WO2022252974A1 - 一种羧基化丝蛋白的方法及由其制备的羧基化丝蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种羧基化丝蛋白的方法及由其制备的羧基化丝蛋白及其应用。本发明提供羧基化丝蛋白的方法，包括在锂盐的存在下使丝蛋白与二羧酸酐反应的步骤。相比现有技术的丝蛋白的羧基化方法，本发明的方法具有制备条件温和，制备步骤简便的优点，同时，相对于未羧基化的丝蛋白，本发明制备得到的羧基化丝蛋白的分子量未出现下降，且表现出提高的亲水性。
Description
本申请要求于2021年6月4日向中国专利局提交的申请号为202110625401.6的中国发明专利申请的优先权权益，该申请的全部内容通过引用并入本文，如同记载在本文中一样。
本发明涉及蛋白基天然高分子材料改性技术领域，特别涉及一种羧基化丝蛋白的方法及由其制备的羧基化丝蛋白及其应用。
蛋白基天然高分子材料，如胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白等，由于具有良好的生物相容性与生物可降解性，被广泛应用于植入介入材料、组织修复、组织工程、药物缓释等多个生物医学与生物工程领域。但是，相比于合成高分子材料，已发展的针对蛋白基天然高分子材料的化学修饰方法十分有限，并且难以制备得到具有高修饰和可控修饰度的蛋白基材料。高效化学修饰方法的匮乏极大地制约着蛋白基天然高分子材料的实际应用和未来发展。
丝蛋白，主要来源于蚕丝，是构成蚕丝的结构蛋白。由于其优异的力学性能、生物相容性和生物可降解性，近年来，受到研究者的广泛关注，特别是在生物医学领域。例如，丝蛋白薄膜可以作为制备生物传感器的基底；丝蛋白海绵可以作为组织工程支架；丝蛋白纳米小球可以作为药物传输和释放的载体；丝蛋白块材可以被加工成可植入的骨钉等。丝蛋白可以通过溶解再生的方法从天然蚕茧中提取得到，这一制备途径绿色环保，具有很好的实际应用价值。
天然家蚕丝中丝蛋白主要由重链和轻链构成，其分子量分别为390kDa和26kDa。重链和轻链间通过二硫键相连。丝蛋白中主要的氨基酸及其占比为：甘氨酸(42.9％)、丙氨酸(30％)、丝氨酸(12.2％)、酪氨酸(4.8％)、缬氨酸(2.5％)、天门冬氨酸和天门冬酰胺(2％)等。重链主要由12个结构域组成，这些结构域中包含有高度重复的氨基酸序列，形成半晶态结构。分子层面上是由β-折叠结构所形成的纳米微晶(以下简称β-折叠纳米微晶)嵌入到结晶度较小的无定形连续相中组成。天然丝蛋白经过脱胶、溶解、纯化后，会在溶液中形成高度无序的结构。通过冷冻干燥，水溶液中具有 高度无序结构的丝蛋白可以被制备成具有无定形态的丝蛋白粉末。该丝蛋白粉末可以被用作一些护肤品或化妆品的添加剂。
天然丝蛋白作为一种结构蛋白，其主要特点在于力学性能优异，生物相容性好和生物可降解性好，但是其生物功能有限，特别是不具备生物相应性。所以如何构建具有特定生物功能和生物响应性的丝蛋白是目前的迫切需求，也是促进丝蛋白在更多领域，特别是生物医学领域应用的关键一环。
化学修饰丝蛋白主要是通过对丝蛋白分子链侧链官能团(如羟基、氨基等)进行化学反应，其中丝蛋白的羧基化是一个研究重点。
羧基化丝蛋白具有很好的应用前景，通过特定的化学反应将丝蛋白分子链侧链的羟基转变为羧基，进而利用点击化学方法在羧基的位点接入活性分子片段或药物，以实现丝蛋白的生物功能化。
已有研究者尝试通过氯乙酸的取代反应或次氯酸钠的氧化反应将侧链的羟基转变为羧基(Kaplan D.L.et al.Biomacromolecules 2016,17,237；Kaplan D.L.et al.Biomacromolecules 2020,21,2829；Fan Y.et al.ACS Appl.Mater.Interfaces 2016,8,14406.)，但反应条件较为苛刻，且会对丝蛋白的其他化学结构产生影响，造成丝蛋白分子量的下降。除此之外，也有研究者利用离子液体的体系对丝蛋白进行羧基化修饰(Burke K.A.et al.Bioconjugate Chem.2020,31,1307-1312.)，但离子液体的成本较高，方法不具有经济性。因此，仍存在开发经济性，低成本的丝蛋白羧基化改性的有效方法的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种羧基化丝蛋白的方法。
本发明的另一目的是提供一种由所述方法制备的羧基化丝蛋白。
本发明的再一目的是提供所述羧基化丝蛋白在医学工程材料中的应用。
一方面，本发明提供一种羧基化丝蛋白的方法，所述方法包括在锂盐的存在下使丝蛋白与二羧酸酐反应的步骤。
更特别地，所述方法包括以下步骤：
(1)将丝蛋白在锂盐存在下与二羧酸酐反应；
(2)将步骤(1)中反应后的产物透析，得到羧基化丝蛋白水溶液，并将该溶液干燥(例如冷冻干燥)，得到羧基化丝蛋白。
本发明中，所述丝蛋白指的是基于丝蛋白的材料，如天然丝蛋白、重 组丝蛋白、具有不同分子量的再生丝蛋白等。
在一些实施方式中，通过以下步骤制备所述丝蛋白：
1’：将蚕茧加入到碳酸钠的水溶液中，加热至溶液沸腾并保持30-120分钟，脱丝胶后的蚕丝在水中漂洗多次，然后在室温下干燥；
2’：将脱丝胶后的蚕丝加入到溴化锂的水溶液中，加热，待蚕丝溶解后将溶液进行透析，得到丝蛋白溶液。
上述步骤2’制备的的丝蛋白溶液可以直接用于本发明的羧基化过程中，或者进行干燥(例如冷冻干燥)得到固体丝蛋白后再用于羧基化过程。
在一些实施方式中，丝蛋白与二羧酸酐在溶剂中反应，所述溶剂可以为非质子极性溶剂，如二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或甲基吡咯烷酮等。在反应液中，锂离子的浓度可以为0.5-1.5mol/L，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5mol/L等，丝蛋白的浓度可以为1-20g/L，例如2、3、5、7.5、10、15、20g/L等。
在一些实施方式中，所述二羧酸酐可以选自丁二酸酐、戊二酸酐、邻苯二甲酸酐等。
在一些实施方式中，所述锂盐为氯化锂或溴化锂，特别是氯化锂。在采用氯化锂的情况下，能够在溶液中更好地溶解丝蛋白粉。
在一些实施方式中，丝蛋白与二羧酸酐的质量比可以为1:0.1到1:10，优选为1:1到1:10，更优选1:2到1:10，特别是1:5到1:10，例如1:5、1:6、1:7、1:7.5、1:8、1:9、1:10等。通过调整丝蛋白粉末与二羧酸酐的质量比可以控制羧基化丝蛋白的丝氨酸/酪氨酸的羧基化修饰度。
在一些实施方式中，丝蛋白与二羧酸酐的反应的温度可以为20-60℃，优选为40-50℃。例如，可以为25℃、35℃、40℃、45℃、50℃。
在一些实施方式中，丝蛋白与二羧酸酐反应的时间可以为5分钟到72小时，优选为0.5-6小时，例如，可以为0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时。
再一方面，本发明提供一种通过上述方法制备的羧基化丝蛋白。
特别地，在所述羧基化丝蛋白中，丝蛋白的丝氨酸和/或酪氨酸的羟基与二羧酸酐反应生成如下式I的结构
其中，在式I中，R’为C2-C6亚烃基，其由上述制备方法中所使用二羧酸酐的结构决定。
在一些实施方式中，在式I中，R’独立地为亚乙基、亚丙基或1,2-亚苯基。
在一些实施方式中，在所述羧基化丝蛋白中，丝氨酸的修饰率介于20-90％，酪氨酸的修饰率介于10-35％。
再一方面，本发明提供一种上述羧基化丝蛋白在制备医学生物工程材料中的用途。
又一方面，本发明提供一种生物制品，其由前述羧基化丝蛋白制备，具体地，所述制品的形式为多孔支架、薄膜或水凝胶。
在一些实施方式中，通过以下步骤制备所述多孔支架：
1’：将如上所述的羧基化丝蛋白溶解在水中，得到羧基化丝蛋白溶液；
2’：将羧基化丝蛋白溶液加入到模具中，通过冷冻干燥的方法得到羧基化丝蛋白多孔支架。
在一些实施方式中，通过以下步骤制备所述薄膜：
1’：将如上所述的羧基化丝蛋白溶解在水中，得到羧基化丝蛋白溶液；
2’：将羧基化丝蛋白溶液涂覆在模具中，通过自然风干的方法得到羧基化丝蛋白薄膜。
在一些实施方式中，通过以下步骤制备所述水凝胶：
1’：将如上所述的羧基化丝蛋白溶解在水中，得到羧基化丝蛋白溶液；
2’：将羧基化丝蛋白溶液加入到模具中，加入过氧化物酶与过氧化氢。羧基化丝蛋白中酪氨酸残基在过氧化物酶与过氧化氢底物的作用下发生氧化交联，得到羧基化丝蛋白水凝胶。
在一些实施方式中，在制备前述各生物制品的上述步骤1’中，羧基化丝蛋白溶液的浓度可以为5-100g/L，例如5、10、20、30、40、60、80、100g/L。
除非另有说明，在本发明中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后的实施例之外，本申请文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没 有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于15％，小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％，小于或等于0.5％，小于或等于0.1％的变化，并且在某些方面，小于或等于0.01％的变化。
(1)本发明所述的方法需要的丝蛋白直接从蚕茧中提取得到，来源广泛且便宜易得；二羧酸酐，如丁二酸酐、戊二酸酐、邻苯二甲酸酐等，为常见的工业原料，价格低廉。所述方法的制备步骤条件温和，操作简单，十分适合批量化生产。
(2)本发明所述的方法得到的羧基化丝蛋白的羧基化程度能够通过反应物浓度、反应物投料比、反应温度以及反应时间等反应条件进行精确调节。
(3)本发明所述的方法得到的羧基化丝蛋白较未修饰的丝蛋白有更优的亲水性。分子中的羧基官能团可以进行化学反应被修饰为其他功能性官能团。
(4)本发明所述的方法可应用于多种丝蛋白，如天然丝蛋白、重组丝蛋白、具有不同分子量的再生丝蛋白等。
(5)本发明所述的羧基化丝蛋白基材料具有较低细胞毒性与良好的生物相容性，在医学生物工程材料中有广泛的用途。
图1示出本发明实施例1中制备得到的羧基化丝蛋白的粉末照片。
图2是本发明实施例1中制备得到的羧基化丝蛋白在氘代二甲基亚砜中的氢谱核磁图。
图3是本发明实施例中所使用的丝蛋白原料在氘代二甲基亚砜中的氢谱核磁图。
图4是本发明实施例1中制备得到的羧基化丝蛋白的红外吸收光谱图。
图5是本发明实施例2中制备得到的羧基化丝蛋白在氘代二甲基亚砜中的氢谱核磁图。
图6是本发明实施例2中制备得到的羧基化丝蛋白的红外吸收光谱图。
图7示出丝蛋白原料与本发明实施例1中制备得到的羧基化丝蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
图8示出丝蛋白原料与本发明实施例1中制备得到的羧基化丝蛋白的接触角测试结果。
图9示出本发明实施例12中制备得到的羧基化丝蛋白薄膜的照片。
图10示出本发明实施例13中植入羧基化丝蛋白薄膜至小鼠背部30天后，组织切片Masson三色染色图。
图11示出本发明实施例14中NIH-3T3细胞在薄膜上孵育24小时后细胞形态图。
图12示出本发明实施例15中制备得到的羧基化丝蛋白多孔支架的照片。
图13示出本发明实施例16中制备得到的羧基化丝蛋白水凝胶的照片。
本发明所述的制备方法通过下面实施例作进一步详细的说明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。
材料：制备例中所使用的蚕茧从杭州本地的生产商采购得到。实施例中所使用的氯化锂、二甲基亚砜、丁二酸酐从百灵威科技有限公司购买并直接使用。BALB/c小鼠由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供，NIH-3T3细胞由北纳生物科技有限公司提供。
核磁氢谱测试在Bruker AVANCE NEO 600MHz核磁谱测试仪中进行。溶剂为氯化锂浓度为1mol/L的氘代二甲基亚砜。
红外光谱测试在Thermo Nicolet iS50红外光谱仪中进行。扫描次数为64次，分辨率为4cm
-1。
接触角测试在dataphysics光学接触角测量仪OCA25上进行，液滴体积为5μL。
制备例
如下制备蚕丝蛋白。
1’：将蚕茧加入到碳酸钠浓度为20mmol/L的水溶液中，加热至溶液沸腾并保持30-120分钟。脱丝胶后的蚕丝在水中漂洗多次，然后在室温下干燥。
2’：将脱丝胶后的蚕丝加入到溴化锂浓度为9.3mol/L的水溶液中，加热到60℃并保持4小时。待蚕丝溶解后将溶液进行透析，得到丝蛋白溶液。
3’：将丝蛋白溶液进行冷冻干燥，然后研磨得到丝蛋白，其将用于后续的羧基化过程。
实施例1
(1)将1g上面制备例制备的丝蛋白溶解于氯化锂浓度为1mol/L的二甲基亚砜溶液(50mL)中，并加入10g的丁二酸酐，加热至50℃反应6小时。
(2)将反应后的溶液进行透析，得到羧基化丝蛋白水溶液。将该溶液进行冷冻干燥，得到羧基化丝蛋白干粉。
制备得到的羧基化丝蛋白通过称重法得到收率为86％，其在氘代二甲基亚砜中的氢谱核磁图如图2所示。
氢谱核磁图中化学位移为5.5和9.7ppm的峰分别对应丝氨酸和酪氨酸上羟基的氢原子的核磁信号，与丝蛋白原料的氢谱核磁图(图3)对比可知，这两个峰的强度明显降低，说明羟基发生酯化反应。通过峰面积的对比，可以计算得到产物丝蛋白分子中羧基化的丝氨酸占反应前丝蛋白分子中丝氨酸的83.7％，羧基化的酪氨酸占反应前丝蛋白分子中酪氨酸的28.5％。
得到的羧基化丝蛋白的红外吸收光谱图如图4所示。
实施例2
除了使用1g丁二酸酐以外，以与实施例1相同的方法制备。
制备得到的羧基化丝蛋白在氘代二甲基亚砜中的氢谱核磁图如图5所示，红外吸收光谱图如图6所示。
实施例3
除了反应温度设置为25℃以外，以与实施例1相同的方法制备。
实施例4
除了反应温度设置为40℃以外，以与实施例1相同的方法制备。
实施例5
除了将1g制备例制备的丝蛋白溶解于氯化锂浓度为1mol/L的二甲基亚砜溶液(100mL)中以外，以与实施例1相同的方法制备。
实施例6
除了反应时间为0.5小时以外，以与实施例1相同的方法制备。
实施例7
除了反应时间为2小时以外，以与实施例1相同的方法制备。
实施例8
除了反应时间为24小时以外，以与实施例1相同的方法制备。
实施例9
除了使用2.5g丁二酸酐以外，以与实施例1相同的方法制备。
实施例10
除了使用5g丁二酸酐以外，以与实施例1相同的方法制备。
实施例11
除了使用浓度为1mol/L的氯化锂的二甲基甲酰胺溶液(50mL)以外，以与实施例1相同的方法制备。
实施例12
将40mg实施例1中的羧基化丝蛋白粉溶解在1mL的纯水中，得到浓度为40mg/mL的羧基化丝蛋白溶液。将溶液涂覆在模具中，室温下自然干燥得到厚度约为80μm的羧基化丝蛋白薄膜(其照片参见图9)。所述薄膜可用于组织修复、二维细胞培养等生物医学应用。
实施例13
将5mg实施例12中的羧基化丝蛋白薄膜用甲醇浸泡3小时后，经磷酸盐缓冲液多次漂洗，去除多余甲醇。经紫外线照射灭菌后，植入到BALB/c小鼠背部皮下。在植入30天后取出，通过组织切片分析羧基化丝蛋白材料的生物相容性(其照片参见图10)。测量其纤维化组织层厚度约为50μm，羧基化丝蛋白薄膜未促进小鼠产生明显的纤维化组织，说明其具有良好的生物相容性。
实施例14
将2mg实施例1中的羧基化丝蛋白粉溶解在0.1mL的纯水中，得到浓度为20mg/mL的羧基化丝蛋白溶液。将溶液涂覆在48孔细胞培养板的孔中，室温下自然干燥得到厚度约为10μm的羧基化丝蛋白薄膜。羧基化丝蛋白薄膜用甲醇浸泡3小时后，经磷酸盐缓冲液多次冲洗，去除多余甲醇。经紫外线照射灭菌后，加入20μL NIH-3T3细胞悬液(1*10
6cells/mL)与200μL DMEM培养基，在37℃下孵育24小时。经显微镜观察细胞生长情况，分析羧基化丝蛋白材料的细胞相容性(其照片参见图11)。如图11所示，NIH-3T3细胞能够在薄膜上粘附并正常生长，说明其具有良好的细胞相容性。
实施例15
将40mg实施例1中的羧基化丝蛋白粉溶解在1mL的纯水中，得到浓度为40mg/mL的羧基化丝蛋白溶液。将溶液加到模具中，然后经冷冻干燥得到羧基化丝蛋白多孔支架(其照片参见图12)。所述多孔支架可用于组织修复、三维细胞培养等生物医学应用。
实施例16
将20mg实施例1中的羧基化丝蛋白粉溶解在1mL的纯水中，得到浓度为20mg/mL的羧基化丝蛋白溶液。在溶液中加入10μL 1％过氧化氢溶液和10μL过氧化物酶溶液(1000U/mL)，在37℃下进行孵育，即得到羧基化丝蛋白水凝胶(其照片参见图13)。所述水凝胶可用于组织修复、药物递送等生物医学应用。
在以下表1中示出实施例1-11的制备条件及制备产物的丝氨酸/酪氨酸的修饰率。
表1
如以上表1所示，通过延长反应时间、提高反应温度或者提高二羧酸酐与丝蛋白粉末的质量比，均可以提高丝氨酸及酪氨酸的修饰率。
如图7所示，制备得到的羧基化丝蛋白分子量与丝蛋白原料分子量基本保持一致，证实本羧基化反应不会造成蛋白分子量下降。
如图8所示，制备得到的羧基化丝蛋白薄膜较未修饰的丝蛋白薄膜有更小的接触角(羧基化丝蛋白薄膜：45°，未修饰的丝蛋白薄膜：59°)，说明羧基化丝蛋白有更优的亲水性。该改善的亲水性将有助于将本申请的羧基化丝蛋白开发成具有特定蛋白吸附与细胞吸附性能的生物材料，在组织修复与细胞培养上具有应用价值。
对比例1
在文献Biomacromolecules 2016,17,237和Biomacromolecules 2020,21,2829中，在浓度为45mg/ml的丝蛋白溶液中加入10mol/L的氢氧化钠溶液，并稀释至氢氧化钠终浓度为3mol/L。然后，加入氯乙酸(浓度为1mol/L)，在室温下反应1小时。在反应后加入磷酸二氢钠溶液终止反应，并用10 mol/L的盐酸将溶液中和至pH为7.4，中和溶液过程中用冰浴进行降温。最后，将反应后的溶液进行透析，得到羧基化丝蛋白水溶液。
根据文献实验结果，该羧基化反应将丝蛋白分子的峰值分子量从原来的131.3kDa降低至36.4kDa。并且，该羧基化反应的丝氨酸修饰率仅为19.9％。
对比例2
在文献ACS Appl.Mater.Interfaces 2016,8,14406中，在丝蛋白溶液中加入一定量次氯酸钠溶液(0-5mmol次氯酸钠每克丝蛋白)，加入氢氧化钠溶液调节溶液pH为10并在反应中不断补充氢氧化钠溶液维持pH。反应在室温下进行，反应结束后，加入盐酸调节pH至7，最后通过透析得到羧基化丝蛋白水溶液。
根据文献实验结果，在最优的条件下，丝氨酸修饰率约为47％。文献未表征产物分子量变化，但在高次氯酸钠投料比例下，产物产率明显降低，推断次氯酸钠氧化反应会造成丝蛋白分子量下降。
Claims (18)
- 一种羧基化丝蛋白的方法，所述方法包括在锂盐的存在下使丝蛋白与二羧酸酐反应的步骤。
- 根据权利要求1所述的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将丝蛋白在锂盐存在下与二羧酸酐反应；(2)将步骤(1)中反应后的产物透析，得到羧基化丝蛋白水溶液，并将该溶液干燥，得到羧基化丝蛋白。
- 根据权利要求1所述的方法，其中，所述二羧酸酐选自丁二酸酐、戊二酸酐和邻苯二甲酸酐。
- 根据权利要求1所述的方法，其中，通过以下步骤制备所述丝蛋白：1’：将蚕茧加入到碳酸钠的水溶液中，加热至溶液沸腾并保持30-120分钟，脱丝胶后的蚕丝在水中漂洗多次，然后在室温下干燥；2’：将脱丝胶后的蚕丝加入到溴化锂的水溶液中，加热，待蚕丝溶解后将溶液进行透析，得到丝蛋白溶液。
- 根据权利要求1所述的方法，其中，所述丝蛋白与所述二羧酸酐在溶剂中反应，和/或锂离子的浓度为0.5-1.5mol/L，和/或丝蛋白的浓度为1-20g/L，和/或所述丝蛋白与所述二羧酸酐的质量比为1:0.1到1:10。
- 根据权利要求5所述的方法，其中，所述溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或甲基吡咯烷酮，和/或所述丝蛋白与所述二羧酸酐的质量比为1:1到1:10。
- 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述锂盐为氯化锂或溴化锂，优选为氯化锂。
- 根据权利要求1或2所述的方法，其中，丝蛋白与二羧酸酐的反应温度为20-60℃；和/或丝蛋白与二羧酸酐的反应时间为5分钟到72小时。
- 根据权利要求1或2所述的方法，其中，丝蛋白与二羧酸酐的反应温度为40-50℃；和/或丝蛋白与二羧酸酐的反应时间为0.5-6小时。
- 一种羧基化丝蛋白，其通过权利要求1-9中任一项所述的方法制备，其中，在所述羧基化丝蛋白中，丝蛋白的丝氨酸和/或酪氨酸的羟基与二羧酸酐反应生成如下式I的结构：
其中，在式I中，R’为C2-C6亚烃基，其由羧基化过程中所使用的二羧酸酐的结构决定。 - 根据权利要求10所述的羧基化丝蛋白，其中，在式I中，R’独立地为亚乙基、亚丙基或1,2-亚苯基，和/或在所述羧基化丝蛋白中，丝氨酸的修饰率介于20-90％，酪氨酸的修饰率介于10-35％。
- 如权利要求10或11所述的羧基化丝蛋白在制备医学生物工程材料中的用途。
- 一种生物制品，其由权利要求10或11所述的羧基化丝蛋白制备。
- 根据权利要求13所述的生物制品，其中，所述制品为多孔支架、薄膜或水凝胶。
- 根据权利要求14所述的生物制品，其中，所述多孔支架由所述羧基化丝蛋白通过溶液冻干法制备。
- 根据权利要求14所述的生物制品，其中，所述薄膜由所述羧基化丝蛋白通过涂覆法制备。
- 根据权利要求14所述的生物制品，其中，所述水凝胶由所述羧基化丝蛋白通过酶交联法制备。
- 根据权利要求17所述的生物制品，其中，所述水凝胶通过如下所述方法制备得到：将所述羧基化丝蛋白溶液加入到模具中，加入过氧化物酶与过氧化氢，通过酶交联法制备得到。
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