CN102274548A - 一种骨软骨修复梯度活性支架材料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种骨软骨修复梯度活性支架材料及其制备方法与应用,所述活性支架材料主要由分别载荷有生物活性物质的软骨层、钙化层和软骨下骨层组成,其中钙化层置于软骨层和软骨下骨层中间,所述软骨层与钙化层之间、钙化层和软骨下骨层之间由生物医用可降解聚合物有机连接;所述软骨层、钙化层和软骨下骨层具有相互贯通的孔隙;其制备方法为:(1)HA/Col-I复合粉体的制备;(2)生物活性物质控制释放体系的构建;(3)骨软骨修复梯度活性支架材料的成型制备;所述活性支架材料用于制备骨软骨复合体;所述活性支架材料可有效的促进细胞的黏附、增殖和分化,适合骨、软骨的修复重建和营养物质的输送。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域,尤其是一种骨软骨修复梯度活性支架材料及其制备方法与应用。
背景技术
关节骨软骨缺损在临床上十分常见,常常导致患者出现关节疼痛、活动受限,诱发骨关节炎,甚至导致肢体功能障碍和残缺,严重影响患者的生活质量,已成为目前肢体残障的主要原因之一。但成人关节软骨缺乏直接的血液供应和神经支配,并有代谢率低的生理特性,自身修复能力极差,直径>2mm的软骨缺损几乎不能完全修复,如果合并软骨下骨缺损治疗更为困难。临床应用的治疗骨软骨损伤的方法都存在明显的缺点:(1)口服药物、关节腔内注射透明质酸、关节灌洗术和清理术等,只能起到缓解症状,延缓病情进展的作用,不能修复已损伤的软骨及软骨下骨。(2)钻孔术、微骨折术等手术可利用经髓腔自然渗透到钻孔区的、未经过特殊处理的少量MSCs修复缺损,但其刺激所新生成的是疤痕组织和以I型胶原为主的纤维软骨,不具备正常关节软骨的生物力学性能,远达不到关节软骨力学的需要。(3)自体软骨细胞移植或自体骨软骨块嵌合移植,获得了一定的治疗效果,但取材来源有限,供体不足,软骨细胞扩增能力欠佳及对供区造成伤害,留下疤痕等原因大大限制了其应用。(4)同种异体骨软骨移植,虽然可以提供相应位置的供体材料,但存在免疫排斥反应、供体受体融合不完全、软骨分离等弊端,且面临疾病传播的风险。
软骨损伤后理想的治疗效果是在损伤局部形成持久的、具有良好生物学性能的新生透明软骨,软骨下骨缺损则需要在缺损部位形成具有良好生物力学性能的新生软骨下骨组织,与周围正常组织结合为一体并能为软骨提供支撑。组织工程技术,可以利用少量的一种或多种细胞复合到单层或复层具有良好生物学性能的支架上构建出合适形状和大小的组织工程骨软骨复合体,有效克服了自体骨软骨移植中供体不足、软骨细胞扩增能力欠佳的限制,避免异体骨-软骨移植免疫排斥等问题产生的优点,为骨软骨损伤的修复提供了新的希望。国内外对组织工程骨软骨复合组织的构建研究比较深入,从“分层构建”的可行性初探到“一体构建”的动物实验研究取得了阶段性成果,然而目前尚存在缺损区修复组织质量缺陷、与宿主界面整合欠佳及缺乏相应力学功能等主要问题。因此,改善骨软骨复合组织的结构和界面整合情况,在软骨与软骨下骨之间形成有效的骨性结合,设计一体化、呈梯度变化的支架材料成为今后主要的研究方向之一。
生物体的任何一种组织均由细胞和细胞外基质两部分组成,前者是保持组织功能或生命活性的要素,后者是维持这种生命活性要素的支撑体。细胞在体内发挥作用,有赖于与适宜的载体结合,既要阻止细胞迁移出移植区,更重要的是提供了一个有利于细胞增殖和分化的微环境。理想的组织工程支架材料必须能有选择性地和靶细胞上的特异性地黏附受体及生长因子受体相互作用,吸引循环血中的靶细胞迁移至受损部位,并能促进它们的生长和分化;与此同时,在修复重建过程中,支架还必须能被细胞所分泌的酶逐渐降解。因此,支架材料应具有一定的传导性,以利于细胞在支架上的黏附、增殖和分化;可降解性,以利于细胞的消化、吸收;一定的降解速率,以利于降解能和组织的修复重建相匹配。一定的机械强度,以利于在修复初期起到力学支撑的作用。另外,材料的几何尺寸及内部结构、孔径和孔隙率也一直是骨组织工程关注的指标。一般认为,孔径必须大于100μm,否则组织仅能侵入植入物表面,且组织内不易得到充分的养料。孔隙率要求在维持材料一定强度的情况下尽可能的高,这有利于细胞的长入。支架材料的孔隙率至少在70%以上才能保证细胞种植的成功。
生长因子是传递信号的重要蛋白物质,在细胞信号网络中参与细胞分化、增殖、基质合成和调控等许多方面。修复重建的过程正是细胞在生长因子的调控下,在支架材料上黏附、增殖、分化,并消化吸收支架材料,重新构建成组织的过程。在骨软骨修复的不同阶段有大量生长因子表达,这些因子能有效调节修复重建过程中细胞的增殖、分化及凋亡,激励骨软骨的修复重建。
综上所述,理想的一体化层状梯度骨软骨修复材料的制备应考虑到生物活性物质(诱导性)和基质材料(传导性、可降解性等)的优缺点,模拟天然骨软骨基质成分,构建具备一定的孔径、孔隙率及连通性,降解性的梯度复合材料;载荷适宜细胞增殖、分化的特定生物活性物质,并含有适宜的生长因子控释系统。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种骨软骨修复梯度活性支架材料。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述骨软骨修复梯度活性支架材料的应用。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:
一种骨软骨修复梯度活性支架材料,主要由分别载荷有生物活性物质的软骨层、钙化层和软骨下骨层组成,其中钙化层置于软骨层和软骨下骨层中间,所述软骨层与钙化层之间、钙化层和软骨下骨层之间由生物医用可降解聚合物有机连接;所述软骨层由30%-80%II型胶原和20%-70%生物医用可降解聚合物组成,钙化层由10%-40%I型胶原、20%-50%羟基磷灰石和20%-60%生物医用可降解聚合物组成,软骨下骨层由10%-40%I型胶原、30%-70%羟基磷灰石和15%-50%生物医用可降解聚合物组成;所述软骨层、钙化层和软骨下骨层具有相互贯通的孔隙。
上述百分含量为质量百分含量。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料,所述软骨层的厚度为2mm-5mm,钙化层的厚度为50-400微米,软骨下层的厚度为6mm-10mm。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料,所述软骨层、钙化层和软骨下骨层的内部为层结构。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料,所述生物医用可降解聚合物为相同材料。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料,所述生物医用可降解聚合物是PLGA(聚乳酸乙醇酸共聚物)、PHB(聚羟基丁酸酯)、PHBV(聚羟基丁酸酯戊酸酯共聚物)、PLA(聚乳酸)、PGA(聚乙醇酸)、PCL(聚己内酯)或PA(聚酰胺)。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料,所述软骨层孔隙的孔径为200-400微米,钙化层孔隙的孔径为100-200微米,软骨下骨层孔隙的孔径为200-500微米。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料,所述软骨层、钙化层和软骨下骨层的孔隙率为70%-99%,且80%-90%的孔径是互相贯通的。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料,所述生物活性物质为bFGF、TGF和/或BMP等适宜细胞增殖、分化的特定生物活性物质的一种或几种。
上述骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法,具体步骤如下:
(1)HA/Col-I复合粉体的制备:
利用共沉淀法制备一系列不同配比的粉状HA/Col-I复合材料,其中羟基磷灰石含量为50%-80%,I型胶原蛋白含量为20%-50%;
(2)生物活性物质控制释放体系的构建:
用EDC/NHS-Heparin法对步骤(1)制备的HA/Col-I复合粉体及事先制备的II型胶原粉末进行改性处理,利用肝素分子的结合位点通过共价结合方式复合bFGF、TGF、BMP等生物活性物质的一种或几种;或
利用微球化技术用壳聚糖、明胶等材料包埋bFGF、TGF、BMP等生物活性物质的一种或几种;
(3)骨软骨修复梯度活性支架材料的成型制备:在步骤(1)制备的HA/Col-I复合粉体中依次添加生物医用可降解聚合物和致孔剂并混合均匀;II型胶原粉体中依次添加生物医用可降解聚合物和致孔剂并混合均匀;添加二氯甲烷溶解混合粉末中的生物医用可降解聚合物,然后按羟基磷灰石(HA)含量高低从下至上注入模具;同时引入步骤(2)所构建的生物活性物质控制释放体系,经溶剂溶解挥发成型,即得。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法,所述步骤(3)中生物活性物质控制释放体系是用下述方法引入的:
在骨软骨修复梯度活性支架材料成型时,引入负载生物活性物质的HA/Col粉体、II型胶原粉体,从而引入生物活性物质控制释放体系;或
在骨软骨修复梯度活性支架材料成型时,引入负载生物活性物质的壳聚糖、明胶等材料的微球或微粒,从而引入生物活性物质控制释放体系。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法,所述步骤(3)中生物活性物质控制释放体系的引入时,可引入一种生物活性物质的控制释放系统,也可以引入多种生物活性物质的控制释放系统。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法,所述步骤(2)中生物活性物质控制释放体系是用下述方法制成的:
将胶原(指HA/Col-I复合粉体和II型胶原粉末)放入0.05mol/LMES缓冲液(pH 5.6)里浸泡30min备用,将每1-3g肝素溶于200-500ml含有1-3gEDC和0.5-2gNHS的0.05mol/L MES缓冲液中活化10min,按照胶原与肝素重量比1:1-3将备用胶原放入含有肝素和EDC/NHS的MES缓冲液中,37℃恒温下轻轻摇动反应4h;然后把改性后的HA/Col-I复合粉体、II型胶原粉末置于浓度为0.1-100ng/ml的bFGF、TGF、BMP等生物活性物质的PBS溶液(含有0.5%-2%的BSA,0-4mol/L的NaCl)中在37℃下恒温孵育24h-72h,由于改性后的胶原蛋白分子上键合有肝素分子的结合位点,利用这些位点可以与生物活性物质通过共价键相连接,从而使bFGF、TGF、BMP等生物活性物质与I型胶原、II型胶原得以复合;或
利用微球化技术用壳聚糖、明胶等材料包埋的bFGF、TGF、BMP等生物活性物质。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法,所述生物活性物质为bFGF、TGF和/或BMP的一种或几种。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法,所述微球化技术包括交联法、凝聚法、乳化-溶剂蒸发法、溶液包衣法或喷雾干燥法。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法,所述致孔剂为氯化钠、氯化钾、蔗糖或甘露醇等高溶解性颗粒。
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法,所述步骤(2)中生物活性物质控制释放体系是用下述方法制成的:
将HA/Col-I复合粉体及事先制备的II型胶原粉末放入0.05mol/L MES缓冲液(pH 5.6)里浸泡30min备用,将每2.5g肝素溶于300ml含有2gEDC和1.5gNHS的0.05mol/L MES缓冲液中活化10min,按照胶原与肝素重量比1∶2将备用胶原放入含有肝素和EDC/NHS的MES缓冲液中,37℃恒温下轻轻摇动反应4h;然后把改性后的HA/Col-I复合粉体、II型胶原粉末置于70ng/ml bFGF的PBS溶液(含有1.5%BSA,4mol/L NaCl)中在37℃下恒温孵育60h,由于改性后的胶原蛋白分子上键合有肝素分子的结合位点,利用这些位点可以与生物活性物质通过共价键相连接,从而使bFGF、TGF、BMP等生物活性物质与I型胶原、II型胶原得以复合;或
将80ng/ml bFGF在50℃温度下,分散在20%(w/v)明胶溶液中并通过雾化器雾化,滴入5℃无水液状石蜡胶凝,冷冻干燥24小时,形成负载bFGF的明胶微球
优选的,上述骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法,具体步骤如下:
(1)以I型胶原、四水硝酸钙、磷酸氢二铵为原料,氨水调节PH=8.0,采用共沉淀法制备HA/Col粉体,所制备的HA/Col-I复合粉体中,I型胶原含量为35%,羟基磷灰石含量为65%;
(2)利用EDC/NHS-Heparin法构建生物活性物质控制释放体系,将HA/Col-I复合粉体及事先制备的II型胶原粉体放入0.05mol/LMES缓冲液(pH 5.6)里浸泡30min备用,将每2.5g肝素溶于300ml含有2gEDC和1.5gNHS的0.05mol/L MES缓冲液中活化10min,按照胶原与肝素重量比1∶2将备用胶原放入含有肝素和EDC/NHS的MES缓冲液中,37℃恒温下轻轻摇动反应4h;然后把改性后的HA/Col-I复合粉体、II型胶原粉末置于70ng/ml BMP的PBS溶液(含有1.5%BSA,4mol/L NaCl)中在37℃下恒温孵育60h,由于改性后的胶原蛋白分子上键合有肝素分子的结合位点,利用这些位点可以与生物活性物质通过共价键相连接,从而使BMP与I型胶原、II型胶原得以复合;其中,0.05mol/L(pH 5.6)MES缓冲液:准确称取4.8805g MES溶于400ml去离子水中,搅拌溶解,定容至500ml,用2mol/L NaOH调至pH 5.6,即得;
(3)首先,将1kg PLGA(PLGA75∶25,Mw=50000)、1kg HA/Col-I复合粉体和8kg 100目大小的NaCl微粒;1kg PLGA、2kg HA/Col-I复合粉体和7kg 40目大小的NaCl微粒;以及1kg PLGA、1kgII型胶原粉体和8kg 50目大小的NaCl微粒分别混合均匀,分别添加二氯甲烷溶解混合微粒中的PLGA,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上依次注入模具;同时引入步骤(2)所构建的生物活性物质控制释放体系,经二氯甲烷溶解挥发成型,去离子水将氯化钠溶解,超声清洗,即得骨软骨修复梯度支架材料。
上述骨软骨修复梯度活性支架材料在制备骨软骨复合体方面的应用。
本发明的有益效果是:
上述骨软骨修复梯度活性支架材料,在多层结构中引用了同一种材料,黏合牢固,可有效解决软骨与骨的整合问题;引入了生物活性物质释放系统,可有效的促进细胞的黏附、增殖和分化;对软骨层、钙化层和软骨下骨层材料的孔隙分别设计,各层具有不同的孔径及孔隙率,且相互贯通,分别适合骨、软骨的修复重建和营养物质的输送;其制备方法简单,适合规模化工业生产的需要。
附图说明
图1是本发明实施例1所述骨软骨修复梯度活性支架材料的结构示意图。
图中:1-软骨层2-钙化层3-软骨下骨层
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案,下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为购买得到的;以下实施例中所用的原料、试剂,如无特别说明,均为质量百分含量;下述实施例中所用的EDC/NHS-Heparin法指EDC/NHS交联和肝素复合同步法,EDC,即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐;NHS,即N-羟基琥珀酰亚胺。
实施例1
(1)以I型胶原、四水硝酸钙、磷酸氢二铵为原料,氨水调节PH=8.0,采用共沉淀法制备HA/Col粉体,所制备的HA/Col-I复合粉体中,I型胶原含量为35%,羟基磷灰石含量为65%;
(2)利用EDC/NHS-Heparin法构建生物活性物质控制释放体系,将HA/Col-I复合粉体及事先制备的II型胶原粉体放入0.05mol/LMES缓冲液(pH 5.6)里浸泡30min备用,将每2.5g肝素溶于300ml含有2gEDC和1.5gNHS的0.05mol/L MES缓冲液中活化10min,按照胶原与肝素重量比1∶2将备用胶原放入含有肝素和EDC/NHS的MES缓冲液中,37℃恒温下轻轻摇动反应4h;然后把改性后的HA/Col-I复合粉体、II型胶原粉末置于70ng/ml BMP的PBS溶液(含有1.5%BSA,4mol/L NaCl)中在37℃下恒温孵育60h,由于改性后的胶原蛋白分子上键合有肝素分子的结合位点,利用这些位点可以与生物活性物质通过共价键相连接,从而使BMP与I型胶原、II型胶原得以复合;其中,0.05mol/L(pH 5.6)MES缓冲液:准确称取4.8805g MES溶于400ml去离子水中,搅拌溶解,定容至500ml,用2mol/L NaOH调至pH 5.6,即得;
(3)首先,将1kg PLGA(PLGA75∶25,Mw=50000)、0.75kg HA/Col-I复合粉体和7kg 100目大小的NaCl微粒,1kg PLGA、1kg HA/Col-I复合粉体和8kg 100目大小的NaCl微粒,1kg PLGA、1.33kg HA/Col-I复合粉体和9.32kg 100目大小的NaCl微粒,1kg PLGA、1.8kgHA/Col-I复合粉体和11.2kg 100目大小的NaCl微粒;1kg PLGA、2kg HA/Col-I复合粉体和7kg 40目大小的NaCl微粒,1kg PLGA、2.6kg HA/Col-I复合粉体和8.4kg 40目大小的NaCl微粒,1kg PLGA、3.5kg HA/Col-I复合粉体和10.5kg 40目大小的NaCl微粒,1kgPLGA、5.1kg HA/Col-I复合粉体和14.2kg 40目大小的NaCl微粒;以及1kg PLGA、1kg II型胶原粉体和8kg 50目大小的NaCl微粒,1kg PLGA、0.67kg II型胶原粉体和6.68kg 50目大小的NaCl微粒,1kg PLGA、0.43kg II型胶原粉体和5.72kg 50目大小的NaCl微粒分别混合均匀,并分别添加二氯甲烷溶解混合微粒中的PLGA,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上依次注入模具;同时引入步骤(2)所构建的生物活性物质控制释放体系,经二氯甲烷溶解挥发成型,去离子水将氯化钠溶解,超声清洗,即得骨软骨修复梯度支架材料。
如图1所示,该支架材料中软骨层、钙化层和软骨下骨层的内部为层结构,其中软骨层中第一层II型胶原含量为50%,PLGA含量为50%,第二层II型胶原含量为40%,PLGA含量为60%,第三层II型胶原含量为30%,PLGA含量为70%;钙化层中第一层I型胶原含量为15%,羟基磷灰石含量为27.9%,PLGA含量为57.1%,第二层I型胶原含量为17.5%,羟基磷灰石含量为32.5%,PLGA含量为50%,第三层I型胶原含量为20%,羟基磷灰石含量为37.1%,PLGA含量为42.9%,第四层I型胶原含量为22.5%,羟基磷灰石含量为41.8%,PLGA含量为35.7%;软骨下骨层中第一层I型胶原含量为23.3%,羟基磷灰石含量为43.3%,PLGA含量为33.4%,第二层I型胶原含量为25.3%,羟基磷灰石含量为47.1%,PLGA含量为27.6%,第三层I型胶原含量为27.3%,羟基磷灰石含量为50.7%,PLGA含量为22%,第四层I型胶原含量为29.3%,羟基磷灰石含量为54.4%,PLGA含量为16.3%。软骨层孔隙的孔径为270微米,钙化层孔隙的孔径为150微米,软骨下骨层孔隙的孔径为380微米。软骨层、钙化层的孔隙率为80%,软骨下骨层的孔隙率为70%,且90%的孔径是互相贯通的。
实施例2
(1)以I型胶原、四水硝酸钙、磷酸氢二铵为原料,氨水调节PH值=8.0,采用共沉淀法制备HA/Col粉体,所制备的HA/Col-I复合粉体中,I型胶原含量为20%,羟基磷灰石含量为80%;
(2)利用EDC/NHS-Heparin法构建生物活性物质控制释放体系,将HA/Col-I复合粉体及事先制备的II型胶原粉体放入0.05mol/LMES缓冲液(pH 5.6)里浸泡30min备用,将每3g肝素溶于200ml含有1gEDC和2gNHS的0.05mol/L MES缓冲液中活化10min,按照胶原与肝素重量比1∶3将备用胶原放入含有肝素和EDC/NHS的MES缓冲液中,37℃恒温下轻轻摇动反应4h;然后把改性后的HA/Col-I复合粉体、II型胶原粉末置于浓度为50ng/ml bFGF的PBS溶液(含有0.5%BSA,1mol/L NaCl)中在37℃下恒温孵育24h,由于改性后的胶原蛋白分子上键合有肝素分子的结合位点,利用这些位点可以与生物活性物质通过共价键相连接,从而使bFGF与I型胶原、II型胶原得以复合;
(3)首先,将1kg PHBV(Mw=312000,HV含量5.7mo l%)、1kgHA/Col-I复合粉体和8kg 120目大小的NaCl微粒;1kg PHBV、2kgHA/Col-I复合粉体和7kg 35目大小的NaCl微粒;以及1kg PHBV、2kg II型胶原粉体和7kg 60目大小的NaCl微粒分别混合均匀,分别添加二氯甲烷溶解混合微粒中的PHBV,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上依次注入模具;同时引入步骤(2)所构建的生物活性物质控制释放体系,经二氯甲烷溶解挥发成型,去离子水将氯化钠溶解,超声清洗,即得骨软骨修复梯度支架材料。
该支架材料的软骨层中II型胶原含量为66.7%,PHBV含量为33.3%;钙化层中I型胶原含量为10%,羟基磷灰石含量为40%,PHBV含量为50%;软骨下骨层中I型胶原含量为13.4%,羟基磷灰石含量为53.3%,PHBV含量为33.3%。其中软骨层孔隙的孔径为250微米,钙化层孔隙的孔径为120微米,软骨下骨层孔隙的孔径为425微米。软骨层和软骨下骨层的孔隙率为70%,钙化层的孔隙率为80%,且85%的孔径是互相贯通的。
实施例3
(1)以I型胶原、四水硝酸钙、磷酸氢二铵为原料,氨水调节PH值=8.0,采用共沉淀法制备HA/Col粉体,所制备的HA/Col-I复合粉体中,I型胶原含量为50%,羟基磷灰石含量为50%;
(2)利用EDC/NHS-Heparin法构建生物活性物质控制释放体系,将HA/Col-I复合粉体及事先制备的II型胶原粉体放入0.05mol/LMES缓冲液(pH 5.6)里浸泡30min备用,将每1g肝素溶于500ml含有3gEDC和0.5gNHS的0.05mol/L MES缓冲液中活化10min,按照胶原与肝素重量比1∶1将备用胶原放入含有肝素和EDC/NHS的MES缓冲液中,37℃恒温下轻轻摇动反应4h;然后把改性后的HA/Col-I复合粉体、II型胶原粉末置于浓度为0.1ng/ml bFGF、90ng/ml TGF的PBS溶液(含有2%BSA,3mol/L NaCl)中在37℃下恒温孵育72h,由于改性后的胶原蛋白分子上键合有肝素分子的结合位点,利用这些位点可以与生物活性物质通过共价键相连接,从而使bFGF、TGF与I型胶原、II型胶原得以复合;
(3)首先,将0.5kg PLA(Mw=50000)、1.5kg HA/Col-I复合粉体和8kg 120目大小的KCl微粒;0.2kg PLA、0.8kg HA/Col-I复合粉体和9kg 35目大小的KCl微粒;以及2kg PLA、1kg II型胶原粉体和7kg 60目大小的KCl微粒分别混合均匀,分别添加二氯甲烷溶解混合微粒中的PLA,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上依次注入模具;同时引入步骤(2)所构建的生物活性物质控制释放体系,经二氯甲烷溶解挥发成型,去离子水将KCl溶解,超声清洗,即得骨软骨修复梯度支架材料。
该支架材料的软骨层中II型胶原含量为33.3%,PLA含量为66.7%;钙化层中I型胶原含量为37.5%,羟基磷灰石含量为37.5%,PLA含量为25%;软骨下骨层中I型胶原含量为40%,羟基磷灰石含量为40%,PLA含量为20%。其中软骨层孔隙的孔径为250微米,钙化层孔隙的孔径为120微米,软骨下骨层孔隙的孔径为425微米。软骨层的孔隙率为70%,软骨下骨层的孔隙率为90%,钙化层的孔隙率为80%,且80%的孔径是互相贯通的。
实施例4
(1)以I型胶原、四水硝酸钙、磷酸氢二铵为原料,氨水调节PH值=8.0,采用共沉淀法制备HA/Col粉体,所制备的HA/Col-I复合粉体中,I型胶原含量为40%,羟基磷灰石含量为60%;
(2)利用EDC/NHS-Heparin法构建生物活性物质控制释放体系,将HA/Col-I复合粉体及事先制备的II型胶原粉体放入0.05mol/LMES缓冲液(pH 5.6)里浸泡30min备用,将每1.5g肝素溶于400ml含有3gEDC和2gNHS的0.05mol/L MES缓冲液中活化10min,按照胶原与肝素重量比1∶1.3将备用胶原放入含有肝素和EDC/NHS的MES缓冲液中,37℃恒温下轻轻摇动反应4h;然后把改性后的HA/Col-I复合粉体、II型胶原粉末置于浓度为30ng/ml bFGF、30ng/ml TGF、40ng/ml BMP的PBS溶液(含有2%BSA,2mol/L NaCl)中在37℃下恒温孵育24h,由于改性后的胶原蛋白分子上键合有肝素分子的结合位点,利用这些位点可以与生物活性物质通过共价键相连接,从而使bFGF、TGF和BMP与I型胶原、II型胶原得以复合;
(3)首先,将1kg PLGA(PLGA50∶50,Mw=150000)、1kg HA/Col-I复合粉体和8kg 100目大小的NaCl微粒;1kg PLGA、2kg HA/Col-I复合粉体和7kg 40目大小的NaC l微粒;以及1kg PLGA、1kg II型胶原粉体和8kg 50目大小的NaCl微粒分别混合均匀,分别添加二氯甲烷溶解混合微粒中的PLGA,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上依次注入模具;同时引入步骤(2)所构建的生物活性物质控制释放体系,经二氯甲烷溶解挥发成型,去离子水将氯化钠溶解,超声清洗,即得骨软骨修复梯度支架材料。
该支架材料的软骨层中II型胶原含量为50%,PLGA含量为50%;钙化层中I型胶原含量为20%,羟基磷灰石含量为30%,PLGA含量为50%;软骨下骨层中I型胶原含量为26.6%,羟基磷灰石含量为40%,PLGA含量为33.4%。其中软骨层孔隙的孔径为270微米,钙化层孔隙的孔径为150微米,软骨下骨层孔隙的孔径为380微米。软骨层、钙化层的孔隙率为80%,软骨下骨层的孔隙率为70%,且83%的孔径是互相贯通的。
实施例5
(1)以I型胶原、四水硝酸钙、磷酸氢铵为原料,氨水调节PH值=8.0,采用共沉淀法制备HA/Col粉体,所制备的HA/Col-I复合粉体中,I型胶原含量为30%,羟基磷灰石含量为70%;
(2)利用EDC/NHS-Heparin法构建生物活性物质控制释放体系,将HA/Col-I复合粉体及事先制备的II型胶原粉体放入0.05mol/LMES缓冲液(pH 5.6)里浸泡30min备用,将每3g肝素溶于500ml含有1gEDC和0.5gNHS的0.05mol/L MES缓冲液中活化10min,按照胶原与肝素重量比1∶1将备用胶原分别放入含有肝素和EDC/NHS的MES缓冲液中,37℃恒温下轻轻摇动反应4h;然后把改性后的HA/Col-I复合粉体置于浓度为50ng/ml BMP的PBS溶液(含有2%BSA)中在37℃下恒温孵育36h,把改性后的II型胶原粉末置于浓度为40ng/mlTGF的PBS溶液(含有2%的BSA,3mol/L的NaCl)中在37℃下恒温孵育36h,由于改性后的胶原蛋白分子上键合有肝素分子的结合位点,利用这些位点可以与生物活性物质通过共价键相连接,从而使BMP与I型胶原、TGF与II型胶原得以复合;
(3)首先,将0.5kg PLGA(PLGA75∶25,Mw=100000)、0.5kg HA/Col-I复合粉体和9kg 100目大小的NaCl微粒;0.2kg PLGA、0.8kgHA/Col-I复合粉体和9kg 50目大小的NaCl微粒;以及0.5kg PLGA、0.5kg II型胶原粉体和9kg 50目大小的NaCl微粒分别混合均匀,分别添加二氯甲烷溶解混合微粒中的PLGA,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上依次注入模具;同时引入步骤(2)所构建的生物活性物质控制释放体系,经二氯甲烷溶解挥发成型,去离子水将氯化钠溶解,超声清洗,即得骨软骨修复梯度支架材料。
该支架材料的软骨层中II型胶原含量为50%,PLGA含量为50%;钙化层中I型胶原含量为15%,羟基磷灰石含量为35%,PLGA含量为50%;软骨下骨层中I型胶原含量为24%,羟基磷灰石含量为56%,PLGA含量为20%。其中软骨层、软骨下骨层孔隙的孔径为270微米,钙化层孔隙的孔径为150微米。软骨层、钙化层、软骨下骨层的孔隙率均为90%,且87%的孔径是互相贯通的。
实施例6
(1)以I型胶原、四水硝酸钙、磷酸氢铵为原料,氨水调节PH值=8.0,采用共沉淀法制备HA/Col粉体,所制备的HA/Col-I复合粉体中,I型胶原含量为25%,羟基磷灰石含量为75%;
(2)利用EDC/NHS-Heparin法构建生物活性物质控制释放体系,将HA/Col-I复合粉体及事先制备的II型胶原粉体放入0.05mol/LMES缓冲液(pH 5.6)里浸泡30min备用,将每2g肝素溶于300ml含有2gEDC和1gNHS的0.05mol/L MES缓冲液中活化10min,按照胶原与肝素重量比1∶2将备用胶原分别放入含有肝素和EDC/NHS的MES缓冲液中,37℃恒温下轻轻摇动反应4h;然后把改性后的HA/Col-I复合粉体置于浓度为10ng/ml BMP的PBS溶液(含有0.5%BSA,0.5mol/L的NaCl)中,把改性后的II型胶原粉末置于浓度为20ng/mlTGF的PBS溶液(含有1%的BSA,0.7mol/L的NaCl)中,在37℃下恒温孵育72h,由于改性后的胶原蛋白分子上键合有肝素分子的结合位点,利用这些位点可以与生物活性物质通过共价键相连接,从而使BMP与I型胶原、TGF与II型胶原得以复合;
(3)首先,将0.4kg PHB(Mw=250000)、0.6kg HA/Col-I复合粉体和9kg 100目大小的蔗糖微粒;0.3kg PHB、0.7kg HA/Col-I复合粉体和9kg 40目大小的蔗糖微粒;以及0.4kg PHB、0.6kg II型胶原粉体和9kg 40目大小的蔗糖微粒,0.5kg PHB、0.5kg II型胶原粉体和9kg 40目大小的蔗糖微粒分别混合均匀,分别添加二氯甲烷溶解混合微粒中的PHB,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上依次注入模具;同时引入步骤(2)所构建的生物活性物质控制释放体系,经二氯甲烷溶解挥发成型,去离子水将蔗糖溶解,超声清洗,即得骨软骨修复梯度支架材料。
该支架材料的软骨层中第一层II型胶原含量为60%,PHB含量为40%,第二层II型胶原含量为50%,PHB含量为50%;钙化层中I型胶原含量为15%,羟基磷灰石含量为45%,PHB含量为40%;软骨下骨层中I型胶原含量为17.5%,羟基磷灰石含量为52.5%,PHB含量为30%。其中软骨层、软骨下骨层孔隙的孔径为380微米,钙化层孔隙的孔径为150微米。软骨层、钙化层、软骨下骨层的孔隙率均为90%,且85%的孔径是互相贯通的。
实施例7
(1)以I型胶原、四水硝酸钙、磷酸铵为原料,氨水调节PH值=8.0,采用共沉淀法制备HA/Col粉体,所制备的HA/Col-I复合粉体中,I型胶原含量为45%,羟基磷灰石含量为55%;
(2)利用交联技术,将100ng/ml TGF分散在壳聚糖水溶液中,加入异辛烷至形成W/O型乳剂,继续滴入1mol/L NaOH溶液,过滤洗涤干燥,形成负载TGF的壳聚糖微球;
(3)首先,将0.8kg PLGA(PLGA85∶15,Mw=50000)、1.2kg HA/Col-I复合粉体和8kg 100目大小的蔗糖微粒;0.25kg PLGA、0.75kgHA/Col-I复合粉体和9kg 40目大小的蔗糖微粒;以及0.45kg PLGA、0.55kg II型胶原粉体和9kg 40目大小的蔗糖微粒分别混合均匀;分别添加负载生物活性物质TGF的微球、二氯甲烷溶解混合微粒中的PLGA,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上依次注入模具;经二氯甲烷溶解挥发成型,去离子水将蔗糖溶解,超声清洗,即得骨软骨修复梯度支架材料。
该支架材料的软骨层中II型胶原含量为55%,PLGA含量为45%;钙化层中I型胶原含量为27%,羟基磷灰石含量为33%,PLGA含量为40%;软骨下骨层中I型胶原含量为33.75%,羟基磷灰石含量为41.25%,PLGA含量为25%。其中软骨层、软骨下骨层孔隙的孔径为380微米,钙化层孔隙的孔径为150微米。软骨层、软骨下骨层的孔隙率均为90%,钙化层的孔隙率均为80%,且89%的孔径是互相贯通的。
实施例8
(1)以I型胶原、四水硝酸钙、磷酸铵为原料,氨水调节PH值=8.0,采用共沉淀法制备HA/Col粉体,所制备的HA/Col-I复合粉体中,I型胶原含量为30%,羟基磷灰石含量为70%;
(2)利用凝聚技术,将0.1-100ng/ml bFGF在室温下加入到15%(w/v)壳聚糖醋酸溶液中,加入2mol/L硫酸钠至壳聚糖沉淀,形成负载bFGF的壳聚糖微球,同法制备负载BMP的壳聚糖微球;
(3)首先,将1kg PA(Mw=20000)、1kg HA/Col-I复合粉体和8kg 100目大小的甘露醇微粒;0.25kg PA、0.75kg HA/Col-I复合粉体和9kg 40目大小的甘露醇微粒;以及0.6kg PA、0.4kg II型胶原粉体和9kg 40目大小的甘露醇微粒分别混合均匀;分别添加负载生物活性物质bFGF和BMP的微球、二氯甲烷溶解混合微粒中的PA,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上依次注入模具;经二氯甲烷溶解挥发成型,去离子水将甘露醇溶解,超声清洗,即得骨软骨修复梯度支架材料。
该支架材料的软骨层中II型胶原含量为40%,PA含量为60%;钙化层中I型胶原含量为15%,羟基磷灰石含量为35%,PA含量为50%;软骨下骨层中I型胶原含量为22.5%,羟基磷灰石含量为52.5%,PA含量为25%。其中软骨层、软骨下骨层孔隙的孔径为380微米,钙化层孔隙的孔径为150微米。软骨层、软骨下骨层的孔隙率均为90%,钙化层的孔隙率均为80%,且83%的孔径是互相贯通的。
实施例9
(1)以I型胶原、四水硝酸钙、磷酸铵为原料,氨水调节PH值=8.0,采用共沉淀法制备HA/Col粉体,所制备的HA/Col-I复合粉体中,I型胶原含量为35%,羟基磷灰石含量为65%;
(2)利用喷雾干燥技术,将80ng/ml bFGF在50℃温度下,分散在20%(w/v)明胶溶液中并通过雾化器雾化,滴入5℃无水液状石蜡胶凝,冷冻干燥24小时,形成负载bFGF的明胶微球;
(3)首先,将1kg PCL(Mw=100000)、0.75kg HA/Col-I复合粉体和7kg 100目大小的甘露醇微粒,1kg PCL、1kg HA/Col-I复合粉体和8kg 100目大小的甘露醇微粒;0.4kg PCL、0.6kg HA/Col-I复合粉体和9kg 40目大小的甘露醇微粒;以及0.65kg PCL、0.35kg II型胶原粉体和9kg 60目大小的甘露醇微粒分别混合均匀;分别添加负载生物活性物质bFGF的微球、二氯甲烷溶解混合微粒中的PCL,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上依次注入模具;经二氯甲烷溶解挥发成型,去离子水将甘露醇溶解,超声清洗,即得骨软骨修复梯度支架材料。
该支架材料的软骨层中II型胶原含量为35%,PCL含量为65%;钙化层中第一层I型胶原含量为15%,羟基磷灰石含量为27.9%,PCL含量为57.1%,第二层I型胶原含量为17.5%,羟基磷灰石含量为32.5%,PCL含量为50%;软骨下骨层中I型胶原含量为21%,羟基磷灰石含量为39%,PCL含量为40%。其中软骨层的孔径为250微米,软骨下骨层孔隙的孔径为380微米,钙化层孔隙的孔径为150微米。软骨层、软骨下骨层的孔隙率均为90%,钙化层的孔隙率均为80%,且86%的孔径是互相贯通的。
实施例10
(1)以I型胶原、氢氧化钙、磷酸为原料,氨水调节PH值=8.0,采用共沉淀法制备HA/Col粉体,所制备的HA/Col-I复合粉体中,I型胶原含量为50%,羟基磷灰石含量为50%;
(2)利用乳化-溶剂蒸发技术,在液体石蜡中加入适量司盘80(1%,w/v),预热至60℃,螺旋形搅拌桨搅拌均匀;将80ng/ml TGF分散在液体石蜡中,另取23%(w/v)预热至60℃的明胶溶液,缓缓加入液体石蜡并搅拌至充分乳化,迅速冷却至10℃,抽滤后用40%甲醛溶液固化,挥去残留甲醛后形成负载TGF的明胶微球,同法制备负载BMP的明胶微球;
(3)首先,将0.8kg PLGA(PLGA75∶25,Mw=80000)、1.2kg HA/Col-I复合粉体和8kg 100目大小的蔗糖微粒;0.25kg PLGA、0.75kgHA/Col-I复合粉体和9kg 40目大小的蔗糖微粒;以及0.45kg PLGA、0.55kg II型胶原粉体和9kg 40目大小的蔗糖微粒分别混合均匀;在软骨层先驱体中添加TGF微球,在钙化层、软骨下骨层先驱体中添加BMP微球,然后分别添加二氯甲烷溶解混合微粒中的PLGA,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上依次注入模具;经二氯甲烷溶解挥发成型,去离子水将蔗糖溶解,超声清洗,即得骨软骨修复梯度支架材料。
该支架材料的软骨层中II型胶原含量为55%,PLGA含量为45%;钙化层中I型胶原含量为30%,羟基磷灰石含量为30%,PLGA含量为40%;软骨下骨层中I型胶原含量为37.5%,羟基磷灰石含量为37.5%,PLGA含量为25%。其中软骨层、软骨下骨层孔隙的孔径为380微米,钙化层孔隙的孔径为150微米。软骨层、软骨下骨层的孔隙率均为90%,钙化层的孔隙率均为80%,且88%的孔径是互相贯通的。
实施例11
(1)以I型胶原、氢氧化钙、磷酸为原料,氨水调节PH值=8.0,采用共沉淀法制备HA/Col粉体,所制备的HA/Col-I复合粉体中,I型胶原含量为20%,羟基磷灰石含量为80%;
(2)利用离子凝聚技术,将30ng/ml bFGF在室温下混悬于25%(w/v)明胶溶液中,加入1.5mol/L Na2HPO4溶液至凝聚成球,于65℃加入0.1mol/L Na2HPO4溶液至有微球沉降,迅速降温至10℃,加入甲醛溶液并持续搅拌36小时,水洗至无甲醛,形成负载bFGF的明胶微球,同法制备负载BMP的明胶微球;
(3)首先,将0.8kg PGA(Mw=400000)、1.2kg HA/Col-I复合粉体和8kg 100目大小的蔗糖微粒;0.25kg PGA、0.75kg HA/Col-I复合粉体和9kg 40目大小的蔗糖微粒;以及0.35kg PGA、0.65kgII型胶原粉体和9kg 40目大小的蔗糖微粒分别混合均匀;在软骨层先驱体中添加bFGF微球,在钙化层、软骨下骨层先驱体中添加bFGF微球、BMP微球,然后分别添加二氯甲烷溶解混合微粒中的PGA,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上依次注入模具;经二氯甲烷溶解挥发成型,去离子水将蔗糖溶解,超声清洗,即得骨软骨修复梯度支架材料。
该支架材料的软骨层中II型胶原含量为65%,PGA含量为35%;钙化层中I型胶原含量为12%,羟基磷灰石含量为48%,PGA含量为40%;软骨下骨层中I型胶原含量为15%,羟基磷灰石含量为60%,PGA含量为25%。其中软骨层、软骨下骨层孔隙的孔径为380微米,钙化层孔隙的孔径为150微米。软骨层、软骨下骨层的孔隙率均为90%,钙化层的孔隙率均为80%,且89%的孔径是互相贯通的。
试验例1:
委托上海卓康生物科技有限公司对其进行测试,与未引入任何生物活性物质控制释放体系的支架材料比较,应用实施例1所述骨软骨修复梯度活性支架材料后,细胞增殖率明显提高,2天时为32.4%,5天时为42.1%,7天时为38.3%。
试验例2:
委托上海卓康生物科技有限公司对其进行测试,与未引入任何生物活性物质控制释放体系的支架材料比较,应用实施例9所述骨软骨修复梯度活性支架材料后,细胞增殖率明显提高,2天时为26.7%,5天时为35.4%,7天时为28.7%。
上述测试方法为MTT法测试细胞增值率,其中:
实验细胞:小鼠MC3T3-E1成骨细胞系;
实验试剂:MTT浓度为5mg/ml;
测试吸光度:酶标仪检测,560nm处测OD值。
上述参照具体实施方式对该一种骨软骨修复梯度活性支架材料及其制备方法与应用进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种骨软骨修复梯度活性支架材料,其特征在于:主要由分别载荷有生物活性物质的软骨层、钙化层和软骨下骨层组成,其中钙化层置于软骨层和软骨下骨层中间,所述软骨层与钙化层之间、钙化层和软骨下骨层之间由生物医用可降解聚合物有机连接;所述软骨层由30%-80%II型胶原和20%-70%生物医用可降解聚合物组成,钙化层由10%-40%I型胶原、20%-50%羟基磷灰石和20%-60%生物医用可降解聚合物组成,软骨下骨层由10%-40%I型胶原、30%-70%羟基磷灰石和15%-50%生物医用可降解聚合物组成;所述软骨层、钙化层和软骨下骨层具有相互贯通的孔隙。
2.根据权利要求1所述的骨软骨修复梯度活性支架材料,其特征在于:所述软骨层、钙化层和软骨下骨层的内部为层结构。
3.根据权利要求1所述的骨软骨修复梯度活性支架材料,其特征在于:所述生物医用可降解聚合物为相同材料。
4.根据权利要求1或3所述的骨软骨修复梯度活性支架材料,其特征在于:所述生物医用可降解聚合物是PLGA、PHB、PHBV、PLA、PGA、PCL或PA。
5.根据权利要求1所述的骨软骨修复梯度活性支架材料,其特征在于:所述软骨层孔隙的孔径为200-400微米,钙化层孔隙的孔径为100-200微米,软骨下骨层孔隙的孔径为200-500微米;所述软骨层、钙化层和软骨下骨层的孔隙率为70%-99%,且80%-90%的孔径是互相贯通的。
6.根据权利要求1所述的骨软骨修复梯度活性支架材料,其特征在于:所述生物活性物质为bFGF、TGF和/或BMP的一种或几种。
7.权利要求1-6之一所述的骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法,其特征在于:具体步骤如下:
(1)HA/Col-I复合粉体的制备:
利用共沉淀法制备一系列不同配比的粉状HA/Col-I复合材料,其中羟基磷灰石含量为50%-80%,I型胶原蛋白含量为20%-50%;
(2)生物活性物质控制释放体系的构建:
用EDC/NHS-Heparin法对步骤(1)制备的HA/Col-I复合粉体及事先制备的II型胶原粉末进行改性处理,利用肝素分子的结合位点通过共价结合方式复合生物活性物质;或
利用微球化技术用壳聚糖或明胶包埋生物活性物质;
(3)骨软骨修复梯度活性支架材料的成型制备:
在步骤(1)制备的HA/Col-I复合粉体中依次添加生物医用可降解聚合物和致孔剂并混合均匀;II型胶原粉体中依次添加生物医用可降解聚合物和致孔剂并混合均匀;添加二氯甲烷溶解混合粉末中的生物医用可降解聚合物,然后按羟基磷灰石含量高低从下至上注入模具;同时引入步骤(2)所构建的生物活性物质控制释放体系,经溶剂溶解挥发成型,即得。
8.根据权利要求7所述的骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中生物活性物质控制释放体系是用下述方法制成的:
将胶原放入0.05mol/L MES缓冲液(pH 5.6)里浸泡30min备用,将每1-3g肝素溶于200-500ml含有1-3gEDC和0.5-2gNHS的0.05mol/L MES缓冲液中活化10min,按照胶原与肝素重量比1∶1-3将备用胶原放入含有肝素和EDC/NHS的MES缓冲液中,37℃恒温下轻轻摇动反应4h;然后把改性后的HA/Col-I复合粉体、II型胶原粉末置于含有0.1-100ng/ml生物活性物质的PBS溶液(含有0.5%-2%的BSA,0-4mol/L的NaCl)中,在37℃下恒温孵育24h-72h,使生物活性物质与I型胶原、II型胶原得以复合;或
利用微球化技术用壳聚糖或明胶包埋生物活性物质,所述微球化技术包括交联法、凝聚法、乳化-溶剂蒸发法、溶液包衣法或喷雾干燥法。
9.根据权利要求7所述的骨软骨修复梯度活性支架材料的制备方法,其特征在于:所述致孔剂为氯化钠、氯化钾、蔗糖或甘露醇。
10.权利要求1-6之一所述的骨软骨修复梯度活性支架材料在制备骨软骨复合体方面的应用。
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PB01 | Publication | ||
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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