近傍に設けられたインレット２６とで構成される組を流路方向に複数組設ける構成であってもよい。この構成では、上記と同様に、同一の表皮細胞７１を用いて形成された表皮層７０の再現性を確認することや、例えば、少なくとも二種の臓器の表皮細胞を用い、インレット２６を介して臓器毎の表皮細胞７１を播種することができる。複数種の臓器の表皮細胞を播種した場合、ほぼ同一条件の真皮組織層６０上に異なる臓器の表皮層７０を独立して形成して観察することが可能となる。
　本発明は、人工多層組織培養デバイスと人工多層組織の製造方法に適用できる。
　１…人工多層組織培養デバイス、　１０…第１基板、　１０ａ…下面（一面）、　１３Ｂ、１３Ｃ…第１部分、　１４Ｂ、１４Ｃ…第２部分、　１５…第１隔壁、　１６…第１連通路、　１７Ｂ…対向面、　１８Ｂ…第２対向面、　１９Ｂ…第１空気収容部、　１９Ｃ…第２空気収容部、　２０Ｂ、２０Ｃ…柱部、　２１…第２隔壁、　２２…第２連通路、　２６…インレット、　３０…第２基板、　５０…人工多層組織、　６０…真皮組織層（第１組織層）、　６２真皮細胞（第１細胞）、　７０…表皮層（第２組織層）、　７１…表皮細胞（第２細胞）、　ＦＡ…第１流路、　ＦＢ…第２流路、　ＦＣ…第３流路

Claims (14)

  1. 　第１基板の一面に開口して第１方向に延び、第１細胞が培養される第１流路と、
    　前記一面に開口して前記第１方向に延び、第２細胞が培養される第２流路と、
    　前記一面に開口して前記第１方向に延び、少なくとも培地が供給される第３流路と、
    　前記一面に接合され前記第１流路、前記第２流路および前記第３流路を封止する光透過性を有する第２基板と、
    　を有し、
    　前記第２流路は、前記第１流路に対して前記第１方向と交差する第２方向の一方側に第１隔壁を介して設けられ、
    　前記第３流路は、前記第１流路に対して前記第２方向の他方側に第２隔壁を介して設けられ、
    　前記第１隔壁は、前記第１流路と前記第２流路とを連通させる第１連通路を有し、
    　前記第２隔壁は、前記第１流路と前記第３流路とを連通させる第２連通路を有し、
    　前記第１連通路は、前記第１方向に対向し前記第２流路から前記第１流路に向けて先細る対向面を有することを特徴とする人工多層組織培養デバイス。
  2. 　前記第１連通路は、前記第２流路側に位置する前記対向面と、前記第１流路側に位置し前記対向面の先細った端部から前記第１流路側に向けて拡径する第２対向面とを有する、
    　請求項１に記載の人工多層組織培養デバイス。
  3. 　前記第２流路は、
    　前記第１流路と平行に配置され前記第１連通路が設けられた第１部分と、
    　前記第１部分の前記第１方向の両側に設けられ前記第１部分から前記第１方向に離れるのに従って、前記第１流路からの前記第２方向の距離が大きくなる第２部分とを有する、
    　請求項１または２に記載の人工多層組織培養デバイス。
  4. 　前記第１隔壁の前記第２流路に臨む壁面および前記第１連通路の前記第２流路に臨む壁面には、前記第２細胞の付着を抑制する表面処理が施されている、
    　請求項１から３のいずれか一項に記載の人工多層組織培養デバイス。
  5. 　前記第２隔壁の前記第３流路に臨む壁面および前記第２連通路の前記第３流路に臨む壁面は、前記表面処理が非処理である、
    　請求項４に記載の人工多層組織培養デバイス。
  6. 　前記第１隔壁は、前記第１流路、前記第２流路および前記第１連通路と離れた領域に第１空気収容部を有し、
    　前記第２隔壁は、前記第１流路、前記第３流路および前記第２連通路と離れた領域に第２空気収容部を有し、
    　前記第１基板は、ポリジメチルシロキサンで形成されている、
    　請求項１から５のいずれか一項に記載の人工多層組織培養デバイス。
  7. 　前記第２基板は、ポリジメチルシロキサンで形成されている、
    　請求項６に記載の人工多層組織培養デバイス。
  8. 　前記第１空気収容部と前記第２空気収容部には、前記一面の法線方向に延び先端が前記一面と面一の柱部が設けられている、
    　請求項６または７に記載の人工多層組織培養デバイス。
  9. 　前記第１細胞は真皮細胞であり、
    　前記第２細胞は表皮細胞であり、
    　請求項１から８のいずれか一項に記載の人工多層組織培養デバイス。
  10. 　前記第１連通路より前記第２方向の一方側に、前記第２流路と連通するインレットが設けられる、請求項１から８のいずれか一項に記載の人工多層組織培養デバイス。
  11. 　請求項１から１０のいずれか一項に記載の人工多層組織培養デバイスを準備することと、
    　前記第１流路で第１細胞を培養して第１組織層を形成することと、
    　前記第２流路に前記第２細胞および培地を供給するとともに、前記第３流路に培地を供給することと、
    　前記人工多層組織培養デバイスの姿勢を調整して、前記第１流路の上側に前記第２流路を位置させ、前記第１連通路に露出する前記第１組織層上に前記第２細胞を配置することと、
    　前記第１組織層上に配置した前記第２細胞を前記第２流路の前記培地で培養することと、
    　を含むことを特徴とする人工多層組織の製造方法。
  12. 　前記第１組織層を形成することは、コラーゲン、アルギン酸塩および第１細胞の混合液を前記第１流路に供給することと、
    　前記混合液を培養して前記コラーゲンをゲル化させることと、
    　前記コラーゲンのゲル化後に前記第１流路にカルシウムイオンを添加して前記アルギン酸塩をゲル化させることと含む、
    　請求項１１に記載の人工多層組織の製造方法。
  13. 　前記第１流路における前記第１連通路と離れた位置から前記カルシウムイオンを添加する、
    　請求項１２に記載の人工多層組織の製造方法。
  14. 　前記第２流路に前記第２細胞および培地を供給することは、
    　前記第１連通路より前記第２方向の一方側に前記第２流路と連通して設けられたインレットから前記第２細胞および培地を供給する、
    　請求項１１から１３のいずれか一項に記載の人工多層組織の製造方法。
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