CN110215536B - 针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料及其制备方法，所述水凝胶敷料包括羧基化细菌纤维素和氨基化葡萄糖氧化酶，所述羧基化细菌纤维素与所述氨基化葡萄糖氧化酶通过酰胺键连接。所述水凝胶敷料还包括普乐沙福；所述普乐沙福负载在所述水凝胶敷料的内部。本发明水凝胶敷料的表面通过酰胺键接枝葡萄糖氧化酶，能够起到降低创面中葡萄糖的作用，而葡萄糖氧化酶不会进入血液循环；与此同时，改性纤维素敷料中还通过物理吸附作用负载了干细胞动员药AMD3100，该药物能够在敷料与创面接触时释放到体液中，其作用在于促进创面处新生血管的生成。

Description

针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体地，涉及一种针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料及其制备方法，本发明提供了一种新型细菌纤维素创面敷料及其在糖尿病创面愈合中的应用。
背景技术
糖尿病创面溃疡是糖尿病的一个常见并发症，常见于糖尿病人的足部。由于血糖水平高，糖尿病人的创面愈合速率远低于健康人群。创面的愈合过程分为凝血期、炎症期、增殖期和重塑期四个阶段，而糖尿病创面处的血管、神经发生病变，造成创面增殖期中血管、神经再生速率过慢或无法再生，是导致糖尿病创面愈合速率缓慢的主要原因。要提高糖尿病创面的愈合速率，就要采取以下手段：1、降低血液及创面处的血糖水平；2、清创及控制感染；3、促进创面处新生血管、神经的再生。常规的方法是在胰岛素治疗的同时，对糖尿病创面进行清创并使用药物消炎，以及服用促进血管、神经再生的药物。
细菌纤维素(Bacterial cellulose，BC)是由醋酸菌属、八叠球菌属、土壤杆菌属中的一种微生物合成的纤维素的统称，以醋酸菌属中葡糖醋杆菌合成的细菌纤维素应用最为广泛。虽然从分子结构上说，细菌纤维素的结构单元与普通纤维素完全一致，但是微生物合成法给予了它一些独特的性质：1、与植物纤维素相比，细菌纤维素的分子量大(聚合度2000-8000)、结晶度高(95％)；2、与植物纤维素相比，细菌纤维素没有木质素、半纤维素等伴生物质，纯度高；3、细菌纤维素的微观结构是通过分子链间的物理缠结作用及分子链间氢键作用而形成的交联网络结构，使得细菌纤维素具有更高的力学强度。4、细菌纤维素的保水能力优异，从培养液中提纯后的状态即为水凝胶态，便于后续改性。由于细菌纤维素具有上述优势，其在生物医用材料领域中应用广泛，常用作各种创面敷料，对烧伤创面的治疗尤为有效。但细菌纤维素这样的常规的水凝胶创面敷料应用于糖尿病创面时，由于没有改善糖尿病创面的微观环境，故无法对糖尿病创面的愈合起到促进作用。
对细菌纤维素水凝胶进行改性，在其现有优势的基础上制备出一种多功能的创面敷料，使它能够适用于糖尿病创面，是一项非常具有前景的技术。
公开号为CN 103990172 B公开了一种复合医用敷料及其制备方法，该复合医用敷料包括：细菌纤维素膜、胶原蛋白和交联剂，所述胶原蛋白通过所述交联剂交联到所述细菌纤维素膜上；所述制备方法包括：将纯化后的细菌纤维素膜加入含有交联剂的胶原蛋白溶液中，使细菌纤维素膜与胶原蛋白进行交联反应，制备得到复合医用敷料。该发明通过使用交联剂提高了胶原蛋白在细菌纤维素膜上的负载量及负载的稳定性，使所制备的复合医用敷料的性能更加持久稳定。但在该专利中由于：第一，细菌纤维素负载的是胶原蛋白；第二，其涉及的敷料是经过冷冻干燥的干态敷料；第三，该专利未涉及任何的小分子药物负载，因此，该专利公开的敷料不适用于糖尿病创面。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料及其制备方法。
本发明特点在于，对细菌纤维素进行改性，将细菌纤维素的表面通过酰胺键负载了一定量的葡萄糖氧化酶，这部分葡萄糖氧化酶能够起到降低创面血糖的作用。由于葡萄糖氧化酶与细菌纤维素水凝胶之间是共价键连接，故葡萄糖氧化酶不会进入血液循环中去，安全性得到了保证。将改性的细菌纤维素作为水凝胶敷料，在分解创面处血液及组织液中糖分的过程中，将葡萄糖分解成为葡萄糖酸和过氧化氢，这部分原位产生的过氧化氢能够起到对创面杀菌消炎的作用。
另外，本发明将改性细菌纤维素水凝胶的凝胶网络内部通过物理吸附作用负载了一定浓度的普乐沙福AMD3100，作为敷料使用时能够缓释到伤口组织液中去，释放周期为12-48h。普乐沙福是一种造血干细胞动员药，能够促进创面处新生血管的再生，从而促进糖尿病创面的愈合。
本发明得到的负载有普乐沙福的细菌纤维素水凝胶敷料(BC-GOD/AMD3100)能够分解创面处的多余糖分并原位产生过氧化氢进行消炎杀菌，且能够缓释普乐沙福，是一种适用于糖尿病创面的新型多功能敷料。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供一种针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料，包括羧基化细菌纤维素和氨基化葡萄糖氧化酶，所述羧基化细菌纤维素与所述氨基化葡萄糖氧化酶通过酰胺键连接。
优选地，所述羧基化细菌纤维素采用固含量为2％-8％的细菌纤维素为原料。
优选地，所述羧基化细菌纤维素与所述氨基化葡萄糖氧化酶通过酰胺键连接后，葡萄糖氧化酶的酶活力值范围为4-10U/mg。说明连接后的葡萄糖氧化酶仍具有酶活力。
优选地，所述氨基化葡萄糖氧化酶与所述羧基化细菌纤维素上总羧基数的摩尔比为1：20～1：1。
更优选地，所述氨基化葡萄糖氧化酶与所述羧基化细菌纤维素上总羧基数的摩尔比为1：10～1：4。游离的葡萄糖氧化酶的酶活力通常在200U/mg左右，为了控制BC-GOD的酶活力，故需要控制反应至细菌纤维素表面的氨基化葡萄糖氧化酶的总量，故更优选地，控制氨基化葡萄糖氧化酶与羧基化细菌纤维素的摩尔比为1：10～1：4。
优选地，还包括普乐沙福；所述普乐沙福负载在所述水凝胶敷料的内部。所述普乐沙福通过物理吸附作用负载在所述水凝胶敷料的内部。
优选地，在最终得到的含有普乐沙福的水凝胶敷料中，所述葡萄糖氧化酶的质量百分比含量为10％-75％。
优选地，在最终得到的含有普乐沙福的水凝胶敷料中，所述普乐沙福能够在pH6.0-pH 7.4缓冲液体系缓慢释放，释放的周期为24h。
本发明还提供一种针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：
S1、对细菌纤维素依次进行醛基化和羧基化后，得到羧基化细菌纤维素；
S2、将氨基化葡萄糖氧化酶与所述羧基化细菌纤维素进行酰胺化反应。此处步骤中得到了细菌纤维素-葡萄糖氧化酶水凝胶，即表面负载葡萄糖氧化酶的细菌纤维素凝胶BC-GOD。
优选地，所述醛基化的具体步骤为：将细菌纤维素凝胶切小块后置于高碘酸钠溶液中搅拌12-24h，反应结束后去除剩余的高碘酸钠，随后弃去反应液，清洗凝胶块，得到醛基化细菌纤维素(BC-CHO)。在上述醛基化的步骤中，高碘酸钠能够有效的将邻二醇转化为邻二醛，该方法常用于水溶液中的多糖醛基化。在上述醛基化的步骤中，反应结束后采用乙二醇作为终止剂去除剩余的高碘酸钠，乙二醇也是一种邻二醇，与多糖相比，其与高碘酸钠的反应活性更高，故可使用乙二醇作为终止剂，在反应需要结束时加入就能将参与的高碘酸钠全部消耗掉。而其他常见的羟基-醛基转化体系均为有机相体系，并不适用于醛基化细菌纤维素水凝胶的制备。
优选地，所述高碘酸钠与所述细菌纤维素结构单元总数的摩尔比为1:1-3:1(细菌纤维素是交联结构，其理论分子量是无穷大的，所以在知道细菌纤维素的总质量之后，只能计算其糖单元的摩尔数/羧基摩尔数，而无法确定其具体分子量)。若两者摩尔比大于3时，过量的高碘酸钠会使得细菌纤维素之间糖苷键发生断裂，导致细菌纤维素主链的降解，从而导致细菌纤维素凝胶的力学性能大幅下降，故不采用更高的高碘酸钠投料量。
优选地，所述羧基化的具体步骤为：将醛基化细菌纤维素置于亚氯酸钠与过氧化氢的混合溶液中搅拌12-24h，得到羧基化细菌纤维素(BC-COOH)。亚氯酸钠/过氧化氢体系能够高效的将水相中的有机物醛基转化为羧基，而其他常见的醛基-羧基转化体系均为有机相体系，并不适用于羧基化细菌纤维素水凝胶的制备。
优选地，所述亚氯酸钠与所述醛基化细菌纤维素上总醛基数的摩尔比为1:2-2:1；所述亚氯酸钠与所述过氧化氢的摩尔比为1:1。在醛基氧化为羧基的过程中，反应历程如下：R-CHO+NaClO2＝R-COOH+NaClO，NaClO+H2O2＝NaCl+O2+H2O，过氧化氢用于去除副产物次氯酸钠，故亚氯酸钠与过氧化氢的摩尔比为1:1。其中，过氧化氢按照30％过氧化氢溶液中溶质的摩尔数量计算。
优选地，所述氨基化葡萄糖氧化酶的制备方法为：
A1、将葡萄糖氧化酶在pH为7.5-8.5的弱碱性条件下与丙烯酰氧琥珀酰亚胺(NAS)反应12-24h，得到经过双键修饰的葡萄糖氧化酶；
A2、将所述经过双键修饰的葡萄糖氧化酶在过硫酸铵/四甲基乙二胺(APS/TEMED)的引发体系下，与氨基单体进行原位共聚反应4-24h，制备得到氨基化葡萄糖氧化酶。
更优选地，步骤A2中，所述氨基单体包括N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐。经过反应后使得在葡萄糖氧化酶表面形成带有氨基的聚合物层，制备得到氨基化葡萄糖氧化酶。
优选地，所述酰胺化反应的具体步骤为：将羧基化细菌纤维素置于pH为4-6的缓冲液中，加入催化剂活化所述羧基化细菌纤维素，然后加入氨基化葡萄糖氧化酶进行酰胺化反应；所述氨基化葡萄糖氧化酶与所述羧基化细菌纤维素上总羧基数的摩尔比为1：20～1：1。
更优选地，所述氨基化葡萄糖氧化酶与所述羧基化细菌纤维素上总羧基数的摩尔比为1：10～1：4。
优选地，所述催化剂与所述羧基化细菌纤维素上总羧基数的摩尔比为1:1-2:1。
优选地，所述催化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
优选地，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和所述羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:1。
更优选地，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)与所述羧基化细菌纤维素(BC-COOH)上总羧基数的摩尔比为1:2-1:1。为了控制通过反应连接至羧基化纤维素主链上的氨基化葡萄糖氧化酶的总量，故控制单一催化剂的投料量小于羧基的摩尔数，即只活化BC-COOH上一部分的羧基，从而控制BC-GOD的酶总量。
优选地，所述制备方法还包括：还包括：将步骤S2制得的水凝胶敷料负载普乐沙福的步骤，具体为：将步骤S2制得的水凝胶敷料在浓度为20-200μg/mL的普乐沙福溶液中浸泡12-48h。普乐沙福药物分子通过物理吸附作用负载在BC-GOD凝胶网络之中，从而使得BC-GOD凝胶成为AMD3100的药物缓释载体，得到BC-GOD/AMD3100。
本发明制备的细菌纤维素水凝胶敷料在扫描电镜下的微观结构为纤维状，负染色后进行高倍率下透射电镜下能够观察到球状的葡萄糖氧化酶蛋白。本发明提供的细菌纤维素水凝胶敷料应用于糖尿病创面的治疗之中，能够有效的促进糖尿病创面的愈合率。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明特点在于，对细菌纤维素进行改性，将细菌纤维素的表面通过酰胺键负载了一定量的葡萄糖氧化酶，这部分葡萄糖氧化酶能够起到降低创面血糖的作用。由于葡萄糖氧化酶与细菌纤维素水凝胶之间是共价键连接，故葡萄糖氧化酶不会进入血液循环中去，安全性得到了保证。将改性的细菌纤维素作为水凝胶敷料，在分解创面处血液及组织液中糖分的过程中，将葡萄糖分解成为葡萄糖酸和过氧化氢，这部分原位产生的过氧化氢能够起到对创面杀菌消炎的作用。
2、本发明中负载有普乐沙福的细菌纤维素水凝胶敷料BC-GOD/AMD3100能够缓释小分子药物普乐沙福AMD3100，且80％以上的药物能够在24h内释放。普乐沙福能够促进造血干细胞的生成，改善糖尿病创面的血供。故BC-GOD/AMD3100能够起到改善糖尿病创面微环境的作用。
3、本发明中没有负载普乐沙福的细菌纤维素水凝胶敷料BC-GOD和负载有普乐沙福的细菌纤维素水凝胶敷料BC-GOD/AMD3100是均为一种凝胶态的敷料，具有良好的保水率和透气性，不易与创面发生黏连。
4、本发明中涉及的细菌纤维素羧基化改性方法，对固定化葡萄糖氧化酶非常重要。只有对细菌纤维素进行羧基化改性，才能将氨基化的葡萄糖氧化酶接到其主链上，这对于后续的应用非常重要。若葡萄糖氧化酶没有固定到细菌纤维素分子链上，只是简单物理混合，那么它就无法作为敷料进行使用。游离的葡萄糖氧化酶一旦进入到血液循环系统，那么它就会大幅的分解血糖，降低血糖水平，从而发生低血糖症等症状，反而不利于病人的健康。因此，唯有将葡萄糖氧化酶固定在细菌纤维素的主链上，它针对糖尿病创面的降糖效果才是有意义的。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是实施例1中BC-GOD凝胶的外观；
图2是实施例2中BC-GOD凝胶的扫描电镜照片，标尺长度为5μm；
图3是实施例3中BC-GOD凝胶的透射电镜照片，标尺长度为50nm；
图4是试验例1中BC-GOD凝胶的酶活力指标，纵坐标表示酶活力值，单位为U/mg；
图5是试验例2中BC-GOD/AMD3100凝胶中AMD3100的缓释曲线，横坐标表示时间，单位h；纵坐标表示累计释放率，单位％；
图6是试验例3中小鼠创面愈合率的趋势图，横坐标表示时间，单位d；纵坐标表示愈合率，单位％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明的针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料的制备方法，包括如下四步；
第一步是将原料细菌纤维素BC进行改性，得到醛基化的细菌纤维素BC-CHO；
第二步是将醛基化的细菌纤维素BC-CHO进行进一步的氧化改性，得到羧基化细菌纤维素BC-COOH；
第三步是将羧基化的BC-COOH与氨基化的葡萄糖氧化酶进行反应，制备得到细菌纤维素-葡萄糖氧化酶BC-GOD水凝胶，其中葡萄糖氧化酶和细菌纤维素骨架之间是以酰胺键相连接；
第四步是将BC-GOD凝胶浸泡于造血干细胞动员药AMD3100的溶液中过夜，即得到载AMD3100的BC-GOD水凝胶。
实施例1
将5g原料细菌纤维素凝胶(固含量为0.27g)切小块后置于250mL含有0.71g高碘酸钠溶液中搅拌24h，其中高碘酸钠与细菌纤维素结构单元的摩尔比为2:1，反应结束后用10mL乙二醇终止反应并清洗凝胶，制备得到醛基化的细菌纤维素BC-CHO。再将BC-CHO置于250mL含有亚氯酸钠与过氧化氢混合溶液中搅拌12h，其中亚氯酸钠与BC-CHO的总醛基数摩尔比为2:1、亚氯酸钠与过氧化氢的摩尔比为1:1，结束后清洗凝胶，制备得到羧基化细菌纤维素BC-COOH。
配制2mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液共计100mL，在pH8.0条件下与0.01mol NAS(丙烯酰氧琥珀酰亚胺)进行反应，使得GOD表面修饰上一定数量的双键。然后对反应液进行透析48h，去除未反应的NAS。然后加入APS/TEMED(过硫酸铵/四甲基乙二胺)作为引发剂(浓度为0.00001mol/L)，再加入0.01mol氨基单体N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(APM)，带双键的GOD与氨基单体进行原位共聚和反应8h，反应结束后进行超滤浓缩纯化，去除小分子。经过反应后的葡萄糖氧化酶表面即形成具有氨基的聚合物层，制备得到氨基化葡萄糖氧化酶。
将羧基化细菌纤维素BC-COOH置于pH6.0的磷酸缓冲液中，加入催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，其中EDC与BC-COOH的总羧基数摩尔比为1:1，EDC和NHS的摩尔比为1:1，搅拌溶液活化羧基2h，再加入1mL浓度为1mg/mL氨基化葡萄糖氧化酶与之进行酰胺化反应24h，氨基化葡萄糖氧化酶与羧基化细菌纤维素总羧基数的摩尔比为1:10，结束后清洗凝胶，获得表面负载葡萄糖氧化酶的细菌纤维素凝胶BC-GOD。图1是实施例1中BC-GOD凝胶的外观。
通过将BC-GOD凝胶浸泡在20μg/mL普乐沙福溶液中12h，普乐沙福药物分子通过物理吸附作用负载在BC-GOD凝胶网络之中，从而使得BC-GOD凝胶成为AMD3100的药物缓释载体，即得到敷料BC-GOD/AMD3100。
实施例2
将5g原料细菌纤维素凝胶(固含量为0.27g)切小块后置于250mL含有0.71g高碘酸钠溶液中搅拌18h，其中高碘酸钠与细菌纤维素结构单元的摩尔比为2:1，反应结束后用20mL乙二醇终止反应并清洗凝胶，制备得到醛基化的细菌纤维素BC-CHO。再将BC-CHO置于250mL含有亚氯酸钠与过氧化氢混合溶液中搅拌24h，其中亚氯酸钠与BC-CHO的总醛基数摩尔比为2:1、亚氯酸钠与过氧化氢的摩尔比为1:1，结束后清洗凝胶，制备得到羧基化的细菌纤维素BC-COOH。
将羧基化细菌纤维素BC-COOH置于250mL pH 5.0的磷酸缓冲液中，加入催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，其中EDC与BC-COOH的总羧基数摩尔比为1:1，EDC和NHS的摩尔比为1:1，搅拌溶液活化羧基3h，再加入2mL浓度为0.5mg/mL氨基化葡萄糖氧化酶(氨基化葡萄糖氧化酶的制备方法与实施例1中相同)与之进行酰胺化反应24h，氨基化葡萄糖氧化酶与羧基化细菌纤维素总羧基数的摩尔比为1:8，结束后清洗凝胶，获得表面负载葡萄糖氧化酶的细菌纤维素凝胶BC-GOD。图2是实施例2中BC-GOD凝胶的扫描电镜照片，标尺长度为5μm。
通过将BC-GOD凝胶浸泡在100μg/mL的普乐沙福溶液中36h，普乐沙福药物分子通过物理吸附作用负载在BC-GOD凝胶网络之中，从而使得BC-GOD凝胶成为AMD3100的药物缓释载体，即得到敷料BC-GOD/AMD3100。
实施例3
将5g原料细菌纤维素凝胶(固含量为0.4g)切小块后置于250mL含有0.52g高碘酸钠溶液中搅拌12h，其中高碘酸钠与细菌纤维素结构单元的摩尔比为1:1，反应结束后用10mL乙二醇终止反应并清洗凝胶，制备得到醛基化的细菌纤维素BC-CHO。再将BC-CHO置于250mL含有亚氯酸钠与过氧化氢混合溶液中搅拌24h，其中亚氯酸钠与BC-CHO的总醛基数摩尔比为1:1、亚氯酸钠与过氧化氢的摩尔比为1:1，结束后清洗凝胶，制备得到羧基化的细菌纤维素BC-COOH。
将羧基化细菌纤维素BC-COOH置于250mL pH4.0的磷酸缓冲液中，加入催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，其中EDC与BC-COOH的总羧基数摩尔比为1:2，EDC和NHS的摩尔比为1:1，搅拌溶液活化羧基4h，再加入2mL浓度为1mg/mL氨基化葡萄糖氧化酶(氨基化葡萄糖氧化酶的制备方法与实施例1中相同)与之进行酰胺化反应12h，氨基化葡萄糖氧化酶与羧基化细菌纤维素总羧基数的摩尔比为1:15，结束后清洗凝胶，获得表面负载葡萄糖氧化酶的细菌纤维素凝胶BC-GOD。图3是实施例3中BC-GOD凝胶的透射电镜照片，标尺长度为50nm；样品经过1％磷钨酸负染色，其中的圆形亮点是未被染色的葡萄糖氧化酶蛋白。
通过将BC-GOD凝胶浸泡在200μg/mL的普乐沙福溶液中48h，普乐沙福药物分子通过物理吸附作用负载在BC-GOD凝胶网络之中，从而使得BC-GOD凝胶成为AMD3100的药物缓释载体，即得到敷料BC-GOD/AMD3100。
试验例1
利用邻联茴香胺染色法对实施例1中的BC-GOD水凝胶上的葡萄糖氧化酶活力进行测定。酶活力测试需要以下溶液：
(1)邻联茴香胺缓冲液A：1.3g邻联茴香胺加在100mL去离子水中搅拌溶解备用。取0.1mL上述溶液分别加入到7.4、6.0缓冲液12mL中混匀。成为缓冲液A1、A2。
(2)邻联茴香胺缓冲液B：1.3g邻联茴香胺加在100mL去离子水中搅拌溶解备用。取0.2mL上述溶液分别加入到7.4、6.0缓冲液12mL中混匀。成为缓冲液B1、B2。
(3)180g/L葡萄糖水溶液
(4)0.03％辣根过氧化物酶溶液A
(5)0.06％辣根过氧化物酶溶液B
实验方法：
酶活力测试的实验步骤如下，在比色皿里按照步骤加入以下表1中溶液，酶活力数值在37度下测得。
表1
Figure BDA0002093716580000091
X＝[Ax÷(11.3×t×V)]×n
t—测定时间，3min
V—样品体积，mL
11.3—消光系数
n—稀释倍数
图4是试验例1中BC-GOD凝胶的酶活力指标，纵坐标表示酶活力值，单位为U/mg。由图4中可知，BC-GOD在pH 7.4与pH 6.0下的酶活力分别为5.05U/mg与5.81U/mg，该酶活力数值能够满足作为糖尿病敷料使用时酶活力的要求。
试验例2
对实施例2中载药凝胶BC-GOD/AMD3100中的干细胞动员药AMD3100的释放行为进行测定。将一片BC-GOD/AMD3100置于MWCO＝14kDa的透析袋中，再把透析袋置于50mL不同的磷酸缓冲液体系中(pH＝7.4，pH＝6.0)以及含4.5g/L葡萄糖的磷酸缓冲液体系中(pH＝7.4，pH＝6.0)，在5min，15min，30min，45min，1h，2h，3h，4h，8h，24h取样0.5mL，测试其在260nm下的吸光度，利用AMD3100标准曲线计算其浓度及累计释放率。结果显示(图5)，不论是哪种缓释体系，凝胶中的AMD3100分子均在前4小时内快速释放60％以上，4小时后再继续释放剩余的AMD3100。所以AMD3100的释放行为满足本敷料12小时换药一次的需求。
试验例3
对实施例3中载药凝胶BC-GOD/AMD3100是否对糖尿病小鼠创面愈合有促进作用进行测定。取若干只4周龄的糖尿病小鼠及健康小鼠，在其背部制造一个直径5mm的创面。正常对照组为健康小鼠，其创面不使用敷料；糖尿病对照组使用的是糖尿病小鼠，其创面不使用敷料；BC-GOD/AMD3100组使用的是糖尿病小鼠，使用对应直径的BC-GOD/AMD3100水凝胶作为创面敷料覆盖在创口处，每隔12小时换一次药，共换药两次。利用imageJ软件对照片中不同时间点的小鼠创面大小进行统计，从而得到愈合率的数据。从数据中可以看出(图6)，正常对照组的小鼠创面愈合最快，而使用BC-GOD/AMD3100敷料的糖尿病小鼠的创面愈合率明显优于糖尿病对照组。敷料组的小鼠创面愈合率在12天时达到了100％，说明创面已经完全愈合。与此同时，糖尿病对照组的小鼠创面愈合率在12天时仍未愈合。
本发明提供了一种基于改性细菌纤维素的功能性创面敷料，并能够应用于糖尿病创面的治疗之中。该改性细菌纤维素敷料为水凝胶态，凝胶的表面通过酰胺键接枝了葡萄糖氧化酶，能够起到降低创面中葡萄糖的作用，而葡萄糖氧化酶不会进入血液循环；与此同时，改性纤维素敷料中还通过物理吸附作用负载了干细胞动员药AMD3100，该药物能够在敷料与创面接触时释放到体液中，其作用在于促进创面处新生血管的生成。这种新型的细菌纤维素敷料能够有效的促进糖尿病创面的愈合。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (11)

1.一种针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料，其特征在于，包括羧基化细菌纤维素和氨基化葡萄糖氧化酶，所述羧基化细菌纤维素与所述氨基化葡萄糖氧化酶通过酰胺键连接；
所述氨基化葡萄糖氧化酶的制备方法为：
A1、将葡萄糖氧化酶在pH为7.5-8.5的弱碱性条件下与丙烯酰氧琥珀酰亚胺反应12-24h，得到经过双键修饰的葡萄糖氧化酶；
A2、将所述经过双键修饰的葡萄糖氧化酶在过硫酸铵/四甲基乙二胺的引发体系下，与氨基单体进行原位共聚反应4-24h，制备得到氨基化葡萄糖氧化酶。
2.根据权利要求1所述的针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料，其特征在于，所述氨基化葡萄糖氧化酶与所述羧基化细菌纤维素上总羧基数的摩尔比为1：20～1：1。
3.根据权利要求1所述的针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料，其特征在于，还包括普乐沙福；所述普乐沙福负载在所述水凝胶敷料的内部。
4.一种根据权利要求1所述的针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、对细菌纤维素依次进行醛基化和羧基化后，得到羧基化细菌纤维素；
S2、将氨基化葡萄糖氧化酶与所述羧基化细菌纤维素进行酰胺化反应。
5.根据权利要求4所述的针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述醛基化的具体步骤为：将细菌纤维素凝胶切小块后置于高碘酸钠溶液中搅拌12-24h，反应结束后去除剩余的高碘酸钠，随后弃去反应液，清洗凝胶块，得到醛基化细菌纤维素；
所述高碘酸钠与所述细菌纤维素的结构单元总数的摩尔比为1:1-3:1。
6.根据权利要求4所述的针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述羧基化的具体步骤为：将醛基化细菌纤维素置于亚氯酸钠与过氧化氢的混合溶液中搅拌12-24h，得到羧基化细菌纤维素；
所述亚氯酸钠与所述醛基化细菌纤维素上总醛基数的摩尔比为1:2-2:1；
所述亚氯酸钠与所述过氧化氢的摩尔比为1:1。
7.根据权利要求4所述的针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述氨基化葡萄糖氧化酶的制备方法为：
A1、将葡萄糖氧化酶在pH为7.5-8.5的弱碱性条件下与丙烯酰氧琥珀酰亚胺反应12-24h，得到经过双键修饰的葡萄糖氧化酶；
A2、将所述经过双键修饰的葡萄糖氧化酶在过硫酸铵/四甲基乙二胺的引发体系下，与氨基单体进行原位共聚反应4-24h，制备得到氨基化葡萄糖氧化酶。
8.根据权利要求4所述的针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述酰胺化反应的具体步骤为：将羧基化细菌纤维素置于pH为4-6的缓冲液中，加入催化剂活化所述羧基化细菌纤维素，然后加入氨基化葡萄糖氧化酶进行酰胺化反应；所述氨基化葡萄糖氧化酶与所述羧基化细菌纤维素上总羧基数的摩尔比为1：20～1：1。
9.根据权利要求8所述的针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述催化剂与所述羧基化细菌纤维素上总羧基数的摩尔比为1:2-1:4。
10.根据权利要求8或9所述的针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述催化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和羟基琥珀酰亚胺。
11.根据权利要求4所述的针对糖尿病创面的细菌纤维素水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，还包括：将步骤S2制得的水凝胶敷料负载普乐沙福的步骤，具体为：将步骤S2制得的水凝胶敷料在浓度为20-200μg/mL的普乐沙福溶液中浸泡12-48h。
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