CN117731693A - 基于掺杂的多酶活性纳米材料在治疗炎症性疾病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于掺杂的多酶活性纳米材料在治疗炎症性疾病中的应用。本发明利用不同元素掺杂制备具有多酶活性的纳米药物用于炎症性疾病的缓解与治疗,基于SOD和CAT活性清除感染部位的ROS;基于POD活性消除致病原;融入炎症靶向的细胞膜,实现纳米药物的炎症部位靶向性聚集,提高药物利用效率;用于炎症性疾病的治疗,包括炎症反应和致病原的清除,以实现对感染性炎症疾病如肺炎,尿道炎,肠胃炎等治疗作用。
Description
技术领域
本发明属于涉及生物医学、材料科学与工程、药学等多个交叉领域,具体涉及基于掺杂的多酶活性纳米材料在治疗炎症性疾病中的应用。
背景技术
炎症是生命体的一种自然防御反应,旨在恢复生命体健康。机体的炎症性反应在可控范围是有益处的,但炎症性反应超过一定阈值,就会促发炎症性疾病。炎症性疾病包括两种类型,一种是自身性炎症疾病,由机体本身一些疾病所致,表现为在没有抗原刺激下而出现的炎症性反应,包括类风湿性关节炎,原发性胆汁性肝硬化;另一种是非自身炎症性疾病,由外源的致病微生物所致,包括各种致病微生物所致的肺炎、尿道炎以及肠胃炎等。在非自身性炎症中,致病微生物通常包括细菌类致病原、病毒类致病原以及其他类型的致病微生物;生命体在遭受这些致病微生物入侵后会产生一系列的抵抗性反应,包括大量活性氧分子的产生、大量免疫细胞的感染部位聚集和大量细胞因子释放,这些反应持续发展进而导致了炎症性疾病的发生。如尿路感染所致的尿道炎,会引发尿道黏膜增生,导致尿路梗阻,甚至促发严重的肾炎、膀胱炎;肠道感染所致的肠道炎,会造成肠道消化能力下降与黏膜出血等;上呼吸道感染所致的肺炎,若不及时进行控制会促发不可逆的肺损伤和呼吸衰竭。
近年来上呼吸道感染促发的肺炎呈上涨趋势。感染性肺炎,尤其是新型冠状病毒感染,由于发展迅速往往因为未及时得到诊治而诱发的急性肺损伤(ALI)甚至导致呼吸衰竭,特别是幼儿和老人。伴随急性肺损伤发生,会造成一系列难以逆转的损伤,包括肺泡上皮和毛细血管内皮细胞损伤、肺水肿和低氧血症,这些损伤与过多的活性氧(ROS)和炎症反应引起的细胞因子风暴直接相关。因此,一系列药物被用于预防和治疗肺损伤,包括清除ROS的抗氧化剂(如姜黄素、柚皮素和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制剂),吸入血管扩张气体(如一氧化氮(NO)以缓解低氧血症,甚至注射糖皮质激素以减少细胞因子。然而,基于肺损伤发展迅速、恶化程度高等特点,以上常规类治疗药物存在一定的弊端,如ROS的抗氧化剂(如姜黄素、柚皮素和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制剂)由于血液药物利用率低,且不具有肺部靶向性,因而不能迅速的清除ROS;吸入血管扩张气体(如一氧化氮(NO)在一定程度上能够缓解肺部的低氧血症,但需要持续的吸入,且对病原菌无抵御作用,一般只作为辅助治疗方式;抗细胞因子类一些药物也存在非靶向性,相对效率低下;此外,进行肺损伤治疗同时还需要额外给予抗病毒或抗生素类药物以抵抗外援致病物,抗生素的大量使用会致使耐药致病原的产生,也会给后续治疗带来一定的难度,因此,开发一种快速消除炎症和抵抗病原菌的药物是极其有必要的。
基于纳米科学和纳米技术研究的深入,纳米材料独特性与潜在应用被挖掘,因而随之发展而来纳米医用材料/药物逐渐成为研究热点之一。纳米医用材料/药物已被广泛用于生物医学领域涉及到分子检测、成像、药物递送等,能够大大提升生物医学检测灵敏度与药物利用效率。纳米酶,作为一种具有类酶活性的纳米材料,2022年被国际纯粹和应用化学联合会评为“十大化学新兴技术”之一。纳米酶的类酶活性包括超氧化物歧化酶活性(SOD),过氧化氢酶活性(CAT),过氧化物酶活性(POD),氧化物酶活性(OXD)以及谷胱甘肽过氧化物酶活性(GPx)等,利用超氧化物歧化酶活性(SOD)和过氧化氢酶活性(CAT)可以催化清除活性氧物种;利用过氧化物酶活性(POD)和氧化物酶活性(OXD)催化底物过氧化/氧化,产生氧化应激。基于以上这些特性,纳米酶已被应用于一些疾病的治疗,如ROS清除类的纳米酶被用于如炎症性肠病、动脉粥样硬化治疗、急性肾损伤、类风湿性关节炎治疗等;具有过氧化物酶活性(POD)和氧化物酶活性(OXD)等活性纳米酶,基于催化产生的高水平氧化应激被用于抵抗细菌,肿瘤细胞杀伤等。但对感染性炎症而言如感染性肺炎,感染性尿道炎以及感染性肠胃炎等,一方面是要清除炎症,另一方面是抵抗致病源,且纳米酶在以上感染性炎症上的应用并不多见,尤其是在感染性肺炎方面。
基于纳米酶活性用于炎症性治疗研究先例,尽管取得一定成功应用,但纳米酶在抗感染性炎症类疾病治疗方面还存难点:(1)如何设计多酶活性的纳米酶,使其兼具炎症反应清除和致病原清除能力;(2)如何靶向炎症部位,以提高药物的利用效率和快速清除能力;(3)对感染性炎症而言,尤其是感染性肺炎,目前尚未有相关纳米酶治疗案例。
所以,针对现实状况与局限性,利用纳米酶优势,亟待设计开发一种掺杂的多酶活性的纳米药物,用于炎症性疾病治疗,特别是感染性肺炎。
发明内容
发明目的:针对现有技术的不足,本发明提出通过掺杂的方式制备具有多酶活性的纳米酶,同时通过修饰炎症靶向性的细胞膜以实现炎症部位的靶向聚集,实现抗炎症和清除致病原相结合的治疗作用。本发明通过对纳米材料进行不同元素的掺杂,获得兼具多酶活性的纳米酶,多酶活性包括类超氧化物歧化酶(SOD)活性、类过氧化氢酶(CAT)活性、类过氧化物酶(POD)活性以及类氧化物酶(OXD)活性等。利用超氧化物歧化酶(SOD)和类过氧化氢酶(CAT)活性可有效地清除炎症反应;利用类过氧化物酶(POD)和类氧化物酶(OXD)活性以及纳米酶本身的理化性质可有效的清除致病原;清除炎症反应和清除致病原相结合,可高效地用于炎症性疾病的治疗。本发明为增强纳米药物的快速靶向性,对优选的多酶活性纳米酶进行炎症靶向性细胞膜修饰,进而获得靶向性的纳米药物。此外本发明以感染性肺炎为例,探索本发明纳米药物的治疗效果,以后续的拓展至其他炎症性疾病的治疗应用。
技术方案:为了解决上述技术问题,本发明提供了基于掺杂的多酶活性纳米材料在抑制耐药金黄色葡萄球菌中的应用,所述基于掺杂的多酶活性纳米材料包括纳米材料经不同元素掺杂获得类酶活性的纳米酶,所述类酶活性包括类超氧化物歧化酶、类过氧化氢酶、类过氧化物酶以及类氧化物酶中的一种或几种,所述不同元素掺杂包括钴掺杂、锰掺杂或钴锰双元素共掺杂。
其中,所优选的纳米材料包括但不限于贵金属前体包括金、铱、铂、钯、钌或合金中的一种或几种;作为优选,所述金属氧化物前体包括氧化铈、氧化锰、氧化铜、氧化铁基、氧化钴中的一种或几种;作为优选,所述MOFs前体包括铁基MOFs、锌基MOFs、铜基MOFs、钴基MOFs中的一种或几种;作为优选,所述碳纳米材料前体包括还原型石墨烯、氧化型石墨烯、富勒烯、碳纳米管的一种或几种。
其中,所述基于掺杂的多酶活性纳米材料包括纳米材料经不同元素掺杂获得类酶活性的纳米酶,所述类酶活性包括类超氧化物歧化酶、类过氧化氢酶、类过氧化物酶以及类氧化物酶中的一种或几种,所述不同元素掺杂包括钴掺杂、锰掺杂或钴锰双元素共掺杂。
其中,所述元素掺杂还包括非金属元素包括氧、氮、硼、磷、硫中的一种或多种的组合,所述掺杂金属元素包括铁、铜、镍、锌中的一种或多种的组合;作为优选,所属非金属前驱体包括尿素、氨气、双氰胺、氧化硼、硼酸、磷酸、硫粉、硫脲、二苯基硫醚中的一种或多种组合,所述金属前驱体包括硝酸钴、氯化铁、硝酸铁、氯化锰、硝酸锰、氯化镍、硝酸镍、氯化铜或硝酸铜中的一种或多种的组合。
其中,所优选的元素掺杂方法包括后掺杂、原位掺杂、特殊气氛下热处理、混合热处理、模板法中的一种或多种的组合。
其中,所述基于掺杂的多酶活性纳米材料包括钴掺杂的碳纳米酶、锰掺杂的碳纳米酶或钴锰双元素共掺杂的碳纳米酶中的一种或几种,作为优选,所述钴锰双元素共掺杂的碳纳米酶包括两种不同投料比例的碳纳米酶Co1Mn1CN或Co0.5Mn3CN。
其中,所述炎症性疾病是指致病原感染所致的炎症性疾病,作为优选,所述病原体包括耐药金黄色葡萄球菌。
其中,所述炎症性疾病包括肺炎、尿道炎或肠胃炎。
其中,所述应用还包括将基于掺杂的多酶活性纳米材料进行靶向性细胞膜修饰。
本发明的基于掺杂的多酶活性纳米酶的合成方法如下:
(1)纳米材料前驱体溶液A的配制:溶剂优选为丙酮、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、水的一种或更多种;前驱体1优选为2-甲基咪唑;
(2)纳米材料前驱体元素掺杂溶液B的配制:溶剂优选为甲醇、乙醇、水、二甲基甲酰胺中的一种或更多种;金属盐优选为乙酰丙酮锰,乙酰丙酮钴,硝酸锰,硝酸钴,硝酸锌,乙酸锰,乙酸钴,乙酸锌,氯化锰,氯化钴,氯化锌中的一种或几种组合;作为更优选的,所述金属盐为硝酸钴,乙酰丙酮钴,硝酸锰,氯化锰,硝酸锌中的一种或几种组合。
(3)充分混合A和B溶液,超声以加大前驱体与修饰化合物的接触;
(4)将步骤(3)中所得混合溶液在一定方法下反应,反应方法优选为水热法,溶剂热法,液相直接合成法中的一种或更多种。
(5)降温并收集产物,进行如离心、透析、干燥处理的一种或多种。
(6)将(5)的产物在惰性气体(优选为氮气和氩气中的一种)保护下进行高温碳化处理,温度优选为900℃,950℃,1000℃中的一种。
其中,所述钴掺杂的碳纳米酶的制备方法包括以下步骤:
(1)取ZIF-8前驱体2-甲基咪唑溶解于甲醇中,备用;
(2)取Zn(NO3)2·6H2O,加入Co(NO3)2·6H2O,用甲醇溶解后得到前驱体溶液备用;
(3)步骤(2)所得前驱体溶液使用滴管缓慢滴加到步骤(1)的体系中,剧烈搅拌制备得到混合溶液;
(4)将步骤(3)得到的混合溶液倒入聚四氟乙烯内衬密封后放入反应釜,烘箱中水热反应后自然冷却至室温;
(5)将步骤(4)所得液体分装在离心管中,离心去除上清液,然后每支离心管加入甲醇冲洗,离心去除洗液,重复本步骤操作多次,获得钴掺杂的ZIF-8前驱体;
(6)将步骤(5)的钴掺杂ZIF-8前驱体研磨均匀后用瓷舟装载放入管式炉,在N2保护下升温至900~1000℃保持3h,之后自然冷却至室温,收集瓷舟中的黑色粉末即为钴掺杂的碳纳米酶。
其中,所述锰掺杂的碳纳米酶的制备方法与步骤(1)、(3)~(6)基本一样,所不同的在于步骤(2),取Zn(NO3)2·6H2O,加入MnCl2·4H2O,用甲醇溶解后得到前驱体溶液备用。
其中,所述钴锰双元素共掺杂的碳纳米酶的制备方法与步骤(1)、(3)~(6)基本一样,所不同的在于步骤(2),取Zn(NO3)2·6H2O,加入Co(NO3)2·6H2O和0.069g MnCl2·4H2O,用甲醇溶解后得到前驱体溶液备用。
其中,所述炎症性疾病包括由耐药金黄色葡萄球菌诱导的急性肺炎。
其中,所述药物剂量为5~15mg/kg动物。所述动物包括但不仅限于小鼠,其他动物均适用。
基于掺杂的多酶活性纳米酶的制备、优选纳米酶的炎症靶向性修饰以及在炎症性疾病中的应用,其中以感染性肺炎为例进行治疗应用。
本发明所述的基于掺杂的多酶活性纳米酶,是指纳米材料经元素掺杂后获得类酶活性,包括但不限于类超氧化物歧化酶(SOD)、类过氧化氢酶(CAT)、类过氧化物酶(POD)以及类氧化物酶(OXD)等;所述的优选纳米酶,是指经掺杂后获得的多酶活性的纳米酶,经酶活性测试和性能比较,优选的一种或多种纳米酶;所述的炎症靶向性修饰,是指为增强优选纳米酶的炎症部分靶向聚集,对优选纳米酶进行靶向细胞膜的修饰,靶向性的细胞膜包括但不限于中性粒细胞膜、红细胞膜、巨噬细胞膜以及血小板膜等,本发明中以血小板膜为实施例;所述的炎症性疾病,包括感染性炎症疾病如尿道炎、肠胃炎以及肺炎等,以感染性肺炎为例进行治疗应用。
其中一个实施方案,所述的靶向性细胞膜的修饰,为增强所优选多酶活性的纳米酶炎症部位的靶向能力,对所优选的纳米酶进行靶向性细胞膜修饰,包括但不限于中性粒细胞膜、红细胞细胞膜以及血小板细胞膜,以血小板细胞膜为实施例;所述的对优选的纳米酶进行靶向性细胞膜的修饰,修饰方法包括但不限于超声分散修饰、脂质体挤压器挤压修饰等。
其中一个实施方案,所述的炎症性疾病的治疗,是指对优选的多酶活性纳米酶进行靶向性修饰后的纳米药物用于炎症性疾病的治疗,炎症性疾病包括但不限于感染性尿道炎、肠胃炎以及飞扬等,以感染性肺炎治疗作为实施例。
有益效果:与现有技术相比,本发明具备以下显著优点:
1、增强药物利用效率与减少用药量种类:本发明通过的多酶活性纳米药物用于炎症性疾病的治疗,基于掺杂的多酶活性纳米酶的靶向性细胞膜的修饰,可以增强药物的炎症部位的靶向能力,进而可以增强药物利用效率;基于多酶活性,一方面可以消除炎症反应,另一方面可以消除致病原,可以有效减少用药种类。该纳米药物可以实现低剂量的高效治疗目的,降低常规治疗药物剂量与减少治疗药物种类,减轻大剂量与多种类药物给病患带来的其他毒副作用与经济负担。
2、炎症的清除:基于掺杂的多酶活性,类超氧化物歧化酶(SOD)和类过氧化氢酶(CAT)可以有效清除炎症部位的活性氧物种,进而减轻炎症反应。由于类酶活性具有高效性,其活性氧清除能力可超越抗氧化剂类药物,且抗氧化剂类药物属于消耗性的药物,纳米酶在活性氧清除方面具有更好的优势,充分满足炎症清除需求。
3、致病原的消除:基于掺杂的多酶活性,类过氧化物酶(POD)和类氧化物酶(OXD)可以利用底物产生氧化应激来对抗致病原,同时纳米酶作为一种纳米材料,其本身物化性质也表现出抗致病原的能力。因而无需额外给予抵抗致病原类药物,如抗生素等。
4、生产成本低:本发明所涉及的纳米药物,制备工艺简单、原料等成本低,且有利于工业化生产和临床转化。
附图说明
图1本发明实施例1的基于不同元素掺杂的多酶活性纳米酶的TEM图,分别为钴掺杂的碳纳米酶(Co CN),锰掺杂的碳纳米酶(Mn CN),钴锰双元素共掺杂的碳纳米酶(CoMnCN),其中CoMn共掺杂纳米酶包括两种不同投料比例碳纳米酶Co1Mn1 CN和Co0.5Mn3CN。
图2本发明实施例2的基于不同元素掺杂的多酶活性纳米酶的类超氧化物歧化酶(SOD)和类过氧化氢酶(CAT)分析图;
图3本发明实施例2的基于不同元素掺杂的多酶活性纳米酶的类过氧化物酶(POD)和类氧化物酶(OXD)分析图;
图4本发明实施例3的基于不同元素掺杂的多酶活性纳米酶的类超氧化物歧化酶(SOD)活性,用于细胞内ROSUP清除流式细胞图;
图5本发明实施例3的基于不同元素掺杂的多酶活性纳米酶的类过氧化氢酶(CAT)活性,用于细胞内双氧水清除流式细胞图;
图6本发明实施例4的基于不同元素掺杂的多酶活性纳米酶的类过氧化物酶(POD)和类氧化物酶(OXD)活性,用于耐药金黄色葡萄球菌的杀伤细菌平板涂板图;
图7本发明实施例5的基于不同元素掺杂的多酶活性纳米药物自身的理化性质对耐药金黄色葡萄球菌的杀伤作用SEM图;
图8本发明实施例6,对优选的掺杂纳米酶进行靶向性细胞膜的修饰,所得纳米药物的SDS-PAGE电泳图和TEM图。
图9本发明实施例7的基于不同元素掺杂的多酶活性纳米药物用于急性肺炎模型示意图;
图10本发明实施例7的基于不同元素掺杂的多酶活性纳米药物用于急性肺炎治疗,经不同纳米药物治疗后,小鼠外周血细胞因子情况柱状图;
图11本发明实施例7的基于不同元素掺杂的多酶活性纳米药物用于急性肺炎治疗,经不同纳米药物治疗后,肺部的HE切片图;
图12本发明实施例7的基于不同元素掺杂的多酶活性纳米药物用于急性肺炎治疗,经不同纳米药物治疗后,肺部致病原涂板分布图;
具体实施方式
下面结合实例,对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
合成纳米材料前驱体,并对其进行元素掺杂,获得具有多酶活性的纳米药物的制备方法:
①取ZIF-8前驱体2-甲基咪唑0.616g溶解于15mL甲醇中,备用;
②取0.488g Zn(NO3)2·6H2O,分别加入0.068g Co(NO3)2·6H2O;或0.034g Co(NO3)2·6H2O和0.023g MnCl2·4H2O;或0.017g Co(NO3)2·6H2O和0.069g MnCl2·4H2O;或0.046g MnCl2·4H2O;用30mL甲醇溶解后备用;
③将②中所得前驱体溶液使用滴管缓慢滴加到①体系中,剧烈搅拌30min,制备得到混合溶液;
④将③所得溶液倒入聚四氟乙烯内衬密封后放入反应釜,在120℃烘箱中水热反应4h,反应后自然冷却至室温。
⑤将④所得液体分装在10mL离心管中,以6000g离心去除上清液,然后每支离心管加入5mL甲醇冲洗,以10000g离心去除洗液。重复本步骤操作3次,获得钴/锰掺杂的ZIF-8前驱体。
⑥将⑤ZIF-8前驱体研磨均匀后用瓷舟装载放入管式炉,在N2保护下升温至950℃(升温速率5℃/min)保持3h,之后自然冷却至室温,收集瓷舟中的黑色粉末作为纳米药物使用。
实施例1中,通过单元素掺杂和双元素不同比例掺杂,制备4种不同掺杂的纳米酶,分别命名为:钴掺杂的碳纳米酶(Co CN),锰掺杂的碳纳米酶(Mn CN),钴锰双元素共掺杂的碳纳米酶(CoMn CN),其中CoMn共掺杂纳米酶包括两种不同投料比例碳纳米酶Co1Mn1 CN和Co0.5Mn3 CN。四种纳米酶的形貌一致,大小均为89+5nm(图1)。
实施例2
将实施例1制备的4种不同掺杂的纳米酶进行类酶活性测试与验证。
SOD活性检测:使用WST-1商用试剂盒(日本同仁化学公司)对四种钴/锰掺杂的碳纳米酶的·O2-清除活性进行检测。钴/锰碳纳米酶通过将·O2 -催化歧化为过氧化氢和水,实现对·O2 -的清除,纳米酶的消除作用可通过WST-1与·O2 -相互作用所生成的甲臜染料来检测。当纳米酶发挥·O2 -消除活性时,由于染料生成减少,溶液在450nm处的吸光度将下降。结果如图所示:四种纳米酶对·O2 -均表现出较高的清除效率,在10μg/mL的低浓度下清除率均超过50%,其中Co1Mn1碳纳米酶的清除率最高,接近80%(图2A)。
CAT活性检测:使用溶解氧检测方法对四种钴/锰掺杂的碳纳米酶的CAT活性进行检测。具体方法是:在10mL小烧杯中加入4.9mL的Tris-HCl缓冲液(0.2M,pH=7.6),加入钴/锰掺杂碳纳米酶(终浓度为10μg/mL),加入H2O2(终浓度为5mM)后立即插入溶解氧探头读取300s内的数据变化(30s一次)。钴/锰掺杂的碳纳米酶会催化过氧化氢分解产生氧气,使溶液中溶解氧水平升高。结果如图所示:四种纳米酶均表现出一定的CAT活性,其中Co0.5Mn3碳纳米酶活性最强,Co和Co1Mn1碳纳米酶其次,Mn碳纳米酶最弱(图2B)。
POD活性检测:使用对苯二甲酸(TA)对四种钴/锰掺杂的碳纳米酶的POD活性进行检测。具体方法是:在四支离心管中加入1800μL醋酸-醋酸钠缓冲液(0.2M,pH=4.66),分别加入四种钴/锰掺杂的碳纳米酶(终浓度为10μg/mL),TA(终浓度为4mM),最后加入H2O2(终浓度为1mM),避光反应20min后,在荧光分光光度计上使用315nm激发,读取330-550nm荧光发射光谱。TA是一种羟自由基捕获剂,钴/锰掺杂的碳纳米酶催化H2O2分解产生羟自由基,TA与其反应后生成羟基对苯二甲酸,在315nm激发后,在425nm处荧光信号强度增加。结果如图3A所示:四种纳米酶均表现出一定的POD活性,其中Co0.5Mn3碳纳米酶活性最强,Co和Co1Mn1碳纳米酶其次,Mn碳纳米酶最弱(图3A)。
OXD活性检测:使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)对四种钴/锰掺杂的碳纳米酶的OXD活性进行检测。具体方法是:在四支离心管中加入430μL醋酸-醋酸钠缓冲液(0.2M,pH=4.66),分别加入四种钴/锰掺杂的碳纳米酶(终浓度为10μg/mL),H2O2(终浓度为0.5mM),最后使用排枪加入TMB(终浓度为0.5mM),混匀后反应10min后,使用酶标仪读取350-750nm紫外光谱。钴/锰掺杂的碳纳米酶可将3,3',5,5'-四甲基联苯胺氧化为蓝色产物,溶液在652nm处的吸光度将上升。结果表明三种含钴纳米酶均表现出较高的氧化酶活性(图3B)。
实施例3
将实施例1制备掺杂的多酶活性的纳米酶进行细胞水平的消除ROS的验证。基于SOD和CAT活性,掺杂的多酶活性纳米酶对肺上皮细胞MLE-12(购于中国细胞资源库细胞库)的ROS清除作用。
1、以3×105个/孔的浓度在6孔板中接种MLE-12肺上皮细胞(购于中国细胞资源库细胞库),培养箱中培养24h;
2、4种不同掺杂的Co CN,Mn CN,Co1Mn1 CN和Co0.5Mn3 CN纳米酶,分别与细胞共孵育6h,每种纳米酶的工作浓度为10μg/mL;
3、去除步骤2中的共孵育培养液,用PBS缓冲液(0.01M,pH=7.4,下同)清洗细胞后,加入新的细胞培养液,并加入终浓度为20μM的过氧化氢细胞培养液或终浓度为20μM的ROSUP(商用混合性ROS溶液,购于碧云天生物科技有限公司,货号为S0033S)与细胞共孵育30min;
4、去除步骤3中的与不同ROS共孵育培养液,用PBS缓冲液(0.01M,pH=7.4,下同)清洗细胞,加入终浓度10μM的2,7-二氯荧光素二乙酸酯探针(碧云天生物科技有限公司)的PBS后,在细胞培养箱中避光孵育30分钟;
5、去除步骤4中与探针共孵育PBS缓冲液,并用新鲜的PBS清洗细胞3次,收集细胞于离心管中,避光保存;
6、使用流式细胞仪对肺上皮细胞MLE-12中的ROS含量进行考察:图4为ROSUP的消除效果,含Co掺杂的纳米酶如Co CN,Co1Mn1 CN和Co0.5Mn3 CN表现出较高的ROSUP清除效果;图5为过氧化氢清除效果,含Co掺杂的纳米酶如Co CN和Co1Mn1 CN过氧化氢清除效果最佳。
图4和图5所示,肺上皮细胞MLE-12与不同掺杂的纳米酶共孵育后,表现不同ROSUP和过氧化氢清除效果,其中含Co掺杂的纳米酶如Co CN,Co1Mn1 CN和Co0.5Mn3 CN表现出较高抗ROS效果。通过细胞流式分析,Co CN和Co1Mn1 CN掺杂的纳米酶能够有效清除细胞内的ROS,进而保护细胞免受氧化应激。
实施例4
将实施例1制备的不同掺杂的纳米酶,用于抵抗致病原的验证。以耐药金黄色葡萄球菌MRSA的抑制作用。
1、挑取平板新鲜活化的耐药金黄色葡萄球菌(菌株编号ATCC 43300,购于ATCC细菌库)单菌落至5mL液体LB培养基中培养16h;
2、将步骤1中的耐药金黄色葡萄球菌,以OD600nm=0.2的浓度转接至1.5mL的离心管中,分别加入4种不同掺杂的纳米酶Co CN,Mn CN,Co1Mn1 CN和Co0.5Mn3 CN共孵育,同时加入或不加入过氧化氢,纳米酶孵育的工作浓度为20μg/mL,过氧化氢的工作浓度为20μM;
3、将步骤2中纳米酶与耐药金黄色葡萄球菌(加入终浓度为20μM的过氧化氢或不加入过氧化氢)共培养4h;
4、取步骤3中纳米酶与耐药金黄色葡萄球菌共培养液100μL,分别涂布于新鲜的LB固体培养板上,置于37℃细菌培养箱中;
5、步骤4中的涂布后的细菌培养板,置于37℃细菌培养箱中24h后,取出培养板观察耐药金黄色葡萄球菌的生长情况。
图6为不同掺杂的纳米酶与耐药金黄色葡萄球菌共孵育后,对耐药金黄色葡萄球菌生长影响情况。不加入过氧化氢的纳米酶和耐药金黄色葡萄球菌共孵育后,Co掺杂的纳米酶表现出对耐药金黄色葡萄球菌的抑制作用;加入过氧化氢的纳米酶和耐药金黄色葡萄球菌共孵育后,Co掺杂的纳米酶表现出更为突出的耐药金黄色葡萄球菌抑制作用。基于OXD活性,Co掺杂的纳米酶表现出对耐药金黄色葡萄球菌的抑制作用;基于POD活性,Co掺杂的纳米酶表现出对耐药金黄色葡萄球菌更强的抑制作用;其中Co1Mn1效果最佳。
实施例5
将实施例1制备的不同掺杂的纳米酶,用于抵抗致病原的验证。以耐药金黄色葡萄球菌MRSA的抑制作用。
1、挑取平板新鲜活化的耐药金黄色葡萄球菌ATCC 43300单菌落至5mL液体LB培养基中培养16h;
2、将灭菌的载玻片至于6孔板中以便于细菌爬片,将步骤1中培养得到的耐药金黄色葡萄球菌,以OD600nm=0.6的浓度转接含有载玻片的6孔板中培养得到细菌培养液;
3、向步骤2中的细菌培养液中,分别加入4种不同掺杂的纳米酶Co CN,Mn CN,Co1Mn1 CN和Co0.5Mn3 CN共孵育,纳米酶孵育的工作浓度为20μg/mL;
4、将步骤3中的纳米酶与耐药金黄色葡萄球菌共培养,置于37℃细菌培养箱中静置培养48h,取出各组含有细菌的载玻片;
5、对步骤4中含有细菌的载玻片进行PBS缓冲液清洗;
6、对步骤5中含有细菌的载玻片进行固定,固定液为戊二醛,工作浓度为2.5%;
7、对步骤6中戊二醛固定的细菌载玻片进行酒精梯度脱水处理,依次地酒精梯度为70%,80%,90%,95%,并对脱水后细菌载玻片进行冷冻干燥;
8、对步骤7中干燥后的细菌载玻片进行喷金和SEM观察。
图7为不同掺杂的纳米酶与耐药金黄色葡萄球菌共孵育后,对耐药金黄色葡萄球菌生长影响情况SEM图。Co掺杂的纳米酶表现出对耐药金黄色葡萄球菌的抑制作用,其中Co1Mn1效果最佳,表现明显的细菌破碎。
实施例6
将实施例1制备的Co1Mn1 CN进行靶向性细胞膜的修饰,以实现炎症靶向性。以血小板膜(Platelet membrane,PM)为例进行。
1、对小鼠Balb/c(购于浙江维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号为SCXK(浙)2021-0006)进行心脏取血,获得新鲜全血;
2、对步骤1中获得全血进行饱和EDTA-Na的抗凝处理;
3、对步骤2中抗凝处理后的全血经差速离心分离出血浆和红细胞,然后将上清液进行多次差速离心,最终可得到富含血小板膜的沉淀;
4、用PBS缓冲液清洗步骤3中的血小板细胞膜,并利用one drop仪器进行定量,读A280nm数值,计算血小板细胞膜浓度;
5、取步骤4中的血小板细胞膜(PM)和实施例1中制备并优选的Co1Mn1 CN进行混合超声30min,得到Co1Mn1@PM纳米药物,其中PM和Co1Mn1超声修饰的质量比例为10:1。
图8掺杂的纳米酶的靶向性细胞膜修饰,以Co1Mn1为优选的纳米酶,血小板膜为例进行。A图为SDS-PAGE电泳图,表明血小板膜对Co1Mn1酶的成功修饰;B图为修饰后的Co1Mn1@PM纳米药物TEM图。
实施例7
将实施例1和实施例6中制备的掺杂的纳米酶和纳米药物进行炎症性疾病治疗的应用。以耐药金黄色葡萄球菌诱导的急性肺炎为例进行。
1、选取6~8周龄,18~20g小鼠Balb/c(购于浙江维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号为SCXK(浙)2021-0006)构建耐药金黄色葡萄球菌诱导的急性肺炎模型,分为对照组、Co CN,Mn CN,Co1Mn1 CN,Co0.5Mn3 CN以及Co1Mn1@PM,每组6只小鼠,共计36只小鼠;
2、向步骤1中的小鼠经气管滴入耐药金黄色葡萄球菌ATCC 43300的菌悬液,滴入剂量为OD600nm=1.8 50μL,滴入耐药金黄色葡萄球菌的小鼠置于笼中饲养2h;
3、对步骤2中的小鼠分别按步骤1中的分组进行处理,分别为对照组、Co CN,MnCN,Co1Mn1 CN,Co0.5Mn3 CN以及Co1Mn1@PM,药物剂量为5mg/kg,按100μL体积进行尾静脉注射,其中对照组给予100μL PBS;
4、对步骤3中的小鼠继续笼中饲养48h,眼眶采血100μL室温静置30min,经5000转离心10min,得到血清,按试剂盒检测方法,进行细胞因子TNF-α和IL-1β检测,验证抗氧化应激能力(图10);
5、对步骤3中的小鼠继续笼中饲养48h,收样,剖取小鼠肺,称重0.1g,组织研磨后,研磨液10倍稀释,取100μL进行平板涂布,验证抗致病原能力(图11);
6、对步骤3中的小鼠继续笼中饲养48h,收样,剖取小鼠肺,进行组织包埋和切片,切片进行苏木精曙红染色(HE),观察肺部治疗效果(图12)。
图10-12,为实施例1和实施例6中的掺杂的纳米酶和优选纳米酶的靶向性修饰后的纳米药物,对耐药金黄色葡萄球菌诱导的急性肺炎治疗效果。其中图10从细胞因子TNF-α和IL-1β检测,掺杂的纳米酶能够降低细胞因子,Co1Mn1@PM表现最佳;图11为肺部感染耐药金黄色葡萄球菌后经各种处理的肺部细菌涂板图,掺杂的纳米酶能够表现出抗菌效果,Co1Mn1@PM表现最佳;图12为肺部感染耐药金黄色葡萄球菌后经各种处理的肺部HE染色图,掺杂的纳米酶能够表现出治疗效果,Co1Mn1@PM表现最佳。
综上,利用本发明制备掺杂的多酶活性纳米药物,并用于炎症性疾病的治疗。以Co和Mn掺杂的碳纳米酶为例进行掺杂后的各种酶活性评估,再经抗氧化应激和抗菌测试,优选Co1Mn1为例进行靶向性修饰,并用于后续炎症性疾病的治疗;其中以耐药金黄色葡萄球菌诱导的肺炎进行治疗效果评估,发现所开发的掺杂型的纳米药物具有抵抗ROS和致病原的效果,且具有一定的普适性,具有临床转化的可能。
Claims (10)
1.基于掺杂的多酶活性纳米材料在抑制耐药金黄色葡萄球菌中的应用,所述基于掺杂的多酶活性纳米材料包括纳米材料经不同元素掺杂获得类酶活性的纳米酶,所述类酶活性包括类超氧化物歧化酶、类过氧化氢酶、类过氧化物酶以及类氧化物酶中的一种或几种,所述不同元素掺杂包括钴掺杂、锰掺杂或钴锰双元素共掺杂。
2.基于权利要求1所述的掺杂的多酶活性纳米材料在制备治疗炎症性疾病的药物中的应用,所述基于掺杂的多酶活性纳米材料包括纳米材料经不同元素掺杂获得类酶活性的纳米酶,所述类酶活性包括类超氧化物歧化酶、类过氧化氢酶、类过氧化物酶以及类氧化物酶中的一种或几种,所述不同元素掺杂包括钴掺杂、锰掺杂或钴锰双元素共掺杂。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述基于掺杂的多酶活性纳米材料包括钴掺杂的碳纳米酶、锰掺杂的碳纳米酶或钴锰双元素共掺杂的碳纳米酶中的一种或几种,作为优选,所述钴锰双元素共掺杂的碳纳米酶包括两种不同投料比例的碳纳米酶Co1Mn1CN或Co0.5Mn3CN。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述炎症性疾病是指致病原感染所致的炎症性疾病,作为优选,所述病原体包括耐药金黄色葡萄球菌。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述炎症性疾病包括肺炎、尿道炎或肠胃炎。
6.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述应用还包括将基于掺杂的多酶活性纳米材料进行靶向性细胞膜修饰。
7.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述钴掺杂的碳纳米酶的制备方法包括以下步骤:
(1)取ZIF-8前驱体2-甲基咪唑溶解于甲醇中,备用;
(2)取Zn(NO3)2·6H2O,加入Co(NO3)2·6H2O,用甲醇溶解后得到前驱体溶液备用;
(3)步骤(2)所得前驱体溶液使用滴管缓慢滴加到步骤(1)的体系中,剧烈搅拌制备得到混合溶液;
(4)将步骤(3)得到的混合溶液倒入聚四氟乙烯内衬密封后放入反应釜,烘箱中水热反应后自然冷却至室温;
(5)将步骤(4)所得液体分装在离心管中,离心去除上清液,然后每支离心管加入甲醇冲洗,离心去除洗液,重复本步骤操作多次,获得钴掺杂的ZIF-8前驱体;
(6)将步骤(5)的钴掺杂ZIF-8前驱体研磨均匀后用瓷舟装载放入管式炉,在N2保护下升温至900~1000℃保持3h,之后自然冷却至室温,收集瓷舟中的黑色粉末即为钴掺杂的碳纳米酶。
8.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述锰掺杂的碳纳米酶的制备方法与权利要求5的步骤(1)、(3)~(6)基本一样,所不同的在于步骤(2),取Zn(NO3)2·6H2O,加入MnCl2·4H2O,用甲醇溶解后得到前驱体溶液备用。
9.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述钴锰双元素共掺杂的碳纳米酶的制备方法与权利要求5的步骤(1)、(3)~(6)基本一样,所不同的在于步骤(2),取Zn(NO3)2·6H2O,加入Co(NO3)2·6H2O和0.069g MnCl2·4H2O,用甲醇溶解后得到前驱体溶液备用。
10.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述炎症性疾病包括由耐药金黄色葡萄球菌诱导的急性肺炎。
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