JP4581082B2 - 自己免疫増強剤、その製造方法及びそれを用いた化粧料 - Google Patents
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また、一般に赤血球凝集素については100℃での熱処理によって、その糖鎖結合能力を喪失するという欠点がある。
上記の硫酸アンモニウムの飽和濃度は、「グリーン及びヒューズ(Green,A.A.& Hughes,W.L.)著(1955)「メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)、第1巻、第67〜90ページ」に記載されている[結晶硫酸アンモニウムの添加量と濃度(%飽和)との関係に関する表]に基づいて、規定されるものである。
この際用いる塩類水溶液としては、例えば生理食塩水や、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、2−メルカプトエタノール及びジチオスレイトールから選ばれる少なくとも一種を添加した液などがあり、特に、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液あるいはこれらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸亜鉛及び2−メルカプトエタノールから選ばれる少なくとも1種を添加した液が好ましい。
上記で得た液状体は、糖を主成分とする赤血球凝集素を含んでいる。このような糖としては、糖を構成している単糖の中のガラクトースの割合が70〜100%、特には90から100%のものが好ましい。本発明の自己免疫増強剤として上記液状体を用いる場合、糖のほかに糖の質量に対してタンパク質の質量が0.4以下であるタンパク質を含んでいてもよい。
なお、糖の定量は、標準試料としてガラクトースを用いて、フェノール硫酸法によって行い、タンパク質の定量は、標準試料としてウシ血清アルブミンを用いて、ローリー(Lowry)法によって行う。
例えば、日本産海藻では、オゴノリ属紅藻類(Gracilaria sp.)とは、非特許文献「新日本海藻誌日本産海藻類総覧、吉田忠生著、内田老鶴圃発行、1998年」においてオゴノリ目(Gracilariales:グラシラリアレス)オゴノリ科(Gracilariaceae:グラシラリアシー)に分類されている海藻を含む。
これらの紅藻類は、寒海にも存在するが特に暖海に多く、わが国ではほとんどすべての海岸地帯に分布しており、寒天の増量物や刺身のつまなどに用いられている。
(1)プロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツイン又はアシアロフェツインで阻害されること、
(2)ウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化すること、
(3)球状タンパク質を標準分子量物質として使用したときのゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、分子量100,000以上に相当する画分に溶出すること、
(4)細胞性免疫能力賦活活性を有すること、
(5)100℃、10分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有すること、
(6)ヒトリンパ球を幼若化する活性を有すること、
(7)トリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進させること。
ツルシラモ(徳島県吉野川河口域産)を0.15M塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、天日乾燥して乾燥物を得た。この乾燥物100gに0.15M塩化ナトリウム含有100mMリン酸緩衝液(pH6.9)700mlを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を4℃で6時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。
次いで、この粗抽出液に、最終濃度が35%飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて1段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、4℃で1時間放置、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度が70%飽和濃度の溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し、添加終了後、4℃で一晩放置した。生成した沈殿を遠心分離して分別した。得られた沈殿画分を、0.15M塩化ナトリウム含有100mMリン酸緩衝液(pH6.9)に再溶解し、粗活性画分を得た。得られた粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は256単位であり、比活性は3372.9単位/mgプロテイン、活性回収率は62.4%であった。ここで、凝集活性の単位は、凝集活性が検出できる試料の最大希釈率の逆数と定義した。これらの結果を表5に示す。
次に、このようにして得られた粗活性画分に100℃、10分間の熱処理を行い、遠心分離し不溶性の夾雑タンパク質を除去後、ゲル濾過クロマトグラフィーで分子量10万以上の画分を分画し、TSKgelDEAE−5PWを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、精製標品を得た。得られた精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を示す最小タンパク質濃度は0.8763μg/mlであった。以上の結果から、本発明の自己免疫増強剤を用いると、紅藻類由来の赤血球凝集素が、その活性を保持したまま効果的に得られることが分かる。
ツルシラモ(徳島県吉野川河口域産)湿質量500gを0.15M塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、−30℃で凍結した。30mM塩化カリウムと3μM硫酸亜鉛、5mM2−メルカプトエタノールを含んだ0.5Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液(pH8.2)を抽出用緩衝液として使用し、細かく粉砕した凍結海藻(ツルシラモ湿質量500g相当)に対し、抽出用緩衝液800mlを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を4℃で6時間放置後、遠心分離して上澄である粗抽出液を得た。
次いで、この粗抽出液に、最終濃度35質量%飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて1段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムの添加終了後、4℃で1時間放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度70%飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを添加し添加終了後、4℃で一晩放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分を、0.15M塩化ナトリウム含有100mMリン酸緩衝液(pH6.9)で再溶解し、次いで0.15M塩化ナトリウム含有100mMリン酸緩衝液(pH6.9)に対して透析し、粗活性画分を得た。得られた粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は256単位であった。ここで、凝集活性の単位は、凝集活性が検出できる試料の最大希釈率の逆数と定義した。
次に、このようにして得られた粗活性画分を100℃1分間で熱処理、遠心分離し不溶性の夾雑タンパク質を除去後、ゲル濾過クロマトグラフィーで分子量10万以上の画分を分画し、TSKgelDEAE−5PWを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、精製標品を得た。このようにして得た精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は2048単位であった。以上の結果から、本発明の自己免疫増強剤が、その活性を保持したまま得られることが分かる。
次いで5%CO2含有空気中37℃の湿潤状態で、3日間培養した。培養終了8時間前に3H−チミジンを培養液当りの最終濃度が1μCi/mlになるように各ウェルに分注した。
また、表2ないし4の陰性コントロールの平均値から明らかなように、紫外線を照射すると、3H−チミジンの取り込み量、すなわち免疫力が低下することが分かるが、実験区B及びCの結果から明らかなように、本発明の自己免疫増強剤を添加することにより、紫外線を照射しても3H−チミジンの取り込みが促進されることが分かる。
以上の結果から、自己免疫増強成分の粗活性画分・精製標品を紫外線照射処理によりDNA合成能力(3H−チミジンの取り込みなど)など免疫力が低下したヒトリンパ球に対して添加することにより、当該リンパ球のDNA合成能力など免疫力を増強させることができる。また、紫外線照射時間が30分以内であれば、紫外線を照射しなかったヒトリンパ球に自己免疫増強成分を添加した場合と同等のDNA合成能力まで上昇させることができる。紫外線を16時間照射しても、紫外線を照射しなかったヒトリンパ球に自己免疫増強成分を添加した場合の50%以上のDNA合成能力まで上昇させることができるし、紫外線を照射しなかった陰性コントロールと比較すると、3H−チミジンの取り込み量がはるかに多いことが分かる。
実施例1−(ロ)の粗活性画分の分別工程において、硫酸アンモニウム添加による2段階の塩析による分別処理の代わりに、50質量%エタノールによる分別処理[「フィトケミストリー(Phytochemistry)」第27巻、第2063〜2067ページ(1988年)参照]を行った以外は、実施例1と同様にして粗活性画分を得た。この粗活性画分のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性は4単位、比活性は53.4単位/mgプロテイン、活性回収率は5.0%であった。これらの結果を表5に示す。
常用の方法[「コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー(Comp.Biochem.Phisiol.)」第102B巻、第445〜449ページ(1992年)に記載されている方法]に従って、紅藻類由来の赤血球凝集素を得た。得られた粗活性画分の赤血球凝集活性は16単位、比活性は149.5単位/mgプロテイン、活性回収率は19.5%であった。これらの結果を表5に示す。また、精製標品のウサギ赤血球に対する赤血球凝集活性を示す最小タンパク質濃度は32.6μg/mlであり、実施例1の約1/40の比活性に相当した。
紅藻類から常用の方法[「コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロジー(Comp.Biochem.Phisiol.)」第102B巻、第445〜449ページ(1992年)に記載されている方法]に従って精製した分子量50,000の凝集素について、ウサギ赤血球に対する凝集活性のイオン濃度依存性を検討した。0.15M塩化ナトリウム濃度及び0.4M塩化ナトリウム濃度での凝集活性はともに1024単位であり、凝集活性のイオン強度依存性は見られなかった。これらの結果を表6に示す。
Con A[和光純薬(株)製]25mgをリン酸緩衝液100mlに溶解し、ウサギ赤血球凝集活性のイオン濃度依存性を検討した。0.15M塩化ナトリウム濃度及び0.4M塩化ナトリウム濃度での凝集活性はともに64単位であり、凝集活性のイオン強度依存性は見られなかった。これらの結果を表6に示す。
Claims (14)
- オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度35〜40%飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第1段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度60〜80%飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第2段目の塩析を行い、粗活性画分を沈殿として回収し、沈殿を適当な溶媒で溶解することにより細胞性免疫能力賦活活性を示す液状抽出物を分離し、捕集したのち、液状抽出物をさらに100℃において1〜10分間熱処理して夾雑タンパク質を除去し、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量100,000以上の画分を分画することを特徴とする、糖及びタンパク質を含む免疫増強剤の製造方法。
- 前記塩類水溶液が塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液である請求項1記載の糖及びタンパク質を含む免疫増強剤の製造方法。
- 前記塩類水溶液が塩化カリウム、硫酸亜鉛及び2−メルカプトエタノールから選ばれた少なくとも1種を含むトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液である請求項1記載の糖及びタンパク質を含む免疫増強剤の製造方法。
- 前記オゴノリ属紅藻類がオゴノリ(Gracilariaverrucosa)又はツルシラモ(Gracilaria chorda)あるいはそれらの亜種である請求項1〜3のうちいずれか一項記載の糖及びタンパク質を含む免疫増強剤の製造方法。
- 請求項1〜4のうちいずれか一項記載の免疫増強剤の製造方法により製造される糖及びタンパク質を含む免疫増強剤であって、プロナーゼ処理したヒツジ赤血球を凝集させる性質を有し、かつこの凝集活性が単糖類又は二糖類では阻害されないが、フェツイン又はアシアロフェツインで阻害される免疫増強剤。
- 請求項1〜4のうちいずれか一項記載の免疫増強剤の製造方法により製造される糖及びタンパク質を含む免疫増強剤であって、ウサギ赤血球に対する凝集活性がイオン強度により変化する免疫増強剤。
- 請求項1〜4のうちいずれか一項記載の免疫増強剤の製造方法により製造される糖及びタンパク質を含む免疫増強剤であって、細胞性免疫能力賦活活性を有する免疫増強剤。
- 請求項1〜4のうちいずれか一項記載の免疫増強剤の製造方法により製造される糖及びタンパク質を含む免疫増強剤であって、100℃、10分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有する免疫増強剤。
- 請求項1〜4のうちいずれか一項記載の免疫増強剤の製造方法により製造される糖及びタンパク質を含む免疫増強剤であって、ヒトリンパ球を幼若化する活性を有する免疫増強剤。
- 請求項1〜4のうちいずれか一項記載の免疫増強剤の製造方法により製造される糖及びタンパク質を含む免疫増強剤であって、トリチウムラベルしたチミジンの細胞核への取り込みを促進する免疫増強剤。
- 請求項1〜4のうちいずれか一項記載の免疫増強剤の製造方法により製造される免疫増強剤であって、糖及びタンパク質を含み、該タンパク質の質量が糖の質量に対し0.4以下である免疫増強剤。
- 請求項1〜4のうちいずれか一項記載の免疫増強剤の製造方法により製造される糖及びタンパク質を含む免疫増強剤を含有することを特徴とする化粧料。
- オゴノリ属紅藻類を塩類水溶液により抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度35〜40%飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第1段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度60〜80%飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第2段目の塩析を行い、粗活性画分を沈殿として回収し、沈殿を適当な溶媒で溶解することにより得られる細胞性免疫能力賦活活性を示す液状抽出物であって、球状タンパク質を標準分子量物質として使用するゲルろ過クロマトグラフィーにおいて、分子量100,000以上に相当する画分に溶出し、100℃、10分間の熱処理後も糖鎖結合活性を有する液状抽出物を有効成分とする、糖及びタンパク質を含む免疫増強剤。
- 請求項13記載の糖及びタンパク質を含む免役増強剤を含有することを特徴とする化粧料。
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