CN111714694A - 一种具有促血管再生性能的胶原基细胞支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有促血管再生性能的胶原基细胞支架及其制备方法。本方法首先采用湿法氧化法制备含有羧基的氧化淀粉，接着在1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺的催化作用下，实现氧化淀粉羧基与胶原氨基之间的酰胺化反应，通过调控氧化淀粉的羧基含量制备得到微观孔道结构均一可控、机械性能良好且具有促血管再生性能的胶原基细胞支架。本发明制备的胶原基细胞支架微环境能够促进脂肪干细胞在支架中由黏附生长逐渐转变为聚集生长，进而诱导脂肪干细胞调控内皮血管生长因子和纤维生长因子的高表达，促使创面血管再生，加速创面的愈合。本发明提供的胶原基细胞支架在生物医用材料领域具有潜在的市场应用前景。

Description

一种具有促血管再生性能的胶原基细胞支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体而言涉及一种微观孔道结构尺寸可控、有效促进血管和脂肪组织再生、具有良好生物相容性和可生物降解的胶原基细胞支架及其制备方法。
背景技术
组织工程学是20世纪80年代末期发展起来的一门新型边缘学科。组织工程为组织再生提供了有效途径，由于临床上软组织缺损的巨大需要，促进了组织工程在脂肪组织再生方面的研究。目前已有一些方法用于脂肪组织的再生：支架引导组织再生、可注射体系、嵌段两亲性共聚物片段等，但上述方法均注重脂肪本身的再生。有研究表明，通过诱导血管再生促使脂肪再生效果更为显著。
2001年，Zuk等从人脂肪抽吸术后的脂肪组织悬液中第一次分离获得了多向分化干细胞。该细胞具有取材容易、量大、可反复取材、损伤较小、细胞增殖快速、能反复分裂而不衰老等优点，这使其具有临床应用的潜力，该细胞被命名为脂肪干细胞(ASCs)。ASCs能够分泌多种生长因子，其中促进血管再生的VEGF、PLGF和HGF表达量相对于其它活性因子较高。具有一定孔径且良好亲水溶胀性能的细胞支架可以有效阻止ASCs细胞贴壁从而成微团，微团结构使ASCs细胞处于低氧环境中。此时的细胞可以通过上调缺氧诱导旁分泌促进血管生成基因表达，同时成功地实现细胞微团成脂分化。最为重要的是ASCs可以直接从体内获得，省去了体外培养的阶段。因此，可以直接将支架材料植入体内，促进ASCs细胞在支架中由开始的黏附生长逐渐变为聚集生长，调控内皮血管生长因子和纤维生长因子的高表达，促使创面血管再生。
胶原是组织中分布最广泛的蛋白，具有良好的生物相容性、低免疫原性、可生物降解性以及独特的生物学性质。因此，胶原在生物医用材料领域的应用具有优势。目前，胶原已被广泛应用于止血剂与创面敷料、生物补片、骨修复材料、药物释放载体及组织工程支架方面。临床显示，胶原对于缺损组织的修复、再生及重建有着显著促进作用。但胶原较差的机械强度限制了其广泛应用。因此，需要通过化学交联改性以改善胶原基材料的理化性能。天然高分子多糖淀粉广泛存在于马铃薯、大米、麦子、木薯等植物中。淀粉在水中的溶解度较低，不利于其应用。因此可以通过化学氧化法改善淀粉的水溶性。淀粉分子中大量存在的羟基能够被双氧水氧化成羧基，显著增加淀粉的水溶性。此外，在催化剂存在下，氧化淀粉分子中的羧基能够与胶原的氨基发生交联反应，改善胶原基材料的理化性能。
基于此，本发明涉及一种具有促血管再生性能的胶原基细胞支架及其制备方法。本方法首先采用湿法氧化法制备含有羧基的氧化淀粉，接着在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的催化作用下，实现氧化淀粉羧基与胶原氨基之间的酰胺化反应，通过调控氧化淀粉的羧基含量制备得到微观孔道结构均一可控、机械性能良好且具有促血管再生性能的胶原基细胞支架。本发明制备的胶原基细胞支架微环境能够促进脂肪干细胞在支架中由黏附生长逐渐转变为聚集生长，进而诱导脂肪干细胞调控内皮血管生长因子和纤维生长因子的高表达，促使创面血管再生，加速创面的愈合。本发明提供的胶原基细胞支架在生物医用材料领域具有潜在的市场应用前景。
发明内容
为了加速机体创面的血管和脂肪再生，本发明提供了一种具有促血管再生性能的胶原基细胞支架。本方法以双氧水氧化法制备出不同羧基含量的氧化淀粉，然后通过调控氧化淀粉与胶原的交联反应，制备得到微观孔道结构可控且能够促进创面血管再生的细胞支架。其具体制备方法如下：
(1) 将淀粉在80~100 ℃下溶于去离子水中得到质量浓度为5~10%的淀粉溶液，然后向1体积份淀粉溶液中加入0.5~2.5体积份质量浓度为5~30%的双氧水溶液和0.1~1体积份质量浓度为0.05~0.5%的硫酸铜溶液，接着将混合溶液在50~70 ℃下搅拌反应2~10 h，待其冷却至室温后于3000~5000转/分离心10~20 min，向上清液中加入无水乙醇后抽滤得滤饼，使用无水乙醇洗涤滤饼3~5次后将滤饼在40~60 ℃下干燥36~48 h以制备得到含有羧基的氧化淀粉；
(2) 分别将氧化淀粉和胶原溶于浓度为30~60 mM、pH为4~6的吗啉乙磺酸溶液中得到质量浓度为0.5~1%的氧化淀粉溶液和质量浓度为0.6~0.8%的胶原溶液，将0.1~0.2质量份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05~0.1质量份N-羟基琥珀酰亚胺加入到1质量份氧化淀粉溶液中，搅拌10~20 min后加入4~9质量份胶原溶液，继续搅拌10 min后将混合溶液静置6~20 min以形成胶原基水凝胶，使用PBS洗涤后将其冷冻干燥以制备得到具有促血管再生性能的胶原基细胞支架。
本发明与已有的细胞支架相比，具有如下优点：
(1) 本发明以天然高分子淀粉和胶原为原材料，通过控制氧化淀粉的氧化度而调控其与胶原之间的化学交联反应，进而制备具有微观孔道结构可控、较高机械强度、良好的生物相容性、可生物降解性和能够促进血管再生性能的胶原基细胞支架；
(2) 本发明以MES缓冲液为反应环境，通过提高淀粉糊化温度，利用氧化淀粉与胶原形成酰胺键，解决了胶原与天然大分子反应时易絮凝的问题；
(3) 本发明提供的胶原基细胞支架无需负载任何细胞和生长因子，通过机体自身脂肪干细胞成球生长以促进机体自身血管生成因子、细胞生长因子的高表达，进而促进血管和脂肪组织的再生，加速创面的愈合。
具体实施方式
下面给出本发明的3个实施例，通过实施例对本发明进行具体描述。有必要指出的是，实施例只用于对本发明做进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可根据本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。
实施例1
将淀粉在80 ℃下溶于去离子水得到质量浓度为7%的淀粉溶液，然后向1体积份淀粉溶液中加入0.5体积份质量浓度为30%的双氧水溶液和1体积份质量浓度为0.05%的硫酸铜溶液，接着将混合溶液在50 ℃下搅拌反应10 h，待其冷却至室温后于3000转/分离心20 min，向上清液中加入无水乙醇后抽滤得滤饼，使用无水乙醇洗涤滤饼4次后将滤饼在60 ℃下干燥36 h以制备得到含有羧基的氧化淀粉；分别将氧化淀粉和胶原溶于浓度为30 mM、pH为4.5的吗啉乙磺酸溶液中得到质量浓度为0.5%的氧化淀粉溶液和质量浓度为0.6%的胶原溶液，之后将0.1质量份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05质量份N-羟基琥珀酰亚胺加入到1质量份氧化淀粉溶液中，搅拌10 min后加入4质量份胶原溶液，继续搅拌10 min后将混合溶液均匀静置20 min以形成胶原基水凝胶，使用PBS洗涤后将其冷冻干燥以制备得到具有促血管再生性能的胶原基细胞支架。
实施例2
将淀粉在95 ℃下溶于去离子水得到质量浓度为5%的淀粉溶液，然后向1体积份淀粉溶液中加入1体积份质量浓度为10%的双氧水溶液和0.5体积份质量浓度为0.1%的硫酸铜溶液，接着将混合溶液在65 ℃下搅拌反应6 h，待其冷却至室温后于5000 转/分离心10 min，向上清液中加入无水乙醇后抽滤得滤饼，使用无水乙醇洗涤滤饼3次后将滤饼在40 ℃下干燥48 h以制备得到含有羧基的氧化淀粉；分别将氧化淀粉和胶原溶于浓度为35 mM、pH为4.7的吗啉乙磺酸溶液中得到质量浓度为0.6%的氧化淀粉溶液和质量浓度为0.7%的胶原溶液，之后将0.12质量份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.06质量份N-羟基琥珀酰亚胺加入到1质量份氧化淀粉溶液中，搅拌15 min后加入6质量份胶原溶液，继续搅拌10 min后将混合溶液均匀静置12 min以形成胶原基水凝胶，使用PBS洗涤后将其冷冻干燥以制备得到具有促血管再生性能的胶原基细胞支架。
实施例3
将淀粉在100 ℃下溶于去离子水得到质量浓度为10%的淀粉溶液，然后向1体积份淀粉溶液中加入2体积份质量浓度为15%的双氧水溶液和0.1体积份质量浓度为0.5%的硫酸铜溶液，接着将混合溶液在70 ℃下搅拌反应2 h，待其冷却至室温后于4500 转/分离心15 min，向上清液中加入无水乙醇后抽滤得滤饼，使用无水乙醇洗涤滤饼3次后将滤饼在55 ℃下干燥40 h以制备得到含有羧基的氧化淀粉；分别将氧化淀粉和胶原溶于浓度为50 mM、pH为5的吗啉乙磺酸溶液中得到质量浓度为1%的氧化淀粉溶液和质量浓度为0.8%的胶原溶液，之后将0.2质量份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.1质量份N-羟基琥珀酰亚胺加入到1质量份氧化淀粉溶液中，搅拌20 min后加入9质量份胶原溶液，继续搅拌10 min后将混合溶液均匀静置6 min以形成胶原基水凝胶，使用PBS洗涤后将其冷冻干燥以制备得到具有促血管再生性能的胶原基细胞支架。

Claims (2)

1.一种具有促血管再生性能的胶原基细胞支架，其特征在于通过调控氧化淀粉的羧基与胶原的氨基之间的反应，制备得到微观孔道结构均一可控且能够诱导脂肪干细胞高效表达内皮血管生长因子和纤维生长因子以促进血管再生和加速创面愈合的胶原基细胞支架，其具体制备方法如下：
(1) 将淀粉在80~100 ℃下溶于去离子水中得到质量浓度为5~10%的淀粉溶液，然后向1体积份淀粉溶液中加入0.5~2.5体积份质量浓度为5~30%的双氧水溶液和0.1~1体积份质量浓度为0.05~0.5%的硫酸铜溶液，接着将混合溶液在50~70 ℃下搅拌反应2~10 h，待其冷却至室温后于3000~5000转/分离心10~20 min，向上清液中加入无水乙醇后抽滤得滤饼，使用无水乙醇洗涤滤饼3~5次后将滤饼在40~60 ℃下干燥36~48 h以制备得到含有羧基的氧化淀粉；
(2) 分别将氧化淀粉和胶原溶于浓度为30~60 mM、pH为4~6的吗啉乙磺酸溶液中得到质量浓度为0.5~1%的氧化淀粉溶液和质量浓度为0.6~0.8%的胶原溶液，将0.1~0.2质量份1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.05~0.1质量份N-羟基琥珀酰亚胺加入到1质量份氧化淀粉溶液中，搅拌10~20 min后加入4~9质量份胶原溶液，继续搅拌10 min后将混合溶液静置6~20 min以形成胶原基水凝胶，使用PBS洗涤后将其冷冻干燥以制备得到具有促血管再生性能的胶原基细胞支架。
2.根据权利要求1所述的具有促血管再生性能的胶原基细胞支架，其特征在于步骤(1)中所述淀粉为红薯淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉、绿豆淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉中的任意一种或几种的混合物。
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