CN114196047B - 丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶及其制备和应用 - Google Patents

丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶及其制备和应用，其是通过以下方法获得：将丝胶蛋白均匀溶解在水中，并在高温下变性处理，得到变性丝胶蛋白水溶液；将化学修饰的蔗渣木聚糖溶解在去离子水中得到蔗渣木聚糖水溶液，然后与变性丝胶蛋白水溶液均匀混合，再加入EDC和NHS反应；继续加入谷氨酰胺转氨酶进行反应，即得。本发明采用低分子量丝胶蛋白和蔗渣木聚糖为原料，突破了现有低分子量丝胶蛋白无法形成水凝胶的限制，利用木聚糖与蛋白之间的反应以及蛋白分子内和分子间的共价交联，实现丝胶蛋白和蔗渣木聚糖复合水凝胶的制备；且制备过程绿色可控，获得的水凝胶具有特殊结构，能够用于细胞三维培养和增殖。

Description

丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶及其制备和应用
技术领域
本发明属于生物医用水凝胶材料领域，涉及一种丝胶蛋白和蔗渣木聚糖复合水凝胶及其制备和应用。
背景技术
水凝胶是一种能够在水中溶胀、保持大量水分而又不溶解于水的三维网状聚合物，其在性质上类似于细胞外基质，因此在组织工程和再生医学方面应用广泛。作为构成和维持生命体最基本的两种物质，糖和蛋白质在生物医用材料领域展示出极大的应用前景。将糖和蛋白质制备成水凝胶材料具有重要的产品价值。
中国发明专利CN201210137940.6公开了一种生物大分子水凝胶的制备方法，该水凝胶包括：蛋白或多肽或含有氨基酸残基的分子通过酶催化交联而成的蛋白或多肽生物大分子网络，多糖大分子通过二价离子交联而成的多糖生物大分子网络；上述两个网络之间相互贯穿，没有化学键结合，其中蛋白或多肽生物大分子含量为水凝胶干重总质量的1％～99％，多糖大分子构成的大分子网络含量为水凝胶干重总质量的1％～99％。同样，中国发明专利CN201410259494.5又公开了一种生物大分子互穿网络水凝胶及其制备方法，是两种酶催化交联形成的互穿网络水凝胶，一个是引入酚羟基的多糖大分子通过氧化酶和过氧化氢催化酚羟基氧化交联形成多糖大分子网络，另一个是蛋白质或含有氨基酸残基的多肽通过转移酶催化肽键交联形成蛋白质或多肽大分子网络。
中国发明专利CN202110004280.3公开了一种胶原蛋白肽复合水凝胶及其制备方法，所述组合物是由以下重量份配比的原料制备而成：丝素蛋白肽20份～30份、酪蛋白水解肽18份～25份、丝胶蛋白15份～20份、多糖原材料5份～9份、生物催化剂1份～3份、防过敏添加剂0.8份～1.5份和酸碱度中和剂0.3份～0.8份。采用丝素蛋白肽、酪蛋白水解肽和丝胶蛋白作为复合水凝胶基础原材料并在原材料内添加有多糖原材料和生物催化剂，可以通过多糖原材料提高水凝胶的美白、保湿、抗氧化的效果并通过生物催化剂将药物成分充分的提取出，然后在水凝胶内添加有防过敏添加剂，并以白芷粉末、薄荷粉末、金银花粉末和甘草粉末多种抗过敏成分作为组成部分，可以有效的降低复合水凝胶对皮肤的刺激。
以上专利公开了利用酶来制备水溶性多糖和蛋白质复合水凝胶的启示，现有技术中使用的多糖均为分子量比较高且水溶性好的多糖制备，例如壳聚糖等。同样的，现有丝胶蛋白水凝胶必须采用较高分子量的丝胶蛋白，若分子量低则无法形成水凝胶。
蔗渣木聚糖是从甘蔗制糖后产生的甘蔗废渣中提取的低聚木糖，是甘蔗加工副产物，产量大。但是蔗渣木聚糖相比与常规多糖存在分子量较低，且侧链较少导致分子水溶性较弱的问题，这使得蔗渣木聚糖无法在水中形成粘度，从而无法形成水凝胶。如何克服蔗渣木聚糖自身性质缺陷，发展新用途是蔗渣木聚糖面临的问题。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶及其制备和应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一个方面提供了一种丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将分子量为50kDa以下的丝胶蛋白均匀溶解在水中，获得丝胶蛋白水溶液，并在80～150℃下高温变性处理，得到变性丝胶蛋白水溶液；
(2)将化学修饰的蔗渣木聚糖溶解在去离子水中得到蔗渣木聚糖水溶液，然后将蔗渣木聚糖水溶液与步骤(1)得到的变性丝胶蛋白水溶液均匀混合，之后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应；
(3)在步骤(2)的反应中继续加入谷氨酰胺转氨酶进行反应，即得到丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶；
其中，步骤(2)中蔗渣木聚糖的用量低于步骤(1)中丝胶蛋白的用量，以蔗渣木聚糖和丝胶蛋白干重计算。
进一步地，步骤(1)中，所述丝胶蛋白分子量为1～30kDa；优选为1～20kDa。
进一步地，步骤(1)中，所述高温变性处理的温度为85℃～150℃；高温变性处理的时间为10～30min。
进一步地，步骤(1)中丝胶蛋白水溶液的质量浓度为40％～99％，优选为50％～90％。丝胶蛋白需保持一定的质量浓度，以提供交联位点。
进一步地，步骤(2)中化学修饰的蔗渣木聚糖为通过羧甲基化修饰或羟基修饰的蔗渣木聚糖。
进一步地，步骤(2)中蔗渣木聚糖水溶液的质量浓度为1％～60％，优选为10％～50％。
进一步地，步骤(2)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为5:1～1:1。
进一步地，步骤(2)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和步骤(1)中丝胶蛋白的质量比为1:1～1:5。
进一步地，步骤(2)中蔗渣木聚糖与步骤(1)中丝胶蛋白的质量比为0.1:1～0.9:1，优选为0.1:1～0.6:1。
进一步地，步骤(3)中加入的谷氨酰胺转氨酶与步骤(1)中丝胶蛋白的质量比为0.05:1～0.5:1。
进一步地，步骤(2)的反应时间为0.5～6h。
进一步地，步骤(3)的反应时间为2～6h。
进一步地，蔗渣木聚糖为经过化学修饰的蔗渣木聚糖，且取代度大于0.2，所述化学修饰为羧甲基化修饰或羟基修饰。
蔗渣木聚糖属于低聚木糖，其水溶性较差，且活性基团较少，本发明对其进行羧甲基化修饰和羟基修饰，为保证其水溶性，取代度需大于0.2。
进一步地，还可以在步骤(1)时添加其他蛋白，包括胶原、明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、大豆蛋白中的一种以上，其他蛋白质量为丝胶蛋白质量的1％～10％。
进一步地，所述蔗渣木聚糖的分子量为1000～30000g/mol，优选为2000～15000g/mol。
本发明另一个方面提供了一种丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶，其通过上述制备方法获得。
本发明再一个方面提供了上述丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶在细胞培养和增殖中的应用。以丝胶蛋白和蔗渣木聚糖制备的水凝胶在成分和结构上具有仿生细胞外基质的特性，能为细胞提供物理支持与适宜微环境，从而诱导细胞黏附、存活、迁移、分化及细胞向特定的形态和功能发育。
本发明的原理如下：
本发明采用低分子量丝胶蛋白和蔗渣木聚糖为原料，突破了现有低分子量丝胶蛋白无法形成水凝胶的限制，通过利用木聚糖与蛋白之间的反应，以及蛋白分子内和分子间的共价交联的创造性设计，实现丝胶蛋白和蔗渣木聚糖复合水凝胶的制备。
本发明将丝胶蛋白溶解在去离子水中，利用高温使蛋白变性得到暴露氨基等活性位点的丝胶蛋白水溶液，同时利用化学修饰的蔗渣木聚糖含有的羧甲基或羟基，在EDC和NHS的作用下形成反应，构成丝胶蛋白与蔗渣木聚糖的大分子网络。由于控制丝胶蛋白和蔗渣木聚糖的比例，蛋白分子内和分子间在谷氨酰胺转移酶的作用下进一步形成共价交联网络，从而制备出双重交联的复合水凝胶。
有益效果：
(1)本发明克服了技术偏见，采用低分子量丝胶蛋白和蔗渣木聚糖为原料，突破了现有低分子量丝胶蛋白无法形成水凝胶，以及蔗渣木聚糖水溶性差，分子量低的问题，利用木聚糖与蛋白之间的反应，以及蛋白分子内和分子间的共价交联的创造性设计，实现丝胶蛋白和蔗渣木聚糖双重交联，进而获得了复合水凝胶。
(2)本发明仅利用谷氨酰胺转氨酶和EDC、NHS就实现复合水凝胶的制备，制备过程绿色可控，并可添加一定比例的其他蛋白，为纯天然高分子生物医用水凝胶的制备提供思路。
(3)本发明通过EDC、NHS实现了低分子量丝胶蛋白和蔗渣木聚糖的交联，在此基础上，又加入谷氨酰胺转氨酶在低分子量丝胶蛋白的分子内和分子间形成交联，进一步强化了水凝胶的结构。本发明采用了两步交联的方法，其顺序不能改变，否则无法形成水凝胶。
(4)本发明通过对丝胶蛋白的加热变性处理，使其暴露活性位点，有利于形成交联网络，采用物理方法进行处理，处理工艺简单。同时通过控制丝胶蛋白和蔗渣木聚糖的用量，以及谷氨酰胺转氨酶的用量，实现了水凝胶的制备。
附图说明
图1为实施例1所制备的水凝胶的电子显微镜照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
(1)将分子量为12kDa的丝胶蛋白1g均匀溶解在2g去离子水中，并在100℃下高温变性处理30min，得到质量浓度为50％的变性处理丝胶蛋白水溶液；
(2)将经过羧甲基化修饰且取代度为0.25的蔗渣木聚糖(分子量为5000g/mol)0.2g溶解在1g去离子水中得到质量浓度为20％的蔗渣木聚糖水溶液；将步骤(1)得到的变形处丝胶蛋白水溶液与上述蔗渣木聚糖水溶液均匀混合，之后加入1g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1g N-羟基琥珀酰亚胺进行反应30min；
(3)加入0.05g活力值大于100U/g的谷氨酰胺转氨酶，反应2h，即得到丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶。图1是制备得到水凝胶的扫描电子显微镜照片，从图中看出，水凝胶中既有大孔又有小孔，表明是两种交联形式下形成的。这种复杂结构有利于细胞的三维培养，可为细胞提供最接近生物体的环境，有利于细胞的粘附、生长与分化。
实施例2
一种丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
(1)将分子量为5kDa的丝胶蛋白1.3g均匀溶解在2g去离子水中，并在85℃下高温变性处理20min，得到质量浓度为65％的丝胶蛋白水溶液；
(2)将经过羟基修饰且取代度为0.3的蔗渣木聚糖(分子量为15000g/mol)0.15g溶解在1g去离子水中得到质量浓度为15％的蔗渣木聚糖水溶液；将步骤(1)得到的丝胶蛋白水溶液与上述得到的蔗渣木聚糖水溶液均匀混合，之后加入1g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.5g N-羟基琥珀酰亚胺进行反应2h；
(3)加入0.4g活力值大于100U/g的谷氨酰胺转氨酶，反应3h，即得到丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶。
实施例3
一种丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
(1)将分子量为1kDa的丝胶蛋白1.8g均匀溶解在2g去离子水中，并在90℃下高温变性处理25min，得到质量浓度为90％的丝胶蛋白水溶液；
(2)将经过羧甲基化修饰且取代度为0.4的蔗渣木聚糖(分子量为2000g/mol)1g溶解在2g去离子水中得到质量浓度为50％的蔗渣木聚糖水溶液；将步骤(1)得到的丝胶蛋白水溶液与上述得到的蔗渣木聚糖水溶液均匀混合，之后加入0.36g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.07g N-羟基琥珀酰亚胺反应6h；
(3)加入0.36g活力值大于100U/g的谷氨酰胺转氨酶，反应6h，即得到丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶。
实施例4
一种丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
(1)将分子量为20kDa的丝胶蛋白1.2g均匀溶解在2g去离子水中，并在100℃下高温变性处理15min，得到质量浓度为60％的丝胶蛋白水溶液；
(2)将经过羟基修饰且取代度为0.3的蔗渣木聚糖(分子量为10000g/mol)0.2g溶解在2g去离子水中得到质量浓度为10％的蔗渣木聚糖水溶液；将步骤(1)得到的丝胶蛋白水溶液与上述得到的蔗渣木聚糖水溶液均匀混合，之后加入0.6g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.2g N-羟基琥珀酰亚胺反应2h；
(3)加入0.6g活力值大于100U/g的谷氨酰胺转氨酶，反应2h，即得到丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶。
对比例1
采用与实施例3相同的方法，区别仅在于将其中的蔗渣木聚糖用量由1g提高到1.8g。观察反应得到的产品发现无法形成水凝胶。
本发明人在研发仿生细胞外基质材料过程中首先考虑到将丝胶蛋白与蔗渣木聚糖结合来制备水凝胶，但由于选用的丝胶蛋白与蔗渣木聚糖的分子量均较低，这为形成水凝胶带来了难度，越低的分子量越难以形成水凝胶。实验过程中，创造性的提出让两种材料双重交联来构建水凝胶，同时发现提高丝胶蛋白的比例能够有效促进水凝胶的形成，即发现丝胶蛋白的含量高于蔗渣木聚糖即可实现水凝胶的制备，而当丝胶蛋白与蔗渣木聚糖用量相同(以干重质量计)，则不能形成水凝胶。现有技术中，由于分子量以及蛋白和糖的类型与本发明不同，并未教导该比例对于水凝胶形成的具有重要影响。

Claims (10)

1.一种丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将分子量为50kDa以下的丝胶蛋白溶解在水中，获得丝胶蛋白水溶液，并在80～150℃下高温变性处理，得到变性丝胶蛋白水溶液；
(2)将蔗渣木聚糖溶解在去离子水中得到蔗渣木聚糖水溶液，然后将蔗渣木聚糖水溶液与步骤(1)得到的变性丝胶蛋白水溶液均匀混合，之后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺反应；
(3)在步骤(2)的反应中继续加入谷氨酰胺转氨酶进行反应，即得到丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶；
其中，步骤(2)中蔗渣木聚糖的用量低于步骤(1)中丝胶蛋白的用量，以蔗渣木聚糖和丝胶蛋白干重计算；
所述蔗渣木聚糖的分子量为1000～30000g/mol；
所述蔗渣木聚糖为经过化学修饰的蔗渣木聚糖，且取代度大于0.2，所述化学修饰为羧甲基化修饰或羟基修饰；
步骤(3)中加入的谷氨酰胺转氨酶与步骤(1)中丝胶蛋白的质量比为0.05:1～0.5:1。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述丝胶蛋白分子量为1～30kDa；所述高温变性处理的温度为85℃～150℃；高温变性处理的时间为10～30min。
3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中丝胶蛋白水溶液的质量浓度为40％～99％。
4.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中蔗渣木聚糖水溶液的质量浓度为1％～60％。
5.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为5:1～1:1。
6.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和步骤(1)中丝胶蛋白的质量比为1:1～1:5。
7.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中蔗渣木聚糖与步骤(1)中丝胶蛋白的质量比为0.1:1～0.9:1。
8.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中还包含添加其他蛋白的步骤，其他蛋白选自胶原、明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、大豆蛋白中的一种以上，其他蛋白质量为丝胶蛋白质量的1％～10％。
9.一种丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶，其特征在于，其通过权利要求1-8任一项所述的制备方法获得。
10.权利要求9所述的丝胶蛋白和蔗渣木聚糖仿生复合水凝胶在制备细胞培养和增殖介质中的应用。
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CN107615062A (zh) * 2015-02-09 2018-01-19 弹弓生物科学公司 具有可调光学性质的水凝胶颗粒以及使用其的方法

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