CN109295137B - 一种多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，是将微纤维胶原原料分散在去离子水中配置为混合液，称取转谷氨酰胺酶加入至混合液中进行催化反应0.5～3h，然后称取A酶加入至混合液中继续进行催化反应0.5～2h，最后将混合液离心处理取沉淀，将所得沉淀进行后处理，即得交联改性的微纤维胶原。该方法通过少量多次的酶催化使得微纤维胶原在短时间内完成分步交联，从而制备获得机械性能、耐热稳定性和耐酶解性能得到提升的改性微纤维胶原，并且具备生物活性和安全无毒的特点。
Description
技术领域
本发明涉及微纤维胶原交联改性技术领域，具体涉及一种多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，特别是针对至少50％含量的纤维为长度1mm以下的微纤维胶原进行多步连续酶催化交联改性的方法。
背景技术
微纤维胶原是一种胶原蛋白，通常是指对胶原纤维束进行解聚、蓬松处理得到的大部分(90％以上)长度低于12mm的纤维。微纤维胶原完全保留了胶原的生物活性和三股螺旋结构，广泛应用于止血材料、软骨组织工程支架材料等生物医学领域。目前，微纤维胶原主要是由牛胶原提取获得，可促进血小板聚集在微纤维胶原表面，促进血小板释放凝血物质，同时通过物理堵塞出血血管而实现止血目的(司泽兵,吴继功,临床止血材料的应用现状及研究进展[J].生物骨科材料与临床研究,2015,12(06):64-67)。同时，微纤维胶原很容易从伤口处清除，几乎没有残留物，免疫原性低，可以有效降低手术后出血的发生率，操作简单，安全且有效(Palm MD,Altman JS.Topical hemostatic agents:A review[J].Dermatologic Surgery.2008,34(4):431-445；崔波,欧彤文.微纤维止血胶原海绵在经直肠前列腺穿刺术后直肠出血中的应用效果[J].广西医学,2018,40(6):692-693)。同时，微纤维胶原也可用作支架材料，使在体外扩增的组织细胞粘附在微纤维胶原上，形成细胞—材料复合物，随后将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着微纤维胶原在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的(周丽斌,徐冰心,丁瑞英,等.应用微纤维胶原支架构建组织工程软骨[J].中国组织工程研究,2017,21(22):3483-3487)。并且微纤维胶原具有高孔隙率的三维立体结构，具有三维立体结构的微纤维支架材料，更利于细胞的分化(Kim JJ,Hou LQ,Yang G,et al.Microfibrous scaffolds enhance endothelialdifferentiation and organization of induced pluripotent stem cells[J].Cellular and Molecular Bioengineering.2017,10(05):417-432)。
目前，关于胶原的研究和相关报道已表明胶原的相关制备运用逾近成熟。以天然胶原蛋白为基材的生物材料在实际应用中，其机械性能差、降解速率过快等问题较为突出(Sarkar SD,Farrugia BL,Dargaville TR,et al.Chitosan-collagen scaffolds withnano/microfibrous architecture for skin tissue engineering[J].Journal ofBiomedical Materials Research Part A.2013,101(12):3482-3492)。微纤维胶原同样也是一种天然胶原蛋白，并且因其纤维聚集程度及长度远低于胶原纤维束，因此其机械性能、降解速率过快等问题更为显著。正因上述微纤维胶原的不足之处，急切需求某种方式来提升微纤维胶原的机械性能、耐热稳定性以及耐酶解等性能，以使得微纤维胶原在生物医学领域具有更广泛的应用和更佳的应用前景。
目前关于提高天然胶原蛋白的机械性能和耐酶降解性能等选择采用交联改性的报道较多。交联胶原蛋白的方法主要有物理交联和化学交联。物理交联主要有热交联、紫外交联、γ射线交联等方式，但物理方法处理后的胶原交联度低；化学交联主要通过化学交联剂将胶原进行交联，但化学交联存在着引入外源有毒试剂，残留试剂难清除等缺点，且最常见的化学交联剂戊二醛交联胶原存在细胞毒性。(周爱梅,张静,唐启伟,等.胶原三维多孔基质常用交联方法[J].明胶科学与技术,2014,34(02):55-60；公维菊,李国英.胶原交联改性的研究现状[J].皮革化工,2007,24(05):21-30；王全胜,任磊.羊皮胶原的交联类型与体外细胞毒性的关系[J].国外医学生物医学工程分册,1993,16(01):60；车鹏程,孙红,戚孟春.戊二醛交联时间对人脱细胞真皮基质生物学性质的影响[J].解剖学杂志,2009,32(01):41-44)。近几年出现的酶催化胶原交联改性是一种利用酶催化蛋白质交联改性的方法。酶法交联与物理交联和化学交联相比，具有反应条件温和、不产生副产物、交联效果好等特点(程珊,王稳航,路福平.基于蛋白质交联的氧化酶特性与应用[J].食品科学技术学报,2017,35(03):36-42)。除此以外，酶法交联最大的特点在于其安全性较高，多项研究表明酶法交联不会产生细胞毒性(Chen RN,Ho HO,Sheu MT.Characterization of collagenmatrices crosslinked using microbial transglutaminase[J].Biomaterials.2005,26:4229-4235；Kuo KC,Lin RZ,Tien HW,et al.Bioengineering vascularized tissueconstructs using an injectable cell-laden enzymatically crosslinked collagenhydrogel derived from dermal extracellular matrix[J].Acta Biomaterialia.2015,27:151-166)。
虽然微纤维胶原同样也是一种天然胶原蛋白，但目前有关微纤维胶原进行交联改性的文献报道较为罕见，并且尚未有文献报道利用酶法对微纤维胶原进行交联改性的信息，相关研究处于空白状态。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的空缺，提供一种多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法。该方法通过少量多次的酶催化使得微纤维胶原在短时间内完成分步交联，从而制备获得机械性能、耐热稳定性和耐酶解性能得到提升的改性微纤维胶原，并且具备生物活性和安全无毒的特点。
为实现上述目的，本发明是采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。
一种多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，是将微纤维胶原原料分散在去离子水中配置为混合液，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计0.1～2.5U/g所称取的转谷氨酰胺酶加入至混合液中于25～30℃下催化反应0.5～3h；催化反应时间到达后，再调节混合液的pH为5.0～7.0，然后以微纤维胶原干重计50～250U/g所称取的A酶加入至混合液中继续于25～30℃下催化反应0.5～2h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀，将所得沉淀进行包括洗涤、干燥的后处理，即得交联改性的微纤维胶原；
所述A酶包括酪氨酸酶、辣根过氧化物酶中的任意一种；当选用辣根过氧化物酶时，在将所称取的辣根过氧化物酶加入至混合液后，还包括加入浓度为5～10×10-3mol/L的过氧化氢溶液80～200μL，过氧化氢溶液的加入方式为每次滴加2～5μL，间隔60～180s进行下一次滴加，直至滴加完毕。
进一步地，所述转谷氨酰胺酶加入至混合液中于25～30℃下催化反应0.5～3h，还包括加入以混合液总体积计0.05～0.1％且摩尔浓度为0.1～1mol/L的金属离子试剂。
进一步地，所述A酶加入至混合液中继续于25～30℃下催化反应0.5～2h，还包括加入以混合液总体积计0.05～0.1％且摩尔浓度为0.1～1mol/L的金属离子试剂。
其中，所述金属离子试剂，通常选择对人体无害的金属离子试剂，为了更好地说明本发明，所述金属离子优选Na+试剂、Mg2+试剂、Ca2+试剂、Cu2+试剂中的任意一种。为了达到更好的催化反应效果，通常选择在酶加入后再马上加入金属离子试剂，使得酶与金属离子试剂共同催化反应。
值得说明的是，所述微纤维胶原原料通常为指代通过对胶原纤维束进行解聚、蓬松处理得到的大部分(90％以上)长度低于12mm的纤维作为原料。
通常地，所述将微纤维胶原分散在去离子水中配置为混合液，是将微纤维胶原分散在去离子水中，并通过振荡等方式使得微纤维胶原分散均匀，当静置后不会产生沉积，视为将微纤维胶原均匀分散在去离子水中形成混合液。
其中，去离子水的添加量通常为满足微纤维胶原分散后不产生沉积即可，为了更好的说明本发明，通常是根据所需要交联改性的微纤维胶原干重，然后以固液重量比至少为1:50的方式对微纤维胶原和去离子水进行配比，并选择合适的催化反应作用容器。
通常地，因为市面上酶试剂同种产品的比活力具有差异，本发明需要精确控制所添加酶的酶活力以防止产生负面影响，因此所述以微纤维胶原干重计0.1～2.5U/g所称取的转谷氨酰胺酶加入至混合液中，为根据微纤维胶原的干重与所使用酶的比活力称取加入的酶量，即每1g干重的微纤维胶原称取相当于0.1～2.5U酶活力的转谷氨酰胺酶加入，转谷氨酰胺酶的添加量通过酶活力除以所使用转谷氨酰胺酶的比活力得到；
同样，所述以微纤维胶原干重计50～250U/g所称取的A酶加入至混合液中，为根据微纤维胶原的干重与所使用酶的比活力称取加入的酶量，即每1g干重的微纤维胶原称取相当于50～250U酶活力的A酶加入，A酶的添加量通过酶活力除以所使用A酶的比活力得到。
通常地，所述催化反应包括将加入酶之后的混合液进行适当的搅拌或振荡操作以促进酶均匀地催化微纤维胶原进行交联。优选地，是将加入酶之后的混合液放置在水浴振荡器中以50～200rpm的条件进行催化反应。
其中，所述离心处理优选为转速8000～15000rpm离心至上清液澄清为止，去上清液取沉淀。
其中，所述后处理包括将离心出的沉淀用去离子水洗涤4～6次。进一步地，为了方便保存及运输和性能测试，后处理通常可选择将洗涤后的交联改性的微纤维胶原冻干，得到蓬松状的固体产品。所述后处理还包括灭菌，优选为25kGy辐照灭菌。
其中一种优选的技术方案中，是将短纤维(纤维长度≤1mm)含量为50～80％的微纤维胶原作为微纤维胶原原料；
将微纤维胶原原料分散在去离子水中配置为混合液，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计0.1～1.2U/g所称取的转谷氨酰胺酶加入至混合液中于25～30℃下催化反应0.5～2.5h；催化反应时间到达后，再调节混合液的pH为5.0～7.0，然后以微纤维胶原干重计50～220U/g所称取的A酶加入至混合液中继续于25～30℃下催化反应0.5～1.5h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀，将所得沉淀进行包括洗涤、干燥的后处理，即得交联改性的微纤维胶原；
所述A酶包括酪氨酸酶、辣根过氧化物酶中的任意一种；当选用辣根过氧化物酶时，在将所称取的辣根过氧化物酶加入至混合液后，还包括加入浓度为5～10×10-3mol/L的过氧化氢溶液80～160μL，过氧化氢溶液的加入方式为每次滴加2～5μL，间隔60～150s进行下一次滴加，直至滴加完毕。
其中一种优选的技术方案中，是将短纤维(纤维长度≤1mm)含量为50～80％、长纤维(纤维长度2～5mm)含量为5～10％的微纤维胶原作为微纤维胶原原料；
将微纤维胶原原料分散在去离子水中配置为混合液，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计0.1～0.5U/g所称取的转谷氨酰胺酶加入至混合液中于25～30℃下催化反应0.5～2h；催化反应时间到达后，再调节混合液的pH为5.0～7.0，然后以微纤维胶原干重计50～150U/g所称取的A酶加入至混合液中继续于25～30℃下催化反应0.5～1h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀，将所得沉淀进行包括洗涤、干燥的后处理，即得交联改性的微纤维胶原；
所述A酶包括酪氨酸酶、辣根过氧化物酶中的任意一种；当选用辣根过氧化物酶时，在将所称取的辣根过氧化物酶加入至混合液后，还包括加入浓度为5～10×10-3mol/L的过氧化氢溶液80～120μL，过氧化氢溶液的加入方式为每次滴加2～5μL，间隔60～120s进行下一次滴加，直至滴加完毕。
其中，所述短纤维(纤维长度≤1mm)含量为50～80％、长纤维(纤维长度2～5mm)含量为5～10％的微纤维胶原，可参照本发明申请人在先专利(申请号：2018110365927)所制备获得的微纤维胶原。
本发明的原理是利用酶具有特异性，能催化微纤维胶原上特定的氨基酸残基发生反应，使两个不同的胶原分子相互交联，从而提高微纤维胶原的耐热稳定性及耐酶解能力。利用少量多种的酶催化微纤维胶原交联，并优选加入金属离子辅助酶催化，可以使微纤维胶原获得均匀一致的交联。此外，酶催化反应具有反应条件温和的特点，能够较好地保持微纤维胶原的三股螺旋结构，保持所得交联改性的微纤维胶原所具有活性。
但经本发明的发明人研究发现，将现有技术中针对天然胶原蛋白的酶法交联改性方法，直接运用在同为天然胶原蛋白的微纤维胶原上时，所得产品很难符合交联改性的原有目的，如提高机械性能和耐酶降解性能等，所得产品出现了例如交联不均匀、耐热稳定性变化不大甚至有所降低、损失生物活性等问题，反而降低了微纤维胶原的使用价值。上述的负面现象猜测可能是因为微纤维胶原的纤维尺寸过小所导致的，尤其是本发明申请人在先申请专利(申请号：2018110365927)所制备获得的微纤维胶原，因其短纤维(纤维长度≤1mm)含量较大，且大部分纤维长度低于5mm，参照现有胶原蛋白酶法交联改性方法所制得的产品交联极不均匀且耐热稳定性反而出现下降的现象，完全不符合交联改性的原本目的。
而单纯在现有酶法交联改性方法上降低所使用酶浓度或加酶量，虽然随着酶浓度或加酶量降低幅度增大，交联不均匀和生物活性损失的问题随之缓解，但要达到交联改性的微纤维胶原能够交联均匀且基本保持原有的生物活性，酶法改性的交联催化反应时间将增至20h以上，本发明申请人在先申请专利(申请号：2018110365927)所制备获得的微纤维胶原的交联催化反应时间将增至更长，并且需要长时间精确保持低浓度酶活性，预测在工业化放大效应下不具备较佳的发展前景。
因此本发明采用多步连续酶催化法对微纤维胶原进行交联改性，不同的酶因其作用位点的不同，对微纤维胶原的作用程度不同，具有不同的作用效果，酶作用的位点越多，对微纤维胶原的作用越强，因此大幅缩短了催化反应所需的时间，仅需1～5h即可交联改性完成，得到符合生物医学材料要求的交联均匀且耐热稳定性较高的交联改性微纤维胶原。同时在优选方案中，进一步添加了金属离子作为酶催化的激活剂，通过控制金属离子的浓度和添加量来控制微纤维胶原的交联程度。
此外，在酶催化微纤维胶原进行交联时，采用多种酶分布催化微纤维胶原，一是由于酶的催化具有特异性，转谷氨酰胺酶能够催化微纤维胶原上的谷氨酰胺残基与赖氨酸残基的ε-氨基之间交联反应，A酶(即酪氨酸酶、辣根过氧化物酶)可以催化微纤维胶原上的酚羟基(如酪氨酸残基)与氨基进行交联，先让谷氨酰胺残基与赖氨酸残基交联，再让酪氨酸残基与其他氨基交联，提高微纤维胶原整体的交联度。二是由于不同酶的最适反应条件各不相同，多步连续酶催化能让相应的酶在最适的反应条件下进行催化，得到更好的交联效果。三是由于微纤维胶原呈固态，过强的交联作用易导致微纤维胶原交联不均匀，采用多种酶分步催化，避免多种酶同时加入导致过强的交联，使微纤维胶原得到均匀一致的交联。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明公开了一种采用多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，制备获得机械性能、耐热稳定性和耐酶解性能得到提升的交联改性微纤维胶原，并且具备生物活性和安全无毒的特点。
2、本发明所制得交联改性微纤维胶原，相较交联改性前，基本保持了原有尺寸纤维的含量(如本发明中短纤维、长纤维含量)，耐热稳定性提升了6～15℃，侧面说明该产品交联均匀，提高了机械性能且保留了原有微纤维胶原的医学功能；体外酶降解率相较交联改性前降低了10～64％，重金属含量不大于10mg/kg。
3、本发明制备方法在交联改性过程中所采用的转谷氨酰胺酶、辣根过氧化物酶、酪氨酸酶在食品行业中有所应用，属于无毒材料，不会对人体产生危害，符合生物医学材料的相关标准需求。
4、本发明制备方法催化反应时间仅为1～5h，相较现有技术大幅缩短了催化反应所需时间，具有更佳的工业放大效应和生产前景。
5、本发明制备方法的优选方案中，通过添加金属离子试剂，可对微纤维胶原的交联程度进行控制，并进一步缩短催化反应时间。
6、本发明所得交联改性的微纤维胶原保留了未变性胶原特有的三股螺旋结构，保证了微纤维胶原的生物活性，所得微纤维胶原具有低免疫原性和生物可降解性，且安全性高，可广泛应用于生物医学领域。
附图说明
图1为本发明实施例7和对比例1所制得产品的热变性温度对比曲线图。图中，灰线为实施例7中转谷氨酰胺酶与辣根过氧化物酶分步催化交联改性后的微纤维胶原，黑线为未用酶催化交联改性的微纤维胶原，经测定，结果表明实施例7所得交联改性的微纤维胶原热变性温度提升了7.4℃。
具体实施方式
下面给出的实施例是对本发明的技术方案进行进一步说明。有必要在此指出的是，以下实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，这些实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，如果该领域的技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明保护范围。
注意的是，下述实施例及对比例所制得交联改性的微纤维胶原或产品，其纤维长度和比例、热变性温度及重金属含量是通过以下设备并采用现有技术测定得到。
使用鲍尔纤维筛分仪测定微纤维胶原纤维长度和比例。
使用差示扫描量热仪测定微纤维胶原的热变性温度。
使用重金属检测仪测定微纤维胶原中重金属含量。
测定微纤维胶原的体外酶降解性能分析：准确称取微纤维胶原样品40mg，记为m1，置于20mL的胶原蛋白酶溶液中(胶原蛋白酶溶液浓度为0.02mg/mL，缓冲体系为含5mmol/LCaCl2的0.01mol/L Tris-HCl，pH 7.4)，随后将该样品液置于37℃条件下酶解24h，取出后用去离子水冲洗表面后离心取沉淀，再冻干，称重，记为m2。通过计算可得微纤维胶原的体外酶降解率(公式1)。
式中：
m1：微纤维胶原酶解前的质量/g；
m2：微纤维胶原酶解后的质量/g。
此外，值得说明的是，实施例中作为原料的微纤维胶原其原有短纤维、长纤维含量百分比，在交联改性后会出现一定偏差，偏差通常在3％以内，该偏差主要是由测量误差与交联改性共同造成。
实施例1
所选择的微纤维胶原原料为按照现有文献做出来的普通产品。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为36.3％。
将2000g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置15min后不会产生沉淀，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计2.5U/g所称取的转谷氨酰胺酶50g(比活力为100U/g)加入至混合液中于28℃下催化反应2.5h；催化反应时间到达后，再调节混合液的pH为5.0～5.5，然后以微纤维胶原干重计250U/g所称取的酪氨酸酶1g(比活力为500U/mg)加入至混合液中，同时加入以混合液总体积计0.08％且摩尔浓度为0.5mol/L的CuCl2溶液继续于28℃下催化反应1.5h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到交联改性的微纤维胶原。
经测定，交联改性后的微纤维胶原长度1mm以下的纤维含量36.8％，长度2～5mm的纤维含量为28.4％，其热变性温度为64.4℃；体外酶降解率为80.2％，重金属含量为5.5mg/kg。
实施例2
所选择的微纤维胶原原料为按照现有文献做出来的普通产品。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为27.2％。
将700g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置15min后不会产生沉淀，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计2.0U/g所称取的转谷氨酰胺酶14g(比活力为100U/g)加入至混合液中，同时加入以混合液总体积计0.1％且摩尔浓度为1mol/L的CaCl2于28℃下催化反应3h；催化反应时间到达后，再调节混合液的pH为6.5～7.0，然后以微纤维胶原干重计250U/g所称取的辣根过氧化物酶1.09g(比活力为160U/mg)加入至混合液中继续于28℃下催化反应2h，期间在辣根过氧化物酶加入之后每隔60s滴加4μL摩尔浓度为5×10-3mol/L的过氧化氢溶液，总计滴加160μL；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到交联改性的微纤维胶原。
经测定，交联改性后的微纤维胶原长度1mm以下的纤维含量27.2％，长度2～5mm的纤维含量为35.5％，其热变性温度为65.2℃；体外酶降解率为64.7％，重金属含量为5.2mg/kg。
实施例3
所选择的微纤维胶原原料为按照现有文献做出来的普通产品。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为58.6％。
将3200g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置20min后不会产生沉淀，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计1.0U/g所称取的转谷氨酰胺酶32g(比活力为100U/g)加入至混合液中，同时加入以混合液总体积计0.1％且摩尔浓度为0.5mol/L的CaCl2溶液于25℃下催化反应2h；催化反应时间到达后，再调节混合液的pH为5.0～5.5，然后以微纤维胶原干重计200U/g所称取的酪氨酸酶1.28g(比活力为500U/mg)加入至混合液中继续于25℃下催化反应1h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到交联改性的微纤维胶原。
经测定，交联改性后的微纤维胶原长度1mm以下的纤维含量58.4％，长度2～5mm的纤维含量为16.3％，其热变性温度为66.4℃；体外酶降解率为55％，重金属含量为4.9mg/kg。
实施例4
所选择的微纤维胶原原料为按照现有文献做出来的普通产品。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为63.2％。
将1700g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置22min后不会产生沉淀，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计0.8U/g所称取的转谷氨酰胺酶13.6g(比活力为100U/g)加入至混合液中于25℃下催化反应2h；催化反应时间到达后，再调节混合液的pH为6.5～7.0，然后以微纤维胶原干重计170U/g所称取的辣根过氧化物酶1.81g(比活力为160U/mg)加入至混合液中，同时加入以混合液总体积计0.05％且摩尔浓度为0.7mol/L的NaCl溶液继续于25℃下催化反应1.5h，期间在辣根过氧化物酶加入之后每隔120s滴加5μL摩尔浓度为6.2×10-3mol/L的过氧化氢溶液，总计滴加100μL；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到交联改性的微纤维胶原。
经测定，交联改性后的微纤维胶原长度1mm以下的纤维含量63.3％，长度2～5mm的纤维含量为11.2％，其热变性温度为67.1℃；体外酶降解率为45.5％，重金属含量为3.9mg/kg。
实施例5
所选择的微纤维胶原原料为参照本发明申请人在先专利(申请号：2018110365927)所制备获得的微纤维胶原。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为75.8％，长纤维(纤维长度2～5mm)含量为5.4％。
将1920g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置25min后不会产生沉淀，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计0.5U/g所称取的转谷氨酰胺酶9.6g(比活力为100U/g)加入至混合液中，同时加入以混合液总体积计0.07％且摩尔浓度为0.6mol/L的CaCl2溶液于25℃下催化反应1.5h；催化反应时间到达后，再调节混合液的pH为6.5～7.0，然后加入以微纤维胶原干重计130U/g所称取的辣根过氧化物酶1.56g(比活力为160U/mg)加入至混合液中继续于25℃下催化反应1h，期间在辣根过氧化物酶加入之后每隔90s滴加4μL摩尔浓度为8×10-3mol/L的过氧化氢溶液，总计滴加120μL；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到交联改性的微纤维胶原。
经测定，交联改性后的微纤维胶原长度1mm以下的纤维含量76.0％，长度2～5mm的纤维含量为5.3％，其热变性温度为69.8℃；体外酶降解率为39.6％，重金属含量为4.5mg/kg。
实施例6
所选择的微纤维胶原原料为参照本发明申请人在先专利(申请号：2018110365927)所制备获得的微纤维胶原。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为75.8％，长纤维(纤维长度2～5mm)含量为5.4％。
将4000g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置25min后不会产生沉淀，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计0.4U/g所称取的转谷氨酰胺酶16g(比活力为100U/g)加入至混合液中，同时加入以混合液总体积计0.05％且摩尔浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液于25℃下催化反应1.5h；催化反应时间到达后，再调节混合液的pH为5.0～5.5，然后以微纤维胶原干重计150U/g所称取的酪氨酸酶1.2g(比活力为500U/mg)加入至混合液中，同时加入以混合液总体积计0.05％且摩尔浓度为0.2mol/L的CuCl2溶液继续于25℃下催化反应1h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到交联改性的微纤维胶原。
经测定，交联改性后的微纤维胶原长度1mm以下的纤维含量75.7％，长度2～5mm的纤维含量为5.6％，其热变性温度为70.7℃；体外酶降解率为35.4％，重金属含量为4.5mg/kg。
实施例7
所选择的微纤维胶原原料为参照本发明申请人在先专利(申请号：2018110365927)所制备获得的微纤维胶原。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为68.1％，长纤维(纤维长度2～5mm)含量为6.9％。
将1350g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置25min后不会产生沉淀，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计0.4U/g所称取的转谷氨酰胺酶5.4g(比活力为100U/g)加入至混合液中于30℃下催化反应1.5h；催化反应时间到达后，再调节混合液的pH为6.5～7.0，然后以微纤维胶原干重计120U/g所称取的辣根过氧化物酶1.01g(比活力为160U/mg)加入至混合液中继续于30℃下催化反应1h，期间在辣根过氧化物酶加入之后每隔120s滴加5μL摩尔浓度为9.4×10-3mol/L的过氧化氢溶液，总计滴加110μL；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到交联改性的微纤维胶原。
经测定，交联改性后的微纤维胶原长度1mm以下的纤维含量68.0％，长度2～5mm的纤维含量为7.1％，其热变性温度为65.7℃；体外酶降解率为58％，重金属含量为2.4mg/kg。
对比例1
所选择的微纤维胶原原料为参照本发明申请人在先专利(申请号：2018110365927)所制备获得的微纤维胶原。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为68.6％，长纤维(纤维长度2～5mm)含量为6.7％。
将1350g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置25min后不会产生沉淀，调节混合液pH为6.0～7.0，然后将混合液在30℃下振荡1.5h，之后再调节混合液的pH为6.5～7.0，于30℃下振荡1h，离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到对比例1产品。
经测定，对比例1产品长度1mm以下的纤维含量68.4％，长度2～5mm的纤维含量为6.8％，其热变性温度为58.3℃；体外酶降解率为93.3％，重金属含量为2.3mg/kg，除热变性温度有所下降外基本同该对比例所使用的微纤维胶原性质一致，证明其基本未产生交联改性。
对比例2
所选择的微纤维胶原原料为参照本发明申请人在先专利(申请号：2018110365927)所制备获得的微纤维胶原。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为70.5％，长纤维(纤维长度2～5mm)含量为6.4％。
将8000g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置25min后不会产生沉淀，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计0.05U/g所称取的转谷氨酰胺酶4g(比活力为100U/g)加入至混合液中于30℃下催化反应2h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到对比例2的产品。
经测定，对比例2的产品长度1mm以下的纤维含量70.7％，长度2～5mm的纤维含量为6.3％，其热变性温度为58.2℃；体外酶降解率为93.6％，重金属含量为2.4mg/kg，同该对比例所使用的微纤维胶原性质差异很小，推测其交联改性程度不明显。
对比例3
所选择的微纤维胶原原料为按照现有文献做出来的普通产品。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为65.1％。
将1600g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置20min后不会产生沉淀，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计1.2U/g所称取的转谷氨酰胺酶19.2g(比活力为100U/g)加入至混合液中于25℃下催化反应5h，催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到对比例3的产品。
经测定，对比例3的产品长度1mm以下的纤维含量65.3％，长度2～5mm的纤维含量为10.8％，其热变性温度为58.4℃；体外酶降解率为92.8％，重金属含量为2.4mg/kg，同该对比例所使用的微纤维胶原性质差异较小，相较对比例2情况更好，但仍推测其交联改性程度极低。
对比例4
所选择的微纤维胶原原料为参照本发明申请人在先专利(申请号：2018110365927)所制备获得的微纤维胶原。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为72.5％，长纤维(纤维长度2～5mm)含量为6.1％。
将100g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置25min后不会产生沉淀，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计50U/g所称取的转谷氨酰胺酶50g(比活力为100U/g)加入至混合液中于25℃下催化反应2h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到对比例4的产品。
经测定，对比例4的产品长度1mm以下的纤维含量72.7％，长度2～5mm的纤维含量为6.0％，其热变性温度为51℃；体外酶降解率为98.3％，重金属含量为2.4mg/kg，从测定结果可以看出，该对比例所得产品热稳定性过低，不适宜作为生物医学材料。
对比例5
所选择的微纤维胶原原料为参照本发明申请人在先专利(申请号：2018110365927)所制备获得的微纤维胶原。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为72.5％，长纤维(纤维长度2～5mm)含量为6.1％。
将100g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置25min后不会产生沉淀，调节混合液的pH为5.0～5.5，然后以微纤维胶原干重计100 000U/g所称取的酪氨酸酶20g(比活力为500U/mg)加入至混合液中于25℃下催化反应1h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到对比例4的产品。
经测定，对比例4的产品长度1mm以下的纤维含量72.6％，长度2～5mm的纤维含量为6.0％，其热变性温度为48℃；体外酶降解率为100％，重金属含量为2.4mg/kg，从测定结果可以看出，该对比例所得产品热稳定性过低，不适宜作为生物医学材料。
对比例6
所选择的微纤维胶原原料为参照本发明申请人在先专利(申请号：2018110365927)所制备获得的微纤维胶原。该微纤维胶原中短纤维(纤维长度≤1mm)含量为69.7％，长纤维(纤维长度2～5mm)含量为6.5％。
将9000g微纤维胶原原料加入到去离子水中配制成固含量为2.5％的混合液，通过振荡充分将微纤维胶原原料分散均匀，至静置25min后不会产生沉淀，调节混合液pH为6.0～7.0；然后加入以微纤维胶原干重计0.3U/g所称取的转谷氨酰胺酶27g(比活力为100U/g)，以及以微纤维胶原干重计80U/g所称取的酪氨酸酶1.44g(比活力为500U/mg)，同时加入以混合液总体积计0.06％且摩尔浓度为0.3mol/L的MgCl2溶液于30℃下催化反应5h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀并用去离子水洗涤，冷冻干燥，灭菌，得到对比例5的产品。
经测定，对比例4的产品长度1mm以下的纤维含量70.1％，长度2～5mm的纤维含量为6.5％，其热变性温度为57.7℃；体外酶降解率为95.3％，重金属含量为3.5mg/kg，同该对比例所使用的微纤维胶原性质差异较小，推测其交联改性程度不明显。
Claims (10)
1.一种多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，其特征在于是将微纤维胶原原料分散在去离子水中配置为混合液，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计0.1～2.5U/g所称取的转谷氨酰胺酶加入至混合液中于25～30℃下催化反应0.5～3h；催化反应时间到达后，然后以微纤维胶原干重计50～250U/g所称取的A酶加入至混合液中继续于25～30℃下催化反应0.5～2h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀，将所得沉淀进行包括洗涤、干燥的后处理，即得交联改性的微纤维胶原；
所述A酶包括酪氨酸酶、辣根过氧化物酶中的任意一种；当选用酪氨酸酶时，在加入前调节混合液的pH为5.0～5.5；当选用辣根过氧化物酶时，在加入前调节混合液的pH为6.5～7.0，在将所称取的辣根过氧化物酶加入至混合液后，还包括加入浓度为5～10×10-3mol/L的过氧化氢溶液80～200μL，过氧化氢溶液的加入方式为每次滴加2～5μL，间隔60～180s进行下一次滴加，直至滴加完毕。
2.根据权利要求1所述多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，其特征在于：所述转谷氨酰胺酶加入至混合液中于25～30℃下催化反应0.5～3h，还包括加入以混合液总体积计0.05～0.1％且摩尔浓度为0.1～1mol/L的金属离子试剂。
3.根据权利要求1或2所述多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，其特征在于：所述A酶加入至混合液中继续于25～30℃下催化反应0.5～2h，还包括加入以混合液总体积计0.05～0.1％且摩尔浓度为0.1～1mol/L的金属离子试剂。
4.根据权利要求3所述多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，其特征在于：所述金属离子为Na+试剂、Mg2+试剂、Ca2+试剂、Cu2+试剂中的任意一种。
5.根据权利要求1所述多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，其特征在于：是将纤维长度≤1mm的短纤维含量为50～80％的微纤维胶原作为微纤维胶原原料；
将微纤维胶原原料分散在去离子水中配置为混合液，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计0.1～1.2U/g所称取的转谷氨酰胺酶加入至混合液中于25～30℃下催化反应0.5～2.5h；催化反应时间到达后，然后以微纤维胶原干重计50～220U/g所称取的A酶加入至混合液中继续于25～30℃下催化反应0.5～1.5h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀，将所得沉淀进行包括洗涤、干燥的后处理，即得交联改性的微纤维胶原；
所述A酶包括酪氨酸酶、辣根过氧化物酶中的任意一种；当选用酪氨酸酶时，在加入前调节混合液的pH为5.0～5.5；当选用辣根过氧化物酶时，在加入前调节混合液的pH为6.5～7.0，在将所称取的辣根过氧化物酶加入至混合液后，还包括加入浓度为5～10×10-3mol/L的过氧化氢溶液80～160μL，过氧化氢溶液的加入方式为每次滴加2～5μL，间隔60～150s进行下一次滴加，直至滴加完毕。
6.根据权利要求5所述多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，其特征在于：所述转谷氨酰胺酶加入至混合液中于25～30℃下催化反应0.5～2.5h，还包括加入以混合液总体积计0.05～0.1％且摩尔浓度为0.1～1mol/L的金属离子试剂。
7.根据权利要求5或6所述多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，其特征在于：所述A酶加入至混合液中继续于25～30℃下催化反应0.5～1.5h，还包括加入以混合液总体积计0.05～0.1％且摩尔浓度为0.1～1mol/L的金属离子试剂。
8.根据权利要求1所述多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，其特征在于：是将纤维长度≤1mm的短纤维含量为50～80％、纤维长度2～5mm的长纤维含量为5～10％的微纤维胶原作为微纤维胶原原料，
将微纤维胶原原料分散在去离子水中配置为混合液，调节混合液pH为6.0～7.0；然后以微纤维胶原干重计0.1～0.5U/g所称取的转谷氨酰胺酶加入至混合液中于25～30℃下催化反应0.5～2h；催化反应时间到达后，然后以微纤维胶原干重计50～150U/g所称取的A酶加入至混合液中继续于25～30℃下催化反应0.5～1h；催化反应时间到达后，将混合液离心处理取沉淀，将所得沉淀进行包括洗涤、干燥的后处理，即得交联改性的微纤维胶原；
所述A酶包括酪氨酸酶、辣根过氧化物酶中的任意一种；当选用酪氨酸酶时，在加入前调节混合液的pH为5.0～5.5；当选用辣根过氧化物酶时，在加入前调节混合液的pH为6.5～7.0，在将所称取的辣根过氧化物酶加入至混合液后，还包括加入浓度为5～10×10-3mol/L的过氧化氢溶液80～120μL，过氧化氢溶液的加入方式为每次滴加2～5μL，间隔60～120s进行下一次滴加，直至滴加完毕。
9.根据权利要求8所述多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，其特征在于：所述转谷氨酰胺酶加入至混合液中于25～30℃下催化反应0.5～2h，还包括加入以混合液总体积计0.05～0.1％且摩尔浓度为0.1～1mol/L的金属离子试剂。
10.根据权利要求8或9所述多步连续酶催化微纤维胶原交联改性的方法，其特征在于：所述A酶加入至混合液中继续于25～30℃下催化反应0.5～1h，还包括加入以混合液总体积计0.05～0.1％且摩尔浓度为0.1～1mol/L的金属离子试剂。
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