CN113447462B - 一种二甲双胍衍生的碳量子点应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于二甲双胍碳量子点的应用，配置一定浓度的碳量子点溶液，向其中加入不同浓度的铜离子溶液。将混合溶液在荧光分光光度计中测量其荧光强度变化，绘制荧光强度随铜离子浓度变化曲线，并将曲线进行拟合得到拟合公式。本发明方法检测铜离子简单易操作，灵敏度高，检测限低，低检测范围、较强的选择性。除此之外，本发明二甲双胍碳量子点还可以用于抑制结直肠癌lovo细胞系。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用二甲双胍衍生的碳量子点应用检测铜离子或抑制肿瘤细胞。
背景技术
碳量子点(Carbon quantum dots, CQDs) ，是近几年来出现的一种新型荧光碳纳米材料。低毒性的碳点目前已经开始替代生物毒性较大的传统半导体量子点并应用于靶向治疗、生物成像、生化分析与检测等生命科学领域，是现今最有希望在医学检测上实现应用的新兴荧光纳米材料。
例如，近年来，铜和铜基纳米颗粒（CuNP）已用于工业用途，电气设备、建筑材料、抗菌剂以及与其他金属的合金形成。 CuNPs越来越多地用于各个领域，包括在有机合成中用作催化剂，用于药物递送、传感器、农业和食品保鲜，以及油漆和水处理。地壳中有大量的铜供应。铜是一种易延展且可延展的重金属，密度大于5 g/cm-3，化学反应性低。铜还是一种必需的微量微量营养素，在与人类和动物生存所必需的身体过程相关的关键酶反应中，作为辅助因子起着重要作用。除了铜的广泛用途外，它还参与酶活性，包括赖氨酰氧化酶，酪氨酸酶和多巴胺羟化酶。它的代谢作用与铜螯合物和铜蛋白复合物的形成有关。铜作为血蓝蛋白的一部分在氧气的运输中起着重要的生物学作用。血蓝蛋白是血红蛋白在氧气中的对应物，可在软体动物和甲壳类动物中发现。在Cu2O NP中使用的Cu（I）可以在Cu +和Cu2+之间翻转，而Cu（II）可以以Cu(OH)2 NP的形式合成并且可以用作抗菌剂。在鱼的腮，肾，脑，肝和骨骼肌中发现了大多数铜。铜是维持红细胞，神经细胞和免疫系统的重要化合物。铜代谢不当时，该元素的积累可能对人体有害。体内铜的失衡与某些遗传疾病有关，例如毛发灰质营养不良病和阿尔茨海默氏病。2001年，成人铜的推荐饮食津贴为0.9毫克/天。然而，研究表明，高浓度的铜对鱼类和人类均具有毒性。因此，有必要评估中铜离子形式的释放。
目前碳量子点进行检测金属离子的报道较少。利用碳量子点作为探针检测铜离子，方法简单易操作，灵敏度高，检测限低，较强的选择性。因此，在快速灵敏检测环境中铜离子浓度具有重要作用。
再如，恶性肿瘤是严重威胁人类生命的重要疾病。2020年全球约有1930万例新癌症病例和近1000万例癌症死亡，预计到2040年，全球癌症负担将达到2840万例，将比2020年增加47％，其中中国新发癌症人数、癌症死亡人数均位居全球第一。恶性肿瘤（癌症）已经成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，肿瘤治疗与药物开发是医学研究领域的持续性热点。
荧光纳米粒子在生物成像、药效监测和肿瘤治疗等方面有着潜在的应用前景。但是，对于许多半导体量子点，由于尺寸、表面效应或者含有重金属等原因，实验上已经证明其对人类健康存在着负面影响。碳量子点是近几年来出现的一种新型荧光碳纳米材料，具有分子量小、荧光稳定性高、激发光谱宽而连续、发射光谱连续可调等优点。此外，因为主要成分是碳，具有生物相容性好且毒性低等特点，低毒性的碳点目前已经开始替代生物毒性较大的传统半导体量子点并应用于靶向治疗、生物成像、生化分析与检测等生命科学领域。基于此，碳量子点在肿瘤治疗领域的应用成为可能。
发明内容
本发明设计了一种二甲双胍衍生的碳量子点应用，其解决的技术问题是：（1）现有荧光检测技术对分子、离子的检测局限性。（2）
为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：
一种二甲双胍碳量子点的应用，包括以下步骤：
步骤1、将碳量子点溶液与相同体积但不同浓度的铜离子水溶液混合均匀，得到多份混合溶液；在所有混合溶液中碳量子点的浓度均保持一致，铜离子的浓度范围为0-40μM，将混合溶液放入荧光分光光度计中；
步骤2、通过荧光分光光度计测量步骤1多份混合溶液中二甲双胍量子点的最佳激发波长，将后续测量的激发波长设置为最佳激发波长，记录多份混合溶液中不同浓度的铜离子的混合溶液的荧光强度；
步骤3、将记录的荧光强度绘制成混合溶液中铜离子浓度与荧光强度变化曲线图，将其中先行部分进行拟合并得出拟合公式；
步骤4、将待测铜离子水溶液按照步骤1的方法配制成碳量子点和铜离子的混合溶液；在按照步骤2的最佳激发波长下，通过荧光分光光度计测量其荧光强度，将所得荧光强度带入步骤3中的所述拟合公式，即可得到未知铜离子水溶液中铜离子的浓度。
优选地，激发波长为 400 nm。
优选地，步骤3中绘制混合溶液荧光强度相对变化量(F-F0)/F0，随铜离子浓度（0-40μM）增加而荧光淬灭的荧光曲线图，并进行拟合，得到拟合公式Y=0.01235X+0.01109；其中，F：加入铜离子后混合溶液的荧光强度；F0：不含铜离子时混合溶液的荧光强度；X：待检测混合溶液中对应的铜离子浓度值；Y：混合溶液的荧光强度。
优选地，步骤1中二甲双胍碳量子点使用二甲基亚砜（DMSO）进行配置溶液，其碳量子点浓度为0.1mg/mL,铜离子溶液的体积为0.2mL,浓度范围为：0-40μM。
一种基于二甲双胍碳量子点药物抗肿瘤的应用，其特征在于：所述的二甲双胍碳量子点用于抑制结直肠癌lovo细胞系。
优选地，步骤1、将不同浓度的二甲双胍碳量子点溶液加入到接种数量一致的肿瘤细胞中培养，MTT细胞增殖实验测定不同时间和浓度的碳量子点对肿瘤细胞活力的影响，确定碳量子点作用于肿瘤细胞的浓度；
步骤2、按照步骤1确定的浓度范围，利用MTT细胞增殖实验检测不同浓度碳量子点对细胞增殖的影响；
步骤3、按照步骤1确定的浓度范围，利用流式细胞仪检测不同浓度碳量子点对细胞凋亡的影响；
步骤4、不同给药量对荷瘤小鼠的肿瘤治疗效果。
优选地，步骤1中确定碳量子点溶液作用lovo细胞系浓度范围0-200ng/µL, 优选50ng/µL和100 ng/µL。
优选地，所述的碳量子点作用lovo细胞系时间范围12-72 h，，优选24 h和48 h。
优选地，所述的碳量子点作用荷瘤小鼠浓度范围0-75 mg/Kg，优选12.5 mg/Kg，25mg/Kg和50 mg/Kg。
优选地，所述的碳量子点作用荷瘤小鼠时间范围0-10天，优选0-7天。
该二甲双胍衍生的碳量子点应用具有以下有益效果：
（1）本发明通过二甲双胍衍生的碳量子点，利用其碳量子点表面的官能团能够与铜离子进行络合，使得碳量子点的荧光发射发生淬灭，利用这一现象来检测铜离子。
（2）本发明检测方法简单易操作，灵敏度高，检测限低，较强的选择性。
（3）本发明中二甲双胍衍生的碳量子点检测铜离子具有较低的检测范围0-40μM及检测限0.5μM。
（4）本发明二甲双胍碳量子点抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡；可显著提高荷瘤小鼠抗肿瘤作用，平均肿瘤体积及抑制率与对照组相比明显降低。本发明二甲双胍碳量子可有效实现抗肿瘤治疗。
附图说明
图1是本发明第一种应用体系下的碳量子点的荧光强度随激发波长变化的曲线图；
图2是不同金属离子对碳量子点荧光强度的影响；
图3是不同铜离子浓度对荧光强度的淬灭图；
图4是不同铜离子浓度（0-40μM）下荧光相对变化量曲线图及线性相关Stern-Volemr曲线；
图5是本发明第二种应用体系下的碳量子点对结直肠癌lovo细胞系细胞活力的影响；
图6是本发明第二种应用体系下的碳量子点对结直肠癌lovo细胞系细胞增殖的影响；
图7是本发明第二种应用体系下的碳量子点对结直肠癌lovo细胞系细胞凋亡的影响；
图8是本发明第二种应用体系下的荷瘤小鼠在碳量子点处理期间相对肿瘤体积的变化情况。
具体实施方式
下面结合图1至图8，对本发明做进一步说明：
实施例1：一种基于二甲双胍衍生的碳量子点检测铜离子的方法：
（1）配制0.1 mg/mL的碳量子点溶液，通过荧光分光光度计测试其荧光性质，最终得到其最佳激发波长为400 nm，记录并绘制溶液荧光强度曲线图，如图1所示。
（2）向3.8 mL含有0.1 mg/mL的碳量子点溶液中分别加入0.2 mL含有Ni+、Na+、Ba2 +、Al3+、Fe3+、Ag+、Ca2+、Fe2+、K+、Cu2+、Mg2+的溶液，搅拌均匀后静置，最终得到不同的混合溶液。
（3）利用荧光分光光度计测试上述混合溶液的荧光强度，激发波长设置为400 nm，测试记录其在460 nm激发下的荧光强度，并绘制荧光强度对比图F/F0，如图2所示。
（4）从图2中可以得出，本碳量子点溶液对铜离子具有良好的选择性。
实施例2：
（1）配置0.1 mg/mL的碳量子点溶液。
（2）向石英比色皿中加入3.8 mL上述配置好的碳量子点溶液。
（3）通过使用移液枪将铜溶液分别加入到比色皿中，使之最终浓度为0-40μM。用移液枪搅拌均匀，形成混合溶液，静置过夜。
（4）使用荧光分光光度计测试上述混合溶液的荧光强度，并将激发波长设置为400nm，记录其溶液的荧光强度，并绘制成变化曲线，如图3所示。
（5）绘制混合溶液荧光强度相对变化量(F-F0)/F0随铜离子浓度（0-40μM）增加而荧光淬灭的荧光曲线图，并进行拟合，得到拟合公式Y=0.01235X+0.01109，如图4所示。
（6）将上述步骤（1）中配制的碳量子点溶液加入到石英荧光比色皿中，将待测含铜离子溶液加入到石英荧光比色皿中。
（7）通过使用荧光分光光度计测试上述待测混合溶液的荧光强度，激发波长设置为400 nm，记录并计算其荧光相对变化量(F-F0)/F0 。
（8）将荧光相对变化量(F-F0)/F0带入到步骤（5）中的拟合公式，计算得出待测溶液中所含铜的浓度。
实施例3：一种基于二甲双胍碳量子点的抗肿瘤应用：
将不同浓度碳量子点溶液药物分别作用于结直肠癌lovo细胞系，作用时间0-72h，研究不同浓度不同时间碳量子点药物对细胞活力的影响。确定优选的作用浓度50ng/µL和100 ng/µL，作用时间24 h和48 h。
（1）取96孔板加入细胞混悬液，使细胞密度为10000个/孔。
（2）24h换液，加入浓度范围0-200 ng/µL碳量子点溶液。
（3）加药24h和48h后，每孔加入10µL MTT，加MTT4h后吸出96孔板中的液体，每孔中加100μl二甲基亚砜，测定吸光度值。
得出结论：确定优选的作用浓度50ng/µL和100 ng/µL，作用时间24 h和48 h。
实施例4：
（1）96孔板外围一周用PBS填充，剩下的孔中，每孔种1000个lovo细胞。
（2）根据实施例1实验结果得到的IC50浓度，选取25ng/µL，96孔板上半部分不加药，作为对照组，下半部分加药，作为实验组。
（3）接种细胞后第二天为Day 0天，而后为Day 1天，以此类推。Day0天吸除96孔板中旧培养基，换液并加药，并在Day0天相应孔中加入MTT，4h后弃掉MTT并在每孔中加100μLDMSO。
（4）吹打DMSO溶解液，将其移入一个新的孔板进行测量。对照组与实验组测定的Day0天值应近似，作为相同的起点。重复7-9天，根据吸光度值绘制增殖曲线。
得出结论：二甲双胍碳量子点抑制肿瘤细胞增殖。
实施例5：
（1）6孔板中种2X105个细胞/孔，设一组对照组，两组实验组。
（2）24 h后换液，实验组按照实施例1确定的优选浓度50ng/µL和100 ng/µL加入碳量子点药物。
（3）48 h后，流式细胞仪测定肿瘤细胞凋亡情况。
得出结论：二甲双胍碳量子点促进肿瘤细胞凋亡。
实施例6：
（1）建立结直肠癌lovo细胞系小鼠模型，BALB/c-nu SPF级小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司，雌性，鼠龄4周，饲养于哈尔滨工业大学SPF级无菌饲养室，适应性饲养1周，自由摄取饮水。
（2）取对数生长期的lovo细胞，每只小鼠注射1 X106个细胞，皮下注射到右下肢背部靠近臀部位置。自接种之日起隔天观察各组小鼠生长状态及成瘤时间。
（3）接种后15天，全部动物接种部位可触及肿块，且肿块稳定增长。随机分为4组，各组间肿瘤大小无差异（肿瘤体积计算公式ab2/2）。第一组为对照组，第二组肿瘤部位皮下注射12.5 mg/Kg碳量子点溶液，第三组肿瘤部位皮下注射25 mg/Kg碳量子点溶液，第四组肿瘤部位皮下注射50 mg/Kg碳量子点溶液。
（4）用药15天后，脱颈椎处死小鼠并解剖，取各组瘤体，内脏器官，血液等，检测相关指标。
得出结论：二甲双胍碳量子点抑制肿瘤生长，减小肿瘤体积，可以实现治疗肿瘤效果。
上面结合附图对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种二甲双胍碳量子点的应用，包括以下步骤：
步骤1、将碳量子点溶液与相同体积但不同浓度的铜离子水溶液混合均匀，得到多份混合溶液；在所有混合溶液中碳量子点的浓度均保持一致，铜离子的浓度范围为0-40μM，将混合溶液放入荧光分光光度计中；
步骤2、通过荧光分光光度计测量步骤1多份混合溶液中二甲双胍量子点的最佳激发波长，将后续测量的激发波长设置为最佳激发波长，记录多份混合溶液中不同浓度的铜离子的混合溶液的荧光强度；
步骤3、将记录的荧光强度绘制成混合溶液中铜离子浓度与荧光强度变化曲线图，将其中先行部分进行拟合并得出拟合公式；
步骤4、将待测铜离子水溶液按照步骤1的方法配制成碳量子点和铜离子的混合溶液；在按照步骤2的最佳激发波长下，通过荧光分光光度计测量其荧光强度，将所得荧光强度带入步骤3中的所述拟合公式，即可得到未知铜离子水溶液中铜离子的浓度。
2.根据权利要求1所述二甲双胍碳量子点的应用，其特征在于：激发波长为 400 nm。
3.根据权利要求1所述二甲双胍碳量子点的应用，其特征在于：步骤3中绘制混合溶液荧光强度相对变化量(F-F0)/F0，随铜离子浓度（0-40μM）增加而荧光淬灭的荧光曲线图，并进行拟合，得到拟合公式Y=0.01235X+0.01109；其中，F：加入铜离子后混合溶液的荧光强度；F0：不含铜离子时混合溶液的荧光强度；X：待检测混合溶液中对应的铜离子浓度值；Y：混合溶液的荧光强度。
4.根据权利要求1所述二甲双胍碳量子点的应用，其特征在于：步骤1中二甲双胍碳量子点使用二甲基亚砜DMSO进行配置溶液，其碳量子点浓度为0.1mg/mL,铜离子溶液的体积为0.2mL,浓度范围为：0-40μM。
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