CN103948962A - 一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法 - Google Patents
一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103948962A CN103948962A CN201410201006.5A CN201410201006A CN103948962A CN 103948962 A CN103948962 A CN 103948962A CN 201410201006 A CN201410201006 A CN 201410201006A CN 103948962 A CN103948962 A CN 103948962A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- temperature
- sensitive hydrogel
- carrier
- growth factor
- bio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 64
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims abstract description 11
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000003999 initiator Substances 0.000 claims abstract description 8
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 claims abstract description 7
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000011837 N,N-methylenebisacrylamide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 claims abstract description 5
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 21
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 21
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 12
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 12
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 8
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 7
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims description 7
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 5
- 108700022290 poly(gamma-glutamic acid) Proteins 0.000 claims description 5
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 4
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 4
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000233803 Nypa Species 0.000 claims description 3
- 235000005305 Nypa fruticans Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 2
- -1 cationic amino acid Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000011557 critical solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 claims description 2
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 claims description 2
- 235000019394 potassium persulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 2
- 229920003213 poly(N-isopropyl acrylamide) Polymers 0.000 claims 4
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical group OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 claims 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract 2
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 abstract 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 229920001499 Heparinoid Polymers 0.000 description 1
- 108010020346 Polyglutamic Acid Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229940045110 chitosan Drugs 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000013267 controlled drug release Methods 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000002554 heparinoid Substances 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005213 imbibition Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 1
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明公开了一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法。是以γ-聚谷氨酸(γ-PGA)、牛磺酸、N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)为主要原料，N，N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)为交联剂，过硫酸铵或过硫酸钾为引发剂，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)为促进剂。本发明主要采用半互穿网络技术，制备方法包括γ-PGA-S72单体的合成、温敏水凝胶生物载体的制备、温敏水凝胶生物载体的纯化和温敏水凝胶生物载体与生长因子的结合四个步骤。本发明的原料来源丰富、制备方法简单。本发明的结合生长因子型温敏水凝胶具有良好的生物相容性，在组织工程支架、生物药物载体、生物粘合剂和创伤敷料等生物医疗领域具有广阔的应用前景。
Description
【技术领域】：本发明涉及生物材料、组织工程和高分子材料领域，具体涉及一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法。
【背景技术】：生物医学组织工程是一个涉及细胞生物学、材料科学、反应器工程和临床医学的多学科交叉研究领域。其目的在于构建新的组织和器官。最初认为，所谓组织工程就是将细胞置于适合的反应器条件下进行三维培养，使其构建成为组织，并进而发展成为人体器官的替代物。组织工程的三要素就是支架材料、种子细胞和生长因子。
用于组织工程的支架材料必须具有良好的生物相容性；良好的细胞亲和性；合适的生物降解性和降解速率；可负载生长因子及传递生物信号等特点。目前可用于组织工程的支架材料有：无机材料，羟基磷灰石、磷酸钙；天然高分子材料，壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸、丝胶、聚谷氨酸；合成材料，聚乳酸、聚己内酯等。
水凝胶是一类引起组织工程领域极大关注的生物材料。因为水凝胶具有高度的生物相容性以及可与软组织媲美的机械特性。水凝胶是以水为分散介质的凝胶，在具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀形成交联聚合物。
聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)具有温度敏感性，其LCST约为32℃。Okano等根据PNIPAAm的疏-亲水性间可逆变化的特性，将PNIPAAm以共价键形式固定在聚苯乙烯板(TCPS)表面进行细胞培养。37℃时细胞在TCPS表面粘附增殖，当温度由37℃降至32℃时，TCPS由疏水性转化为亲水性，即接枝有PNIPAAm的TCPS吸水膨胀，整体细胞群则在保持细胞间连接状态下以片状的形态得以脱附，这种方法经济、方便，可以更好地保持细胞的分化特性及细胞的完整性。然而此类凝胶存在机械性能差、易碎、生物相容性差等缺点，不利于在组织工程等领域应用。
γ-聚谷氨酸是由谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基以酰胺键的方式缩合而成的一种多肽型高分子。γ-PGA具有良好的生物相容性和生物降解性，可单独使用或者与传统的组织工程材料结合用于组织修复，引入γ-PGA可改善材料的细胞亲和性，更有利于细胞的粘附和增殖；也可用于药物载体提供药物缓释性和靶向性。
干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度的自我复制能力、高度增殖和多向分化性能，可分化成多种功能细胞及组织器官，在治疗各种细胞损伤性疾病等方面拥有极强的优越性。胚胎干细胞(ES)/诱导多能干细胞(iPS)比其它干细胞更为原始，其扩增能力更强，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。但是胚胎干细胞面临着伦理道德和法律问题，使得iPS细胞的出现，在干细胞研究领域、表观遗传学研究领域以及生物医学研究领域都引起了强烈的反响。
细胞生长因子在促进干细胞自我更新和定向分化的过程中扮演着重要的角色，但是生长因子都是分子量不大的可溶性多肽，对于微环境中的pH值变化、有机溶剂、超声波及酶等都非常敏感，易于变性或降解，而且生长因子的半衰期较短，如果采用传统的将生长因子加入细胞培养液的方式，其诱导作用将很快失效；同时，过量的生长因子加入会导致细胞的癌变。因此，细胞支架材料设计必须能够稳定生长因子的活性并达到对其控制释放的目的。肝素和硫酸化蛋白多糖等通过静电相互作用来保持生长因子在体内的稳定性。据报道肝素、硫酸化蛋白多糖和合成的类肝素都具有保护生长因子活性的作用，因为当硫酸化多糖和生长因子相结合时，多糖中的硫酸化基团首先和生长因子中的碱性氨基酸残基相结合，使其不被迅速降解。因此肝素与类肝素物质通过与生长因子的特异结合性，控制其缓慢释放，从而更好地发挥生长因子对细胞的诱导及刺激分化作用。硫酸化的γ-PGA与肝素结构类似，同时是一种微生物发酵产物、可降解、降解产物无毒，无异源病毒污染，并且比肝素使用更加安全、可靠。所以可采用γ-PGA-S72作为温敏水凝胶载体中保护生长因子活性和控制释放生长因子的大分子物质，制备功能性生物载体。
查阅国内外文献发现，目前尚无将γ-PGA-S72和PNIPAAm相结合的报导。本发明综合考虑了γ-PGA-S72的生物相容性和能够保护生长因子缓慢释放的特点，采用半互穿网络技术，将γ-PGA-S72引入到PNIPAAm水凝胶网络中，制备得到结合生长因子型温敏水凝胶生物载体，提高传统水凝胶的生物相容性、温度响应性、细胞片层脱附和保护并缓慢释放生长因子等特性。
【发明内容】：为了克服目前水凝胶存在的生物相容性不足的问题，本发明目的在于设计一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体，使该凝胶具有高透明性、快速温度响应性、良好的生物相容性、保护生长因子缓慢释放的特性和细胞片层脱附的功能。
为实现上述目的，本发明提供了一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，包括下述步骤：
1)γ-PGA-S72单体的合成：将γ-聚谷氨酸和牛磺酸在室温下溶解于0.5M的碳酸氢钠溶液中，待溶解完全后将反应液至于4℃的水浴中冷却降温，待冷却后加入缩合剂EDC·HCl搅拌30min，之后将反应液置于室温搅拌24h，50000分子量透析袋透析，冷冻干燥制得γ-PGA-S72单体；
2)凝胶的制备：将NIPAAm和γ-PGA-S72溶解于去离子水中，PNIPAAm和γ-PGA-S72单体在水溶液中的质量百分比浓度分别为3～5％和2～8％，20～25℃搅拌25～45min至完全溶解，将反应液置于冰水浴中冷却降温至0～4℃，加入质量百分比浓度为2～6％的交联剂搅拌均匀，在N2保护和磁力搅拌下加入质量百分比浓度为0.5～2％的引发剂水溶液，搅拌5～15min后，向混合液中加入促进剂50～120μL，搅拌30～60s，将溶液缓慢倒入厚度为1.5mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在20～25℃，24～48h后停止反应；
3)凝胶的纯化：将反应后的产物用直径为18mm的打孔器进行打孔，浸泡于去离子水中7～10天，每间隔6～8小时更换去离子水，以除去未完全反应的单体、交联剂和各种杂质，制得所述的温敏水凝胶生物载体；
4)与生长因子的结合：将步骤3所得的温敏水凝胶置于体积浓度为75％的酒精中浸泡30min进行灭菌，之后用无菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精，将凝胶浸泡于浓度为50ng/ml的含有0.1％BSA的PBS溶液中4℃10h，之后用PBS冲洗3次，制得结合生长因子型温敏水凝胶生物载体。
所述的N-异丙基丙烯酰胺单体分子结构中存在着一定比例的疏水基团(异丙基，-CH(CH3)2)和亲水基团(酰胺基团，-CO-NH-)，它们会竞争性地和水分子产生氢键作用力。在较低温度下及外界温度小于PNIPAAm的低临界溶解温度(LCST≈32℃)时，PNIPAAm与水分子之间的相互作用力主要体现为酰胺基团和水分子之间的氢键作用，此时分子链呈现伸展的线团构象，随着温度升高，当T＞LCST时，部分与水分子形成的氢键被破坏，PNIPAAm大分子内酰胺键之间会形成氢键，形成疏水层，将水分子排出。由于PNIPAAm在人体生理温度附近(LCST≈32℃)表现出优良的温度响应性，使得它在组织工程温敏支架材料中得到广泛的应用。
所述的γ-聚谷氨酸是由谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基以酰胺键的方式缩合成的一种多肽型高分子，γ-PGA的分子链上含有大量的活性较高游离侧链羧基(-COOH)，使得它具有极好的吸水保湿性，易于与一些药物形成稳定的复合物，是一类理想的可生物降解的生物医用高分子材料。
所述的γ-PGA-S72单体中磺酸基团(-SO3H)和羧基(-COOH)的相对含量之比恰好对碱性成纤维细胞生长因子bFGF具有良好的保护和缓慢释放的功能，对细胞的增殖有很大的促进作用。
所述的交联剂是N，N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，所述的引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾，所述的促进剂为N，N，N’，N’-四甲基乙二胺。
所述的水凝胶溶胀后外观为透明状，当外界温度升至31～35℃后，水凝胶立刻由透明色变为乳白色。
根据上述结合生长因子型温敏水凝胶生物载体，于37℃条件下凝胶表面接种小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)，细胞数量随γ-PGA-S72单体含量的增加而增加。并能够在结合生长因子型温敏水凝胶生物载体表面培养iPS细胞，使得iPS细胞能够呈现弱贴壁的拟胚体样细胞生长，利于保持iPS细胞的全能性。
本发明的原理是：N-异丙基丙烯酰胺单体在引发剂和催化剂的氧化还原作用下，分子结构中的双键打开聚合；由于γ-PGA-S72分子链中的羧基基团和磺酸基团的比例恰好适合与生长因子中阳离子氨基酸结合，从而对凝胶起到了增强生物相容性和保护缓慢释放生长因子的作用。而在聚合过程中加入γ-PGA-S72后，由于γ-PGA-S72为水溶性的分子链并没有双键并不发生聚合，反应完成后只是穿插在聚N-异丙基丙烯酰胺形成的高分子三维网络中，形成了半互穿的结构，又由于γ-PGA-S72分子链中含有极性亲水基团(如-COOH、-SO3H)，可以和酰胺键形成氢键，因此不易从凝胶三维网络中渗出，从仿生构思和网络设计的角度出发，结合生长因子型温敏水凝胶生物载体可以提高温敏水凝胶的生物功能性，将温敏脱附和控制释放生长因子的特性相结合，制备新一代干细胞培养支架材料。
与其他凝胶及其制备方法相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明结合生长因子型温敏水凝胶生物载体制备过程操作简便可控，水相反应无毒无害，具有较高的实用价值；
(2)本发明所制备的结合生长因子型温敏水凝胶生物载体具有高的溶胀度、良好的细胞相容性和良好的保护缓慢释放碱性成纤维细胞生长因子bFGF的性能，可应用于细胞培养支架、药物载体、创伤敷料等方面；
(3)本发明所制备的结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的溶胀度和细胞相容性可以通过调节γ-PGA-S72的含量来实现。并能够在结合生长因子型温敏水凝胶生物载体表面培养iPS细胞，使得iPS细胞能够呈现弱贴壁的拟胚体样细胞生长，利于保持iPS细胞的全能性。
【附图说明】：
图1为结合生长因子型温敏水凝胶生物载体制备机理
图2为实例1结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的SEM图
图3为小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)在实例1结合生长因子型温敏水凝胶生物载体表面生长5天的倒置显微镜图
图4为iPS细胞在实例2结合生长因子型温敏水凝胶生物载体表面生长3天的倒置显微镜图
【具体实施方式】：
实施例1：
1)γ-PGA-S72单体的合成：将645mgγ-聚谷氨酸和626mg牛磺酸在室温下溶解于30ml0.5M碳酸氢钠溶液，待溶解完全后将反应液置于4℃的冰水浴中降温冷却，待冷却后加入1917mg缩合剂EDC·HCl搅拌30min，之后将反应液置于室温搅拌24h，50000分子量透析袋透析，冷冻干燥制得γ-PGA-S72；
2)温敏水凝胶生物载体的制备：将3.39g NIPAAm和0.2712gγ-PGA-S72溶解于去离子水中，25℃搅拌30min至完全溶解，将反应液置于冰水浴中冷却降温至4℃，加入0.139g交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺搅拌均匀，在N2保护和磁力搅拌下加入0.0678g引发剂过硫酸铵水溶液，搅拌15min后，向混合液中加入促进剂50μL，搅拌30s，将溶液缓慢倒入厚度为1.5mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在25℃，48h后停止反应；
3)温敏水凝胶生物载体的纯化：将反应后的产物用直径为18mm的打孔器进行打孔，浸泡于无离子水中7天，每间隔6小时更换去离子水，以除去未完全反应的单体、交联剂和各种杂质，制得所述的温敏水凝胶生物载体；
4)将步骤3所得的温敏水凝胶生物载体置于体积浓度为75％的酒精中浸泡30min进行灭菌，之后用无菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精，将凝胶浸泡于浓度为50ng/ml的含有0.1％BSA的PBS溶液中4℃10h，之后用PBS冲洗3次，制得所述的结合生长因子型温敏水凝胶生物载体。
5)将步骤4所得的温敏水凝胶生物载体进行小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)接种，细胞的接种密度密度是2×104cells/mL。
实施例2：
1)γ-PGA-S72单体的合成：将645mgγ-聚谷氨酸和626mg牛磺酸在室温下溶解于30ml0.5M碳酸氢钠溶液，待溶解完全后将反应液置于4℃的冰水浴中降温冷却，待冷却后加入1917mg缩合剂EDC·HCl搅拌30min，之后将反应液置于室温搅拌24h，50000分子量透析袋透析，冷冻干燥制得γ-PGA-S72；
2)温敏水凝胶生物载体的制备：将3.39g NIPAAm和0.1695gγ-PGA-S72溶解于去离子水中，20℃搅拌45min至完全溶解，将反应液置于冰水浴中冷却降温至4℃，加入0.139g交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺搅拌均匀，在N2保护下和磁力搅拌下加入0.0678g引发剂过硫酸铵水溶液，搅拌15min后，向混合液中加入促进剂50μL，搅拌30s，将溶液缓慢倒入厚度为1.5mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在20℃，30h后停止反应；
3)温敏水凝胶生物载体的纯化：将反应后的产物用直径为18mm的打孔器进行打孔，浸泡于无离子水中10天，每间隔5小时更换去离子水，以除去未完全反应的单体、交联剂和各种杂质，制得所述的温敏水凝胶生物载体。
4)将步骤3所得的温敏水凝胶生物载体置于体积浓度为75％的酒精中浸泡30min进行灭菌，之后用无菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精，将凝胶浸泡于浓度为50ng/ml的含有0.1％BSA的PBS溶液中4℃10h，之后用PBS冲洗3次，制得所述的结合生长因子型温敏水凝胶生物载体。
5)将步骤4所得的温敏水凝胶生物载体进行iPS细胞接种。
Claims (7)
1.一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
1)γ-PGA-S72单体的合成：将γ-聚谷氨酸和牛磺酸在室温下溶解于0.5M碳酸氢钠溶液中，待溶解完全后将反应液置于4℃的冰水浴中冷却降温，待冷却后加入缩合剂EDC·HCl搅拌30min，之后将反应液置于室温搅拌24h，50000分子量透析袋透析，冷冻干燥制得γ-PGA-S72单体；
2)温敏水凝胶生物载体的制备：将NIPAAm和γ-PGA-S72溶解于去离子水中，NIPAAm和γ-PGA-S72单体在水溶液中的质量百分比浓度分别为3～5％和2～8％，20～25℃搅拌25～45min至完全溶解，将反应液置于冰水浴中冷却降温至0～4℃，加入质量百分比浓度为2～6％的交联剂搅拌均匀，在N2保护和磁力搅拌下加入质量百分比浓度为0.5～2％的引发剂水溶液，搅拌5～15min后，向混合液中加入促进剂50～120μL，搅拌30～60s，将溶液缓慢倒入厚度为1.5mm的玻璃器皿中，密封后进行原位自由基聚合反应，控制反应温度在20～25℃，24～48h后停止反应；
3)温敏水凝胶生物载体的纯化：将反应后的产物用直径为18mm的打孔器进行打孔，浸泡于去离子水中7～10天，每间隔6～8小时更换去离子水，以除去未完全反应的单体、交联剂和各种杂质，制得所述的温敏水凝胶生物载体；
4)温敏水凝胶生物载体与生长因子的结合：将步骤3所得的温敏水凝胶置于体积浓度为75％的酒精中浸泡30min进行灭菌，之后用无菌的PBS溶液浸泡2d除去多余的酒精，将凝胶浸泡于浓度为50ng/ml的含有0.1％BSA的PBS溶液中4℃10h，之后用PBS冲洗3次，制得结合生长因子型温敏水凝胶生物载体。
2.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于：所述的N-异丙基丙烯酰胺单体分子结构中存在着一定比例的疏水基团异丙基-CH(CH3)2，以及亲水基团酰胺基团-CO-NH-，它们会竞争性地和水分子产生氢键作用力。在较低温度下及外界温度小于PNIPAAm的低临界溶解温度LCST≈32℃时，PNIPAAm与水分子之间的相互作用力主要体现为酰胺基团和水分子之间的氢键作用，此时分子链呈现伸展的线团构象，随着温度升高，当T＞LCST时，部分与水分子形成的氢键被破坏，PNIPAAm大分子内酰胺键之间会形成氢键，形成疏水层，将水分子排出。由于PNIPAAm在人体生理温度附近LCST≈32℃表现出优良的温度响应性，使得它在组织工程温敏支架材料中得到广泛的应用。
3.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于：所述的γ-聚谷氨酸是由谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基以酰胺键的方式缩合成的一种多肽型高分子，γ-PGA的分子链上含有大量的活性较高游离侧链羧基-COOH，使得它具有极好的吸水保湿性，易于与一些药物形成稳定的复合物，是一类理想的可生物降解的生物医用高分子材料。
4.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于：所述的γ-PGA-S72单体中磺酸基团-SO3H和羧基-COOH的相对含量之比恰好适合与生长因子中阳离子氨基酸结合，从而对温敏水凝胶生物载体起到了增强生物相容性和保护缓慢释放生长因子的作用。
5.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于：所述的交联剂是N，N-亚甲基双丙烯酰胺，所述的引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾，所述的促进剂为N，N，N’，N’-四甲基乙二胺。
6.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于：所述的水凝胶溶胀后外观为透明状，当外界温度升至31～35℃后，水凝胶立刻由透明色变为乳白色。
7.根据权利要求1所述的一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法，其特征在于：根据上述结合生长因子型温敏水凝胶生物载体，于37℃条件下凝胶表面接种小鼠胚胎成纤维细胞，细胞数量随γ-PGA-S72单体含量的增加而增加。并能够在结合生长因子型温敏水凝胶生物载体表面培养iPS细胞，使得iPS细胞能够通过水凝胶的亲疏水性自动脱附，从而避免了酶对细胞增殖和分化的影响。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410201006.5A CN103948962B (zh) | 2014-05-09 | 2014-05-09 | 一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410201006.5A CN103948962B (zh) | 2014-05-09 | 2014-05-09 | 一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103948962A true CN103948962A (zh) | 2014-07-30 |
| CN103948962B CN103948962B (zh) | 2015-07-22 |
Family
ID=51326397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410201006.5A Expired - Fee Related CN103948962B (zh) | 2014-05-09 | 2014-05-09 | 一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103948962B (zh) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104387596A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-03-04 | 南开大学 | 一种温度敏感性水凝胶的制备方法 |
| CN104877087A (zh) * | 2015-04-29 | 2015-09-02 | 武汉理工大学 | 一种具有生物活性的温敏性水凝胶及其制备方法 |
| CN106754364A (zh) * | 2017-03-14 | 2017-05-31 | 南京九寿堂医药科技有限公司 | 一种提高肺癌干细胞富集效率的细胞培养容器 |
| CN109385685A (zh) * | 2018-11-09 | 2019-02-26 | 东华大学 | 一种相转变温度可控的热响应纳米纤维膜的制备方法 |
| CN110292657A (zh) * | 2019-08-12 | 2019-10-01 | 郑州大学第一附属医院 | 一种用于组织修复的生物胶囊及其构建方法 |
| CN111803701A (zh) * | 2020-06-15 | 2020-10-23 | 中国人民解放军海军特色医学中心 | 负载抗菌药物的环γ-聚谷氨酸改性水凝胶的制备方法 |
| CN111803702A (zh) * | 2020-06-15 | 2020-10-23 | 中国人民解放军海军特色医学中心 | 负载生长因子的环γ-聚谷氨酸改性水凝胶的制备方法 |
| CN113318267A (zh) * | 2021-05-27 | 2021-08-31 | 东华大学 | 一种贻贝仿生的红外响应性抗菌水凝胶敷料及其制备方法 |
| CN114716693A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-07-08 | 国家纳米科学中心 | 一种重编程响应性智能型水凝胶材料及其制备方法与应用 |
| CN114796593A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-07-29 | 四川轻化工大学 | 一种医用敷料用抗菌肽-水凝胶及其制备方法和应用 |
| CN116407618A (zh) * | 2023-03-31 | 2023-07-11 | 陕西美芙康生物科技有限公司 | 一种缓释生长因子温敏性凝胶的制备方法 |
| CN117660344A (zh) * | 2023-08-11 | 2024-03-08 | 聊城市人民医院 | 一种双网络水凝胶表面及其制备方法与应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011024556A (ja) * | 2009-07-28 | 2011-02-10 | Yasuhiro Maeno | 豚ブシの製造方法 |
| CN102961782A (zh) * | 2012-12-11 | 2013-03-13 | 天津工业大学 | 一种生长因子控释温敏凝胶及其制备方法 |
| CN103520082A (zh) * | 2013-10-10 | 2014-01-22 | 深圳市金因生物技术有限公司 | 一种含有表皮生长因子的抗衰老组合物及其制备方法 |
-
2014
- 2014-05-09 CN CN201410201006.5A patent/CN103948962B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011024556A (ja) * | 2009-07-28 | 2011-02-10 | Yasuhiro Maeno | 豚ブシの製造方法 |
| CN102961782A (zh) * | 2012-12-11 | 2013-03-13 | 天津工业大学 | 一种生长因子控释温敏凝胶及其制备方法 |
| CN103520082A (zh) * | 2013-10-10 | 2014-01-22 | 深圳市金因生物技术有限公司 | 一种含有表皮生长因子的抗衰老组合物及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 毕思信等: "温敏性半乳糖基化壳聚糖水凝胶的制备及其对HL-7702细胞增殖行为影响的研究", 《高分子学报》 * |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104387596A (zh) * | 2014-11-03 | 2015-03-04 | 南开大学 | 一种温度敏感性水凝胶的制备方法 |
| CN104387596B (zh) * | 2014-11-03 | 2017-02-15 | 南开大学 | 一种温度敏感性水凝胶的制备方法 |
| CN104877087A (zh) * | 2015-04-29 | 2015-09-02 | 武汉理工大学 | 一种具有生物活性的温敏性水凝胶及其制备方法 |
| CN104877087B (zh) * | 2015-04-29 | 2017-11-17 | 武汉理工大学 | 一种具有生物活性的温敏性水凝胶及其制备方法 |
| CN106754364A (zh) * | 2017-03-14 | 2017-05-31 | 南京九寿堂医药科技有限公司 | 一种提高肺癌干细胞富集效率的细胞培养容器 |
| CN109385685A (zh) * | 2018-11-09 | 2019-02-26 | 东华大学 | 一种相转变温度可控的热响应纳米纤维膜的制备方法 |
| CN110292657A (zh) * | 2019-08-12 | 2019-10-01 | 郑州大学第一附属医院 | 一种用于组织修复的生物胶囊及其构建方法 |
| CN111803701A (zh) * | 2020-06-15 | 2020-10-23 | 中国人民解放军海军特色医学中心 | 负载抗菌药物的环γ-聚谷氨酸改性水凝胶的制备方法 |
| CN111803702A (zh) * | 2020-06-15 | 2020-10-23 | 中国人民解放军海军特色医学中心 | 负载生长因子的环γ-聚谷氨酸改性水凝胶的制备方法 |
| CN113318267A (zh) * | 2021-05-27 | 2021-08-31 | 东华大学 | 一种贻贝仿生的红外响应性抗菌水凝胶敷料及其制备方法 |
| CN114716693A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-07-08 | 国家纳米科学中心 | 一种重编程响应性智能型水凝胶材料及其制备方法与应用 |
| CN114796593A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-07-29 | 四川轻化工大学 | 一种医用敷料用抗菌肽-水凝胶及其制备方法和应用 |
| CN116407618A (zh) * | 2023-03-31 | 2023-07-11 | 陕西美芙康生物科技有限公司 | 一种缓释生长因子温敏性凝胶的制备方法 |
| CN116407618B (zh) * | 2023-03-31 | 2024-05-10 | 陕西美芙康生物科技有限公司 | 一种缓释生长因子温敏性凝胶的制备方法 |
| CN117660344A (zh) * | 2023-08-11 | 2024-03-08 | 聊城市人民医院 | 一种双网络水凝胶表面及其制备方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103948962B (zh) | 2015-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103948962B (zh) | 一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法 | |
| Kabir et al. | Cellulose-based hydrogel materials: Chemistry, properties and their prospective applications | |
| Mousavi et al. | Comparative study of collagen and gelatin in chitosan-based hydrogels for effective wound dressing: Physical properties and fibroblastic cell behavior | |
| DeVolder et al. | Hydrogels for in vivo‐like three‐dimensional cellular studies | |
| Zhang et al. | Fabrication of gelatin–hyaluronic acid hybrid scaffolds with tunable porous structures for soft tissue engineering | |
| Chen et al. | Thermo‐responsive chitosan‐graft‐poly (N‐isopropylacrylamide) injectable hydrogel for cultivation of chondrocytes and meniscus cells | |
| Tang et al. | A review on recent advances of Protein-Polymer hydrogels | |
| Chen et al. | Preparation and evaluation of thermo-reversible copolymer hydrogels containing chitosan and hyaluronic acid as injectable cell carriers | |
| CN105327388B (zh) | 一种医用粘合剂及其制备方法 | |
| JP4335316B2 (ja) | アルギネートまたは修飾アルギネートのようなポリサッカライドを含むポリマー | |
| Hasan et al. | Cellulose-based superabsorbent hydrogels | |
| Sun et al. | Covalently crosslinked hyaluronic acid‐chitosan hydrogel containing dexamethasone as an injectable scaffold for soft tissue engineering | |
| CN114716700B (zh) | 一种动态结合天然多酚的可注射双交联水凝胶的制备方法 | |
| JP2017527669A (ja) | 官能性双性イオン性ポリマーおよび混合電荷ポリマー、関連するヒドロゲルならびにこれらの使用方法 | |
| CN106947094A (zh) | 一种pH敏感自修复水凝胶及其制备方法 | |
| CN101130107B (zh) | 含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇凝胶的制备方法 | |
| CN102718991A (zh) | 一种高强度可注射水凝胶及其制备方法 | |
| Burdick et al. | Biomedical hydrogels | |
| CN106866841A (zh) | 一种可注射水凝胶及其制备方法 | |
| CN110627976B (zh) | 一种柞蚕丝素蛋白水凝胶及其制备方法和应用 | |
| CN110152055A (zh) | 海藻酸胺化衍生物/细菌纤维素纳米晶复合凝胶构筑的功能性药物缓释医用敷料 | |
| CN102127234A (zh) | 一种膨胀型水凝胶的制备方法 | |
| CN100441225C (zh) | 氨基酸改性壳聚糖亲核no供体及其合成方法 | |
| CN1330386C (zh) | 用于组织工程的可注射性壳聚糖水凝胶的制备方法 | |
| Cao et al. | A broad-spectrum antibacterial and tough hydrogel dressing accelerates healing of infected wound in vivo |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150722 |