CN105646894B

CN105646894B - 一种基于聚酰胺-胺型树枝状分子的水凝胶的制备方法

Info

Publication number: CN105646894B
Application number: CN201410645225.2A
Authority: CN
Inventors: 王尧; 贾欣茹
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2014-11-10
Publication date: 2018-08-07
Anticipated expiration: 2034-11-10
Also published as: CN105646894A

Abstract

本发明公开了一种基于聚酰胺‑胺型树枝状分子的水凝胶的制备方法，该方法包括将基于选用多巴胺对巯基修饰的八臂聚乙二醇进行修饰得到的第一水凝胶因子和基于聚酰胺‑胺型树枝状分子得到的第二水凝胶因子加入到水和/或磷酸盐缓冲溶液中，混合均匀后，加入氧化剂，获得高强度、可降解且生物相容性好的水凝胶，该水凝胶能够应用在组织工程如软骨修复上。由本发明提供的制备方法所合成的水凝胶具备稳定的溶胀率、可控的降解速度和较强的机械性能，且该制备方法简单方便，易于控制，整个交联过程快速安全，从而有利于生产上的操作控制和推广。

Description

一种基于聚酰胺-胺型树枝状分子的水凝胶的制备方法

技术领域

本发明涉及高分子材料制备领域，特别涉及水凝胶的制备方法，具体涉及一种基于聚酰胺-胺型树枝状分子的水凝胶的制备方法，该水凝胶用于在组织工程，例如修复软骨方面的应用。

背景技术

水凝胶是一种可以在一定条件下保持流动状态但在外部物理或化学刺激下又可以形成具有一定形状和强度的材料。水凝胶具有亲水的聚合物网络，与细胞所处正常生理环境接近，因此采用水凝胶制备支架材料，在修复形状复杂缺损以及微创治疗等方面具有独特的优势。理想的水凝胶支架材料需要具备易交联、低溶胀、可降解、强度高以及生物相容性好等特点。近年来，水凝胶及其复合物在修复软骨方面己经取得了较大进展，并显示出良好的应用前景。

另外，水凝胶具备可降解性质，在组织工程应用中十分重要。在近些年的研究中，不同结构的可降解单元被引入到凝胶因子中以实现水凝胶的降解，常见的降解单元有酯键和双硫键等。谷胱甘肽(GSH)普遍存在于生物体内，其浓度从2μM到10mM不等，它可实现对双硫键的降解。相较于酯键的水解，双硫键的降解更为温和，并且不会引起局部pH变化。

目前，在一些现有技术中，将天然高分子应用于细胞外基质的构建。这些天然高分子主要包括海藻酸钠、琼脂、纤粘蛋白、透明质酸、胶原、明胶、壳聚糖、硫酸软骨素和纤维素等。它们共同的特点是生物相容性好，几乎无发炎反应，细胞粘附性好，属于生物友好类材料，但是这类天然高分子材料同时却存在强度低，可设计性差以及不易修饰等缺点，从而限制了该类高分子材料在实际中的应用。

合成高分子材料因其具有可控的分子结构，可设计的降解速率和机械强度，近年来也受到了广泛的关注。常用于组织工程的合成高分子包括聚乙二醇(PEG)及聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)等。然而这些线性分子所形成的水凝胶的强度却仍不足以匹配组织工程要求的强度。此外，该类分子形成的水凝胶缺少与细胞的粘附位点，因此，当细胞存在于这些水凝胶支架中时，往往会导致细胞团聚而死亡。于是，如何制备一类符合组织工程应用的水凝胶材料仍是一个挑战性课题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明人进行了锐意研究，结果发现：将基于选用多巴胺对巯基修饰的八臂聚乙二醇进行修饰得到的第一水凝胶因子或者第一水凝胶因子和基于聚酰胺-胺型树枝状分子得到的第二水凝胶因子加入到水和/或磷酸盐缓冲溶液中，混合均匀后，加入氧化剂，获得高强度、可降解且生物相容性好的水凝胶，从而完成本发明。

本发明的目的在于提供一种基于聚酰胺-胺型树枝状分子的水凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将第一水凝胶因子或者第一水凝胶因子和第二水凝胶因子加入到水和/或磷酸盐缓冲溶液中，混合均匀后，其中，

所述第一水凝胶因子如下式Ⅰ所示：

在所述式Ⅰ中，波纹线表示聚乙二醇，式Ⅰ所示的第一水凝胶因子的分子量12500～52600，

所述第二水凝胶因子为四代聚酰胺-胺型树枝状分子的衍生物，在树枝状分子的2～44个氨基上接有下述基团：以及在10～55个氨基上接有其中，A为多肽基团，n₁为21～440，n₂为21～440；

(2)向混合物中加入氧化剂，获得水凝胶。

本发明的目的还在于由式Ⅰ所示的第一水凝胶因子由包括以下步骤的方法制备得到：

1)的制备：

将2,2’-二硫二吡啶与端巯基丙醇加入到有机溶剂中，在室温下反应，得到包含有的反应体系，

2)的制备：

将步骤1)中得到的与对硝基苯基氯甲酸酯加入到有机溶剂中，在室温条件下反应，得到包含有的反应体系，

3)第一水凝胶因子的制备：

将步骤2)中得到的与多巴胺加入到有机溶剂中，在避光和室温条件下反应，然后继续加入巯基修饰的八臂聚乙二醇进行反应，最终得到包含有第一水凝胶因子的反应体系。

本发明的目的还在于第二水凝胶因子由包括以下步骤的方法制备得到：

1)将制备好的四代聚酰胺-胺型树枝状分子与双官能团聚乙二醇，加入到溶剂中，然后在室温下反应，其中，溶剂为水和与水互溶的有机溶剂中的一种或多种，

2)向步骤1)中的体系中继续加入单官能团聚乙二醇进行反应，

3)向步骤2)中的体系中继续加入多肽化合物，最终获得包含有四代聚酰胺-胺型树枝状分子的第二水凝胶因子的反应体系。

本发明的另一个目的在于由本发明提供的制备方法得到的水凝胶作为在组织工程如软骨修复方法的应用。

由本发明提供的制备方法所合成的水凝胶具备稳定的溶胀率、可控的降解速度和较强的机械性能，且该制备方法简单方便，易于控制，整个交联过程快速安全，从而有利于生产上的操作控制和推广。

附图说明

图1示出由实施例1中所得的第一水凝胶因子的核磁谱图；

图2示出由实施例1中所得的第一水凝胶因子的紫外谱图；

图3示出由实施例9中所得的水凝胶Ⅳ的扫描电镜图；

图4示出由实施例中所得的水凝胶的溶胀率测试图；

图5示出由实施例8中所得的水凝胶Ⅲ的溶胀前状态图；

图6示出由实施例8中所得的水凝胶Ⅲ的溶胀后状态图；

图7示出由实施例9中所得的水凝胶Ⅳ的降解前的状态图；

图8示出由实施例9中所得的水凝胶Ⅳ的降解后的状态图；

图9示出由实施例中所得的水凝胶的降解释放曲线测试图；

图10示出由实施例中所得的水凝胶的储能模量测定曲线图；

图11示出由实施例中所得的水凝胶的损耗模量测定曲线图。

附图标号说明

1-第一水凝胶因子；

2-巯基修饰的八臂聚乙二醇。

具体实施方式

下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。

根据本发明的一方面，提供了一种基于聚酰胺-胺型树枝状分子的水凝胶的制备方法，该方法包括以下两个步骤：

(1)将第一水凝胶因子和/或第二水凝胶因子加入到水和/或磷酸盐缓冲溶液中，混合均匀后。

在上述制备水凝胶中，反应的温度并没有特别地限制，特别地，选择在室温条件下反应。

在上述制备水凝胶中，第一水凝胶因子为O-PEG-DOPA，该O-PEG-DOPA如下式所示：

在上述式Ⅰ中，与双硫键相连接的波纹线表示聚乙二醇，聚乙二醇形成的一条长链可以称之为臂，其中，在所述式Ⅰ中，有八臂。

在上述式Ⅰ中，第一水凝胶因子的分子量为12500～52600，优选12500～42600，更优选12500～32600，最优选12500～22600。

在上述式Ⅰ中，由于水凝胶的结构中存在双硫键，因此使得水凝胶具备可降解性质，在普遍存在于生物体内的谷胱甘肽作用下，实现对双硫键的降解。另外，双硫键的降解更为温和，不会引起局部pH变化。

在上述式Ⅰ中，由于位于末端的多巴胺(DOPA)基团中的邻苯二酚基团能够实现氧化交联。此外，多巴为海洋贻贝类生物所分泌的具有粘附性功能的组分。同时还研究发现，DOPA基团的引入可有效增强材料的强度。

在上述制备水凝胶中，第二水凝胶因子为四代聚酰胺-胺型树枝状分子的衍生物，该衍生物为在四代聚酰胺-胺型树枝状分子的2～44个氨基上接有下述基团：A为多肽基团，n1为21～440，优选为30～335，更优选为62～220，最优选为76～118，同时在10～55个氨基上接有下述基团：n2为21～440，优选为21～335，更优选为21～223，最优选为21～42。

在上述第二水凝胶因子中，PAMAM树枝状分子是一种具有高度支化的高分子化合物，树枝状分子结构精确，分子量分散度窄，且该分子的表面具有大量官能团。由于树枝状分子具有大量的内部空腔以及表面众多的可修饰基团，因此，可根据实际需求，对树枝状分子的表面进行适当的修饰。

在上述制备水凝胶中，所述氧化剂为高碘酸钠、辣根过氧化物酶/H₂O₂、酪氨酸酶/O₂中的一种或多种。

在优选的实施方式中，氧化剂为高碘酸钠、辣根过氧化物酶/H₂O₂中的一种或多种。

特别地，更优选为高碘酸钠。

在上述制备水凝胶中，所述多肽基团并没有特别地限制，特别地，选用下述多肽化合物形成的基团中的一种或多种：RGDyC、RAADyC和Fmoc-RGDC，上述多肽的氨基酸排列分别如下所示：

arg-gly-asp-D-tyr-cys、arg-ala-ala-asp-D-tyr-cys、Fmoc-arg-gly-asp-D-cys。

上述所述的多肽基团中的巯基与第二水凝胶因子中的相应的基团相连接。

上述所提及的三种多肽化合物RGDyC、RAADyC和Fmoc-RGDC均可以商购获得。

在上述制备水凝胶中，第一水凝胶因子和第二水凝胶因子的质量比为1：(0.1～20)，优选1：(0.2～15)，更优选为1：(0.4～8)，最优选为1：(0.5～1.5)。

(2)向混合物中加入氧化剂，获得水凝胶。

在优选的实施方式中，氧化剂的添加量为第一水凝胶因子的重量的0.0125～5％，优选为0.02～2％，更优选为0.03～0.8％，最优选为0.05～0.2％。

经发明人研究发现，氧化剂的添加方式并不受到特别地限制，可直接加入到体系中，也可以配制成一定的溶液，以溶液的方式添加到体系中参与反应。

在上述制备水凝胶中，第一水凝胶因子的添加量为使得第一水凝胶因子在整个体系中的浓度为5～30％w/v，优选8～25％w/v，更优选为10～20％w/v，最优选为13～18％w/v，其中，整个体系的计算方式为所添加的溶剂的体积的总和。

在上述制备水凝胶中，第二水凝胶因子的添加量为使得第二水凝胶因子在整个体系中的浓度为4～30％w/v，优选5～20％w/v，更优选为6～18％w/v，最优选为7～16％w/v。

在上述制备水凝胶中，在氧化剂的作用下，将第一水凝胶因子和第二水凝胶因子中的酚羟基均被氧化为醌基，然后醌基彼此作用，使得第一水凝胶因子和第二水凝胶因子交联在一起，从而获得水凝胶。

不过，需要说明的是，上述机理仅是一种可能性推测，本发明并不限于此。

综合而言，上述水凝胶的制备基于无毒的水凝胶因子，且在水凝胶的制备中，水凝胶因子的交联过程快速安全。另外，与传统的水凝胶材料相比，制备所得的水凝胶具备稳定的溶胀率，可控的降解率和较强的机械性能。

上述水凝胶制备完成后，可将水凝胶在一定的条件下保存，保存方法如下：将所得到的水凝胶，浸泡于去离子水和/或PBS溶液中，在37℃下恒温保存，然后自然溶胀。

在优选的实施方式中，由式Ⅰ所示的第一水凝胶因子由包括以下三个步骤的制备方法得到：

步骤一、的制备：

在上述步骤一中，将2,2’-二硫二吡啶与端巯基丙醇加入到有机溶剂中，在室温下反应，得到包含有的反应体系。

另外，在制备过程中，可根据实际需求选择端巯基烷基醇类物质，作为端巯基烷基醇类物质的实例，具体提及端巯基乙醇，端巯基正丁醇等。

在上述步骤一中，所述有机溶剂为醇类溶剂和卤代烷类溶剂中的一种或多种。

作为醇类溶剂的实例，具体提及：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇和正戊醇。

在优选的实施方式中，优选为甲醇、乙醇、正丙醇以及正丁醇，进一步的，优选为甲醇和乙醇。

作为卤代烃类溶剂的实例，具体提及：二氯甲烷、三氯甲烷和1，2-二氯乙烷。

在优选的实施方式中，优选二氯甲烷和三氯甲烷。

在优选的实施方式中，所述有机溶剂选自下述溶剂中的一种或多种：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇、二氯甲烷、三氯甲烷和1，2-二氯乙烷。进一步的，优选甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种，更进一步的，优选甲醇、乙醇、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种。

在上述步骤一中，所述2,2’-二硫二吡啶与端巯基丙醇的摩尔比为2，2’-二硫二吡啶：端巯基丙醇＝1～16：1，进一步的，优选1～8:1，更优选1～5:1，最终由选为1～3：1。

在上述步骤一中，反应时间优选为8～48小时，更优选为10～18小时，最优选为11～16小时。

在上述步骤一中，将2，2’-二硫二吡啶与端巯基丙醇加入到有机溶剂中后，加入酸从而抑制副反应的产生。

特别的，酸选用有机酸，例如乙酸、柠檬酸。

在上述所提供的酸中，优选乙酸。

根据本发明人研究发现，所述酸的添加量为使得酸与2,2’-二硫二吡啶为酸：2，2’-二硫二吡啶＝(0.1～5)ml：1mol，进一步的，优选为(0.1～2.5)ml：1mol，更进一步的，优选为(0.1～1.5)ml：1mol，最优选为(0.1～1)ml：1mol。

在优选的实施方式中，步骤1)中的反应完成后，反应体系通过纯化方法提纯最终产物，特别地，优选通过柱层析提纯最终产物。

经本发明人研究发现，进行柱层析提纯时，优选二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶剂作为洗脱剂，其中，二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为二氯甲烷：乙酸乙酯＝30～60：1。

步骤二、的制备：

将步骤一中得到的与对硝基苯基氯甲酸酯加入到有机溶剂中，在室温条件下反应，得到包含有的反应体系。

在上述步骤二中，所述有机溶剂为醚类溶剂何卤代烷类溶剂中的一种或多种。

作为醚类溶剂的实例，具体提及：四氢呋喃、乙醚和1,4-二氧己环。

作为卤代烷类溶剂的实例，具体提及：三氯甲烷、二氯甲烷和1，2-二氯乙烷中的一种或多种。

在上述步骤二中，所述与对硝基苯基氯甲酸酯的摩尔比为硝基苯基氯甲酸酯＝1：(1～20)，进一步的，优选为1：(1.5～10)，更进一步的，优选为1：(2～8)，最优选为1：(2.5～3.5)。

在上述步骤二中，反应时间并没有特别的限制，保证反应完全即可。特别地，反应时间优选为18～65小时，更优选为24～55小时，最优选为30～50小时。

在上述步骤二中，在0℃以下的条件下，将原料对硝基苯甲酸酯添加到有机溶剂中。特别地，选择冰盐浴条件。

在上述步骤二中，添加完原料和硝基苯基氯甲酸酯后，加入缚酸剂，使得其与反应体系中产生的酸反应成盐。

其中，对所添加的缚酸剂的种类并没有特别的限制，只要能够与反应体系中的酸反应成盐即可。特别地，缚酸剂优选三乙胺。

其中，缚酸剂的添加量为常规添加量，并没有特别的限制。特别地，优选缚酸剂的添加量为使得缚酸剂与对硝基苯甲氯甲酸酯的摩尔比为缚酸剂：对硝基苯基氯甲酸酯＝1～50：1，优选为1.5～25：1，更优选为2～10:1，最优选为2～3:1。

在优选的实施方式中，步骤二中的反应完成后，反应体系通过纯化方法提纯最终产物，特别地，优选通过柱层析提纯最终产物。

经本发明人研究发现，进行柱层析提纯时，优选二氯甲烷与石油醚的混合溶剂作为洗脱剂，其中，二氯甲烷与石油醚的体积比为二氯甲烷：石油醚＝10～50：1。

步骤三、第一水凝胶因子的制备：

将步骤二中得到的与多巴胺加入到有机溶剂中，在避光和室温条件下反应，然后继续加入巯基修饰的八臂聚乙二醇(O-PEG)进行反应，最终得到包含有第一水凝胶因子的反应体系。

在上述步骤三中，多巴胺存在的形式并没有特别地限制，选用以盐酸盐形式存在的多巴胺或是单独以多巴胺存在的多巴胺均可。

在上述步骤三中，所述巯基修饰的八臂聚乙二醇(O-PEG)如下式Ⅱ所示：

在上述式Ⅱ上，与巯基相连接的波纹线表示聚乙二醇，聚乙二醇形成的一条长链可以称之为臂，其中，在所述式Ⅱ中，有八臂。

根据本发明，巯基修饰的八臂聚乙二醇的来源没有特别地限制，可以自行合成也可以商购。

经本发人研究发现，O-PEG的分子量为10000～50000，优选为10000～40000，更优选为10000～30000，最优选为10000～20000。

在上述步骤三中，所述有机溶剂优选为非质子极性溶剂，例如二甲亚砜和N,N-二甲基甲酰胺。其中，特别地，优选二甲基亚砜。

在上述步骤三中，多巴胺(dopamine/DOPA)是一种天然存在于蚌类中的粘附蛋白，其结构简单，可利用多巴胺结构中的酚羟基团实现氧化交联。此外，DOPA的粘附性能是酚羟基氧化为醌基团所致。同时还研究发现，加入DOPA，可有效增强材料的强度。

在上述步骤三中，与多巴胺的摩尔比为多巴胺＝1：(1～30)，优选为1：(1.3～20)，更优选为1：(1.5～15)，最优选为1：(2～7.5)。

在上述步骤三中，O-PEG的添加量为使得O-PEG与的摩尔量为O-PEG：(8～60)，优选为1：(10～40)，更优选为1：(12～30)。

在上述步骤三中，与多巴胺的反应时间为10～72小时，优选为14～60小时，更优选为20～50小时，最优选为40～48小时。

在上述步骤三中，加入巯基修饰的八臂聚乙二醇后，继续反应20～60小时，优选30～55小时，更优选为37～48小时。

在上述步骤三中，在反应体系中加入缚酸剂，其中，缚酸剂的种类并没有特别地限制，只要加入到体系中能与反应体系中产生的酸形成盐即可，特别地，选用三乙胺即可。

在上述步骤三中，将包含有第一水凝胶因子的反应体系进行纯化后得到的水凝胶因子。其中，纯化的方法并没有特别地限制，只要能将水凝胶因子纯化即可，特别地，可选用超滤或是透析的方法对水凝胶因子进行纯化。

当选用透析方法进行纯化的时候，选用透析袋的分子量为1000～20000，特别地，优选1500～15000，更优选为2000～10000。其中，透析的时间为10～100小时，优选20～50小时，更优选25～48小时，最终透析液介质由二甲基亚砜变为去离子水，且每8小时换液一次。

在上述步骤三中，纯化步骤完成后，进行冻干，则获得最终产物O-PEG-DOPA。

根据本发明，四代聚酰胺-胺型树枝状分子(G-4PAMAM)可以商购，也可以自行合成。在自行制备中，采用发散法合成PAMAM树枝状分子。以乙二胺为初始核，分别通过迈克尔加成和酰胺化反应合成半代和整代的PAMAM树枝状分子。

在优选的实施方式中，第二水凝胶因子在PAMAM树枝状分子的基础上由包括以下三个步骤制备得到：

负0.5代的聚酰胺-胺型树枝状分子(G-(-0.5)PAMAM)由下述式Ⅲ所示：

上述G-(-0.5)PAMAM的合成方法如下:在反应容器中加入乙二胺，以甲醇作为溶剂，在冰浴条件下边搅拌边滴加丙烯酸甲酯，其中，乙二胺与丙烯酸甲酯的摩尔比为1：(4.5～10)。滴加完毕后，在氮气保护作用下以及室温条件下反应48h，得到包含有G-(-0.5)PAMAM的反应体系。

G-0PAMAM的合成:在反应容器中加入上述G-(-0.5)PAMAM，以甲醇为溶剂，在冰浴条件下边搅拌边滴加乙二胺，其中G-(-0.5)PAMAM与乙二胺的摩尔比为1：(50～100)。滴加完毕后，在氮气保护一级室温条件下搅拌反应，得到包含有G-(-0.5)PAMAM的反应体系。

采用与上述相同的合成步骤，在G-3.5PAMAM的基础上合成G-4.0PAMAM。

G-4.0PAMAM树枝状分子的末端带有64个氨基，在氨基上可根据实际需求进行适当的修饰，从而得到四代聚酰胺-胺型树枝状分子的衍生物。

步骤一、将制备好的G-4.0PAMAM树枝状分子与双官能团聚乙二醇，加入到溶剂中，然后在室温下反应，其中，溶剂为水和与水互溶的有机溶剂中的一种或多种。

在上述步骤一中，所提及的双官能团聚乙二醇为聚乙二醇的一端接由马来酰亚胺基，另一端接有N-羟基琥珀酰亚胺基，可以表示为:马来酰亚胺—聚乙二醇—N-羟基琥珀酰亚胺，则MAL-PEG-NHS如下式Ⅲ所示：

作为与水互溶的有机溶剂的实例，具体提及：甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、二甲基亚砜和N，N-二甲基甲酰胺。

在优选的实施方式中，溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、二甲基亚砜以及N，N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。

在进一步优选的实施方式中，溶剂为水、甲醇、乙醇和二甲基亚砜中的一种或多种。

在更进一步的实施方式中，溶剂为水、乙醇和二甲基亚砜中的一种或多种。

特别地，溶剂最优选为水。

在上述步骤一中，MAL-PEG-NHS的分子量为1000～20000，优选为1500～15000，更优选为3000～10000，最优选为3500～5500。

在上述步骤一中，在式Ⅲ中所示的结构式中，n₁为21～440，优选为30～335，更优选为62～220，最优选为76～118。

在上述步骤一中，G-4.0PAMAM树枝状分子与马来酰亚胺—聚乙二醇—N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为G-4.0PAMAM树枝状分子：马来酰亚胺—聚乙二醇—N-羟基琥珀酰亚胺＝1：(2～44)，优选为1：(5～40)，更优选为1：(8～30)，最优选为1：(10～20)。

在上述步骤一中，反应时间并没有特别地限制，只要反应能够进行完全即可，特别地，反应时间为8～60分钟，优选为12～48分钟，更优选为14～30分钟，最优选为15～25分钟。

步骤二、向步骤一中的体系中继续加入单官能团聚乙二醇进行反应。

在上述步骤二中，所述单官能团聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(mPEG-NHS)，其中，mPEG-NHS由下式Ⅳ所示：

在上述步骤二中，mPEG-NHS共聚物的分子量为1000～20000，优选为1000～15000，更优选为1000～10000，最优选为1000～2000。

在上述步骤二中，由式Ⅳ所示的结构式中，n₂为21～440，优选为21～335，更优选为21～223，最优选为21～42。

在上述步骤二中，mPEG-NHS的添加量使得mPEG-NHS与G-4.0PAMAM树枝状分子的摩尔比为mPEG-NHS：G-4.0PAMAM＝(10～55)：1，选择上述摩尔比范围，使得最终得到的水凝胶因子具有良好的生物相容性以及水溶性。

在优选的实施方式中，mPEG-NHS与G-4.0PAMAM树枝状分子的摩尔比优选为(25～50)：1，更优选为(30～45)：1，最优选为(35～40)：1。

在上述步骤二)中，反应时间为15～120分钟，优选为20～100分钟，更优选为20～80分钟，最优选为25～45分钟。

步骤三、向步骤二中的体系中继续加入多肽化合物，最终得到包含有基于四代聚酰胺-胺型树枝状分子的水凝胶因子的反应体系。

在上述步骤三中，多肽化合物并没有特别地限制，只要在多肽化合物的链末端存在能与步骤二中已连接在树枝状分子上的MAL-PEG-NHS中的基团发生成键反应即可。

在优选的实施方式中，在上述多肽化合物中存在氨基或是巯基。多肽化合物中的巯基与MAL-PEG-NHS相连接。

在进一步优选的实施方式中，多肽化合物为RGDyC、RAADyC和Fmoc-RGDC中的一种或种。

其中，RGDyC的氨基酸排列为：arg-gly-asp-D-tyr-cys，RAADyC的氨基酸排列为：arg-ala-ala-asp-D-tyr-cys，Fmoc-RGDC的氨基酸排列为：Fmoc-arg-gly-asp-D-cys，其中Fmoc为芴甲氧羰酰基。

在上述步骤三中，多肽化合物的添加量为使得多肽化合物与步骤一中所添加的双功能聚乙二醇，即MAL-PEG-NHS的摩尔比为多肽化合物：MAL-PEG-NHS＝1：(0.1～10)，特别地，优选1：(0.3～6)，更优选1：(0.4～3)，最优选为1：(0.5～2)。

在得到步骤三的反应体系后，纯化水凝胶因子。

纯化水凝胶因子的方法并不受到特别的限制，只要能将水凝胶因子提纯即可。

在优选的实施方式中，选用透析法对水凝胶因子进行纯化，其中，透析时所需的透析袋的分子量为5000～100000。

透析的时间并没有特别地限制，只要能纯化即可，优选为20～100小时，更优选为25～55小时，最优选为35～50小时。

在透析的过程中，每8小时换液一次，然后冻干，获得基于四代聚酰胺-胺型树枝状分子的水凝胶因子。

在接到树枝状分子的MAL-PEG-NHS的末端选用多肽进行修饰，不仅提升了与细胞的粘附性，而且提供了交联点。

根据本发明的另一方面，由本发明提供的制备方法得到的水凝胶为一种三维材料，具有稳定的溶胀率、可控的降解率、较强的机械性能和良好的生物相容性，因此，该水凝胶材料能够应用到组织工程中，在市场中能够得到越来越广泛的应用。

实施例

以下通过具体实例进一步描述本发明。不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

在下述实施例中：

巯基修饰的八臂聚乙二醇(O-PEG)的分子量为20kDa；

马来酰亚胺—聚乙二醇—N-羟基琥珀酰亚胺(MAL-PEG-NHS)分子量为5000；

甲氧基聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(mPEG-NHS)分子量为1000；

四代聚酰胺-胺型树枝状分子为按照说明书中所提及的发散法自行合成。

实施例1

第一水凝胶因子O-PEG-DOPA的制备过程

1、的制备：将2.00g二硫二吡啶与426.36mg端巯基丙醇加入甲醇溶液中混合，再加入1mL乙酸，在室温下搅拌12h，得到包含有的反应体系，

将反应体系通过柱层析法进行提纯，其中，洗脱剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝40:1；

2)的制备：

在冰盐浴条件下，将步骤1)中所得提纯后的产物340mg与对硝基苯基氯甲酸酯445.01mg加入到四氢呋喃中混合，再加入400mg三乙胺，反应48小时，得到包含有的反应体系，

将上述反应体系通过柱层析进行提纯，其中，洗脱剂：二氯甲烷：石油醚＝20:1。

3)第一水凝胶因子O-PEG-DOPA的制备：

在避光和常温条件下，将219.6mg步骤2)中提纯得到的与170.7mg多巴胺(DOPA)加入二甲基亚砜(DMSO)中，再加入500mg三乙胺，反应48h，之后加入1.0g巯基修饰的八臂聚乙二醇(O-PEG)，继续反应48h，最终得到包含有第一水凝胶因子的反应体系，

将得到的包含有第一水凝胶因子的反应体系用分子量为2000的透析袋透析48h，每8h换液一次，然后冻干，获得产物第一水凝胶因子。

实施例2

含有RGDyC多肽基团的树枝状分子衍生物的制备

1)在室温条件下，将25.03mg四代的聚酰胺-胺型树枝状分子和187.73mgMAL-PEG-NHS加入水中，反应15min；

2)向步骤1)中得到的体系中再加入75.09mg mPEG-NHS，继续反应30min；

3)向步骤2)中的体系中加入13.73mg RGDyC，反应2h，得到包含有水凝胶因子(G-4.0-PEG-RGDyC)的反应体系，

得到的反应体系用分子量为8000的透析袋透析48h，每8h换液一次，然后冻干，获得水凝胶因子，即含有RGDyC多肽基团的树枝状分子衍生物。

实施例3

含有Fmoc-RGDC和RAADyC多肽基团的树枝状分子衍生物的制备

重复实施例2，其中，在步骤3)中，不添加RGDyC，而是添加11.84mgFmoc-RGDC，反应2h，之后再加入13.01mgRAADyC，反应2h，其余条件不变。

实施例4

含有RGDyC和RAADyC多肽基团的树枝状分子衍生物的制备

重复实施例2，其中，在步骤3)中，RGDyC的添加量为13.73mg，反应2h，之后加入13.01mg RAADyC，反应2h，其余条件不变。

实施例5

含有RAADyC多肽基团的树枝状分子衍生物的制备

重复实施例2，其中，在步骤3)中，不添加RGDyC，加入13.01mg RAADyC，反应2h，其余条件不变。

实施例6

水凝胶Ⅰ的制备

将实施例1中的得到的水凝胶因子15mg加入在50μL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，混合均匀后，向其中加入50μL含有1mg/100uL的高碘酸钠(NaIO₄)的水溶液，然后获得水凝胶Ⅰ。

经观察，形成凝胶的时间为5分钟。

实施例7

水凝胶Ⅱ的制备

将实施例1中的得到的水凝胶因子15mg和7.5mg实施例2中得到的水凝胶因子加入到50μL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，混合均匀后，向其中加入50μL含有1mg/100uL的高碘酸钠(NaIO₄)的水溶液，然后获得水凝胶Ⅱ。

经观察，形成凝胶的时间为5分钟。

实施例8

水凝胶Ⅲ的制备

将实施例1中的得到的水凝胶因子15mg和7.5mg实施例3中得到的水凝胶因子加入到50μL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，混合均匀后，向其中加入50μL浓度为1mg/100uL的高碘酸钠(NaIO₄)的水溶液，然后获得水凝胶Ⅲ。

经观察，形成凝胶的时间为5分钟。

实施例9

水凝胶Ⅳ的制备

将实施例1中的得到的水凝胶因子15mg和7.5mg实施例4中得到的水凝胶因子加入到50μL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，混合均匀后，向其中加入50μL浓度为1mg/100uL的高碘酸钠(NaIO₄)的水溶液，然后获得水凝胶Ⅳ。

经观察，形成凝胶的时间为5分钟。

实施例10

水凝胶Ⅴ的制备

将实施例1中的得到的水凝胶因子15mg和7.5mg实施例5中得到的水凝胶因子加入到50μL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，混合均匀后，向其中加入50μL浓度为1mg/100uL的高碘酸钠(NaIO₄)的水溶液，然后获得水凝胶Ⅴ。

经观察，形成凝胶的时间为5分钟。

试验例

核磁1H-NMR(溶剂：氘水)

将实施例1中所得的第一水凝胶因子进行核磁测试，结果如图1所示。

紫外可见光谱测试

将实施例1中所得的第一水凝胶因子进行紫外可见光谱测试，结果如图2所示。

由图2可得出：相较于O-PEG，O-PEG-DOPA存在酰胺键峰以及邻苯二酚峰，说明相较于原料O-PEG，经过反应，确实进行了DOPA的封端，完成了第一凝胶因子的构建。

由图1和图2综合分析可得，核磁低场峰为DOPA上的氢的峰，并且在紫外上出现邻苯二酚的特征峰，证明DOPA确实进行了O-PEG的封端。通过核磁积分可证明每个O-PEG-DOPA上平均有8个DOPA分子，证明DOPA基本对O-PEG进行了完全的封端，在实施例1中已成功制备得到第一水凝胶因子。

扫描电镜测试

将实施例9中所得的水凝胶浸泡在10ml PBS缓冲液中，保持缓冲液的温度为37℃，浸泡时间为48小时。将溶胀好的水凝胶用液氮速冷并切片，将切片放置在内硅片上进行冷冻干燥，然后通过扫描电镜Hitachi S4800观察其表面形态，其中，标尺为100uM，结果如图3所示。

由图3可以得知：在实施例9中得到的水凝胶Ⅳ的表面形态为多孔致密，因此该水凝胶不仅有助于细胞的生存，并且有利于高机械强度的获得。

水凝胶溶胀率的测定

将实施例6～10中所得的水凝胶分别置于10mL的缓冲液中溶胀两天，保持缓冲液的温度为37℃，然后将水凝胶取出，擦去表面的溶液，测定其质量，得到W_溶胀i，之后冻干，得到W_干胶i，利用下述计算公式进行溶胀率的计算：

溶胀率(％)＝[(W_溶胀i-W_干胶i)/W_干胶i]×100％

上述溶胀率的结果如图4所示，其中，在横坐标上每五个为一组，每组从左到右依次表示为水凝胶Ⅰ、水凝胶Ⅱ、水凝胶Ⅲ、水凝胶Ⅳ和水凝胶Ⅴ。

由图4可以得知：由本发明提供的制备方法得到的水凝胶稳定性好，更适合应用在组织工程中。

水凝胶溶胀前后对比

将实施例8所得水凝胶裁剪成一定形状，然后浸泡在10mL PBS缓冲液中，保持缓冲液的温度为37℃，浸泡时间为24小时。

将水凝胶浸泡前后的状态进行记录，结果如图5和图6所示。

由图5和图6对比可以得知：实施例得到的水凝胶尺寸、状态基本不变，因此，制备得到的水凝胶具备良好的稳定性。

水凝胶降解率的测定

将实施例9中得到的水凝胶分别浸泡在10mL PBS缓冲液中，保持缓冲液的温度为37℃，浸泡48h后，水凝胶均完全溶胀，之后在浸泡有水凝胶的PBS缓冲溶液中加入10mM的谷胱甘肽(GSH)，立刻观察水凝胶的变化。

对降解前后的水凝胶进行观察，结果如图7和图8所示。

由图7和图8可以得知：在10mM谷胱甘肽的作用下，水凝胶可以进行快速降解。

水凝胶的降解释放曲线测试

将实施例6～10中所得的水凝胶分别在含有10μM的GSH的PBS缓冲液中浸泡，缓冲溶液的温度保持为37℃，浸泡48小时达到溶胀平衡后，水凝胶从浸泡液中取出，擦去表面PBS缓冲液，称其质量为溶胀重量。之后冷冻干燥，得到干胶重量。

重新上述溶胀及冷冻干燥和称重的过程，直至水凝胶的结构瓦解，其中，W_最初为第一次冻干的干胶质量，其它为W_干胶i，

降解分数(％)＝[(W_最初-W_干胶i)/W_最初]×100％

结果如图9所示，其中，在横坐标上每五个为一组，每组从左到右依次表示为水凝胶Ⅰ、水凝胶Ⅱ、水凝胶Ⅲ、水凝胶Ⅳ和水凝胶Ⅴ。

由图9可以得知：在10μM谷胱甘肽的作用下，水凝胶在50天内基本完成降解。

水凝胶机械强度的测试

将实施例10中所得的水凝胶分别在10ml PBS缓冲溶液中浸泡48小时，保持缓冲溶液的温度为37℃，将溶胀好的水凝胶放置于平板上，分别剪切成厚为2mm，直径为25mm的圆柱体，然后利用流变仪(MCR301,Anton Paar)对裁剪后的水凝胶进行测试，其中，测试期间保持恒温37℃，在线性范围内进行频率扫描测试，频率为0.1-100rad s^-1，γ＝10％，结果分别如图10和11所示。

由图10和图11所示，由实施例提供的水凝胶的机械强度高，适合组织工程方面的应用。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

Claims

1.一种基于聚酰胺-胺型树枝状分子的水凝胶的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将第一水凝胶因子和第二水凝胶因子加入到水和/或磷酸盐缓冲溶液中，混合均匀，其中，所述第一水凝胶因子如下式Ⅰ所示：

在所述式Ⅰ中，波纹线表示聚乙二醇，式Ⅰ所示的第一水凝胶因子的分子量为12500～52600，

所述第二水凝胶因子为四代聚酰胺-胺型树枝状分子的衍生物，在树枝状分子的2～44个氨基上接有下述基团：

以及在10～55个氨基上接有其中，A为多肽基团，n₁为21～440，n₂为21～440；

(2)向混合物中加入氧化剂，获得水凝胶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，

步骤(1)中所述A表示的多肽基团为多肽RGDyC、RAADyC和Fmoc-RGDC形成的基团中的一种或多种，或/和

步骤(2)中所述氧化剂为高碘酸钠、辣根过氧化物酶/H₂O₂、酪氨酸酶/O₂中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，

步骤(1)中所添加的第一水凝胶因子和第二水凝胶因子的质量比为1：(0.1～20)，或/和

第一水凝胶因子的添加量为使得第一水凝胶因子在整个体系中的浓度为5～30％W/V。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，由式Ⅰ所示的第一水凝胶因子由包括以下步骤的方法制备得到：

1)的制备：

将2，2’-二硫二吡啶与端巯基丙醇加入到有机溶剂中，在室温下反应，得到包含有的反应体系，

2)的制备：

3)第一水凝胶因子的制备：

将步骤2)中得到的与多巴胺加入到有机溶剂中，在避光和室温条件下反应，然后继续加入巯基修饰的八臂聚乙二醇进行反应，最终得到包含有水凝胶因子的反应体系。

5.根据权利要求4中所述的制备方法，其中，

在所述步骤1)中，所述有机溶剂为醇类溶剂和卤代烷类溶剂中的一种或多种，或/和添加完2，2’-二硫二吡啶与端巯基丙醇后，添加酸，

在所述步骤2)中，所述有机溶剂为醚类溶剂和卤代烷类溶剂中的一种或多种，或/和添加完原料后，添加缚酸剂，

在所述步骤3)中，所述有机溶剂为非质子极性溶剂中的一种或多种，和/或所述巯基修饰的八臂聚乙二醇的分子量为10000～50000。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，第二水凝胶因子由包括以下步骤的方法制备得到：

1)将制备好的四代聚酰胺-胺型树枝状分子与双官能聚乙二醇，加入到溶剂中，然后在室温下反应，其中，溶剂为水和与水互溶的有机溶剂中的一种或多种，

2)向步骤1)中的体系中继续加入单官能聚乙二醇进行反应，

3)向步骤2)中的体系中继续加入多肽化合物，最终获得包含有四代聚酰胺-胺型树枝状分子的水凝胶因子的反应体系。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，在所述步骤1)中，

双官能聚乙二醇如下式所示：

和/或

所述溶剂为水和与水互溶的有机溶剂中的一种或多种，和/或

四代聚酰胺-胺型树枝状分子与双功能聚乙二醇的摩尔比为四代PAMAM树枝状分子：双功能聚乙二醇＝1：(2～44)，和/或所述反应时间为8～60分钟。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其中，在所述步骤2)中，

所述单官能聚乙二醇由下式所示：

，

和/或

单官能聚乙二醇的添加量使得其与四代聚酰胺-胺型树枝状分子的摩尔比为单官能聚乙二醇：四代聚酰胺-胺型树枝状分子＝(10～55)：1。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其中，在所述步骤3)中，

多肽化合物为RGDyC、RAADyC和Fmoc-RGDC中的一种或多种，和/或

多肽化合物的添加量为使得多肽化合物与步骤1)中所添加的双功能聚乙二醇的摩尔比为多肽化合物：双功能聚乙二醇＝(0.1～10):1，和/或

反应完成后，选用分子量为5000～100000的透析袋对体系透析20～100小时。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的制备方法得到的水凝胶作为在组织工程方面的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，所述组织工程为软骨修复应用。