CN110095448A - 一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法及其应用 - Google Patents

一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法及其应用。于96孔板中，加入细胞膜蛋白溶液和纳米荧光探针溶液，于20‑25℃下孵化5‑10min后检测荧光强度。所述纳米荧光探针溶液的制备方法是：将碳源用水完全溶解，向溶液中加入小分子配体进行掺杂，超声溶解后在190‑220℃下加热反应，得纳米荧光探针，将纳米荧光探针经过滤，透析，冻干后分散于PBS缓冲溶液中，得到纳米荧光探针溶液。采用本发明的方法可以鉴别不同响应状态的细胞膜蛋白，而且还具有生物相容性好、安全无毒、作用效果稳定等特点。可特异性识别细胞膜蛋白的过表达，制备方法工艺简单、易于操作，制备成本低，易于推广。

Description

一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法及其 应用
技术领域
本发明属于荧光纳米材料技术领域，具体涉及一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法及其应用。
背景技术
蛋白质(protein)是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质是机体细胞的重要组成部分，是人体组织更新和修补的主要原料。它主要维持肌体正常的新陈代谢和各类物质在体内的输送。例如:载体蛋白对维持人体的正常生命活动是至关重要的。可以在体内运载各种物质。比如血红蛋白输送氧(红血球更新速率250万/秒)、脂蛋白输送脂肪、细胞膜上的受体还有转运蛋白等。另外，蛋白质广泛存于细胞膜，细胞质，以及细胞核等各个细胞器中。
细胞的各项生命活动与细胞膜蛋白密切相关，其可分为两类主要的转运蛋白，即：载体蛋白和通道蛋白。载体蛋白又称做载体、通透酶和转运器，能够与特定溶质结合，通过自身构象的变化，将与它结合的溶质转移到膜的另一侧。细胞膜蛋白具有许多重要的细胞功能，对生物体存在至关重要。他们具有超过60％的药物靶点，占细胞总蛋白的18％-30％。
细胞膜蛋白能接收外界信号的刺激使细胞做出反应，从而调节细胞的生命活动。细胞膜在生命活动中不单是细胞的物理屏障，是在细胞生命活动中有复杂功能的重要结构。细胞膜把细胞包裹起来，使细胞能够保持相对的稳定性，维持正常的生命活动。此外，细胞所必需的养分的吸收和代谢产物的排出都要通过细胞膜。所以，研究细胞膜蛋白的表达对人类了解生命活动有着至关重要的意义，特别的在疾病诊断，治疗等方面有着重要的指导意义。
小胶质细胞异常活化介导的神经炎症反应以释放细胞因子、趋化因子和自由基等损伤神经元和破坏神经功能为主要特征，并且该炎症反应与细胞膜蛋白密切相关。细胞膜相关的神经形炎症，在多种神经退行性疾病、脑缺血和脑外伤等中枢神经系统疾病的发病过程中具有重要的作用，因此抑制小胶质细胞过度活化，阻断促炎级联信号、抑制炎症反应被认为对上述疾病具有缓解甚至治疗作用。而抑制小胶质细胞膜蛋白的过度活化主要方法是抑制其细胞膜蛋白的过度表达。
目前研究膜蛋白结构的技术包括X射线衍射、核磁共振波谱、电子显微镜、原子力显微镜、红外光谱和圆二色谱等。其中X射线衍射和核磁共振波谱技术是对膜蛋白三维结构进行研究的主要方法。尤其利用固体核磁共振技术可在接近膜蛋白的天然环境的磷脂双分子层中研究膜蛋白的三维结构信息和动力学特征。但是上述检测方法存在一定使用的局限及问题，比如大型仪器依赖，成本高昂，时效性等等。
发明内容
针对现有的检测方法及目前应用的荧光探针所存在的不足，本发明的目的是提供一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法，本发明将荧光探针迅速高效的与细胞膜蛋白进行结合，根据细胞膜蛋白的结合位点的数量以及蛋白亚基的数量不同产生了不同的荧光信号，在酶标仪和荧光分光光度计上得以很好的区分。
本发明采用的技术方案为：一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法，包括如下步骤：于96孔板中，加入细胞膜蛋白溶液和纳米荧光探针溶液，于20-25℃下孵化5-10min后检测荧光强度。所述纳米荧光探针溶液的制备方法是：将碳源，用水完全溶解，向溶液中加入小分子配体进行掺杂，超声溶解后在190-220℃下加热反应，得纳米荧光探针，将纳米荧光探针经过滤，透析，冻干后分散于PBS缓冲溶液中，得到纳米荧光探针溶液。
进一步的，于96孔板中，加入100μL蛋白质浓度为1-100ug/mL的细胞膜蛋白溶液和100μL浓度为5-20mg/L的纳米荧光探针溶液。
进一步的，所述碳源为天然氨基酸的一种或多种。
进一步的，所述小分子配体为氨类小分子。
进一步的，所述氨类小分子为乙二胺或氨水。
进一步的，按摩尔比，碳源:小分子配体＝(1-5):1。
上述的方法在筛选抑制细胞膜蛋白过度表达药物中的应用。
进一步的，方法如下：于96孔板中，加入经药物处理的过表达细胞膜蛋白溶液和纳米荧光探针溶液，于20-25℃下孵化5-10min后检测荧光强度；所述纳米荧光探针溶液的制备方法是：将碳源用水完全溶解，向溶液中加入小分子配体进行掺杂，超声溶解后在190-220℃下加热，得纳米荧光探针，将纳米荧光探针经过滤，透析，冻干后分散于PBS缓冲溶液中，得到纳米荧光探针溶液。
进一步的，所述细胞膜蛋白为小胶质细胞膜蛋白。
本发明的有益效果是：
1.本发明的纳米荧光探针，是以碳原子为骨架结构，尺寸在1-10nm之间，具有荧光性能的类球形的纳米颗粒。本发明的纳米荧光探针是一个没有经过钝化及改性的荧光探针。该纳米荧光探针能作为区分检测不同活化状态的BV2细胞膜蛋白的原因是其能与过度表达的膜蛋白进行结合，当蛋白浓度为1-100μg/ml时都可以将其区分开来。此外，该纳米荧光探针具有荧光性能可以进行细胞成像和生物标记。
2.本发明基于纳米荧光探针的荧光信号不仅可以鉴别不同表达状态的细胞膜蛋白，而且还具有生物相容性好、安全无毒、作用效果稳定等特点。它主要可以特异性识别过度表达膜蛋白；其制备方法工艺简单、易于操作，制备成本低，易于推广。
3.本发明制备的纳米荧光探针，粒径在10nm以下，且为均匀分布的球状颗粒，纳米荧光探针表面没有经过钝化和改性，且没有毒性，因此可用于生物医学领域。
4.传统的药物筛选方法大都通过针对特定的要求和目的，通过适当的方法和技术，主要的技术有基因组学、蛋白质组学、代谢组学、计算生物学、生物芯片技术、微流控芯片技术等方法，在一定的可选择范围内，进行药物优选的过程。上述方法均可准确的筛选药物，但存在大型仪器依赖，操作流程冗长繁琐，经济成本较高等缺点。采用本发明的方法，可以快速，高效，灵敏的检测细胞膜蛋白的表达状态。可以初步快速的筛选具有抑制细胞膜蛋白过度表达的药物，在生物医学检测中具有广阔的发展空间。
附图说明
图1是实施例1制备的纳米荧光探针的透射电镜成像。
图2A是实施例1制备的纳米荧光探针的激发发射光谱图。
图2B是实施例1制备的纳米荧光探针的红外谱图。
图3是实施例1制备的纳米荧光探针的XPS谱图。
图4是实施例2在荧光酶标仪下的，活化与未活化细胞被标记的荧光强度值。
具体实施方式
实施例1
一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法，包括如下步骤：
(一)纳米荧光探针的制备
称取2g(13mmol)组氨酸和0.024g缬氨酸(2mmol)，溶于20mL超纯水中，加入0.18g(3mmoL)乙二胺，完全超声溶解后，在反应釜中210℃条件下加热15h，得到纳米荧光探针。
图1是制备的纳米荧光探针的电镜扫描图，从图1可见，制备的纳米荧光探针平均粒径约为4nm，且分布均匀，成均匀分布的球形颗粒。
图2A是制备的纳米荧光探针样品，利用荧光分光光度计于最佳激发波长处进行荧光检测得到的荧光光谱图。由图2A可知，本实施例所制备的纳米荧光探针的最佳激发波长为330nm，最佳发射波峰位于390nm处。
图2B是制备的荧光探针的样品，利用傅立叶变换红外光谱测得其含有的特定官能团，根据红外光谱图的出峰位置可知，本实施例制备的纳米荧光探针具有C＝C，-COOH，-OH，-NH2，-C-O-C-等化学官能团，这些官能团不仅具有荧光的发射团性能，又对蛋白质的稳定与识别起到关键性作用。
图3是制备的纳米荧光探针样品，利用X射线光电子能谱技术(XPS)进行表面元素含量分析的能谱图。由图3可见，碳元素含量占纳米荧光探针的50％以上，说明该探针是以碳元素为骨架的碳纳米材料。氮元素占据22％的元素比例，为碳量子点提供了丰富的荧光发射团。另外，23.21％的氧元素为蛋白质的识别及稳定提供了保障。
(二)一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法
1、将步骤(一)制备的纳米荧光探针过滤、透析、冻干。取0.004g冻干后的纳米荧光探针溶于200mL PBS缓冲溶液中，得浓度为0.02mg/mL的纳米荧光探针溶液。
在96孔板中，每个孔中加入100μL蛋白质浓度为50ug/mL的小胶质细胞膜蛋白溶液，每个孔中再加入100μL浓度为0.02mg/mL的纳米荧光探针溶液，在20℃下孵化5min后，在荧光酶标仪上检测荧光强度值。
根据荧光强度可以判断小胶质细胞膜蛋白过表达的程度：将纳米荧光探针在酶标仪下的荧光强度归一化为100％，正常小胶质细胞膜蛋白过表达量小，则小胶质细胞膜蛋白与纳米荧光探针的结合能力就弱，荧光强度降低的少。反之，异常小胶质细胞膜蛋白过表达量大，则小胶质细胞膜蛋白与纳米荧光探针的结合能力就强，荧光强度显著降低。
实施例2
抑制细胞膜蛋白过度表达药物的筛选方法，方法如下：
1、使用细胞刮刀将过表达小胶质细胞从培养瓶中分离，分别种在26个6孔板中使细胞数量为5×105个。待4h细胞贴壁后，分别加入舒林酸和盐酸二甲双胍等23种浓度为5μg/ml的药物，置于5％CO2培养箱中培养24h。取出细胞用冷PBS吹洗三遍后，用细胞刮刀将细胞从6孔板中分离，随后用1000r/min，4℃的离心机离心4min，重新分散于1ml10mmol/LTris-HCl缓冲溶液中，利用细胞破碎仪在300w的条件下，超声3s，间隔7s，持续3min进行细胞破碎。根据差速离心法，置于低温离心机中进行细胞膜蛋白的分离。得到沉淀物置于冰上加入膜蛋白裂解液裂解，经过滤后测其浓度，置于-80℃中保存待用，得不同药物处理后的过表达的小胶质细胞膜蛋白溶液。
2、将步骤1获得的不同药物处理后的过表达的小胶质细胞膜蛋白溶液，用PBS稀释，得蛋白质浓度为50ug/mL的不同药物处理后的过表达的小胶质细胞膜蛋白溶液。
3、将实施例1步骤(一)制备的纳米荧光探针过滤、透析、冻干。取0.004g冻干后的纳米荧光探针溶于200mL PBS缓冲溶液中，得浓度为0.02mg/mL的纳米荧光探针溶液。
4、在96孔板中，每个孔中加入100μL步骤2制备的蛋白质浓度为50ug/mL的不同药物处理后的过表达的小胶质细胞膜蛋白溶液，每个孔中再加入100μL浓度为0.02mg/mL的纳米荧光探针溶液，在20℃下孵化5min后，在荧光酶标仪上检测荧光强度值。
图4为23种不同药物处理后的过表达小胶质细胞膜蛋白与纳米荧光探针结合的荧光强度图。其中，CDs为纳米荧光探针的原始荧光强度，纳米荧光探针在酶标仪下的荧光强度归一化为100％。Con为正常小胶质细胞膜蛋白与纳米荧光探针结合的荧光强度，正常的小胶质细胞未经活化，膜蛋白的特异性成分以及细胞因子的浓度较低与纳米荧光探针结合能力较弱，荧光强度降低的少，荧光强度为94.09％。Exp为过表达的小胶质细胞膜蛋白与纳米荧光探针结合的荧光强度。经活化的过表达的小胶质细胞膜蛋白与纳米荧光探针结合的能力较强，荧光强度显著下降，荧光强度为55.85％。上述荧光强度为百分制，每组结果皆为平行实验重复8次取平均值的数值。虚线向右依次为舒林酸、盐酸二甲双胍和21种药物对过表达的小胶质细胞进行治疗后提取的细胞膜蛋白与纳米荧光探针的结合荧光变化强度，同样每组数据进行8次重复实验，取平均数值，经药物治愈的细胞其细胞膜蛋白表达量相对较低，与纳米荧光探针的结合能力低于过表达的细胞膜蛋白，从而荧光强度有所提高。从图4可以看出，23种药物的治愈过程均被成功的监测到。
综上可见，对经药物治愈的细胞提取的膜蛋白进行分析，经过药物的治疗后，细胞膜蛋白过表达量变少则与纳米荧光探针的结合能力就变弱，荧光变化强度相对于过表达的细胞膜蛋白的荧光强度增加，说明药物对小胶质细胞蛋白的过表达具有抑制作用。可见，通过荧光强度的变化可以初步判断药物是否具有抑制细胞膜蛋白过度表达从而治愈疾病的的作用。本发明应用荧光纳米材料可以检测细胞膜蛋白的过表达状态。本发明的方法具有优异的可操作性和良好的准确率
从制备过程来看，本发明的方法，原料价格低廉，方法简单易行，且无需复杂的反应条件，从医学应用来看，本发明可以很好的识别BV2细胞细胞膜活化与未活化的状态。它不仅能够作为纳米荧光探针而且还具有生物相容性好、特异性选择识别、作用时间长、稳定性好、廉价易得等特点。鉴于这些优秀的性能，这种新型纳米荧光探针有望在医学诊疗领域开展应用研究。

Claims (9)

1.一种基于纳米荧光探针检测细胞膜蛋白过表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：向96孔板中，加入细胞膜蛋白溶液和纳米荧光探针溶液，于20-25℃下孵化5-10min后检测荧光强度；所述纳米荧光探针溶液的制备方法是：将碳源用水完全溶解，向溶液中加入小分子配体进行掺杂，超声溶解后在190-220℃下加热反应，得纳米荧光探针，将纳米荧光探针经过滤，透析，冻干后分散于PBS缓冲溶液中，得到纳米荧光探针溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，向96孔板中，加入100μL蛋白质浓度为1-100μg/mL的细胞膜蛋白溶液和100μL浓度为5-20mg/L的纳米荧光探针溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳源为天然氨基酸的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子配体为氨类小分子。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述氨类小分子为乙二胺或氨水。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按摩尔比，碳源:小分子配体＝(1-5):1。
7.权利要求1所述的方法在筛选抑制细胞膜蛋白过度表达药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：方法如下：向96孔板中，加入经药物处理的过表达细胞膜蛋白溶液和纳米荧光探针溶液，于20-25℃下孵化5-10min后检测荧光强度；所述纳米荧光探针溶液的制备方法是：将碳源用水完全溶解，向溶液中加入小分子配体进行掺杂，超声溶解后在190-220℃下加热，得纳米荧光探针，将纳米荧光探针经过滤，透析，冻干后分散于PBS缓冲溶液中，得到纳米荧光探针溶液。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述细胞膜蛋白为小胶质细胞膜蛋白。
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