CN112957457B - 一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统及其制备方法和应用 - Google Patents

一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及生物医用材料技术领域，具体为一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统及其制备方法和应用，所述纳米系统包括金属氧化物纳米颗粒以及修饰在金属氧化物表面的葡萄糖氧化酶。通过将葡萄糖氧化酶修饰到金属氧化物纳米颗粒表面，得到一种级联类纳米材料，将其用于调节糖尿病感染伤口微环境并促使其快速愈合。

Description

一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体为一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
众所周知，糖尿病严重危害人们的健康，给人们的生活造成了巨大的威胁。据不完全统计，2015年全球约有4.15亿人患有糖尿病，而这一数据将在2040年升高至6.42亿人，这是令人担忧的。而中国糖尿病患者约占全球的26.5％，这是非常高的一个比率。更严重的是，除糖尿病本身外，其并发症对人们的危害更大，如糖尿病肾病、糖尿病性视网膜病变、糖尿病伤口溃烂、糖尿病足以及糖尿病性心脑血管并发症等，其中，糖尿病伤口溃烂是常见并发症。
那么为什么糖尿病伤口难以愈合？首先，血糖高时，会造成代谢异常，细胞外液渗透压升高，导致水从细胞内渗出，葡萄糖从尿液中排除，通过尿液排出过多水分和电解质，使得细胞内外发生脱水，伤口难以愈合；其次，高血糖使白细胞杀菌能力减弱，容易成为细菌感染的温床，使得伤口越来越大；第三，高血糖导致的血管病变，使得氧气与营养物质难以运输到创面部位，造成乏氧环境，有利于细菌生长，不利于伤口愈合；第四，创面感染微环境会使创面部位处于氧化应激状态，产生过多活性氧，使皮肤组织发生损伤，创面更加难以愈合。
为了解决上述问题，现有技术提供了一种细菌纤维素水凝胶敷料，该敷料在细菌纤维素表面通过酰胺键负载了一定量的葡萄糖氧化酶，并且，在改性细菌纤维素水凝胶的凝胶网络内部通过物理吸附作用附在了一定浓度的普乐沙福药物。葡糖糖氧化酶与葡萄糖作用生成过氧化氢实现对创面的消炎作用，普乐沙福则促进创面处新生血管的再生，促进糖尿病创面的愈合。但是，发明人发现，糖尿病皮肤表面创面部分存在双氧水会使得创面部位的皮肤处于氧化应激状态，不利于创面伤口愈合。而且，还必须添加一定的药物协同作用才能够促进伤口愈合，不添加药物根本无法促进糖尿病伤口愈合。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本公开提供了一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统及其制备方法和应用，通过将葡萄糖氧化酶修饰到金属氧化物纳米颗粒表面，得到一种级联类酶纳米材料，将其用于调节糖尿病感染伤口微环境并促使其快速愈合。
具体地，本公开的技术方案如下所述：
在本公开的第一方面，一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统，所述纳米系统包括金属氧化物纳米颗粒以及修饰在金属氧化物表面的葡萄糖氧化酶。
在本公开的第二方面，一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，包括：将金属氧化物纳米颗粒与PAH溶液混合，使得金属氧化物表面形成PAH涂层；然后，添加葡萄糖氧化酶，将天然酶共价缀合到PAH的氨基上。
在本公开的第三方面，一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统和/或一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法制备得到的产品在制备促进糖尿病伤口愈合药物中的应用。
在本公开的第四方面，一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统和/或一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法制备得到的产品在制备促进糖尿病伤口愈合的药物注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用。
本公开中的一个或多个技术方案具有如下有益效果：
(1)、本公开在体外实验中表明，利用该类酶纳米系统具有明显的降血糖能力，并且成功生成了羟基自由基(·OH)，表现出优异的体外抗菌效果，与此同时，也证明了该纳米系统将双氧水分解为氧气，改善乏氧环境，促进伤口的愈合。
(2)、将该纳米系统应用于糖尿病小鼠皮肤伤口细菌感染模型中，通过小鼠创面部位面积变化以及创面部位组织的多种病理切片均证明，该纳米系统在糖尿病小鼠细菌感染伤口上表现出优异的抗菌性能，并且促进伤口愈合。
(3)、除此之外，该纳米材料表现出优异的pH选择性，根据糖尿病伤口不同的pH(如弱酸性、中性)起到不同的治疗效果，更加有效地达到调节糖尿病创面微环境促进伤口愈合的目的，弱酸性条件下，产生的羟基自由基杀死细菌；中性条件下，生成氧气改善乏氧环境。
(4)、本公开原料价格低廉，易于获取，同时合成方法简便。本公开可同时解决造成糖尿病创面难以愈合多种问题，在调节伤口微环境的同时促进伤口愈合，以达到高效快速治疗糖尿病伤口的目的。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
以下，结合附图来详细说明本公开的实施方案，其中：
图1：为实施例1的促进糖尿病伤口愈合的酶纳米材料的制备原理图；
图2：为实施例1获得的Fe3O4-GOx纳米系统的投射电镜表征图：(a)为Fe3O4纳米颗粒的透射电镜图；(b)、Fe3O4-GOx纳米系统的透射电镜图；
图3：为实施例1获得的Fe3O4-GOx纳米系统粒径变化和电位变化：(a)为Fe3O4-GOx纳米系统合成过程中粒径变化；(b)、合成过程中Zeta电位变化；
图4：为实施例1获得的Fe3O4-GOx纳米系统稳定性和细胞毒性：(a)为Fe3O4-GOx纳米系统的7天粒径稳定性；(b)、为Fe3O4-GOx纳米系统的细胞毒性；
图5：为实施例1获得的Fe3O4-GOx纳米系统的葡萄糖氧化酶活性：(a)为Fe3O4-GOx纳米系统可体外抑制血糖；(b)、为Fe3O4-GOx纳米系统可与葡萄糖生成双氧水；
图6：为实施例1获得的Fe3O4-GOx纳米系统的类过氧化氢酶活性：(a)为Fe3O4-GOx纳米系统可将与葡萄糖反应生成的双氧水分解为氧气；(b)、不同pH条件下，氧气生成量，中性条件下(pH＝7.5)，Fe3O4-GOx与葡萄反应生成的氧气最多；
图7：为实施例1获得的Fe3O4-GOx纳米系统的类过氧化物酶活性；
图8：为实施例1获得的Fe3O4-GOx纳米系统的抗菌性能；
图9：为实施例1获得的Fe3O4-GOx纳米系统的抗菌性能；
图10：为实施例1获得的Fe3O4-GOx纳米系统对于糖尿病小鼠伤口微环境的调节性能；
图11：为实施例1获得的Fe3O4-GOx纳米系统在治疗小鼠创面处皮肤的病理切片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术难以快速治疗糖尿病伤口，本公开针对糖尿病伤口难以愈合的多种原因，从多角度同时治疗伤口，在调节伤口微环境的同时促进伤口愈合，以达到高效快速治疗糖尿病伤口的目的。
在本公开的一种实施方式中，公开了一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统，所述纳米系统包括金属氧化物纳米颗粒以及修饰在金属氧化物表面的葡萄糖氧化酶。
在某些具体的实施方式中，所述金属氧化物纳米颗粒选自四氧化三铁纳米颗粒、二氧化铈纳米颗粒、金纳米颗粒或二氧化锰纳米颗粒，优选的，为四氧化三铁纳米颗粒。
在某些具体的实施方式中，金属氧化物表面还附有PAH层，所述葡萄糖氧化酶与PAH的氨基共价缀合连接。通过在金属氧化物表面包覆一层PAH层，不仅能够提高葡萄糖氧化酶在金属氧化物表面的连接强度，避免葡萄糖氧化酶还未发挥作用就已经脱落；又能够实现级联反应，避免金属氧化物中高价态金属离子先于葡萄糖氧化酶与创面部分过高的葡萄糖反应。此外，PAH层不会产生毒副作用，并且能够保证金属氧化物中的高价态金属离子在PAH层内外的自由穿梭。
在某些具体的实施方式中，所述级联类酶纳米系统中，葡萄糖氧化酶的酶活力值范围为30-100U/mL，说明连接后的葡萄糖氧化酶能够保持较高的酶活性。
在某些具体的实施方式中，所述级联类酶纳米系统中，葡萄糖氧化酶的质量百分比含量为30％-50％，该范围内的酶纳米系统能够发挥最佳的促进创口愈合的优势，使得创口表面微环境最佳，各类离子种类、数量保持在最合理的水平，极大的提高了伤口愈合的速度。
在某些具体的实施方式中，所述级联类酶纳米系统能够在pH为5.5-8.5的缓冲液体系内发挥促进伤口愈合的最佳效果。所述级联类酶纳米系统在不同pH环境下对伤口有着不同的治疗方式，在细菌感染造成的弱酸性条件下(pH＝5.5-7.0)，所述级联类酶纳米系统能够产生羟基自由基杀死感染细菌，促进伤口愈合；在无细菌感染的中性及弱碱性环境下(pH＝7.0-8.5)，所述级联类酶纳米系统可以产生氧气，改善乏氧环境，促进伤口愈合。
在本公开的一种实施方式中，公开了一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，包括：将金属氧化物纳米颗粒与PAH溶液混合，使得金属氧化物表面形成PAH涂层；然后，添加葡萄糖氧化酶，将葡萄糖氧化酶共价缀合到PAH的氨基上。
在某些具体的实施方式中，所述金属氧化物纳米颗粒与PAH溶液混合的过程包括：配置含有PAH的NaCl溶液，所述PAH在NaCl溶液中的浓度为5-20mg/mL，优选的，为10mg/mL。
在某些具体的实施方式中，金属氧化物与PAH溶液混合后在室温下搅拌，反应完成后，将混合溶液离心得到金属氧化物/PAH纳米颗粒；进一步地，所述搅拌时间为2-5h，优选的，为3h。
在某些具体的实施方式中，将葡萄糖氧化酶与金属氧化物/PAH纳米颗粒混合之前，优选的，激活葡萄糖氧化酶中的羧基。通过激活羧基，不仅有助于更快速、均匀、稳定的实现与PAH中氨基的共价缀合，而且，有助于保持葡萄糖氧化酶的酶活性。验证结果显示，如果不激活羧基，则最终得到的酶纳米系统中葡萄糖氧化酶的酶活力值仅仅为15U/mL，对于伤口愈合治疗效果不佳。
进一步地，激活葡萄糖氧化酶中的羧基的具体过程包括：将四甲基氢氧化铵1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(NHS)按照一定的质量比添加到葡萄糖氧化酶(GOx)中；
所述EDC：NHS为3.0-5.0mg:3.3-5.5mg，质量比；
所述GOx的浓度范围是50-200μg/mL；处于该范围下，保证足够的GOx与伤口处高浓度的葡萄糖反应，以生成足量的双氧水用于后续伤口处的治疗。
所述激活反应保持20-60min，优选的，为30min。
在某些具体的实施方式中，激活后的GOx与金属氧化物/PAH纳米颗粒混合搅拌18-35h，优选的，为24h；进一步地，搅拌反应完成后，将混合物离心、洗涤。
在本公开的一种实施方式中，一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统和/或一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法制备得到的产品在制备促进糖尿病伤口愈合药物中的应用。
在本公开的一种实施方式中，一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统和/或一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法制备得到的产品在制备促进糖尿病伤口愈合的药物注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统：Fe3O4-GOx纳米系统制备方法如下(原理如图1所示)：
材料：六水合氯化铁(III)(FeCl3·6H2O)，油酸钠，油酸，1-十八碳烯，聚烯丙胺盐酸盐(PAH；Mw＝15000Da)，磷酸盐缓冲盐水(PBS)，四甲基氢氧化铵1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(NHS)，3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)和2′,7′-二氯二氟荧光素二乙酸盐(DCFH-DA；≥94％)购自Sigma-Aldrich。3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，2,2'-叠氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，邻苯二胺(OPD；98％)，亚甲基蓝(MB)，对苯二甲酸(TA)和过氧化氢(H2O2)分析试剂盒购自Beyotime Biotechnology。过氧化氢(≥30％)和葡萄糖氧化酶(GOx)购自阿拉丁试剂。BCA蛋白测定试剂盒，丙二醛(MDA)测定试剂盒和蛋白质羰基测定试剂盒购自南京建城生物工程研究所。活/死细菌生存力试剂盒购自ThermoFisher。所有其他化学品均从Adamas beta获得，无需进一步纯化即可使用。所有实验均使用去离子(DI)水(Millipore Milli-Q级，18.2MΩ)。
磁性Fe3O4纳米粒子的制备：首先，将12.2g油酸钠和3.6g FeCl3·6H2O溶解在20mL去离子(DI)水，50mL己烷和30mL无水乙醇的混合溶液中，并在70℃回流4h。反应完成后，将混合物冷却至室温，将通过分液而获得的上层有机液体用DI水洗涤，然后除去己烷，以获得棕红色油酸铁络合物。接着，将6g油酸铁络合物溶解于45mL的1-十八碳烯和1.5mL的油酸混合溶液中，用N2保护，将混合物加热至280℃，然后缓慢升高至320℃，并回流冷凝30分钟获得磁性纳米颗粒。将混合物冷却至室温，添加200mL的无水乙醇以使获得的磁性纳米颗粒沉降，用磁体分离，并用等体积的己烷和无水乙醇交替洗涤3次，将最终获得的磁性纳米颗粒分散在50mL己烷用于后续实验。
为了使所制备的Fe3O4纳米颗粒为水溶性，将等体积的无水乙醇添加到分散在己烷中的Fe3O4纳米颗粒中，并用磁体分离混合物。将0.2M氢氧化四甲基铵加入到获得的沉淀物中，将混合物摇动5分钟，然后将5mL的2-丙醇加入到混合物中，再次磁化。最后，将Fe3O4纳米颗粒用丙酮洗涤，并分散在去离子水中以用于随后的PAH涂层。
Fe3O4-GOx纳米系统的制备：将0.1g PAH溶解在10mL的1mM NaCl溶液中，并添加1mL的制备好的Fe3O4纳米颗粒。将混合物在室温下以900rpm搅拌3小时，以获得Fe3O4/PAH溶液。反应完成后，将获得的Fe3O4/PAH以12000rpm离心15分钟，并将最终沉淀物重悬于1mL去离子水中，用于随后的葡萄糖氧化酶(GOx)偶联。
为了制备Fe3O4-GOx纳米系统，基于EDC/NHS共价偶联方法，将GOx共价缀合到PAH的氨基上。将4.1mg EDC和4.5mg NHS添加到1mL 1mg/mL GOx中以激活羧基。30分钟后，将1mLFe3O4/PAH纳米颗粒添加到混合物中，并在室温下以900rpm搅拌24h，以获得Fe3O4-GOx纳米系统。反应完成后，将混合物以12000rpm离心15分钟，用去离子水洗涤沉淀物，最后将Fe3O4-GOx沉淀物重新悬浮在1mL去离子水中，用于随后的表征和应用。通过对得到的Fe3O4-GOx纳米系统进行透射电镜分析可以看出，经过葡萄糖氧化酶修饰后的Fe3O4纳米颗粒仍然保持稳定的球型结构(如图1、2)，同时，伴随着反应的进行，粒径逐渐发生变化，说明GOx被修饰到Fe3O4纳米颗粒表面(如图3a)。对制备过程中纳米颗粒的Zeta电位进行监测，发现由于正电性的PAH涂层的涂覆，Fe3O4纳米颗粒的Zeta电位由负电荷变为正电荷，接着负电性的GOx的修饰使得纳米颗粒的Zeta电位再次变为负电荷(如图3b)，证明GOx被修饰到Fe3O4纳米颗粒表面。
实施例2：
一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统：MnO2-GOx纳米系统制备方法如下：
MnO2纳米粒子的制备：将高锰酸钾按摩尔比1∶1～3分批放入烷基醇聚氧乙烯醚中，控制反应温度在60℃以下，然后搅拌反应3～4小时，加入无水乙醇，继续搅拌30分钟，滤出固体物，再用无水乙醇进行2～3小时回流，洗脱；再次过滤，滤出固体物为粗制二氧化锰，然后置于75～85℃烘干，将烘干后的二氧化锰在400℃的条件下，晶化4小时，即得黑色的纳米二氧化锰的粉末。
MnO2-GOx纳米系统的制备：将0.1g PAH溶解在10mL的1mM NaCl溶液中，并添加1mL的制备好的MnO2纳米颗粒。将混合物在室温下以900rpm搅拌3小时，以获得MnO2/PAH溶液。反应完成后，将获得的MnO2/PAH以12000rpm离心15分钟，并将最终沉淀物重悬于1mL去离子水中，用于随后的葡萄糖氧化酶(GOx)偶联。
为了制备MnO2-GOx纳米系统，基于EDC/NHS共价偶联方法，将GOx共价缀合到PAH的氨基上。将4.1mg EDC和4.5mg NHS添加到1mL 1mg/mL GOx中以激活羧基。30分钟后，将1mLMnO2/PAH纳米颗粒添加到混合物中，并在室温下以900rpm搅拌24h，以获得MnO2-GOx纳米系统。
实施例3：
一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统：CeO2-GOx纳米系统制备方法如下：
CeO2纳米粒子的制备：在15mL二甲苯中加入0.43g醋酸铈和3.25g油胺，在室温下搅拌至颜色变为半透明棕色，然后在氩气环境下加热至90℃。剧烈搅拌，向混合物中注入1mL去离子水。混合物在90℃老化3小时后，颜色变为淡黄色透明溶液，冷却至室温。沉淀和丙酮洗涤三次后，将CeO2纳米粒子分散在氯仿中进行进一步实验。
CeO2-GOx纳米系统的制备：将0.1g PAH溶解在10mL的1mM NaCl溶液中，并添加1mL的制备好的CeO2纳米颗粒。将混合物在室温下以900rpm搅拌3小时，以获得CeO2/PAH溶液。反应完成后，将获得的CeO2/PAH以12000rpm离心15分钟，并将最终沉淀物重悬于1mL去离子水中，用于随后的葡萄糖氧化酶(GOx)偶联。
为了制备CeO2-GOx纳米系统，基于EDC/NHS共价偶联方法，将GOx共价缀合到PAH的氨基上。将4.1mg EDC和4.5mg NHS添加到1mL 1mg/mL GOx中以激活羧基。30分钟后，将1mLCeO2/PAH纳米颗粒添加到混合物中，并在室温下以900rpm搅拌24h，以获得CeO2-GOx纳米系统。
实施例4：
以实施例1制备得到的Fe3O4-GOx纳米系统为例进行一些列的探究：
1、Fe3O4-GOx纳米系统的粒径稳定性测试：
取1mL Fe3O4-GOx纳米颗粒于石英比色皿中，用动态光散射仪(Zetasizer NanoZS90,Malvern)对Fe3O4-GOx纳米颗粒进行7天水合粒径监测并记录数据，实验重复三次。
通过连续7天的监测发现，Fe3O4-GOx纳米系统粒径非常稳定，7天后的粒径与第一天的粒径基本保持一致，证明该系统稳定性较好，没有发生葡萄糖氧化酶的脱落，葡萄糖氧化酶与Fe3O4的结合力较好(如图4a)。
2、Fe3O4-GOx纳米系统的细胞毒性测试：
通过MTT法分析Fe3O4-GOx纳米系统对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(ATCC)的细胞毒性，来评估Fe3O4-GOx纳米系统的生物相容性。简而言之，将细胞接种到96孔板(8000-10000细胞/孔)中并培养过夜。然后用具有不同铁元素浓度(0、5、10、50、100和200μg/mL)的Fe3O4-GOx处理细胞。培养24小时后，加入MTT，继续培养4小时。用酶标仪评估细胞活力。如图4b所示，当Fe3O4-GOx纳米系统浓度高达200μg/mL时，存活细胞仍然高达90％以上，证明该Fe3O4-GOx纳米系统的细胞毒性较弱，可以安全应用。
3、Fe3O4-GOx纳米系统的葡萄糖氧化酶活性测试：
取糖尿病小鼠全血，用血糖检测仪检测血液中血糖浓度，接着将不同铁元素浓度(0、5、10、20、50、100和200μg/mL)的Fe3O4-GOx纳米系统与已知血糖浓度的血液进行培养，再用血糖检测仪对处理后的血液进行检测并记录数据。
过氧化氢(H2O2)分析试剂盒用于确定Fe3O4-GOx纳米系统与葡萄糖(20mM)孵育后产生H2O2的能力，即Fe3O4-GOx纳米系统的葡萄糖氧化酶活性。简而言之，将不同铁元素浓度(0、5、10、20、50、100和200μg/mL)的Fe3O4-GOx纳米系统与20mM葡萄糖孵育5分钟，并将混合物与H2O2检测溶液孵育30分钟。30分钟后，用酶标仪检测反应溶液在560nm处的吸光度。如图5(a)所示，当Fe3O4-GOx纳米系统浓度为200μg/mL时，血液中血糖浓度下降60％，说明Fe3O4-GOx纳米系统可有效消耗血液中的葡萄糖。与此同时，通过双氧水检测试剂盒发现，200μg/mL的Fe3O4-GOx纳米系统可与葡萄糖产生高达120μM的双氧水，如图5(b)所示，有利于后续糖尿病伤口的治疗，再次证明了Fe3O4-GOx纳米系统的葡萄糖氧化酶活性。
4、Fe3O4-GOx纳米系统的类过氧化氢酶活性测试：
通过检测Fe3O4-GOx纳米系统和葡萄糖(20mM)孵育后产生的氧气量，以验证Fe3O4-GOx纳米系统的类过氧化氢酶活性。简而言之，首先用氮气吹扫20mM葡萄糖以除去溶液中的氧气，然后使用不同的样品溶液Fe3O4-GOx(铁元素浓度200μg/mL，GOx浓度180μg/mL)，Fe3O4NPs(200μg/mL)，GOx(180μg/mL)和PBS与20mM葡萄糖溶液共培养，并使用氧气探针(JPBJ-608便携式溶解氧仪，上海雷克斯仪器厂)检测每种混合物中产生的氧气量。
验证Fe3O4-GOx纳米系统在不同pH条件下的类过氧化氢酶活性的方法与上述方法相同。将Fe3O4-GOx(200μg/mL)与不同pH(5.5、6.5、7.5和8.5)的葡萄糖(20mM)孵育后，用氧气探针测量产生的氧气量。如图6(a)所示，Fe3O4-GOx纳米系统可与葡萄糖在6分钟内产生高达14mg/L的氧气，证明Fe3O4-GOx纳米系统优异的类过氧化氢酶活性，与此相反的是，其余三组(PBS、Fe3O4以及GOx)与葡萄糖培养后均无氧气生成，也证明Fe3O4-GOx纳米系统的级联特性。Fe3O4-GOx纳米系统的类过氧化氢酶活性具有pH选择性，如图6(b)所示，在pH＝7.5时，Fe3O4-GOx与葡萄糖产生的氧气最多，证明中性环境有利于Fe3O4-GOx纳米系统表达出类过氧化氢酶活性，但在弱酸性条件下，Fe3O4-GOx与葡萄糖反应后依然有少量氧气生成，为后续Fe3O4-GOx纳米系统治疗由细菌感染引起的弱酸性环境的糖尿病伤口并促进愈合提供了基础。
5、Fe3O4-GOx纳米系统的类过氧化物酶活性测试：
TMB和ABTS被用作检测Fe3O4-GOx纳米系统类过氧化物酶活性的底物。简而言之，将不同的样品溶液Fe3O4-GOx，Fe3O4 NPs，GOx和PBS与20mM葡萄糖溶液共培养，然后向混合物中添加TMB检测溶液并孵育30分钟。将硫酸终止溶液(2M)加入上述混合溶液中，并用酶标仪检测混合物在450nm的吸光度。测定不同pH(5.5、6.5、7.5和8.5)对Fe3O4-GOx纳米系统类过氧化物酶活性影响的方法与上述方法相同。ABTS氧化的验证方法与TMB氧化相同。处理后，用酶标仪测量混合物在734nm的吸光度。实验重复三遍。
如图7所示，(a)为Fe3O4-GOx纳米系统与葡萄糖的混合溶液将TMB由无色变为蓝色，加入停止液后变为黄色，证明Fe3O4-GOx的类过氧化物酶活性；(b)、为Fe3O4-GOx纳米系统与葡萄糖的混合溶液将ABTS氧化，在734nm处有较强的吸收，证明Fe3O4-GOx的类过氧化物酶活性；(c)、在弱酸性条件下(pH＝5.5～6.5)，TMB显色反应最多，证明Fe3O4-GOx在弱酸性条件下生成的羟基自由基最多，可有效杀死细菌。
6、Fe3O4-GOx纳米系统的抗菌性能测试：
使用活/死分析试剂盒评估Fe3O4-GOx纳米系统处理后细菌的存活力。简而言之，将经过Fe3O4-GOx纳米系统(200μg/mL)处理的细菌与包含SYTO 9和碘化丙啶的染料溶液在黑暗中混合30分钟，然后用共聚焦荧光显微镜成像。用PBS处理的细菌用作对照。实验中与Fe3O4-GOx纳米系统共培养的葡萄糖溶液的浓度为20mM。
Fe3O4-GOx纳米系统处理的细菌的形态通过场发射扫描电子显微镜(FESEM)表征。简而言之，用Fe3O4-GOx纳米系统(200μg/mL)处理的细菌在黑暗中用戊二醛(2.5％)固定2h，然后用不同浓度的乙醇溶液(50％，70％，90％和100％)梯度脱水10分钟。将最终获得的脱水细菌样品滴在硅片上，并在氮气干燥和镀铂后用FESEM成像，并将经PBS处理的细菌样品用作对照(葡萄糖溶液浓度为20mM)。
如图8所示，S.aureus与E.coli的死活双染实验，绿色代表活细菌，红色代表死细菌(颜色无法显示)，Fe3O4-GOx与葡萄糖反应后可有效杀死两种细菌，而PBS与葡萄糖的混合溶液却不能，证明Fe3O4-GOx良好的体外抗菌效果；
如图9所示，S.aureus与E.coli的SEM图片，Fe3O4-GOx与葡萄糖反应后使两种细菌形态均发生明显破坏，细胞膜完整性丧失；而对照组中的细菌形态仍然饱满，并无破损，证明Fe3O4-GOx良好的体外抗菌效果。
7、动物水平验证Fe3O4-GOx纳米系统对于糖尿病小鼠伤口微环境的调节性能：
II型糖尿病小鼠(db/db，6周，约40g)购自南京斯科瑞生物技术有限公司，并使其在实验室中适应1周。所有动物实验均按照苏州大学实验动物中心批准的规程进行。将实验小鼠麻醉后，用打孔器在小鼠背部制作长轴约8mm，短轴约6mm的椭圆形伤口，然后用金黄色葡萄球菌过夜感染伤口(108CFU)，建立了感染性糖尿病伤口模型。
如图10，构建糖尿病小鼠伤口细菌感染模型，并分组进行治疗，Fe3O4-GOx治疗组的小鼠在第15天时，伤口已完全愈合，而其余三组伤口处仍有结痂存在，证明Fe3O4-GOx纳米系统具有良好的调节糖尿病伤口微环境的能力并促进伤口愈合，比例尺为5mm。
通过各治疗组小鼠的创面处皮肤的病理切片来看，经Fe3O4-GOx治疗的小鼠创面处皮肤已完全愈合，皮肤分层明显，无破损表现；除此之外，革兰氏染色切片以及创面皮肤细菌培养实验也表现出Fe3O4-GOx治疗组小鼠创面处已无细菌感染，与健康的小鼠无明显区别。与之相对的则是其余三组治疗组小鼠创面处的皮肤仍呈破损状态以及仍然存活大量感染细菌。证明Fe3O4-GOx纳米系统具有良好的调节糖尿病伤口微环境的能力并促进伤口愈合。
葡萄糖氧化酶(GOx)可以将葡萄糖氧化成双氧水，生成的双氧水可以在Fe3/2+的作用下生成羟基自由基，杀死创面部位感染细菌，促进伤口愈合。并且部分Fe3+还可以将生成的双氧水分解为水和氧气，氧气的生成有利于创面的愈合，同时，糖尿病皮肤表面创面部位本身会存在双氧水，使创面部位的皮肤长期处于氧化应激状态，这也是不利于创面愈合的，Fe3/2+可以充分利用原位的双氧水进行抗菌或者产氧，最终达到改善糖尿病创面微环境并且促进伤口愈合的效果。
除此之外，Fe3O4-GOx纳米材料面对不同的糖尿病伤口有着不同的治疗效果。若糖尿病伤口被细菌感染，那么细菌感染部位的弱酸性条件(pH＝5.5～6.5)有利于Fe3/2+将生成或原位的双氧水转化为羟基自由基，更有效地杀死感染部位细菌，有利于伤口愈合。若糖尿病伤口并无细菌感染的情况，伤口处于中性环境(pH＝7.4)，那么Fe3O4-GOx纳米材料中的Fe3+则可以将双氧水分解为氧气，改善乏氧环境，促进伤口的愈合。Fe3O4-GOx纳米材料对于糖尿病伤口灵敏的pH选择性使得该纳米材料在改善糖尿病创面微环境以及促进伤口愈合方面表现出更优异的效果。
该实施例的特点为：①Fe3O4-GOx纳米系统装载的GOx可有效氧化创面部位过高的葡萄糖，并生成双氧水应用于后续创面部位治疗；②GOx氧化葡萄糖产生的双氧水在Fe3O4-GOx纳米系统中的Fe3/2+的作用下，生成可以有效杀死细菌的羟基自由基(·OH)以达到治疗创面部位细菌感染的问题；③与此同时，产生的双氧水在部分Fe3O4-GOx纳米系统中的Fe3+的作用下，被分解成水和氧气，改善创面部位乏氧环境，促进伤口愈合；④创面部位自身产生的双氧水可被Fe3O4-GOx纳米系统应用于伤口抗菌以及生成氧气方面中去，一方面解决了创面部位氧化应激的状态，另一方面加强了②③的应用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统，其特征是，所述纳米系统包括金属氧化物纳米颗粒以及修饰在金属氧化物表面的葡萄糖氧化酶；所述金属氧化物纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒；金属氧化物表面还附有PAH层，所述葡萄糖氧化酶与PAH的氨基共价缀合连接；
所述纳米系统的制备方法包括：将金属氧化物纳米颗粒与PAH溶液混合，在室温下搅拌，反应完成后，将混合溶液离心，使得金属氧化物表面形成PAH涂层，得到金属氧化物/PAH纳米颗粒；然后，添加激活后的葡萄糖氧化酶，与金属氧化物/PAH纳米颗粒混合搅拌，搅拌反应完成后，将混合物离心、洗涤，实现将葡萄糖氧化酶共价缀合到PAH的氨基上；
其中，将葡萄糖氧化酶与金属氧化物/PAH纳米颗粒混合之前，将四甲基氢氧化铵1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐按照一定的质量比添加到葡萄糖氧化酶中，激活葡萄糖氧化酶中的羧基。
2.如权利要求1所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统，其特征是，所述级联类酶纳米系统中，葡萄糖氧化酶的酶活力值范围为30-100 U/mL。
3.如权利要求1所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统，其特征是，所述级联类酶纳米系统中，葡萄糖氧化酶的质量百分比含量为30%-50%。
4.如权利要求1所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统，其特征是，所述级联类酶纳米系统能够在pH为5.5-8.5的缓冲液体系内发挥促进伤口愈合的最佳效果。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，其特征是，包括：将金属氧化物纳米颗粒与PAH溶液混合，使得金属氧化物表面形成PAH涂层；然后，添加葡萄糖氧化酶，将葡萄糖氧化酶共价缀合到PAH的氨基上。
6.如权利要求5所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，其特征是，所述金属氧化物纳米颗粒与PAH溶液混合的过程包括：配置含有PAH的NaCl溶液，所述PAH在NaCl溶液中的浓度为5-20 mg/mL。
7.如权利要求6所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，其特征是，所述PAH在NaCl溶液中的浓度为10 mg/mL。
8.如权利要求5所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，其特征是，金属氧化物与PAH溶液混合后在室温下搅拌，反应完成后，将混合溶液离心得到金属氧化物/PAH纳米颗粒。
9.如权利要求8所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，其特征是，所述搅拌时间为2-5h。
10.如权利要求9所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，其特征是，所述搅拌时间为3h。
11.如权利要求5所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，其特征是，将葡萄糖氧化酶与金属氧化物/PAH纳米颗粒混合之前，激活葡萄糖氧化酶中的羧基。
12.如权利要求11所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，其特征是，激活葡萄糖氧化酶中的羧基的具体过程包括：将四甲基氢氧化铵1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐按照一定的质量比添加到葡萄糖氧化酶中；
所述四甲基氢氧化铵1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐：N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐的质量比为3.0-5.0 mg : 3.3-5.5 mg；
所述葡萄糖氧化酶的浓度范围是50-200 μg/mL；
所述激活反应保持20-60min。
13.如权利要求12所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，其特征是，所述激活反应保持30min。
14.如权利要求12所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，其特征是，激活后的葡萄糖氧化酶与金属氧化物/PAH纳米颗粒混合搅拌18-35h。
15.如权利要求14所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，其特征是，激活后的葡萄糖氧化酶与金属氧化物/PAH纳米颗粒混合搅拌24h。
16.如权利要求14所述的一种促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法，其特征是，搅拌反应完成后，将混合物离心、洗涤。
17.权利要求1-4任一所述促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统和/或权利要求5-16任一所述的促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法制备得到的产品在制备促进糖尿病伤口愈合药物中的应用。
18.权利要求1-4任一所述促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统和/或权利要求5-16任一所述的促进糖尿病伤口愈合的级联类酶纳米系统的制备方法制备得到的产品在制备促进糖尿病伤口愈合的药物注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用。
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