CN109289050A - 一种四氧化三铁/聚吡咯/葡萄糖氧化酶复合多功能纳米诊疗剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种四氧化三铁/聚吡咯/葡萄糖氧化酶复合多功能纳米诊疗剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种四氧化三铁/聚吡咯/葡萄糖氧化酶复合多功能纳米诊疗剂及其制备方法和应用，所述多功能纳米诊疗剂包括由羧基聚吡咯和分散在羧基聚吡咯中的四氧化三铁颗粒组成的基体及修饰于所述基体外表面的葡萄糖氧化酶。
Description
技术领域
本发明涉及一种四氧化三铁/聚吡咯/葡萄糖氧化酶复合多功能纳米诊疗剂及其制备方法和应用，属于纳米诊疗剂技术领域。
背景技术
癌症是临床医学的重大疾病，已经严重威胁人类生命安全，阻碍社会发展。相关报告显示，我国癌症新增病例数高居世界首位，在肝脏、胃、肺、食道等癌症中，我国的新增病例数和死亡病例数均居世界第1位。2015年，我国癌症新发病病例约为429万，年死亡病例约为281万，这意味着平均每天癌症确诊数为11759人，每分钟平均8人会被确诊为癌症。因而，亟需采取积极有效的防治措施遏制癌症的发展势头，并逐步实现对癌症的早发现、早诊断和早治疗，从而最大限度提高患者的生存质量。
近年来，光热治疗(PTT)作为一种新兴的癌症治疗方法因其具有疗效明显、毒副作用小等特点，而备受关注。PTT技术的关键在于开发出高效、稳定和安全的光热剂。聚吡咯(PPy)拥有优异的生物相容性，已被应用于药物传递、组织修复以及生物传感器等领域。另外，PPy具有较好的光热转换性能。在前期的研究中，我们提出了一种叶酸偶联的金纳米粒/聚吡咯/四氧化三铁多功能复合纳米诊疗剂的制备方法(中国专利 CN201410623958.6)。通过PPy可以吸收大量808nm近红外光，能高效地将光能转变为热能，并将热能集中在肿瘤位点，有效地将肿瘤细胞杀死。同时，由于复合纳米粒子中含有金纳米粒和超顺磁性四氧化三铁(Fe3O4)等成分，将实现核磁共振成像(MRI)和光热成像相结合的高分辨率图像。
发明内容
发明要解决的问题：
然而，相比于波长范围为750-1000nm的近红外一区(NIR-I)，波长范围为1000-1350nm的近红外生物窗口II(NIR-II)由于发射波长更长，具有更大皮肤可承受光暴露能量上限，也可显著降低光在穿透生物组织时光散射及自荧光效应的影响，使探测深度更深、空间分辨率更高。关于PPy的PTT效果研究仍主要集中的NIR-I区，而在NIR-II区的研究则少之甚少。此外，单一治疗手段都有不同程度的副作用和局限性，故多学科和规范化的综合治疗成为癌症治疗的必然趋势。目前癌症的治疗策略中，化疗仍然是最常用的联合治疗手段之一。但是事实上，剧烈的毒副作用与较低的化疗治疗效果已成为癌症病人的主要死亡因素之一。
针对上述问题，本发明的目的在于拓展PPy在NIR-II区的光热潜能，并基于肿瘤微环境与正常组织不同，设计仅在肿瘤组织部位高选择性和高特异性的催化药物，从而达到减少正常组织伤害并高选择性杀死肿瘤细胞，实现高效精准治疗。
解决问题的手段：
在此，一方面，本发明提供一种复合多功能纳米诊疗剂，所述复合多功能纳米诊疗剂包括由羧基聚吡咯和分散在所述羧基聚吡咯中的四氧化三铁颗粒组成的基体及修饰于所述基体外表面的葡萄糖氧化酶。
本发明中，四氧化三铁/聚吡咯/葡萄糖氧化酶复合多功能纳米诊疗剂包括羧基聚吡咯、分散在聚吡咯中的四氧化三铁颗粒、及修饰于由羧基聚吡咯和四氧化三铁颗粒组成的基体外表面的葡萄糖氧化酶。上述复合多功能纳米诊疗剂中，PPy可以将NIR I(808nm)和NIR II(1064nm)激光的光能转化热能从而杀死肿瘤。同时，产生的热量还可使模板区域产生热弹性膨胀而产生超声波信号，经接收器处理实现对肿瘤区域的NIR I和NIR II的光声造影。此外，体系中Fe3O4具有T2模式MRI造影能力。因此，四氧化三铁/聚吡咯/葡萄糖氧化酶复合多功能纳米诊疗剂具备MRI和NIR II区光声诊断肿瘤的性能，并可实现对肿瘤的光热-化学动力学的协同治疗。
所述四氧化三铁颗粒与所述羧基聚吡咯的质量比可以为1：(2～6)。
所述复合多功能纳米诊疗剂中，所述葡萄糖氧化酶的含量可以为5～15wt.％。
所述羧基聚吡咯的粒径可以为30～200nm，所述四氧化三铁颗粒的粒径可以为3～15nm。
较佳地，所述四氧化三铁颗粒以原位掺杂的形式分散在羧基聚吡咯中。所述葡萄糖氧化酶可以通过酰胺键将葡萄糖氧化酶中的氨基和羧基聚吡咯的酸基链接修饰于所述基体外表面。
所述复合多功能纳米诊疗剂在去离子水中的水动力学半径可以为80～200nm，优选 80～120，所述复合多功能纳米诊疗剂在生理盐水中的水动力学半径为100～250nm，优选 100～150。
另一方面，本发明提供一种上述复合多功能纳米诊疗剂的制备方法，包括：
将3-羧基吡咯单体和吡咯单体混合均匀，然后与含有三价铁离子的聚乙烯醇溶液混合，冰浴搅拌，在0～10℃下避光静置，制得羧基聚吡咯纳米粒子分散液；
将所述羧基聚吡咯纳米粒子分散液用去离子水和乙醇稀释，于55～65℃搅拌回流反应10～30分钟后，加入氨水溶液，于55～65℃持续搅拌反应10～30分钟，再次加入氨水溶液，反应10～30分钟，将得到的四氧化三铁/羧基聚吡咯复合纳米粒子分散在去离子水中，形成四氧化三铁/羧基聚吡咯复合纳米粒子分散液，通入保护性气体，1～10℃低温保存；以及
将所述四氧化三铁/羧基聚吡咯复合纳米粒子分散液与羧基活化剂混合，室温搅拌活化0.5～ 2小时后，向反应体系中加入葡萄糖氧化酶溶液，继续反应12～24小时，得到所述复合多功能纳米诊疗剂。
所述3-羧基吡咯单体与所述吡咯单体的质量比可以为1：(0.8～1.5)。
所述3-羧基吡咯单体与所述三价铁离子的摩尔比可以为1:(1～5)。
所述含有三价铁离子的聚乙烯醇溶液中三价铁离子含量可以为2.5～4wt.％。聚乙烯醇溶液的浓度可以为5wt.％～10wt.％。所述聚乙烯醇溶液可以为聚乙烯醇水溶液。
所述羧基活化剂可以为质量比为(1～3):(0.5～1)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
保护性气体可以为氩气和氮气等。
含有三价铁离子的聚乙烯醇溶液可以通过将三价铁盐与聚乙烯醇溶液混合得到。三价铁盐可以为三氯化铁、硫酸铁和硝酸铁等。
将所述羧基聚吡咯纳米粒子分散液用去离子水和乙醇稀释时，稀释前后的分散液的体积比可以为1:(5～20)；两次加入的氨水溶液与稀释后的分散液的体积比分别可以为1: (10～30)。氨水溶液的浓度可以为0.5～1wt.％。
较佳地，按照四氧化三铁/羧基聚吡咯复合纳米粒子、羧基活化剂和葡萄糖氧化酶的质量比为(5～20):(1.5～4.2):1的比例，向反应体系中加入葡萄糖氧化酶溶液。
又一方面，本发明还提供一种上述复合多功能纳米诊疗剂在制备成像剂中的应用，上述复合多功能纳米诊疗剂可用于肿瘤的核磁共振成像、NIR II区光声成像等。
又一方面，本发明还提供上述复合多功能纳米诊疗剂在制备肿瘤的光热和化学动力学协同治疗药物中的应用，上述复合多功能纳米诊疗剂可用于NIR II区光热和化学动力学协同治疗。
本发明中，一方面通过系统性地调控有机/无机杂化材料体系，开发PPy同时跨越NIR-I区和NIR-II区作为高效光热剂和光声造影剂的潜能，另一方面该纳米诊疗剂通过科学合理地组合生物活性酶和无机纳米酶，连锁且高效地进行生物酶催化反应和芬顿(Fenton)反应。首先，葡萄糖氧化酶(GOD)选择性地催化肿瘤内的葡萄糖生成过氧化氢(H2O2)与葡萄糖酸。H2O2作为下一步Fenton反应的底物，在酸性条件下被体系中的 Fe3O4催化生成高毒性的活性氧物种羟基自由基(OH·)，诱导肿瘤细胞凋亡，而不对正常的组织和器官造成损害。同时，PPy的光热效应可以加快芬顿反应，提高OH·的产生水平。此外，羧基PPy(PPy-COOH)基底和Fe3O4的原位掺杂分别赋予其NIR-II区光声成像 (PAI)和磁共振(MRI)成像导航的功能，最终实现MRI/PAI双模态导航下对肿瘤的高效协同治疗。
附图说明
图1是实施例1中Fe3O4@PPy@GOD多功能复合纳米诊疗剂的透射电镜(TEM) 照片；
图2示出实施例1中Fe3O4@PPy@GOD多功能复合纳米诊疗剂的元素分析能谱；
图3示出实施例1中Fe3O4@PPy@GOD多功能复合纳米诊疗剂在水、生理盐水和细胞培养基中的粒径；
图4示出实施例2中Fe3O4@PPy@GOD多功能复合纳米诊疗剂的核磁成像效果(上图示出不同Fe元素浓度的诊疗剂溶液的MR成像，下图示出MRI性能与Fe元素浓度的关系)；
图5示出实施例3中Fe3O4@PPy@GOD多功能复合纳米诊疗剂的NIR I和NIR II光声成像效果(图5上图示出不同Fe3O4@PPy@GOD多功能复合纳米诊疗剂浓度的光声成像，下图示出Fe3O4@PPy@GOD多功能复合纳米诊疗剂浓度和NIR I区、NIR II区均信号值的关系)；
图6(a)和图6(b)分别示出实施例4中不同浓度Fe3O4@PPy@GOD的多功能复合纳米诊疗剂分散液在功率为1.0W/cm2的NIR I区(808nm)和NIR II区(1064nm)激光辐射下液体温度随辐照时间的变化图；
图7(a)示出实施例4中在NIR I区(808nm)和NIR II区(1064nm)功率密度为 1.0W/cm2近红外激光照射下，荷瘤Balb/C裸鼠经尾静脉注射100μL生理盐水、混合了 Fe3O4@PPy-COOH的生理盐水、或混合了Fe3O4@PPy@GOD多功能复合纳米诊疗剂的生理盐水的热成像照片；图7(b)示出与图7(a)相对应实施例2中荷瘤鼠在注射生理盐水、混合了Fe3O4@PPy-COOH的生理盐水、或混合了Fe3O4@PPy@GOD多功能复合纳米诊疗剂的生理盐水后，在NIR I区(808nm)和NIR II区(1064nm)功率密度为1.0 W/cm2近红外激光照射下，肿瘤区域的温度变化情况；
图8实施例5中经不同治疗后裸鼠的肿瘤体积随时间的变化关系(图中的“对照组”、“808nm”、“GOD”、“1064nm”、“Fe3O4@PPy”、“Fe3O4@PPy+808nm”、“Fe3O4@PPy +1064nm”、“Fe3O4@PPy@GOD”、“Fe3O4@PPy@GOD+808nm”、“Fe3O4@PPy@GOD +1064nm”分别表示空白对照、近红外I区808nm激光照射组、近红外II区1064nm激光照射组、仅注射Fe3O4@PPy生理盐水分散液组、注射Fe3O4@PPy生理盐水分散液后近红外 I区808nm激光照射组、注射Fe3O4@PPy生理盐水分散液后近红外II区1064nm激光照射组、仅注射Fe3O4@PPy@GOD生理盐水分散液组、注射Fe3O4@PPy@GOD生理盐水分散液后近红外I区808nm激光照射组、注射Fe3O4@PPy@GOD生理盐水分散液后近红外II区 1064nm激光照射组)。
具体实施方式
以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
本发明涉及一种四氧化三铁/聚吡咯/葡萄糖氧化酶复合多功能纳米诊疗剂的制备方法和应用。更具体地涉及将四氧化三铁、聚吡咯和生物活性的葡萄糖氧化酶有机组合起来，具有磁靶向性、光声成像、核磁共振成像、光热和化学动力学联合治疗的多功能性。可用于人体或者其他哺乳动物肿瘤或癌症的诊断和高效治疗。所述多功能纳米诊疗剂是由四氧化三铁和羧基聚吡咯组成的复合纳米粒子作为基体，选用葡萄糖氧化酶进行表面修饰后，得到粒径为80～200纳米的复合粒子。本发明所制备的多功能复合纳米诊疗剂具有肿瘤靶向性强、成像效果好以及疗效显著等优点，可用于人或者其他哺乳动物的肿瘤或癌症的光热治疗和化学动力学治疗的联合治疗，也可对病变组织进行光声和核磁共振成像诊断，对发展多模态影像介导的肿瘤热疗和化学动力学协同治疗的材料具有重要意义。
本发明的四氧化三铁/聚吡咯/葡萄糖氧化酶复合多功能纳米诊疗剂(可简称为“Fe3O4@PPy@GOD复合多功能诊疗剂”或“Fe3O4@PPy@GOD”)可以包括：羧基聚吡咯 (PPy-COOH)、分散于PPy-COOH上的四氧化三铁(Fe3O4)颗粒及外面表面的葡萄糖氧化酶(GOD)的修饰，葡萄糖氧化酶修饰于由羧基聚吡咯和四氧化三铁颗粒组成的基体外表面。Fe3O4纳米粒子与PPy-COOH的质量比可以为1：(2～6)，优选1：(2～4)。Fe3O4纳米粒子与PPy-COOH的质量比为1：(2～6)时，具有磁性的同时也同时兼具材料的分散性。 GOD的含量可以为5～15wt.％，该含量范围内可高效开启葡萄糖的连锁催化效应的。
以下，示意性说明本发明的四氧化三铁/聚吡咯/葡萄糖氧化酶复合多功能纳米诊疗剂及其制备方法。
首先，将3-羧基吡咯单体(Py-COOH)和吡咯单体(Py)混合均匀，然后与含有三价铁离子的聚乙烯醇溶液混合，冰浴搅拌，在0～10℃下避光静置，从而实现三价铁离子介导的聚吡咯聚合，避免光和高温的影响。由此，制得PPy-COOH纳米粒子溶液。3-羧基吡咯单体与吡咯单体的质量比可以为1：(0.8～1.5)，该含量范围既可以实现聚吡咯的羧基修饰，同时不会因为3-羧基吡咯的过多引入而影响吡咯的光热性能。3-羧基吡咯单体与三价铁离子的摩尔比可以为1:(1～5)。
含有三价铁离子的聚乙烯醇溶液中三价铁离子含量可以为2.5～4wt.％。聚乙烯醇溶液可以使用浓度为5wt.％～10wt.％的聚乙烯醇溶液。所述聚乙烯醇溶液可以为聚乙烯醇水溶液。含有三价铁离子的聚乙烯醇溶液可以通过将三价铁盐与聚乙烯醇溶液混合得到。三价铁盐可以为三氯化铁、硫酸铁和硝酸铁等。在一个示例中，将Py-COOH和Py按质量比为1： (0.8～1.5)的比例混合均匀，缓慢加入到含有2.5～4％Fe3+的浓度为5wt.％～10wt.％的聚乙烯醇溶液中，冰浴搅拌，4℃避光静置，反应结束制得PPy-COOH纳米粒子溶液。其中，“缓慢加入”是指逐滴加入，速率约为20μL/s。
接着，将PPy-COOH纳米粒子溶液用去离子水和乙醇稀释，从而将纳米粒子分散，避免浓度过大而团聚。将PPy-COOH纳米粒子分溶液用去离子水和乙醇稀释时，稀释前后的溶液的体积比可以为1:(5～20)。去离子水和乙醇稀释的体积比可以为(8～12)：(1～5)。在一个示例中，取制备的PPy-COOH纳米粒子溶液加入到圆底烧瓶中，加入8～12mL去离子水和1～5mL无水乙醇，搅拌均匀。
接着，将稀释后的PPy-COOH纳米粒子溶液于55～65℃搅拌回流反应10～30分钟后，加入氨水溶液，于55～65℃持续搅拌反应10～30分钟，再次加入氨水溶液，反应 10～30分钟，反应结束。由此，得到Fe3O4@PPy-COOH复合纳米粒子。两次加入的氨水溶液的浓度各自可以为0.5～1wt.％。两次加入的氨水溶液的体积比可以为(0.5～1)：(0.5～1)。两次加入的氨水溶液与稀释后的溶液的体积比分别可以为1:(10～30)。两次加入的氨水溶液的浓度可以相同，也可以不同。可采用油浴锅进行加热。反应过程中可以通入氩气、氮气等惰性气体进行气体保护。
在一个示例中，搅拌回流反应10～30min后，快速加入浓度为0.5～1％的氨水溶液，55～65℃持续搅拌反应10～30min，再快速加入浓度为0.5～1％的氨水溶液，反应结束。其中，“快速加入”是指注射速率至少为1mL/s。
可以通过离心洗涤得到Fe3O4@PPy-COOH复合纳米粒子(可简称为“Fe3O4@PPy-COOH”)。可以将得到的Fe3O4@PPy-COOH复合纳米粒子分散在去离子水中，形成一定浓度的Fe3O4@PPy-COOH复合纳米粒子溶液，通入保护性气体，1～10℃低温保存。保护性气体可以为氩气和氮气等。Fe3O4@PPy-COOH复合纳米粒子溶液浓度可以为5～40mg/mL。该Fe3O4@PPy-COOH复合纳米粒子中，Fe3O4纳米粒子以原位掺杂的形式分散在PPy- COOH中。PPy-COOH的粒径为30～200nm，Fe3O4纳米粒子的粒径为3～15nm。
接着，将一定浓度的Fe3O4@PPy-COOH复合纳米粒子溶液与羧基活化剂混合，室温搅拌活化0.5～2小时后，向反应体系中加入GOD溶液，继续反应12～24小时。由此，得到Fe3O4@PPy@GOD复合多功能纳米诊疗剂。羧基活化剂为质量比为(1～3)：(0.5～1)的 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。GOD溶液可以为GOD水溶液，浓度可以为0.5～5mg/mL。
可以在Fe3O4@PPy-COOH复合纳米粒子溶液与羧基活化剂混合后，将pH值调至 7～9，从而利于羧基负离子进攻缩合试剂，利于GOD的连接。可以按照Fe3O4@PPy-COOH 复合纳米粒子、羧基活化剂和葡萄糖氧化酶的质量比为(5～20):(1.5～4.2):1的比例，向反应体系中加入葡萄糖氧化酶溶液，该比例范围可实现葡萄糖氧化酶介导的连锁催化芬顿反应的进行。羧基活化剂采用EDC、NHS的情况下，Fe3O4@PPy-COOH、EDC、NHS和 GOD的质量比可以为5～20:1～3:0.5～1.2:1。
可以通过离心洗涤得到Fe3O4@PPy@GOD。可以将其分散在磷酸盐缓冲液(PBS) 中，0～10℃(例如4℃)保存待用。
由上述方法制备的Fe3O4@PPy@GOD复合多功能纳米诊疗剂中，Fe3O4纳米粒子与PPy-COOH的质量比为1：(2～6)，优选为1：(2～4)。GOD的含量可以为5～15％。本发明 Fe3O4@PPy@GOD复合多功能纳米诊疗剂为纳米尺寸。PPy-COOH的粒径为30～200nm，所述Fe3O4纳米粒子的粒径为3～15nm。该多功能纳米诊疗剂在去离子水中的水动力学半径可以为80～200nm，优选80～150nm，所述多功能纳米诊疗剂在生理盐水中的水动力学半径为100～250nm。因此，Fe3O4@PPy@GOD复合多功能纳米诊疗剂具有较好的胶体稳定性。
Fe3O4@PPy@GOD复合多功能纳米诊疗剂中，PPy可以将NIR I(808nm)和NIR II(1064nm)激光的光能转化热能从而杀死肿瘤。同时，产生的热量还可使模板区域产生热弹性膨胀而产生超声波信号，经接收器处理实现对肿瘤区域的NIR I和NIR II的光声造影。此外，体系中Fe3O4具有T2模式MRI造影能力。GOD的引入则赋予了 Fe3O4@PPy@GOD复合多功能纳米诊疗剂的协同催化的性能。因此，Fe3O4@PPy@GOD复合多功能纳米诊疗剂具备MRI和NIR II区光声诊断肿瘤的性能，并可实现对肿瘤的光热-化学动力学的协同治疗。
在本发明中，一方面通过系统性地调控有机/无机杂化材料体系，开发出的PPy作为高效光热剂可同时跨越NIR-I和近红外生物窗口II(1000-1350nm)区，另一方面通过组合生物活性酶和无机纳米酶，高效地开启连锁生物酶催化反应和芬顿反应产生OH·杀死肿瘤细胞。迄今为止，本领域尚未开发基于PPy能够同步实现PTT和CDT协同治疗的诊疗剂，而本发明填补了这一空白。本发明的制备方法具有本发明设备装置简单，操作简便，有助于工业化生产。
本发明还提供上述基于Fe3O4@PPy@GOD的多功能复合纳米诊疗剂在用于肿瘤的核磁共振成像、NIR II区光声成像、NIR II区光热和化学动力学协同治疗等的应用。
在一个实施方式中，将本发明所述的Fe3O4@PPy@GOD复合多功能纳米诊疗剂分散于生理盐水注射液中，取100uL注射到荷4T1乳腺癌肿瘤模型的Balb/c裸鼠的肿瘤内。通过功率密度为1W/cm2、波长为NIR I(808nm)或NIR II(1064nm)的近红外激光照射肿瘤10分钟。实验结果表明，仅注射生理盐水组中荷瘤鼠鼠肿瘤增长明显(如图8)。注射含Fe3O4@PPy@GOD复合多功能纳米诊疗剂的生理盐水的组与注射含Fe3O4@PPy- COOH纳米粒子的生理盐水的组予以激光照射可以有效抑制小鼠的肿瘤生长。NIR II区激光照射的效果要优于NIR I区激光照射，但Fe3O4@PPy@GOD复合多功能纳米诊疗剂对肿瘤的生长抑制更加明显，这一实验结果表明NIR II区的功能开发和化学动力学协同治疗的引入能够显著提高放疗的疗效。
本发明的优点：
本发明涉及的实验装置简易，操作简单，制备周期快，有利于大批量生产；
本发明制备的多功能复合纳米诊疗剂具备NIR II光热治疗，核磁成像，NIR II光声成像等特点，可实现肿瘤的诊疗一体化；
本发明制备的多功能复合纳米诊疗剂，磁靶向性强，针对性高，能有望提高肿瘤的治疗效果；
本发明制备的多功能复合纳米诊疗剂具有生物相容性好，稳定性高，灵敏性强等特点。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1：
首先，将3-羧基吡咯单体(Py-COOH)和吡咯单体(Py)按质量比为1：1的比例混合均匀，缓慢加入到含有3.5％三价铁离子的浓度为8％的聚乙烯醇溶液中，冰浴搅拌，4℃避光静置，反应结束制得PPy-COOH纳米粒子溶液，混合时Py-COOH与三价铁离子的摩尔比为1：2。取制备的PPy-COOH纳米粒子溶液加入到圆底烧瓶中，加入10mL去离子水和 3mL无水乙醇，搅拌均匀。置于60℃的油浴锅中，搅拌回流反应20min后，快速加入 1mL浓度为1％的氨水溶液，60℃持续搅拌反应30min，再快速加入1mL浓度为1 ％的氨水溶液，反应30分钟，气体保护结束反应。离心洗涤得到Fe3O4@PPy-COOH复合纳米粒子，将其分散在去离子水中，氩气保护，4℃低温保存。取一定浓度的Fe3O4@PPy- COOH溶液，称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入其中，室温搅拌活化0.5h后，向反应体系中加入GOD溶液，其中 Fe3O4@PPy-COOH、EDC、NHS和GOD的质量比为10:1:0.5:1。继续反应12h，离心洗涤得到Fe3O4@PPy@GOD，将其分散在PBS中，4℃保存待用。制得的Fe3O4@PPy@GOD中，羧基聚吡咯的粒径为60nm，四氧化三铁颗粒的粒径为5nm，Fe3O4@PPy@GOD在去离子水中的水动力学半径为100nm，在生理盐水中的水动力学半径为120nm。
图1为本实施例Fe3O4@PPy@GOD复合纳米诊疗剂的TEM图片。从图1可以看出，Fe3O4纳米颗粒分散于球形PPy-COOH纳米球上且结合紧密，外表面均匀包覆一层 GOD。
图2为本实施例Fe3O4@PPy@GOD复合纳米诊疗剂的Fe、N、C和O元素的分布图，表明各组分间的有机结合。
图3为是本实施例Fe3O4@PPy@GOD的多功能复合纳米诊疗剂在水、生理盐水和细胞培养基中的粒径分布，可以看出粒子具有很好的稳定性和分散性，可以长期保存。
实施例2
材料自身的磁共振成像性能：将Fe3O4@PPy@GOD多功能复合纳米诊疗剂配成Fe元素浓度分别为1.4、0.7、0.35、0.18和0.09μM的溶液，分别置于1.5mL的玻璃小瓶中，使用核磁成像系统进行MR成像实验。计算T1、T2弛豫时间。从元素浓度的升高图4中可以看出，随着Fe元素浓度的升高，MR图片呈变暗趋势，说明其MRI性能与Fe元素浓度相关，在实验浓度范围内与Fe元素浓度显示出了良好的线性关系，显示出了良好的核磁造影性能，表明在磁共振造影成像方面的具有良好的应用前景。
实施例3
材料自身的光声成像性能：将Fe3O4@PPy@GOD的多功能复合纳米诊疗剂配成浓度分别为24、12、6和3mg/mL的溶液。注射入内径约为1mm的透明塑料细管中，使用小动物光声成像系统进行光声成像实验。得到图像后，选择成像的区域计算光声信号值，得材料的光声信号值。从图5可以看出，随着材料浓度的升高，光声造影信号值呈上升趋势，说明其光声造影性能与浓度相关，在实验浓度范围内与Fe3O4@PPy@GOD的多功能复合纳米诊疗剂浓度和NIR I区、NIR II区均信号值显示出了良好的线性关系，在光声造影成像方面的具有良好的应用前景。
实施例4
将Fe3O4@PPy@GOD的多功能复合纳米诊疗剂分散于装有1mL蒸馏水的玻璃比色皿中，得诊疗剂的浓度为800、400、200、100、50和25μg/mL的悬浮液，取蒸馏水作为对照。分别用功率密度为1.0W/cm2的NIR I(808nm)和NIR II(1064nm)波长的近红外激光照射，通过红外相机记录水温随时间的变化。为检测材料的光热稳定性，重复照射材料次，记录每次照射后水的温度变化值。
取荷瘤裸鼠(肿瘤直径约为0.6-1cm)，分别通过尾静脉注射100μL的 Fe3O4@PPy@GOD纳米粒的生理盐水分散液和生理盐水。然后，分别用NIR I(808nm) 和NIR II(1064nm)波长的近红外激光(功率密度为1.0W/cm2)照射肿瘤部位，通过红外相机记录肿瘤温度随时间的变化情况。由图5可以看出，在非常低的浓度下， Fe3O4@PPy@GOD纳米粒可以有效吸收NIR I(808nm)和NIR II(1064nm)的近红外光，并以热量的形式转换，进而其光热性能。
图6(a)和图6(b)为功率密度为1.0W/cm2的NIR I和NIR II近红外激光照射下，浓度分别为800、400、200和100μg/mL的Fe3O4@PPy@GOD纳米诊疗剂分散液水温的变化情况。很明显，相同功率密度的激光照射下，Fe3O4@PPy@GOD纳米诊疗剂能更加有效地进行光热转换而升高水温。蒸馏水不具备光热转换的能力，而经过10分钟照射后，NIR II(1064nm)照射的Fe3O4@PPy@GOD纳米粒可以使蒸馏水温度升高至62℃。而在相同浓度下，NIR I(808nm)照射的Fe3O4@PPy光热转换能力略低于NIR I区。此外， Fe3O4@PPy@GOD纳米粒显示出了良好的热稳定性。
图7(a)示出实施例4中在NIR I区(808nm)和NIR II区(1064nm)功率密度为1.0W/cm2近红外激光照射下，荷瘤Balb/C裸鼠经尾静脉注射100μL生理盐水、混合了Fe3O4@PPy-COOH的生理盐水、或混合了Fe3O4@PPy@GOD多功能复合纳米诊疗剂的生理盐水的热成像照片；图7(b)示出实施例2中荷瘤鼠在注射生理盐水、混合了 Fe3O4@PPy-COOH的生理盐水、或混合了Fe3O4@PPy@GOD多功能复合纳米诊疗剂的生理盐水后，在NIR I区(808nm)和NIR II区(1064nm)功率密度为1.0W/cm2近红外激光照射下，肿瘤区域的温度变化情况。同样地，生理盐水在荷瘤鼠体内仍不具备光热转换能力，而Fe3O4@PPy@GOD则可以有效地升高肿瘤区域的温度，特别值得一提的是，NIR II(1064nm)激光照射10分钟后肿瘤区域温度即可以升高至60℃，而NIR I(808 nm)激光照射10分钟温度升至50℃，进一步证明了Fe3O4@PPy@GOD纳米诊疗剂在 NIR II区有很好的光热转换能力。
实施例5
将Fe3O4@PPy@GOD复合多功能纳米诊疗剂分散于生理盐水注射液中，取100uL通过尾静脉注射到荷4T1乳腺癌肿瘤模型Balb/c裸鼠内。通过功率密度为1W/cm2、波长为 NIR I(808nm)或NIR II(1064nm)的近红外激光照射肿瘤10分钟。实验结果表明，注射Fe3O4@PPy和Fe3O4@PPy@GOD纳米粒子荷瘤鼠肿瘤体积的增长受到明显抑制。而同等条件下仅注射生理盐水组中荷瘤鼠肿瘤增长明显。同一功率激光照射下，NIR II(1064 nm)比NIR I(808nm)的治疗效果更佳。值得注意的是，Fe3O4@PPy@GOD复合多功能纳米诊疗剂组比Fe3O4@PPy-COOH组可以更加彻底抑制小鼠的肿瘤生长，这一实验结果表明NIR II区的功能开发以及化学动力学协同治疗的引入能够显著提高放疗的疗效。
本发明工艺简单，产品易制备；GOD的引入赋予了纳米诊疗剂连锁催化性能；Fe3O4@PPy@GOD纳米诊疗剂同时拥有NIR I区和NIR II区光声和MR成像的功效；此外，Fe3O4@PPy@GOD纳米诊疗剂在NIR II有很好的吸收，可同步实现肿瘤的光热-化学动力学协同治疗，对发展可准确诊断并实现肿瘤的新型光热协同治疗的材料具有重要意义。
实施例6
首先，将3-羧基吡咯单体(Py-COOH)和吡咯单体(Py)按质量比为1：1.5的比例混合均匀，缓慢加入到含有3.5％三价铁离子的浓度为8％的聚乙烯醇溶液中，冰浴搅拌，4℃避光静置，反应结束制得PPy-COOH纳米粒子溶液，混合时Py-COOH与三价铁离子的摩尔比为1：5。取制备的PPy-COOH纳米粒子溶液加入到圆底烧瓶中，加入10mL去离子水和 3mL无水乙醇，搅拌均匀。置于60℃的油浴锅中，搅拌回流反应20min后，快速加入 1mL浓度为1％的氨水溶液，60℃持续搅拌反应30min，再快速加入1mL浓度为1 ％的氨水溶液，反应30分钟，结束反应。离心洗涤得到Fe3O4@PPy-COOH复合纳米粒子，将其分散在去离子水中，氩气保护，4℃低温保存。取一定浓度的Fe3O4@PPy-COOH 溶液，称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)加入其中，室温搅拌活化30分钟后，向反应体系中加入GOD溶液，其中Fe3O4@PPy-COOH、EDC、NHS和GOD的质量比为20:3:1.2:1。继续反应12h，离心洗涤得到Fe3O4@PPy@GOD，将其分散在PBS中，4℃保存待用。制得的Fe3O4@PPy@GOD 中，羧基聚吡咯的粒径为180nm，四氧化三铁颗粒的粒径为15nm，Fe3O4@PPy@GOD在去离子水中的水动力学半径为200nm，在生理盐水中的水动力学半径为250nm。
实施例7
首先，将3-羧基吡咯单体(Py-COOH)和吡咯单体(Py)按质量比为1：1.2的比例混合均匀，缓慢加入到含有3.5％三价铁离子的浓度为8％的聚乙烯醇溶液中，冰浴搅拌，4℃避光静置，反应结束制得PPy-COOH纳米粒子溶液，混合时Py-COOH与三价铁离子的摩尔比为1：2.5。取制备的PPy-COOH纳米粒子溶液加入到圆底烧瓶中，加入10mL去离子水和 3mL无水乙醇，搅拌均匀。置于60℃的油浴锅中，搅拌回流反应20min后，快速加入 1mL浓度为1％的氨水溶液，60℃持续搅拌反应20min，再快速加入1mL浓度为1 ％的氨水溶液，反应20分钟，结束反应。离心洗涤得到Fe3O4@PPy-COOH复合纳米粒子，将其分散在去离子水中，氩气保护，4℃低温保存。取一定浓度的Fe3O4@PPy-COOH 溶液，称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)加入其中，室温搅拌活化20分钟后，向反应体系中加入GOD溶液，其中 Fe3O4@PPy-COOH、EDC、NHS和GOD的质量比为12.5:1.5:0.8:1。继续反应12h，离心洗涤得到Fe3O4@PPy@GOD，将其分散在PBS中，4℃保存待用。制得的Fe3O4@PPy@GOD 中，羧基聚吡咯的粒径为110nm，四氧化三铁颗粒的粒径为9nm，Fe3O4@PPy@GOD在去离子水中的水动力学半径为140nm，在生理盐水中的水动力学半径为180nm。
Claims (10)
1.一种复合多功能纳米诊疗剂，其特征在于，所述复合多功能纳米诊疗剂包括由羧基聚吡咯和分散在所述羧基聚吡咯中的四氧化三铁颗粒组成的基体及修饰于所述基体外表面的葡萄糖氧化酶。
2.根据权利要求1所述的复合多功能纳米诊疗剂，其特征在于，所述四氧化三铁颗粒与所述羧基聚吡咯的质量比为1：（2～6）；所述复合多功能纳米诊疗剂中，所述葡萄糖氧化酶的含量为 5～15 wt.%。
3.根据权利要求1或2所述的复合多功能纳米诊疗剂，其特征在于，所述羧基聚吡咯的粒径为30～200 nm，所述四氧化三铁颗粒的粒径为3～15 nm。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的复合多功能纳米诊疗剂，其特征在于，所述复合多功能纳米诊疗剂在去离子水中的水动力学半径为80～200 nm，所述复合多功能纳米诊疗剂在生理盐水中的水动力学半径为100～250 nm。
5.一种权利要求1至4中任一项所述的复合多功能纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，包括：
将3-羧基吡咯单体和吡咯单体混合均匀，然后与含有三价铁离子的聚乙烯醇溶液混合，冰浴搅拌，在0～10 ℃下避光静置，制得羧基聚吡咯纳米粒子分散液；
将所述羧基聚吡咯纳米粒子分散液用去离子水和乙醇稀释，于 55～65 ℃搅拌回流反应 10～30 分钟后，加入氨水溶液，于55～65 ℃持续搅拌反应 10～30分钟，再次加入氨水溶液，反应10～30分钟，将得到的四氧化三铁/羧基聚吡咯复合纳米粒子分散在去离子水中，形成四氧化三铁/羧基聚吡咯复合纳米粒子分散液，通入保护性气体，1～10 ℃ 低温保存；以及将所述四氧化三铁/羧基聚吡咯复合纳米粒子分散液与羧基活化剂混合，室温搅拌活化0.5～2 小时后，向反应体系中加入葡萄糖氧化酶溶液，继续反应12～24小时，得到所述复合多功能纳米诊疗剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述3-羧基吡咯单体与所述吡咯单体的质量比为1：（0.8～1.5）；所述3-羧基吡咯单体与所述三价铁离子的摩尔比为1:（1～5）。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，按照四氧化三铁/羧基聚吡咯复合纳米粒子、羧基活化剂和葡萄糖氧化酶的质量比为（5～20）:（1.5～4.2）:1的比例，向反应体系中加入葡萄糖氧化酶溶液。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述羧基活化剂为质量比为（1～3）:（0.5～1）的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺。
9.一种权利要求1至4中任一项所述的复合多功能纳米诊疗剂在制备成像剂中的应用。
10.一种权利要求1至4中任一项所述的复合多功能纳米诊疗剂在制备肿瘤的光热和化学动力学协同治疗药物中的应用。
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