CN116041728A - 一种邻苯二酚修饰的丝蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种邻苯二酚修饰的丝蛋白及其制备方法和用途。所述邻苯二酚修饰的丝蛋白通过以下步骤制备:(1)使丝蛋白与二羧酸酐反应制得羧基化的丝蛋白;以及(2)在酰胺缩合剂的存在下,将羧基化丝蛋白与含有邻苯二酚基团和氨基(‑NH2)的物质进行酰胺化反应得到邻苯二酚修饰的丝蛋白。本发明的方法具有以下优点:原料毒性较低,制备步骤条件温和,操作简单,适合批量化生产,且制备的产物邻苯二酚基修饰率高。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白基天然高分子材料改性技术领域,特别涉及一种邻苯二酚修饰的丝蛋白及其制备方法和用途。
背景技术
来源于天然蚕丝的丝蛋白(又名丝素蛋白、丝心蛋白)因其原料可再生,出色的机械性能,以及优异的生物相容性等优点引起了生物医学领域研究者的广泛关注。通过将提取再生的丝蛋白进行进一步加工后可以制备成多种不同形式的功能材料,包括薄膜、海绵、水凝胶等。这些材料可以被用于生物传感、药物递送、组织工程等领域。
尽管天然丝蛋白具有优异的机械性能和生物相容性,但是其生物功能和一些理化性能(如粘附性)非常有限,这大大限制了丝蛋白材料的广泛应用。
如何通过化学修饰手段构建具有特定功能的丝蛋白基材料是当前的一个研究热点。其中,多巴胺修饰的蛋白质基材料与贻贝蛋白中有相似的邻苯二酚基功能单元,表现出优异的粘附性(Biu Xue et al.,Nature Communication,2021,12,7156)。基于此,邻苯二酚修饰的丝蛋白将来可以被用作生物粘合剂,以促进伤口闭合和组织再生。
然而,至今仍没有有效的化学修饰方法提升邻苯二酚基在丝蛋白上的修饰度,目前丝蛋白上邻苯二酚基修饰率仅为4%-7%(Kelly A.Burke et al.,Biomacromolecules2016,17,1,237-245)。因此,探索新的化学修饰方法以制备具有高修饰度的邻苯二酚丝蛋白具有重要的科学意义和应用前景。
发明内容
技术目的
本发明的目的之一是提供一种制备邻苯二酚修饰的丝蛋白的方法。
本发明的另一目的是提供一种由所述方法制备的邻苯二酚修饰的丝蛋白。
技术方案
一方面,本发明提供一种制备邻苯二酚修饰的丝蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)使丝蛋白与二羧酸酐反应制得羧基化丝蛋白;以及
(2)在酰胺缩合剂的存在下,将所述羧基化丝蛋白与含有邻苯二酚基团和氨基(-NH2)的物质进行酰胺化反应得到邻苯二酚修饰的丝蛋白。
所述酰胺缩合剂可以是能够活化羧基以便与氨基(-NH2)进行酰胺化反应的催化剂。例如,所述酰胺缩合剂是可以是N-羟基琥珀酰亚胺、碳二亚胺、六氟磷酸脲盐、六氟磷酸鏻盐、氯代甲酸酯、四已基焦亚磷酸及二环己基碳二亚胺中的一种或多种。
所述含有邻苯二酚基团和氨基(-NH2)的物质是分子结构中同时含有邻苯二酚结构单元和氨基(-NH2)单元的化合物,例如多巴胺。
在一些实施方式中,所述步骤(2)如下进行:
(2-1)将羧基化丝蛋白与N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺混合后反应得到活化的羧基化丝蛋白;
(2-2)将步骤(2-1)中得到的活化的羧基化丝蛋白和含有邻苯二酚基团和氨基(-NH2)的物质反应得到邻苯二酚修饰的丝蛋白。
在一些实施方式中,根据本发明的方法进一步包括将得到的邻苯二酚修饰的丝蛋白进行纯化的步骤。
在一些实施方式中,所述纯化如下进行:
(3)将步骤(2)中得到的反应产物透析,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白的水溶液,并将该溶液干燥(例如冷冻干燥),得到纯化的邻苯二酚修饰的丝蛋白。
本发明中,所述丝蛋白指的是基于丝素蛋白的材料,包括天然丝蛋白、重组丝蛋白、具有不同分子量的再生丝蛋白。
以下,将详细描述上述步骤(1)-(3)。
步骤(1)
在一些实施方式中,步骤(1)包括:
丝蛋白在氯化锂的存在下与二羧酸酐反应得到羧基化的丝蛋白。
在一些实施方式中,步骤(1)还可以包括纯化和干燥步骤。例如可以将步骤(1)反应得到的反应产物进行透析(例如在纯水中透析)以及冻干干燥得到粉末状的羧基化丝蛋白。
在一些实施方式中,在步骤(1)使用的丝蛋白通过以下步骤制备得到:
1’:将蚕茧加入到碳酸钠的水溶液中,加热至溶液沸腾并保持30-120分钟,将脱丝胶后的蚕丝在水中漂洗多次,然后在室温下干燥;
2’:将脱丝胶后的蚕丝溶解在溴化锂水溶液中,然后将溶液置于透析袋中在纯水中进行透析,得到丝蛋白溶液。
在一些实施方式中,在步骤(1)中,所述二羧酸酐可以是丁二酸酐、戊二酸酐、邻苯二甲酸酐,但不限于此。
在一些实施方式中,在步骤(1)中,所述丝蛋白与所述二羧酸酐在溶剂中反应,所述溶剂可以为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或甲基吡咯烷酮,但不限于此。
在一些实施方式中,在步骤(1)中,所述丝蛋白与所述二羧酸酐的质量比为1:0.1至1:10,优选为1:1至1:5,例如1:0.1、1:2、1:3、1:5、1:10。
在一些实施方式中,在步骤(1)中,丝蛋白与二羧酸酐的反应温度为20-60℃;丝蛋白与二羧酸酐的反应时间为5分钟到72小时。
在一些实施方式中,步骤(1)中得到的羧基化的丝蛋白的羧基化程度为0.1-12%。其中,羧基化程度以CDtotal表示,其计算依据以下公式:
CDtotal=CDSer×11.9%+CDTyr×5.2%
其中,CDtotal代表总羧基化程度,CDSer代表丝氨酸的羧基化程度,CDTyr代表酪氨酸的羧基化程度,
其中,CDSer和CDTyr如下计算:
其中,Ssilk-Ser和Scarboxylated silk-Ser分别代表丝蛋白和羧基化丝蛋白的丝氨酸在核磁图谱中的峰面积(δH 5.5ppm);Ssilk-Tyr和Scarboxylated silk-Tyr分别代表丝蛋白和羧基化丝蛋白的酪氨酸在核磁图谱中的峰面积(δH 9.7ppm);Ssilk-Ala和Scarboxylated silk-Ala分别代表丝蛋白和羧基化丝蛋白的丙氨酸在核磁图谱中的峰面积(δH 1.2ppm)。
步骤(2)
在具体实施方式中,所述步骤(2-1)包括:
将羧基化丝蛋白溶解,例如溶解在柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、纯水、磷酸盐缓冲液或MES缓冲溶液中,然后与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚胺(例如,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或二环己基碳二亚胺)混合后反应得到活化的羧基化丝蛋白。
在一些实施方式中,在步骤(2-1)中,所述羧基化丝蛋白与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比可以为1:0.5到1:4,优选为1:1到1:3,例如1:0.5、1:1、1:1.4、1.3、1:4。所述羧基化丝蛋白与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的质量比可以为1:1到1:5,优选为1:2到1:3,例如1:1、1:2、1:3、1:5。
在一些实施方式中,羧基化丝蛋白与N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺混合反应的时间可以为0.5小时至2.5小时,优选为1.5小时至2.5小时,例如0.5小时、1.5小时、2.5小时。
在一些实施方式中,所述方法还包括:在步骤(2-1)和步骤(2-2)之间,对步骤(2-1)的活化的羧基化丝蛋白进行除氧操作。除氧操作的目的是为了避免后续加入的多巴胺或其盐酸盐被氧化。
在具体实施方式中,所述步骤(2-2)包括:
将步骤(2-1)中得到的活化的羧基化丝蛋白和含有邻苯二酚基团和氨基的物质反应。
在一些实施方式中,所述含有邻苯二酚基团和氨基的物质为多巴胺或其盐,例如盐酸盐。
在一些实施方式中,所述羧基化丝蛋白与多巴胺的质量比可以为1:0.1至1:0.6,例如1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6。
在一些实施方式中,在步骤(2-2)中,所述活化的羧基化丝蛋白与多巴胺的质量比可以为1:0.1至1:0.6,例如1:0.1、1:0.2、1:0.5、1:0.6。
在一些实施方式中,在步骤(2-2)中,活化的羧基化丝蛋白和多巴胺混合反应的时间可以为1小时至24小时,优选2小时至10小时,例如1小时、3小时、10小时、12小时、24小时。
步骤(3)
所述步骤(3)包括:
将步骤(2-2)中得到的反应产物透析,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白水溶液,并将该溶液干燥(例如冷冻干燥),得到邻苯二酚修饰的丝蛋白。
在一些实施方式中,在步骤(3)中,透析的溶液可以是pH为2-10的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液,纯水及PBS缓冲溶液,优选为pH为5-6柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。
特别地,在所述邻苯二酚修饰的丝蛋白中,羧基化丝蛋白的羧基与多巴胺反应式如下:
另一方面,本发明提供通过上述方法制备得到的邻苯二酚修饰的丝蛋白。
在一些实施方式中,所述邻苯二酚修饰的丝蛋白的修饰率为7.5-12%。
又一方面,本发明提供上述邻苯二酚修饰的丝蛋白在制备生物粘合剂中的用途。
再一方面,本发明提供一种生物粘合剂,其由上述邻苯二酚修饰的丝蛋白制备得到。
有益效果
(1)本发明所述的方法需要的丝蛋白直接从蚕茧中提取得到,来源广泛且便宜易得;羧基化丝蛋白合成方法简便,合成需要的原料来源广泛便宜易得。
(2)本发明所述的方法中使用的N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、多巴胺盐酸盐等为常见的工业原料,价格低廉。
(3)本发明所述方法需要的原料毒性较低,符合绿色化学的原则。
(4)本发明所述方法的制备步骤条件温和,操作简单,十分适合批量化生产。
(5)本发明所述方法制得的邻苯二酚修饰的丝蛋白的修饰率可达11%,高于目前文献报道值。
附图说明
图1是本发明实施例1中制备得到的邻苯二酚修饰丝蛋白的粉末照片。
图2是本发明实施例1中制备得到的邻苯二酚修饰丝蛋白透析后的照片。
图3是本发明对比例3中制备得到的邻苯二酚修饰丝蛋白反应结束且未经透析的照片。
图4是本发明实施例1中制备得到的邻苯二酚修饰丝蛋白在氘代二甲基亚砜中的氢谱核磁图。
图5是本发明实施例1-6中制备得到的邻苯二酚修饰丝蛋白与未经邻苯二酚修饰的羧基化丝蛋白在氘代二甲基亚砜中的核磁氢谱对比图。图中的“羧基丝”表示羧基化丝蛋白。
具体实施方式
以下通过具体实施方式来详细描述本发明的技术方案,然而这些具体实施方式不用于限制本发明的范围。
术语
本发明中,术语“丝蛋白”指的是基于丝蛋白的材料,如天然丝蛋白、重组丝蛋白、具有不同分子量的再生丝蛋白等。
本发明中,术语“羧基化丝蛋白”指的是用酸酐改性的羧基化丝蛋白。
材料和仪器
N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺均采购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司,多巴胺盐酸盐采购自百灵威(北京)科技有限公司,柠檬酸采购自麦克林(上海)生化科技有限公司,柠檬酸钠二水合物采购自毕德(上海)医药科技有限公司。
制备例1:羧基化丝蛋白的制备
(1)将1g丝蛋白溶解于氯化锂浓度为1mol/L的二甲基亚砜溶液(50mL)中,并加入10g的丁二酸酐,加热至50℃反应6小时。
(2)将反应后的溶液置于去离子水中透析,得到羧基化丝蛋白水溶液。将该溶液进行冷冻干燥,得到羧基化丝蛋白干粉,其照片参见图1。
实施例1
(1)在室温条件下,将100mg上面制备例1获得的羧基化丝蛋白溶解于1*MES缓冲溶液(1mol/L的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液)(5mL)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(140mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(200mg),反应1.5h后加入多巴胺盐酸盐(10mg),继续反应12h。
(2)将反应后的溶液在pH=5.2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液内室温透析三天,每12小时更换一次透析液透析,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白缓冲盐水溶液(照片参见图2)。将该溶液进行冷冻干燥,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白干粉。
实施例2
(1)在室温条件下,将100mg上面制备例1获得的羧基化丝蛋白溶解于1*MES缓冲溶液(5mL)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(140mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(200mg),反应1.5h后加入多巴胺盐酸盐(20mg),继续反应12h。
(2)将反应后的溶液在pH=5.2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液内进行透析(透析条件同实施例1),得到邻苯二酚修饰的丝蛋白缓冲盐水溶液。将该溶液进行冷冻干燥,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白干粉。
实施例3
(1)在室温条件下,将100mg上面制备例1获得的羧基化丝蛋白溶解于1*MES缓冲溶液(5mL)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(140mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(200mg),反应1.5h后加入多巴胺盐酸盐(30mg),继续反应12h。
(2)将反应后的溶液在pH=5.2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液内进行透析(透析条件同实施例1),得到邻苯二酚修饰的丝蛋白缓冲盐水溶液。将该溶液进行冷冻干燥,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白干粉。
实施例4
(1)在室温条件下,将100mg上面制备例1获得的羧基化丝蛋白溶解于1*MES缓冲溶液(5mL)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(140mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(200mg),反应1.5h后加入多巴胺盐酸盐(40mg),继续反应12h。
(2)将反应后的溶液在pH=5.2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液内进行透析(透析条件同实施例1),得到邻苯二酚修饰的丝蛋白缓冲盐水溶液。将该溶液进行冷冻干燥,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白干粉。
实施例5
(1)在室温条件下,将100mg上面制备例1获得的羧基化丝蛋白溶解于1*MES缓冲溶液(5mL)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(140mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(200mg),反应1.5h后加入多巴胺盐酸盐(50mg),继续反应12h。
(2)将反应后的溶液在pH=5.2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液内进行透析(透析条件同实施例1),得到邻苯二酚修饰的丝蛋白缓冲盐水溶液。将该溶液进行冷冻干燥,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白干粉。
实施例6
(1)在室温条件下,将100mg上面制备例1获得的羧基化丝蛋白溶解于1*MES缓冲溶液(5mL)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(140mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(200mg),反应1.5h后加入多巴胺盐酸盐(60mg),继续反应12h。
(2)将反应后的溶液在pH=5.2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液内进行透析(透析条件同实施例1),得到邻苯二酚修饰的丝蛋白缓冲盐水溶液。将该溶液进行冷冻干燥,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白干粉。
对比例1
(1)在室温条件下,将100mg上面制备例1获得的羧基化丝蛋白溶解于1*MES缓冲溶液(5mL)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(140mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(200mg),反应1.5h后加入多巴胺盐酸盐(70mg),继续反应12h。
(2)将反应后的溶液在pH=5.2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液内进行透析(透析条件同实施例1),得到邻苯二酚修饰的丝蛋白缓冲盐水溶液。将该溶液进行冷冻干燥,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白干粉。
对比例2
(1)在室温条件下,将100mg上面制备例1获得的羧基化丝蛋白溶解于1*MES缓冲溶液(5mL)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(140mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(200mg),反应1.5h后加入多巴胺盐酸盐(80mg),继续反应12h。
(2)将反应后的溶液在pH=5.2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液内进行透析(透析条件同实施例1),得到邻苯二酚修饰的丝蛋白缓冲盐水溶液。将该溶液进行冷冻干燥,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白干粉。
对比例3
(1)在室温条件下,将100mg上面制备例1获得的羧基化丝蛋白溶解于1*MES缓冲溶液(5mL)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(140mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(200mg),反应1.5h后加入多巴胺盐酸盐(90mg),继续反应12h。反应结束后的照片参见图3。从图中可以看出,在此反应中,反应结束时,溶液中有大量沉淀生成,因此,过量的多巴胺不利于反应的进行。
(2)将反应后的溶液在pH=5.2的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液内进行透析(透析条件同实施例1),得到邻苯二酚修饰的丝蛋白缓冲盐水溶液。将该溶液进行冷冻干燥,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白干粉。
对比例4
(1)在室温条件下,将100mg上面制备例1获得的羧基化丝蛋白溶解于1*MES缓冲溶液(5mL)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(140mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(200mg),反应1.5h后加入多巴胺盐酸盐(30mg),继续反应12h。
(2)将反应后的溶液在pH为7.4磷酸氢二钠/磷酸二氢钠/氯化钠缓冲溶液进行透析(透析条件同实施例1),得到邻苯二酚修饰的丝蛋白缓冲盐水溶液。将该溶液进行冷冻干燥,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白干粉。
对比例5
(1)在室温条件下,将100mg上面制备例1获得的羧基化丝蛋白溶解于1*MES缓冲溶液(5mL)中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(140mg)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(200mg),反应1.5h后加入多巴胺盐酸盐(30mg),继续反应12h。
(2)将反应后的溶液在除氧的纯水内进行透析(透析条件同实施例1),得到邻苯二酚修饰的丝蛋白缓冲盐水溶液。将该溶液进行冷冻干燥,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白干粉。
测试例1:
邻苯二酚修饰的丝蛋白的邻苯二酚修饰率的计算:核磁氢谱中7.52-6.20ppm的峰对应羧基化丝蛋白中的酪氨酸和接枝的邻苯二酚基上的氢原子,1.18ppm的峰对应丝蛋白丙氨酸上甲基的三个氢原子,0.76ppm的峰对应缬氨酸的六个氢原子(参见图4),且羧基化丝蛋白中,酪氨酸与丙氨酸和缬氨酸的摩尔比例保持不变。通过峰面积的对比可以计算得到邻苯二酚基的修饰比例。
具体邻苯二酚修饰率计算方法依据以下公式:
Dopafinal=(DopaAla+DopaVal)/2
其中,Dopafinal代表邻苯二酚修饰率(有时也成为接枝率),DopaAla、DopaVal分别代表基于丙氨酸和酪氨酸计算得到的邻苯二酚接枝率,
其中DopaAla、DopaVal分别如下计算:
其中,Sdopa代表邻苯二酚基接枝后,化学位移在(δH 7.52-6.20ppm)范围内的峰面积;Scarboxylated-Tyr代表羧基化丝蛋白中酪氨酸的峰面积,化学位移在7.52-6.20ppm;Scarboxylated-Ala和Scarboxylated-Val分别代表羧基化丝蛋白中丙氨酸和缬氨酸的峰面积,化学位移分别在1.18ppm和0.76ppm。
通过称重法计算得到各实施例制备得到的邻苯二酚修饰丝蛋白的产率(%)。
实施例和对比例的制备条件及得到修饰产物的修饰基团的修饰率和产率如下表1中所示。
表1
如上表1所示,反应时间、多巴胺盐酸盐投料量以及不同的透析溶液是影响邻苯二酚基在羧基化丝蛋白上的接枝率和产率的主要因素,综合产率和邻苯二酚接枝率,可以选择合适的反应时间、投料比和透析溶液。经实验验证,选择羧基化丝蛋白与多巴胺盐酸盐质量比为10:1~6,透析液体系选择弱酸性的体系,特别是柠檬酸/柠檬酸钠缓冲体系,可以很好地实现羧基化丝蛋白的邻苯二酚修饰。
测试例2:
邻苯二酚修饰的丝蛋白的氢谱数据测定是判断邻苯二酚基是否修饰成功的关键表征。对实施例1-6得到的邻苯二酚修饰的丝蛋白进行核磁氢谱数据采集,结果如图5。从图5中能明显看到邻苯二酚修饰的丝蛋白中在化学位移7.52-6.20ppm处增加除羧基化丝蛋白中的酪氨酸的特征峰以外的邻苯二酚基上苯环的峰,以此可认定邻苯二酚基成功修饰上到羧基化丝蛋白上了。
Claims (10)
1.一种制备邻苯二酚修饰的丝蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)使丝蛋白与二羧酸酐反应制得羧基化丝蛋白;以及
(2)在酰胺缩合剂的存在下,将所述羧基化丝蛋白与含有邻苯二酚基团和氨基的物质进行酰胺化反应得到邻苯二酚修饰的丝蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述丝蛋白包括天然丝蛋白、重组丝蛋白、具有不同分子量的再生丝蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述酰胺缩合剂选自N-羟基琥珀酰亚胺、碳二亚胺、六氟磷酸脲盐、六氟磷酸鏻盐、氯代甲酸酯、四已基焦亚磷酸及二环己基碳二亚胺中的一种或多种,优选地,所述酰胺缩合剂是N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺的组合。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述步骤(2)如下进行:
(2-1)将羧基化丝蛋白与N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺混合后反应得到活化的羧基化丝蛋白;
(2-2)将步骤(2-1)中得到的活化的羧基化丝蛋白和含有邻苯二酚基团和氨基的物质反应得到邻苯二酚修饰的丝蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,所述步骤(2-1)包括:
将羧基化丝蛋白溶解,例如溶解在柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液、纯水、磷酸盐缓冲液或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲溶液中,然后与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚胺混合后反应得到活化的羧基化丝蛋白;
优选地,所述碳二亚胺为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺;
优选地,所述羧基化丝蛋白与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.5至1:4,优选为1:1至1:3,例如1:0.5、1:1、1:1.4、1.3、1:4;以及所述羧基化丝蛋白与碳二亚胺的质量比为1:1至1:5,优选为1:2至1:3,例如1:1、1:2、1:3、1:5;
优选地,所述羧基化丝蛋白与N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺混合反应的时间为0.5小时至2.5小时,优选为1.5小时至2.5小时,例如0.5小时、1.5小时、2.5小时。
6.根据权利要求4所述的方法,其中,所述方法在步骤(2-1)和步骤(2-2)之间,还包括:对步骤(2-1)的活化的羧基化丝蛋白进行除氧操作。
7.根据权利要求4所述的方法,其中,在所述步骤(2-2)中,所述含有邻苯二酚基团和氨基的物质为多巴胺或其盐,例如多巴胺盐酸盐;
优选地,所述活化的羧基化丝蛋白与多巴胺的质量比为1:0.1至1:0.6,例如1:0.1、1:0.2、1:0.5、1:0.6;
优选地,所述活化的羧基化丝蛋白和多巴胺混合反应的时间为1小时至24小时,优选2小时至10小时,例如1小时、3小时、10小时、12小时、24小时。
8.根据权利要求1所述的方法,其中,所述方法在步骤(2)之后进一步包括将得到的邻苯二酚修饰的丝蛋白进行纯化的步骤(3),所述纯化步骤(3)包括将步骤(2-2)中得到的产物透析,优选地,在pH为5-6柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中进行透析,得到邻苯二酚修饰的丝蛋白水溶液,并将该水溶液干燥,得到纯化的邻苯二酚修饰的丝蛋白。
9.通过如权利要求1-8中任一项所述的方法制备得到的邻苯二酚修饰的丝蛋白,优选地,所述邻苯二酚修饰的丝蛋白的修饰率为7.5-12%。
10.如权利要求9所述的邻苯二酚修饰的丝蛋白在制备生物粘合剂中的用途。
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