RU2311925C1 - Способ получения диагностического аллергена - Google Patents
Способ получения диагностического аллергена Download PDFInfo
- Publication number
- RU2311925C1 RU2311925C1 RU2006114119/15A RU2006114119A RU2311925C1 RU 2311925 C1 RU2311925 C1 RU 2311925C1 RU 2006114119/15 A RU2006114119/15 A RU 2006114119/15A RU 2006114119 A RU2006114119 A RU 2006114119A RU 2311925 C1 RU2311925 C1 RU 2311925C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ether
- allergen
- minutes
- extraction
- mixture
- Prior art date
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получения диагностического аллергена из тараканов. Способ включает щелочную экстракцию исходного сырья с последующим центрифугированием, фильтрованием и стерилизующей фильтрацией целевого продукта, при этом в качестве исходного сырья используют смесь замороженных тараканов, которые измельчают, после измельчения добавляют эфир, встряхивают, фильтруют, высушивают до полного испарения эфира, растирают до порошкообразного состояния и к полученному порошку повторно добавляют эфир, сушат до полного испарения эфира, затем проводят щелочную экстракцию, перемешивают экстрагируемый материал и ежедневно в течение 3 суток встряхивают трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа, в интервалах между встряхиванием хранят при температуре от 2 до 10°С, после экстракции надосадочную жидкость сливают, центрифугируют, а после стерилизующей фильтрации стерильный раствор аллергена выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 10°С. Изобретение обеспечивает расширение номенклатуры диагностических аллергенов и создание высокоэффективного препарата для диагностических заболеваний, вызванных сенсибилизацией к тараканам.
Description
Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получения диагностического аллергена из тараканов Blatella germanica.
Известен способ получения диагностического аллергена, включающий щелочную экстракцию исходного сырья, в качестве которой используют культуру клещей домашней пыли Дерматофагоидес фарина или Дерматофагоидес птерниссинус и водно-солевую экстракцию исходного сырья (RU 2265450, А61К 39/00, 2005 г.).
Основной причиной круглогодичных респираторных аллергозов (бронхиальная астма, аллергические бронхиты, аллергические конъюктивиты и др.) являются аллергены жилища человека. В состав основного из них - домашней пыли - входят продукты жизнедеятельности различных организмов, спутников биоценоза человека: клещи, насекомые, домашние животные и др. Последнее десятилетие исследователями обращено внимание, как на причину аллергозов, на тараканов, которые встречаются в жилище человека во всех регионах мира. Показано, что 60-80% больных бронхиальной астмой сенсибилизировано к тараканам; максимальные цифры приводятся для США и Японии, несколько ниже для стран Ближнего Востока - Израиль.
На территории СНГ подобных исследований не проводилось, имеются лишь косвенные данные о высокой частоте встречаемости IgE-антител к тараканам у детей, однако они получены с помощью зарубежных тест-систем. Основная причина этого - отсутствие аллергена. С другой стороны, препараты дальнего зарубежья носят преимущественно разовый характер и нуждаются в более подробной физико-химической характеристики и стандартизации. Такая работа в настоящее время активно проводится за рубежом.
Для диагностики повышенной чувствительности к тараканам необходим аллерген, который можно использовать как для постановки кожных проб, так и для использования в реакциях ин витро. Такого аллергена в отечественной аллергологической практике нет.
Расширение номенклатуры производимых препаратов для диагностики аллергических состояний является актуальной задачей практического здравоохранения. К препаратам, которые необходимы для решения данной проблемы, относится и аллерген из тараканов, разработанный в ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.
Техническим результатом изобретения является расширение номенклатуры диагностических аллергенов и создание высокоэффективного препарата для диагностики заболеваний, вызванных сенсибилизацией к тараканам.
Для достижения указанного технического результата в способе получения диагностического аллергена, включающем щелочную экстракцию исходного сырья с последующим центрифугированием, фильтрованием и стерилизующей фильтрацией целевого продукта, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют смесь замороженных тараканов, которые измельчают, после измельчения добавляют эфир в соотношении 1:3, встряхивают 10 минут, фильтруют, высушивают до полного испарения эфира, растирают до порошкообразного состояния и к полученному порошку повторно добавляют эфир, используя на 60 грамм сырья 300 мл эфира, сушат до полного испарения эфира, затем проводят щелочную экстракцию при рН 7,0-7,2, перемешивают экстрагируемый материал в течение 30-40 минут и ежедневно в течение 3 суток встряхивают трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа, в интервалах между встряхиванием хранят при температуре от 2 до 10°С, после экстракции надосадочную жидкость сливают, центрифугируют при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут, фильтруют, а после стерилизующей фильтрации стерильный раствор аллергена выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 10°С.
Сущность изобретения поясняется следующим примером.
Пример. Диагностический аллерген из тараканов разработан в ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН.
Для получения диагностического аллергена в качестве исходного сырья используют смесь замороженных тараканов. Навеску тараканов из морозильной камеры переносят в фарфоровую ступку и мелко нарезают ножницам. Добавляют эфир в соотношении 1:3, встряхивают 10 минут, смесь фильтруют через бумажный фильтр и оставляют в вытяжном шкафу до полного испарения эфира. Измельчение частично обезжиренного сырья производят в фарфоровой ступке, растирая до порошкообразного состояния. Полученный порошок подвергают вторичному обезжириванию, которое производят в стеклянных банках с притертыми пробками, используя на 60 грамм сырья 300 мл эфира. Полностью обезжиренное сырье рассыпают на эмалированные лотки с фильтровальной бумагой и сушат в вытяжном шкафу до полного испарения эфира. Порошок аллергена помещают в фарфоровую ступку вместимостью 0,5 литра и добавляют 100 мл экстрагирующей жидкости. Экстрагирующей жидкостью может быть любой буферный раствор, имеющий рН 7,0-7,2. Порошок растирают пестиком до гомогенной суспензии и переносят в бутыль вместимостью 3 литра, в которую затем добавляют еще 1,9 литра экстрагирующей жидкости. Содержимое бутыли осторожно перемешивают и оставляют на 30-40 минут, после чего контролируют значение рН. Коррекцию рН проводят добавлением 1,0 моль/л раствора гидроокиси натрия или 0,1 моль/л раствора соляной кислоты до значения рН 7,0-7,2. В последующие три дня для более полного извлечения белково-полисахаридных комплексов проводят следующий режим обработки: ежедневно бутыль с экстрагируемым материалом помещают на аппарат для встряхивания жидкостей в сосудах трижды по 30 минут с интервалом 1,5 часа. В интервалах между встряхиваниями бутыль с экстрагируемым материалом должна находиться в холодильной камере при температуре от 2 до 10°С. Ежедневно проводят коррекцию рН аллергенного экстракта до 7,0-7,2. После окончания экстрагирования надосадочную жидкость сливают и осуществляют центрифугирование на рефрежираторной центрифуге при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут с последующей фильтрацией через бумажный фильтр. Далее проводят стерилизующую фильтрацию. В день проведения данной операции необходимо отконтроллировать значение рН аллергенного экстракта. Проводят контроль маточного раствора аллергена: в тот же или на следующей день с соблюдением всех правил асептики отбирают из бутыли пробы для контроля: посев на стерильность, проверку значения рН, который должен иметь величину 7,0-7,2. Визуально оценивают физические свойства: препарат должен быть прозрачным, без посторонних включений, темно-коричневого цвета. Содержание единиц белкового азота определяют по методу Несслера. Стерильный раствор аллергена для стабилизации физических биологических свойств выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 10°С. В тех случаях, когда содержание единиц белкового азота в маточном растворе аллергена превышает 10000 PNU/мл, маточный раствор аллергена разводят стерильной экстрагирующей жидкостью.
После разлива аллергена получают готовую форму препарата.
Полученный препарат изучали с учетом поставленных целей и задач. На первых этапах провели лабораторное изучение псевдоаллергических и неспецифических иммунных свойств препарата. Так как «псевдосвойства» имеют дозозависимость, экстракт тел тараканов брали в различных концентрациях: для культуры лимфоцитов таким образом, чтобы конечное содержание его составило 100, 500, 10000 мкг/мл (по белку), для непрямого теста дегрануляции тучных клеток - 100, 500, 10000 мкг/мл для аллергена, вносимого в систему «тучные клетки крысы - сыворотка больного». Ни одна из испытанных концентраций аллергена не вызывала достоверного прироста ИЛ2Р-позитивных лимфоцитов (2,3±0,65; 3,2±0,65; 3,9±0,88 для концентраций 100, 500, 1000 мкг/мл). Отдельные высокие значения прироста активированных лимфоцитов можно отнести за счет систематической ошибки метода. С другой стороны, с учетом того, что данная реакция отражают сенсибилизацию организма безотносительно к ее характеру, указанные пациенты могли быть чувствительны к тараканам, не по реагиновому типу. Для дальнейшей работы выбрали минимальную концентрацию аллергена - 100 мкг/мл. По результатам исследований сделано предположение об отсутствии у полученного препарата неспецифических иммуногенных свойств, которые присущи многим иммуногенным и аллергенным субстанциям. Оценку псевдоаллергенных свойств экстракта проводили в непрямом тесте дегрануляции тучных клеток перитонеальной жидкости крыс с сыворотками тех же доноров. Ни у одной из испытуемых сывороток доноров не зарегистрировано превышения границы нормы. Однако прослеживаются тенденции к росту псевдоаллергических свойств с повышением концентрации белка в препарате аллергена: если различия в проценте дегранулированных клеток для концентраций 100 мкг/мл и 500 мкг/мл статистически не достоверны (р<0,05), то для концентраций 100 мкг/мл и 1000 мкг/мл - достоверны (р<0,05).
Имеет место некоторая тенденция к увеличению числа активированных лимфоцитов в контрольных культурах, что может быть связано с их меньшей устойчивостью. Средние уровни прироста ИЛ2Р-позитивных лимфоцитов оказалось достоверно выше у больных, чем у здоровых (4,8±0,75% против 2,3±0,65%, р<0,001). Результаты теста активации лимфоцитов у 11 больных (44%) могут быть отнесены к высокодостоверным диагностическим классам, свидетельствующим о наличии сенсибилизации организма.
Средний процент дегрануляции тучных клеток крыс составил 30,6±3,42%, что превышает критическую величину в 30%. Иными словами даже в общей группе больных тест оказался положительным. У 12 больных (48%) показатели НДТК свидетельствуют о присутствии реагиновых антител в сыворотке.
В настоящее время проводится работа по более тонкой характеристике полученного аллергена. Поскольку аналоги подобных исследований в странах СНГ отсутствуют, необходимо привести некоторые предварительные результаты работы. Проводили гель-хроматографию на колонке (35±1,5 см), заполненной сефадексом G-75. На колонку наносили 800 мкг препарата, элюцию проводили 0,15М фосфатным буфером рН 7,4; скорость элюции 20 мл/ч. Образец элюировался двумя основными пиками, что достаточно необычно, поскольку наносили цельный экстракт тел аллергенов. Причем последний пик по объему выхода совпадает с выходом 0,25% раствора фенола, что позволяет идентифицировать его именно с ним. При нанесении на колонку чистого сывороточного альбумина оказалось, что он элюируется единым пиком, предшествуя первому пику препарата, можно думать о том, что молекулярная масса элюируемого белка ниже, чем чистого сывороточного альбумина (то есть меньше 60-70 кДа). Подобные рассуждения подтверждаются и данными диск-электрофореза: выявлена только одна полоса в грубом экстракте тел тараканов - иными словами, при используемом методе экстракции в водную фазу переходит только один белок из массы белков таракана. Идентичная по электрофоретической подвижности полоса присутствует только в одной пробе (фракция 6, которая совпадает с первым пиком). В других трубках аналогичных полос выявлено не было. Белковая фракция в препарате аллергена обладает большей подвижностью в электрическом поле, чем молекулы чистого сывороточного альбумина. Это свидетельствует, с одной стороны, о меньшей молекулярной массе имеющего белка, а с другой - о кислом его характере (движение к положительно заряженному полюсу). С концентрированными хроматографическими фракциями был поставлен тест непрямой дегрануляции тучных клеток крыс, в котором использованы сыворотки больных бронхиальной астмой, имевшим сильные скарификационные пробы и положительный результат в этой реакции с цельным экстрактом аллергена. Аллергенная активность присутствовала в концентрированной фракции 6.
Claims (1)
- Способ получения диагностического аллергена, включающий щелочную экстракцию исходного сырья с последующим центрифугированием, фильтрованием и стерилизующей фильтрацией целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют смесь замороженных тараканов, которые измельчают, после измельчения добавляют эфир в соотношении 1:3, встряхивают 10 мин, фильтруют, высушивают до полного испарения эфира, растирают до порошкообразного состояния, и к полученному порошку повторно добавляют эфир, используя на 60 г сырья 300 мл эфира, сушат до полного испарения эфира, затем проводят щелочную экстракцию при рН 7,0-7,2, перемешивают экстрагируемый материал в течение 30-40 мин и ежедневно в течение 3 суток встряхивают трижды по 30 мин с интервалом 1,5 ч, в интервалах между встряхиванием хранят при температуре от 2 до 10°С, после экстракции надосадочную жидкость сливают, центрифугируют при 5000-6000 об./мин в течение 30-40 мин, фильтруют, а после стерилизующей фильтрации стерильный раствор аллергена выдерживают от 1 до 3 месяцев при температуре от 2 до 10°С.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006114119/15A RU2311925C1 (ru) | 2006-04-27 | 2006-04-27 | Способ получения диагностического аллергена |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2006114119/15A RU2311925C1 (ru) | 2006-04-27 | 2006-04-27 | Способ получения диагностического аллергена |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2311925C1 true RU2311925C1 (ru) | 2007-12-10 |
Family
ID=38903748
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006114119/15A RU2311925C1 (ru) | 2006-04-27 | 2006-04-27 | Способ получения диагностического аллергена |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2311925C1 (ru) |
-
2006
- 2006-04-27 RU RU2006114119/15A patent/RU2311925C1/ru active IP Right Revival
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kumari et al. | Invitro anti-inflammatory and anti-artheritic property of Rhizopora mucronata leaves | |
He et al. | Ginseng (Panax ginseng Meyer) oligopeptides regulate innate and adaptive immune responses in mice via increased macrophage phagocytosis capacity, NK cell activity and Th cells secretion | |
Belska et al. | Water-soluble polysaccharide obtained from Acorus calamus L. classically activates macrophages and stimulates Th1 response | |
US7807622B2 (en) | Composition and use of phyto-percolate for treatment of disease | |
CN102258780B (zh) | 一种螨变应原冻干疫苗及其制备方法 | |
CN109400742A (zh) | 一种齿瓣石斛精制多糖及其制备方法和应用 | |
WO2007065024A2 (en) | Composition and use of phyto-percolate for treatment of disease | |
WO2006113925A2 (en) | Composition and use of phyto-percolate for treatment of disease | |
US10166270B2 (en) | Composition and method for affecting cytokines and NF-κB | |
RU2311925C1 (ru) | Способ получения диагностического аллергена | |
Franklin et al. | Comparison of honeybee venoms and their components from various sources | |
James et al. | In vitro study on inhibition of glycosylation of methanolic leaf extract of Hibiscus cannabinus | |
CN109939227A (zh) | 一种豚草花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法 | |
CN110100945B (zh) | 一种汉麻降血脂肽组合物及其应用 | |
RU2373947C1 (ru) | Способ получения диагностического аллергена из пыльцы растений | |
US10391135B2 (en) | Inhibition of formation of amyloid β-protein fibrils using cactus mucilage extracts | |
CN102319420A (zh) | 甲鱼肽在制药中的应用 | |
RU2428197C1 (ru) | Способ получения диагностического аллергена | |
RU2341272C1 (ru) | Средство для неспецифической иммунотерапии | |
Louis | Lipoatrophic diabetes: An improved procedure for the isolation and purification of a diabetogenic polypeptide from urine | |
JP4581082B2 (ja) | 自己免疫増強剤、その製造方法及びそれを用いた化粧料 | |
Kubota et al. | Single Cellular Algae Digestive Supplement Designed by Yeast & Lactobacillus Rearranged Leukocyte Subsets through Activation of Complement Components | |
IE46618B1 (en) | Peptide complexes of desoxyribonucleic acid(dna)obtained from dna-containing organisms | |
CN1042493C (zh) | 人胎胸腺素的制备方法 | |
CN110064052A (zh) | 一种英国梧桐花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150428 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20160610 |