CN117924740A - 一种胶原水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胶原水凝胶及其制备方法和应用，所述制备方法包括如下步骤：(1)利用胺氧化酶催化胶原氧化脱氨生成不饱和醛基官能团，发生分子内或分子间交联，完成一次交联；(2)将一次交联的产物在羧基活化剂催化下发生二次交联，得到所述胶原水凝胶。本发明中，所述方法制备的胶原水凝胶为纯胶原水凝胶，固化速度快，生物相容性好(仿生性优异)，力学强度可调，结构尺寸可调，稳定性好，应用范围广。

Description

一种胶原水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及胶原水凝胶技术领域，尤其涉及一种胶原水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

水凝胶是一种聚合的网络结构，它可以吸收和保存大量的水。在这种聚合物网络中有亲水的基团或区域，它们可以在中性条件下水合，从而产生凝胶结构。由于具有高度水合的三维网络，水凝胶为细胞粘附、增殖和分化提供了空间。因此，水凝胶支架在负载细胞和组织发展方面具有极大的吸引力。

胶原是细胞外基质的主要组成成分，是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质。胶原因其三股螺旋结构除了具有优良的机械性能以外，还具有低抗原性、凝血作用、易被人体吸收以及促进细胞的存活和生长等性能，在生物医学领域得到了广泛应用。

目前，大部分胶原水凝胶是通过物理交联如低温自组装、紫外照射、热交联、冷冻干燥、氢键作用力等方法制备，存在机械性能较差以及降解速率较快的问题；或与其他材料组成复合体系的方式来实现凝胶化，存在成分复杂、降解产物不清晰等问题。

CN 109265705A公开了一种胶原巯基化衍生物及其制备方法和应用。以胶原为原料，以同时带有巯基和羧基或同时带有巯基和氨基的巯基化合物作修饰剂，在羧基活化剂的作用下，在胶原分子链上成功引入巯基。其公开的巯基改性后的胶原衍生物侧链灵活可变，制备出的不同改性的胶原巯基化衍生物。

CN 107513172A中公布的一种制备胶原膜的方法，利用羟基羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯活化胶原形成共价交联，再利用氧化酶溶液进一步催化形成二次交联。该方法在制备工艺上存在胶体柔韧性较差、降解速率较快、结构不可调控及凝胶化速度较慢、容易失真等问题，大大限制了胶原水凝胶在组织工程支架，特别是纤维材料方面的应用。

综上所述，开发一种固化速度快、胶体机械性能较好、降解速率较慢、结构可调控、能快速精确塑造的胶原水凝胶的制备方法是至关重要的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种胶原水凝胶及其制备方法和应用，所述方法制备的胶原水凝胶为纯胶原水凝胶，固化速度快，生物相容性好(仿生性优异)，力学强度可调，结构尺寸可调，稳定性好，应用范围广。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种胶原水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)利用胺氧化酶催化胶原氧化脱氨生成不饱和醛基官能团，发生分子内或分子间交联，完成一次交联；

(2)将一次交联的产物在羧基活化剂催化下发生二次交联，得到所述胶原水凝胶。

本发明中，通过一次交联(酶交联反应)和二次交联(酰胺化交联)两种交联方式来实现纯胶原的凝胶化转变，通过改变胶原溶液的浓度和酶的用量，以及固化接收液的选择来调节纯胶原水凝胶的力学强度和微观结构。

具体地，胶原(COL)是人及动物体内含量最丰富的蛋白质。到目前为止，在脊椎动物体内已发现有28种类型的胶原。其中，Ⅰ型胶原是数量最多、用途最广的一种胶原。所有的胶原分子都是由3条多肽链构成的，即三股螺旋结构。此结构赋予胶原一些特殊性质，如圆二色性、较低的抗原性、优良的凝血作用等。胶原是一种两性电解质，其分子中的碱性氨基酸(如赖氨酸、组氨酸等)含有ε-氨基、亚氨基等活性基团，它们能与许多化学试剂发生反应。

本发明中，利用胺氧化酶对胶原肽链上的赖氨酰或羟赖氨酰进行酶催化氧化，可得到醛基赖氨酰或醛基羟赖氨酰。进一步地，醛基之间，或醛基与活性氨基之间发生化学交联，能够达到快速固化的目的。

本发明所述方法是模拟体内胶原蛋白和弹性蛋白成熟的机制，因此，所述方法预期也适用于弹性蛋白水凝胶和明胶水凝胶的制备。

本发明中，所述胶原溶液中的胶原为纯胶原，优选为牛皮来源的Ⅰ型胶原、牛皮来源的Ⅱ型胶原或鼠尾来源的Ⅰ型胶原中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括：牛皮来源的Ⅰ型胶原和牛皮来源的Ⅱ型胶原的组合，牛皮来源的Ⅱ型胶原和鼠尾来源的Ⅰ型胶原的组合，牛皮来源的Ⅰ型胶原、牛皮来源的Ⅱ型胶原和鼠尾来源的Ⅰ型胶原的组合等。

优选地，本发明中所述化学交联反应在弱碱性条件下进行，属于席夫碱反应，属于pH响应型化学键，扩大了应用场景。

优选地，所述胶原溶液的浓度为20-60mg/mL，例如24mg/mL、26mg/mL、28mg/mL、30mg/mL、32mg/mL、34mg/mL、36mg/mL、38mg/mL、40mg/mL、42mg/mL、44mg/mL、46mg/mL、48mg/mL、50mg/mL、52mg/mL、54mg/mL、56mg/mL、58mg/mL等。

优选地，所述胶原溶液的pH＜7，例如6.5、6、5.5、5等。

优选地，所述胶原溶液的溶剂包括有机酸溶液。

优选地，所述胶原溶液的溶剂包括乙酸溶液。

优选地，所述乙酸溶液的质量分数为0.01％-30％，例如1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％等。

优选地，所述胺氧化酶溶液的浓度为5-7U/mL，例如5.2U/mL、5.4U/mL、5.6U/mL、5.8U/mL、6U/mL、6.2U/mL、6.4U/mL、6.6U/mL、6.8U/mL等。

本发明中，通过调节胶原的浓度和酶的浓度，可实现纯胶原水凝胶弹性模量的调节和内部孔隙结构的调节，扩大材料的应用范围。

优选地，所述胺氧化酶溶液的pH为6.5-7.5，例如6.6、6.8、7.0、7.2、7.4等。

优选地，所述胺氧化酶包括血浆胺氧化酶、单胺氧化酶、二胺氧化酶或赖氨酰氧化酶中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括：血浆胺氧化酶和单胺氧化酶的组合，单胺氧化酶、二胺氧化酶和赖氨酰氧化酶的组合，血浆胺氧化酶、单胺氧化酶、二胺氧化酶和赖氨酰氧化酶的组合等，进一步优选血浆胺氧化酶。

本发明中，血浆胺氧化酶、单胺氧化酶、二胺氧化酶或赖氨酰氧化酶在机体胶原蛋白纤维形成过程中发挥着近似的作用，优选血浆胺氧化酶的原因是此种研究有望利用病人自体血浆来实现原位固化。

优选地，所述二次交联在含有羧基活化剂的固化接收液中进行。

优选地，所述固化接收液的pH值为7-9，例如7.2、7.4、7.6、7.8、8、8.2、8.4、8.6、8.8等。

优选地，所述固化接收液包括弱碱溶液。

本发明中，所述固化接收液为含碳酸氢根或碳酸根离子的弱碱溶液。采用弱碱溶液作为固化接收液，可提供酶交联的反应条件，快速实现原材料的快速凝胶化转变从而发生席夫碱反应形成第一层可逆共价交联网络。同时固化液可与胶原溶液的溶剂冰醋酸反应生成二氧化碳气泡通过在凝胶内部发生气液置换而形成孔隙。

优选地，所述弱碱溶液包括碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸钠或碳酸钾中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括：碳酸氢钠和碳酸氢钾的组合，碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸钾的组合，碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠和碳酸钾的组合等，进一步优选碳酸氢钠(NaHCO₃)。

本发明中，所述弱碱溶液为碳酸氢钠溶液，避免了使用强碱溶液造成的胶原蛋白变性。其为酶交联提供所需的弱碱pH条件。并且，胶原溶液的溶剂冰醋酸可与碳酸氢钠溶液快速发生反应，在水凝胶内部生成CO₂气体，进而汇集成大小均一的气泡，进行气-液置换后在水凝胶内部形成丰富的孔隙。

优选地，所述一次交联的反应温度4-37℃，例如5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃等。

本发明中，通过在室温下将胺氧化酶与胶原溶液混合均匀，从而使胺氧化酶充分发挥催化氧化活性。

优选地，所述一次交联的反应时间为1s-12h，例如1s、1h、2h、4h、6h、8h、10h等。

需要说明的是，本发明中，在将酶催化反应的反应产物加入到固化液中进行成胶前，所述制备方法还可以包括将酶催化反应的反应产物进行离心，以去除外界因素造成的气泡，能够避免在凝胶中形成额外的大的不均匀的气泡孔洞，影响凝胶的内部结构。

优选地，所述羧基活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和/或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

本发明中，EDC是可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂，也用于活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联和免疫偶联物的制取，常和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺联用，以提高偶联效率。NHS即N-羟基琥珀酰亚胺，活化羧基以利于酰胺键的形成。

胶原肽链中的酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)提供了较多的侧链羧基，其反应活性也很强，在羧基活化剂EDC/NHS的作用下，能够与胶原肽链上剩余的氨基进行反应，进一步形成共价交联的可逆聚合物网络结构，形成纯胶原水凝胶。

优选地，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1-10)：1，其中，1-10可以为2、3、4、5、6、7、8、9等。

优选地，所述羧基活化剂的浓度为0.5-1mg/mL，例如0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL等。

本发明中，所述羧基活化剂进一步优选EDC和NHC的组合，二者的质量比为(1-10)：1，浓度为0.5-1mg/mL，此条件下，在胶原水凝胶中残余的氨基与羧基发生酰胺化反应形成第二层共价交联网络。

本发明中，可选地，所述制备方法还包括通过微量注射技术将胶原溶液凝胶化，制备成不同直径的胶原纤维。具体地，可改变注射挤压的针头直径以及流速、电压等参数来实现。

在可选实施方式中，将共价交联得到的胶原水凝胶用清水洗涤至少3次(例如4次、5次、6次等)，以除去残余的化合物，冷冻干燥2～3天(例如2.2天、2.4天、2.6天、2.8天等)，得到干燥后的纯胶原水凝胶。

上述制备过程中，首先，通过利用胺氧化酶催化氧化胶原蛋白，使其发生酶交联反应，来实现纯胶原水凝胶的快速固化；其次，利用羧基活化剂EDC/NHS进行酰胺化交联，进一步增强纯胶原水凝胶的机械性能。

优选地，所述二次交联的反应温度为4-37℃，例如5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃等。

优选地，所述二次交联的反应时间为0.1-12h，例如1h、2h、4h、6h、8h、10h等。

作为优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将浓度为20-60mg/mL和pH＜7的胶原溶液与浓度为5-7U/mL和pH为6.5-7.5的胺氧化酶溶液，在4-37℃下进行1s-12h酶催化氧化脱氨反应，完成一次交联；

(2)将酶催化反应的反应产物在pH值为7-9的含有羧基活化剂的固化接收液中，在4-37℃下进行1s-12h的二次交联，得到胶原水凝胶。

本发明中，所述方法在时间发生上包含两步：第一步是由胺氧化酶介导的席夫碱反应，使得水凝胶能够在数秒内快速固化，满足精准制造和快速成型的要求，扩大了该水凝胶在干湿法纺丝及3D生物打印等领域的应用；但由于席夫碱在提高水凝胶内分子链流动性的同时对pH敏感，为了增加水凝胶的稳定性，进行了第二步由羧基活化剂介导的酰胺化偶联反应以增强其稳定性。

第二方面，本发明提供一种胶原水凝胶，所述胶原水凝胶由第一方面所述的制备方法制得。

第三方面，本发明提供一种第二方面所述的胶原水凝胶在生物医用材料或组织工程支架中的应用。

本发明中，所述胶原水凝胶模拟体内胶原蛋白纤维形成的机理，仿生性和生物相容性优异。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明中，所述方法制备的胶原水凝胶为纯胶原水凝胶，固化速度快，生物相容性好(仿生性优异)，力学强度可调，结构尺寸可调，稳定性好，应用范围广。

本发明所述胶原水凝胶纤维最大拉断伸长率在79.13±2.54％以上，最大拉伸应力在118.60±2.3kPa以上，纤维直径在199.59±8.45-860.91±15.44μm之间，本发明所述胶原水凝胶纤维具有较好的机械强度和弹性性能，纤维直径小。

(2)本发明中，所述方法制备的胶原水凝胶与目前的纯物理胶原水凝胶、多组分共混胶原水凝胶等相比，既提高了固化速度(本申请成胶时间在12s内可实现，现有技术需要在6min以上)，也改善了胶原水凝胶的机械性能和稳定性，凝胶成分简单而且清晰，可应用于3D生物打印及增材制造。

(3)本发明中，与现有的已开发的先EDC/NHS羧基活化剂交联后酶交联的纯胶原水凝胶相比，既提高了固化速度，也可借助于溶剂之间的反应使胶原水凝胶内部产生大量密集的CO₂气泡从而形成丰富的孔隙。同时，酶交联使得胶原分子链的构象存在可逆变化，增加了分子链的流动性，最终使得胶原水凝胶纤维具有较好的柔韧性。此外，还实现了对水凝胶纤维尺寸的调控，在此基础上能够实现多种形态的材料支架构建。

附图说明

图1是实施例1所述方法制备的块状胶原水凝胶的实物示意图；

图2是实施例1所述方法制备的胶原水凝胶纤维的实物示意图；

图3是实施例1所述方法中涉及的胶原、酶交联反应产物和胶原水凝胶纤维的红外测试结果图；

图4是实施例1所述方法制备的胶原水凝胶纤维的微观截面图；

图5a是实施例1所述方法制备的胶原水凝胶纤维的表面形貌图；

图5b是实施例2所述方法制备的胶原水凝胶纤维的表面形貌图；

图5c是实施例3所述方法制备的胶原水凝胶纤维的表面形貌图；

图5d是实施例4所述方法制备的胶原水凝胶纤维的表面形貌图；

图6是实施例1、实施例5和实施例6所述方法制备的胶原水凝胶纤维的应力应变图；

图7是实施例1、实施例7和实施例8所述方法制备的胶原水凝胶纤维的应力应变图；

图8是实施例13所述方法中成胶过程的时间扫描测试图；

图9是对比例1所述方法中成胶过程的时间扫描测试图；

图10是实施例1所述方法制备的胶原水凝胶纤维在组织工程支架中的应用图。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

本发明中，各实施例中使用的是牛皮胶原提取的大分子胶原蛋白，主要成分是1型胶原。

实施例1

本实施例提供了一种胶原水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将40mg纯胶原溶解在1mL质量分数为1％的乙酸水溶液中，在超声振荡器及37℃水浴的作用下完全溶解至透明状溶液，形成胶原溶液；

(2)准确称取血浆胺氧化酶20mg，加入1mL双蒸水充分溶解，分装保存于-20℃，注意避光，形成胺氧化酶溶液，pH为7，浓度为6.8U/mL；

(3)取10μL上述血浆胺氧化酶溶液加入到1mL溶解好的胶原溶液中，充分混匀，在25℃下进行30min酶催化的一次交联反应，离心去除气泡后，吸入1mL注射器(注射器尺寸为25G)中准备挤出；

(4)将上述酶交联反应的产物挤出到预冷的含50％wt的EDC：NHS(4:1)的NaHCO₃水溶液中，在25℃下固化30min，完成二次交联，得到双交联的纯胶原水凝胶纤维；

(5)将上述交联得到的胶原水凝胶浸入双蒸水中，清洗3次，得到胶原水凝胶纤维。

实施例2-4

实施例2-4与实施例1的区别在于注射器的尺寸分别为27G(实施例2)、22G(实施例3)和18G(实施例4)，其余均与实施例1相同。

实施例5

本实施例提供了一种胶原水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将30mg纯胶原溶解在1mL质量分数为1％的乙酸溶液中，在超声振荡器及37℃水浴的作用下完全溶解至透明状溶液，形成胶原溶液；

(2)准确称取血浆胺氧化酶20mg，加入1mL双蒸水充分溶解，分装保存于-20℃，注意避光，形成胺氧化酶溶液，pH为7，浓度为6.8U/mL；

(3)取10μL上述血浆胺氧化酶溶液加入到1mL溶解好的胶原溶液中，充分混匀，在25℃下进行30min酶催化的一次交联，离心去除气泡后，吸入1mL注射器中准备挤出；

(4)将上述胶原溶液挤出到预冷的含50％wt的EDC：NHS(4:1)的NaHCO₃溶液中，在25℃下固化30min，完成二次交联，得到双交联的纯胶原水凝胶纤维；

(5)将上述交联得到的胶原水凝胶浸入双蒸水中，清洗3次，得到胶原水凝胶纤维。

实施例6

本实施例提供了一种胶原水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将50mg纯胶原溶解在1mL质量分数为1％的乙酸溶液中，在超声振荡器及37℃水浴的作用下完全溶解至透明状溶液，形成胶原溶液；

(2)准确称取血浆胺氧化酶20mg，加入1mL双蒸水充分溶解，分装保存于-20℃，注意避光，形成胺氧化酶溶液，pH为7，浓度为6.8U/mL；

(3)取10μL上述血浆胺氧化酶溶液加入到1mL溶解好的胶原溶液中，充分混匀，在25℃下进行30min酶催化的一次交联反应，离心去除气泡后，吸入1mL注射器中准备；

(4)将上述胶原溶液挤出到预冷的含50％wt的EDC：NHS(4:1)的NaHCO₃溶液中，在25℃下固化30min，完成成胶和二次交联，得到双交联的纯胶原水凝胶纤维；

(5)将上述交联得到的胶原水凝胶浸入双蒸水中，清洗3次，得到胶原水凝胶纤维。

实施例7-8

实施例7-8与实施例1的区别在于纯胶原的质量为20mg(实施例7)和60mg(实施例8)，形成的胶原溶液的质量浓度分别为20mg/mL和60mg/mL，其余均与实施例1相同。

实施例9-10

实施例9-10与实施例1的区别在于血浆胺氧化酶的浓度分别为4U/mL(实施例9)和8U/mL(实施例10)，其余均与实施例1相同。

实施例11

本实施例与实施例1的区别在于步骤(4)具体为：将上述酶交联反应的产物挤出到预冷的含50％wt的EDC：NHS(4:1)的NaHCO₃溶液中，在4℃下固化30min，完成成胶和二次交联，得到交联的纯胶原水凝胶纤维，其余均与实施例1相同。

实施例12

本实施例与实施例1的区别在于步骤(4)中不包括NaHCO₃，其余均与实施例1相同。

实施例13

本实施例与实施例1的区别在于步骤(4)中不包括NaHCO₃和EDC/NHS，其余均与实施例1相同。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于不进行二次交联，其余均与实施例1相同。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于只进行二次交联，其余均与实施例1相同。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于两次交联反应调换顺序，其余均与实施例1相同。

性能测试

1、以实施例1或实施例1-4所述胶原水凝胶纤维为例，进行如下测试：

(1)宏观结构

图1为实施例1所述胶原水凝胶的实物展示，由图1可以看到块状水凝胶内部分布了大量密集均一的气泡，形成孔洞结构。

其中，图1所使用的测试样品是将步骤(3)离心去除气泡后，即酶催化反应后的产物未采用注射器挤出，而是浸泡于NaHCO₃溶液，所述制备方法是为了方便观察块状水凝胶的表观形貌。

图2是实施例1所述的胶原水凝胶纤维的实物展示，由图2可以看到胶原水凝胶纤维呈均匀的线性结构，收集制备得到胶原有序纤维支架，具有与天然脊髓相似的形貌。

(2)红外测试

对实施例1步骤(1)所使用的纯胶原(COL)、步骤(3)中酶交联反应产物(COL-PAO)和步骤(5)所得胶原水凝胶纤维(COL-PAO-E/N)进行红外测试，结果如图3所示，胶原与酶交联胶原水凝胶红外图谱对比分析可以看出，在1900cm^-1附近出现的C＝O表明反应后产生了醛基，证明发生了席夫碱反应；1500-1650cm^-1附近的酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带，可以看到无论是酶交联胶原水凝胶还是二次交联胶原水凝胶的酰胺带均有加强；在2100cm^-1附近的-NH³⁺的吸收带，胶原发生交联反应后游离氨基减少，质子化氨基含量减少，-NH³⁺的吸收带峰强度明显减小，以上现象表明胶原发生了酶交联反应和二次交联反应。

(3)微观表面结构

将实施例1所述胶原水凝胶纤维的截面进行扫描电镜测试，观察其表面形貌，结果如图4可知。

将实施例1-4所述胶原水凝胶纤维，即对得到的不同尺寸的胶原水凝胶纤维的结构和形貌进行SEM分析，结果如图5a、图5b、图5c、图5d所示。

SEM分析表明固化后胶原水凝胶表面出现很多交联后的孔洞，说明交联反应进行得很完全。

(4)时间扫描测试

通过旋转流变仪对实施例1所述胶原水凝胶纤维的一次交联反应进行时间扫描测试，结果如图8所示，结果显示，在约12s时弹性模量(G')>粘性模量(G”)，之后G'稳定并大于G”，说明胶原溶液在约12s发生成胶反应，能够快速固化。

(5)生物性能：将所述胶原水凝胶纤维组装成直径约2mm，长度约4cm的纤维束支架(PCFS)在完全性脊髓损伤大鼠模型中验证其损伤修复功能，治疗3个月后对损伤区域组织的Tuj-1阳性神经元进行免疫荧光标记。结果如图10所示。可以看出PCFS能够有效促进内源性神经元的发生，有利于损伤修复。

2、将实施例1-12和对比例1-2所述的胶原水凝胶纤维进行如下测试：

(1)力学性能：使用10N传感器，置于传感器拉伸夹具上，根据样品的大小设置好测试参数，测试曲线出现突变后，停止拉伸，系统自动得出力学性能值；

测试参数：长10mm，直径260μm(实施例1,5,6,7,8,9,10,11)，直径210μm(实施例2)，直径420μm(实施例3)，直径860μm(实施例4)，压缩速率0.5mm/min。

(2)纤维直径：通过扫描电镜观察统计纤维直径。

测试结果汇总于表1和图6-7中。

表1

分析表1数据可知，本发明所述胶原水凝胶纤维最大拉断伸长率在45.53±16.03％～98.66±2.56％，最大拉伸应力在118.60±2.3kPa～328.42±10.64KPa，纤维直径在199.59±8.45-860.91±15.44μm之间，本发明所述胶原水凝胶纤维具有较好的机械强度和弹性性能，纤维直径可调节。

分析实施例1、5和6可知，结果如图6所示，本发明所述胶原水凝胶纤维具有较好的机械强度和弹性性能，且在一定范围内，随着初始底物浓度的逐渐增加，胶原水凝胶的机械强度逐渐增加。

分析实施例1和实施例7-8，实施例7-8性能不如实施例1，结果如图7所示，证明在一定范围内，随着底物酶浓度的变化，获得胶原水凝胶的机械性能发生变化，优化酶底物浓度后可获得最佳机械性能。本发明中，所述胶原溶液的浓度在30-50mg/mL更利于高性能胶原水凝胶的制备。

分析实施例13和对比例1，实施例13在不含NaHCO₃的条件下无法成胶，结果如图8(实施例13)，图9(对比例1)所示，证明NaHCO₃提供了酶交联的必要性条件。

分析对比例3和实施例1，如表1所示，证明先进行PAO酶催化交联会增加胶原水凝胶内部分子链构象的可逆变化从而提高其流动性，使水凝胶纤维的弹性增大，扩大了纤维的应用范围。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种胶原水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)利用胺氧化酶催化胶原氧化脱氨生成不饱和醛基官能团，发生分子内或分子间交联，完成一次交联；

(2)将一次交联的产物在羧基活化剂催化下发生二次交联，得到所述胶原水凝胶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述胶原和胺氧化酶先各自独立地形成胶原溶液和胺氧化酶溶液，再进行催化反应；

优选地，所述胶原溶液的浓度为20-60mg/mL；

优选地，所述胶原溶液的pH＜7；

优选地，所述胶原溶液的溶剂包括有机酸溶液；

优选地，所述胶原溶液的溶剂包括乙酸溶液；

优选地，所述乙酸溶液的质量分数为0.01％-30％。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述胺氧化酶溶液的浓度为5-7U/mL；

优选地，所述胺氧化酶溶液的pH为6.5-7.5；

优选地，所述胺氧化酶包括血浆胺氧化酶、单胺氧化酶、二胺氧化酶或赖氨酰氧化酶中的任意一种或至少两种的组合。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述二次交联在含有羧基活化剂的固化接收液中进行；

优选地，所述固化接收液的pH值为7-9；

优选地，所述固化接收液包括弱碱溶液；

优选地，所述弱碱溶液包括碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸钠或碳酸钾中的任意一种或至少两种的组合。

5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述一次交联的反应温度4-37℃；

优选地，所述一次交联的反应时间为1s-12h。

6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述羧基活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和/或N-羟基琥珀酰亚胺；

优选地，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(1-10)：1；

优选地，所述羧基活化剂在固化接收液中的浓度为0.5-1mg/mL。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述二次交联的反应温度为4-37℃；

优选地，所述二次交联的反应时间为0.1-12h。

8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将浓度为20-60mg/mL和pH＜7的胶原溶液与浓度为5-7U/mL和pH为6.5-7.5的胺氧化酶溶液，在4-37℃下进行1s-12h酶催化氧化脱氨反应，完成一次交联；

(2)将一次交联反应的反应产物在pH值为7-9的含有羧基活化剂的固化接收液中，在4-37℃下进行1s-12h的成胶和二次交联，得到胶原水凝胶。

9.一种胶原水凝胶，其特征在于，所述胶原水凝胶由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得。

10.一种权利要求9所述的胶原水凝胶在生物医用材料或组织工程支架中的应用。