CN101724029B - 一种抗肿瘤蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗肿瘤蛋白RE26，其分子量约为26kD，等电点为4.3。其制备方法包括：粗分离得到RE26的粗提物，使用三次离子交换层析进一步分离纯化得到RE26蛋白纯品，用于在制备治疗、诊断和研究肿瘤特别是淋巴瘤性疾病的药物或试剂中的用途。本发明的抗肿瘤蛋白RE26有较专一识别淋巴瘤细胞并诱导其凋亡的活性，为治疗、诊断和研究肿瘤疾病特别是淋巴瘤疾病提供了一种新途径。

Description

一种抗肿瘤蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白及其制备方法，特别是一种来源于真菌的抗淋巴瘤蛋白及其制备方法。

背景技术

恶性淋巴瘤属于恶性肿瘤的一种，往往发生在年轻、壮年，对劳动力的影响非常大，因此引起了医学界特别的重视，发病的年龄是20岁到40岁的青壮年比较多见平均死亡年龄都大大低于45岁。

淋巴瘤是起源于淋巴系统的恶性肿瘤，分为霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤两大类。它的发生与淋巴细胞增殖分化产生的免疫细胞恶变有关，其病因目前尚未完全明确，可能与一些病毒的感染有关，比如EB病毒、肝炎病毒以及幽门螺旋杆菌病毒等。

目前，全球平均每9分钟就有1个新发病人。我国淋巴瘤发病率为0.02‰。每年新增患者约2.5万人，死亡人数近2万，淋巴瘤的威胁正在迅速显现。在亚洲地区，非霍奇金淋巴瘤发生率远高于霍奇金氏病，大约为9∶1，由于恶性程度更高、预后更差，所以一般谈到淋巴瘤就是指非霍奇金淋巴瘤。在我国，在恶性肿瘤发病率排名中，男性占第9位，女性占第10位。早期单药治疗非霍奇金淋巴瘤，治疗效果不明显，而且极易复发，患者存活率低。自1976年开始用CHOP方案(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松)治疗以来，其5年生存率上升到30％～40％，总体缓解率80％～90％。在造血干细胞移植应用于治疗非霍奇金淋巴瘤后，进一步提高了治愈率。但上述治疗方法易损伤正常组织，特别是伤害在抗肿瘤机制中占重要地位的机体免疫系统，而且常难彻底消灭肿瘤细胞，很多临床证据表明，残留或移植时回输的肿瘤细胞是导致复发的主要原因，患者生存期因而缩短。目前，随着医学的发展，生物治疗因其靶向性以及能达到体内肿瘤细胞的极微量残留，且副作用小等优点而将成为一种前景很好的新的治疗方法。

人们已经从真菌中发现了较多的抗肿瘤活性物质或成分，这些真菌包括一些大型的可食用菌类如香菇、巴西蘑菇、阿魏蘑菇、灵芝等，也包括有一些虫体内生真菌、植物内生或共生真菌以及海洋真菌等。发现的抗肿瘤物质有多糖、蛋白\肽类、小分子化合物以及一些尚不明确的成份。

紫皱盖罗鳞伞又叫喜山罗鳞伞(Rozites emodensis(Berk.)Moser)是一类产自较高海拔地区的可食用大型野生菇类(蕈类)，在云南、西藏、四川均有分布。本发明从该蕈体内分离出一类分子量约为26kD的蛋白质，具有较为专一的抗淋巴瘤活性，未见现有文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗肿瘤蛋白RE26，其N末端封闭，肽链中含有SEQID NO：1所示的序列NGLEEEETLLLLFFPP和SEQ ID NO：2所示序列NGTEQE，来源于紫皱盖罗鳞伞(Rozites emodensis(Berk.)Moser)子实体，并在子实体展开的伞盖中具有高含量，所述蛋白的分子量为26kD，等电点为4.3。

进一步的，所述蛋白经羟胺切割后得到24kD和17kD两条片段，24kD片段N段氨基酸序列如SEQ ID NO：1，17kD片段N端序列如SEQ ID NO：2所示。

所述蛋白可以特异识别并诱导肿瘤细胞特别是淋巴瘤细胞凋亡。

本发明的另一方面，涉及制备上述蛋白的方法，包括：

1)获得RE26粗提液：采取紫皱盖罗鳞伞(Rozites emodensis(Berk.)Moser)新鲜子实体，用蒸馏水洗净、沥干，加于一倍体积的pH 8.0的0.02mol/lTris-HCl缓冲液，4℃匀浆并温和搅拌过夜，离心后，将上清过滤去悬浮物即获得RE26粗提液。

2)分离纯化步骤1)的RE26粗提液，获得RE26蛋白纯品。

步骤2)所述的分离纯化方法为离子交换层析，先用填料粒径为45-300μm阴离子或阳离子交换树脂对RE26粗提液进行粗分离，再用填料粒径为15-45μm的阴离子或阳离子交换树脂进一步分离得到RE26纯品。

这里需要指出的是，本发明给出的天然来源的RE26蛋白的制备方案不是获得天然RE26的唯一方案。由于大多数蛋白质为酸性蛋白，在发现紫皱盖罗鳞伞(Rozites emodensis(Berk.)Moser)提取物即RE26粗提液具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用的前提下，利用本领域技术人员所熟知的各种蛋白纯化方法(如硫酸铵沉淀、亲和层析、疏水层析、反相层析)应用于本发明方案各步骤的增减、替换以及顺序调换，可以容易的将目的蛋白分离纯化，得到蛋白RE26的纯品。

根据本发明的一方面，本发明的蛋白具有能专一结合并高效抑制淋巴瘤细胞的活性，所述蛋白可以用于制备治疗肿瘤特别是淋巴瘤的药物。

本发明的再一个目的是提供所述蛋白在制备诊断和研究肿瘤疾病，特别是淋巴瘤的试剂中的用途。

RE26是从一类可食用野生蕈类紫皱盖罗鳞伞(Rozites emodensis(Berk.)Moser)中分离得到的一类专一识别并高效抑制淋巴细胞来源肿瘤的蛋白质，其分子量为26kD，等电点为4.3。实验证实，RE26在体外对多种淋巴瘤细胞(包括鼠源和人源)均具有高抑制作用，但对各种正常细胞以及其它组织来源的肿瘤细胞则毒性较小。使用倍比稀释法和MTT法测定RE26对常见的淋巴瘤细胞如Raji、EL-4和YAC-1的半抑制浓度(MIC₅₀)为3-4μg/ml，而对其它常见细胞的则至少大于30μg/ml。用荧光染料FITC标记RE26分子后，再作用于各种细胞，仅发现淋巴瘤细胞出现大量荧光，证明RE26能专一作用于淋巴瘤细胞，利用该性质，可以将RE26应用于淋巴瘤细胞特异性识别的研究和诊断领域。使用凋亡试剂盒和流式细胞术检测RE26对细胞的作用，发现在RE26作用于细胞2h时，淋巴瘤细胞出现明显的凋亡。检测RE26处理后细胞的三种重要凋亡酶Caspase3、Caspase8和Caspase9的活性，发现均有较明显的升高。在初步的动物毒性实验中，连续尾静脉注射RE26溶液于健康小鼠14天，未观察到异常反应，体重与正常组保持一致。使用裸鼠进行RE26抗淋巴瘤体内实验表明，RE26能有效地抑制Raji细胞在体内的成瘤。热稳定性测试实验证实，RE26在60℃以下活性稳定。这些实验表明RE26对淋巴瘤细胞具较为专一的识别作用，并能通过诱导淋巴瘤细胞凋亡而对其高效抑制，而对其它类型细胞则毒性很低，因此，RE26蛋白在淋巴瘤细胞的识别、淋巴瘤疾病的诊断以及治疗上应用前景看好。从RE26的来源、特征、活性等方面进行文献查新，未发现任何相同或相似的报道。

附图说明

图1.使用Sepharose Fast Flow Q柱进行第一次离子交换分离

流动相A：0.02mol/l Tris-HCl缓冲液，pH8.0；

流动相B：0.02mol/l Tris-HCl缓冲液，pH8.0，含1mol/l NaCl；

流速：5ml/min；

穿透峰洗脱后，依次使用7％B、30％B洗脱样品，收集30％洗脱峰。

图2.使用RESOURCE 15Q 4.6/100柱对RE26进行第二次阴离子交换分离。

流动相A：0.02mol/l Tris-HCl缓冲液，pH8.0；

流动相B：0.02mol/l Tris-HCl缓冲液，pH8.0，含1mol/l NaCl；

流速：1ml/min；

洗脱梯度：0％-30％B，50min

图3.使用RESOURCE 15S 4.6/100柱对RE26进行最后的精细纯化

流动相A：0.02mol/l HAc-NaAc缓冲液，pH3.6；

流动相B：0.02mol/l HAc-NaAc缓冲液，pH3.6，含1mol/l NaCl；

流速：1ml/min；

洗脱梯度：0％-30％B，30min

图4.RE26分离纯化的SDS-PAGE电泳鉴定图

1.纯化的RE26，分子量约26kD

M.分子量标记(MW Marker)

图5.RE26的等电聚焦图

1.纯化的RE26，等电点约为4.3

M.等电点标记(pI Marker).

图6.RE26的热稳定性

将溶于PBS的RE26溶液分别在20℃、40℃、60℃、80℃、100℃处理半小时后，冷却至4℃过夜，测定各组样品对淋巴瘤细胞(YAC-1)的抑制活性，以20℃处理样品的活性为100％，计算各组样品的活性保留。由图可知，RE26对温度比较敏感，60℃处理后有约75％的活性保留，而80℃以上则使之完全失活。

图7.RE26的酸碱稳定性

将RE26分别溶入pH为3-11的各缓冲液中，4℃静置过夜。再将各溶液的pH值调至中性后，测定RE26对淋巴瘤细胞(YAC-1)的抑制活性，如图所示，RE26对酸碱度的变化不敏感，在3-11的pH范围内活性均不受明显影响。

图8.RE26对淋巴瘤细胞的特异识别

使用偶联有FITC的RE26作用于各种细胞，观察RE26对各种细胞的特异识别，图中右侧均为各种细胞发出的绿色荧光照片，左侧为对应位置的相差显微照片。可以看出，两种淋巴瘤细胞显示出强的绿色荧光，而两种正常细胞则基本无荧光显示。

1.小鼠骨髓间充值干细胞；

2.小鼠红细胞

3.EL-4鼠淋巴瘤细胞

4.YAC-1鼠淋巴瘤细胞

图9.RE26引起淋巴瘤细胞凋亡的荧光观察实验

用浓度为0.5mg/ml的RE26处理YAC-1细胞1h后，再使用Annexin V-FITC与PI同时处理细胞，在荧光显微镜下分别激发绿色荧光和红色荧光进行观察。

A：绿色荧光和红色荧光叠加后的照片，只发出绿色荧光的细胞为凋亡早期细胞；外部为绿色荧光，内部发红色荧光的细胞为凋亡晚期细胞。

B：与A同一位置细胞的像差显微照片。

图10.RE26处理Raji细胞在不同时间点的三种凋亡酶活性

使用0.1mg/ml的RE26蛋白分别处理Raji细胞1、2、4、6小时后，使用凋亡酶活性检测试剂盒测定各组细胞中Caspase3、8和9的活性。

图中可以看到，用0.1mg/ml的RE26处理Raji细胞后6小时内，三种凋亡酶均有不同程度的上升。表明RE26能有效激活淋巴瘤细胞的凋亡酶系统而促使细胞凋亡。

图11.羟胺切割RE26的SDS-PAGE分析

1：使用2mol/l羟胺在pH9.0，45℃条件下处理RE2612小时所得产物，可以清楚的看到24kD和17kD两条带。

M：分子量Marker

图12.RE26抑制淋巴瘤形成的体内实验

分别向10只裸鼠右腋皮下注射1×10⁷的Raji细胞48小时后将其分为两组，用药组每天在接种肿瘤细胞旁皮下注射0.1ml 1mg/ml的RE26溶液，对照组以相同方法注射PBS溶液。观察各组裸鼠的肿瘤生成情况。

A：13天时对照组所有裸鼠均形成肿瘤(红圈所示)

B：用药组直至21天时也无明显肿瘤生成

具体实施方式

实施例一RE26蛋白质的分离纯化

(1)粗提液的获取：

采取已经充分展开的紫皱盖罗鳞伞(Rozites emodensis(Berk.)Moser)新鲜子实体，弃去杆部，将伞盖部用蒸馏水洗净、沥干，加入一倍体积的pH 8.0的0.02mol/l Tris-HCl缓冲液，4℃匀浆，用1mol/l的NaOH调节溶液pH至8.0，并温和搅拌过夜，离心后，将上清过滤去悬浮物即获得RE26粗提液。

(2)RE26的纯化：通过三次离子交换方法可获得高纯度的RE26蛋白。

第一次离子交换层析：使用有效柱高为10cm的Sepharose Q Fast Flow柱(粒径45-165μm)进行阴离子交换，使用pH 8.0，0.02mol/l的Tris-HCl缓冲液为流动相A，以含1mol/l NaCl，pH 8.0，0.02mol/l的Tris-HCl缓冲液为流动相B，整个过程线性流速保持1.5cm/min，通过在线检测280nm的紫外吸收值来确定蛋白质的流出情况。使用流动相A充分平衡离子交换柱后，将前述的粗提液直接上样，上样体积可达到柱体积的8-10倍。上样完成后，使用流动相A将不能被吸附的物质洗涤干净。首先使用7％B的流动相进行洗脱，可除去大量的色素成分；洗脱完成后，再使用30％B的流动相洗脱，收集洗脱组分；最后使用1mol/l的NaOH清洗离子交换柱进行柱再生，层析结果图如附图1所示。该步层析过程，可以除去较多的色素成分和其它杂质，并使有效成分得以快速浓缩，大大减小后期的处理体积。

第二次离子交换层析：使用有效柱高为10cm的RESOURCE 15Q柱，优选使用GE公司预装柱RESOURCE 15Q 4.6/100柱(粒径15μm)，进行阴离子交换层析。使用pH 8.0，0.02mol/l的Tris-HCl缓冲液为流动相A，以含1mol/lNaCl，pH 8.0，0.02mol/l的Tris-HCl缓冲液为流动相B，整个过程线性流速保持6cm/min，通过在线检测280nm的紫外吸收值来确定蛋白质出峰情况。使用流动相A充分平衡柱后，将已经对流动相A缓冲液充分透析后的第一次离子交换收集的组分进行上样，上样体积不超过柱体积两倍。使用流动相充分洗涤柱子后，在50分钟内将流动相B的浓度从0％线性提升至30％，收集的蛋白峰如附图2所示。

第三次离子交换层析：使用有效柱高为10cm的SOURCE 15S柱(粒径15μm)，优选使用GE公司预装柱RESOURCE 15S 4.6/100柱，进行阳离子交换层析。使用pH3.8，0.02mol/l的HAc-NaAc缓冲液为流动相A，以含1mol/l NaCl，pH3.8的0.02mol/l HAc-NaAc缓冲液为流动相B。将第二次离子交换层析所得的活性组分对水进行充分透析。使用流动相A充分平衡柱子，在每次上样之前，按9∶1比例混合对水充分透析的上一步骤收集的活性组分和pH3.8，0.2mol/l的HAc-NaAc缓冲液，然后立即上样。使用流动相A充分洗涤层析柱后，在30分钟内线性提升流动相B的浓度至30％，收集洗脱蛋白峰如附图3所示。收集到的蛋白峰应立即用0.2mol/l的NaHCO3溶液调至pH7左右。

本实施例提供了获取高纯度RE26的一种优选方案，但该方案并不限制本发明，本领域技术人员可根据需要将其它所熟知的各种纯化方法应用于该蛋白纯化过程。

实施例二RE26的部分理化性质研究

(1)SDS-PAGE电泳分析：

将实施例一分离得到的RE26用SDS-PAGE电泳(凝胶浓度为12％)来鉴定纯度，并测定分子量，实验结果如附图4所示，表明RE26样品纯度高于95％，RE26蛋白分子大小约为26kD。

(2)等电聚焦实验：

将纯化的RE26使用脱盐柱除盐，置换为纯水溶液。在Bio-Rad薄层等电聚焦仪上进行等电聚焦，使用pH3-10的两性电解质建立pH梯度。聚焦完成后，对比等电点Marker来确定RE26的等电点，约为4.3，如附图5所示。同时，纯化的RE26在等电聚焦中也表现出单一的条带，从另一方面说明本方法获得的RE26纯度很高。

(3)热稳定性实验：

将纯化的RE26溶解于0.02mol/l，pH7.2，含0.15mol/l NaCl的PBS中至1mg/ml，各取2ml溶液在室温、40℃、60℃、80℃和100℃下处理30min，然后4℃静置过夜，测定各不同温度处理后的RE26蛋白对淋巴瘤细胞的MIC₅₀，实验结果如附图6所示，表明RE26在60℃以下，活性比较稳定。

(4)酸碱稳定性实验：

将纯化的RE26分别溶解于pH 3、5、7、9、11的缓冲液中至1mg/ml，4℃静置过液，次日将所有溶液pH调回7.0，然后测定不同pH值处理后的RE26对淋巴瘤细胞的MIC₅₀，实验结果如附图7所示，表明RE26在3-11的pH值范围内活性稳定。

(5)N端测序实验：将RE26进行SDS电泳后，转移至PVDF膜上，用考马斯亮蓝R250快速染色，切下条带，使用Edman降解法测序。未得到结果，表明RE26肽链为N末端封闭。

实施例三RE26对多种细胞的最小抑制浓度MIC₅₀的测定

RE26的对各种细胞的MIC₅₀值通过采用倍比稀释后的药物作用于受试细胞48h以MTT法测定细胞活力的方法得出。受试细胞包括：Yac-1(小鼠T淋巴瘤细胞)、Raji(人Burkitt’s淋巴瘤)、HPC(人肝细胞)、Hepg2(人肝癌细胞)、El-4(小鼠淋巴瘤细胞)、MSC(小鼠间充质干细胞)、ECV-304(人脐静脉内皮细胞)、Vero-E6(非洲绿猴肾细胞)、小鼠原代脾脏淋巴细胞、大鼠血红细胞。

将RE26用1640-小牛血清培养基溶解至1mg/ml，再使用相同培养基依次二倍比稀释12次，待用。

将各种细胞配制成5×10⁴/ml浓度的细胞悬液，按每孔100μl接种于96孔板中，每种细胞接种39孔(即12个药物浓度组+1个对照组，每组3个复孔)。接种后的细胞在37℃ CO₂孵箱中孵育2h后，分别加入100μl各浓度的RE26溶液，对照组加入100μl 1640-小牛血清培养基，孵育48h。向每孔细胞中加入5mg/ml的MTT 20μl，继续孵育4h后，吸出各孔上清液，加入100μlDMSO(二甲亚砜)，充分振荡后，在酶标仪上测定570nm的光吸收值。按相同体积比的空白培养基+MTT+DMSO为空白对照，以每组三复孔的光吸收均值与对应的RE26浓度作图求出MIC50。各种细胞的测定结果如附表1所示。

表1RE26对多种细胞的最小抑制浓度MIC₅₀的测定

细胞株	细胞来源	MIC50(μg/ml)
			Yac-1	鼠T淋巴瘤细胞	3
El-4	小鼠淋巴瘤细胞	3.9
			Raji	人Burkitt’s淋巴瘤	3.9
CA46	人Burkitt’sB细胞淋巴肉瘤	5
			K562	人慢性髓原白血病	7.5
HPC	人肝细胞	250
			Hepg2	人肝癌细胞	80
MSC	小鼠骨髓间充质干细胞	100
			ECV-304	人脐静脉内皮细胞	250
Vero-E6	非洲绿猴肾细胞	125
			原代	小鼠脾脏淋巴细胞	75

可以看出RE26对三种淋巴瘤来源的细胞具有强抑制作用，其MIC₅₀相对其它细胞至少低接近1个数量级。而血红细胞在1mg/ml的RE26浓度下作用24小时基本无溶血现象。本实施例表明，RE26对淋巴瘤细胞有较特异的抑制作用，而对其它类型细胞的毒性较小，可能成为治疗淋巴瘤疾病的药物成份。

实施例四RE26对淋巴瘤细胞的特异识别研究

从实施例三中可以看出，RE26对淋巴瘤细胞具有高度选择的强抑制作用，本实施例则可以更为直观地表现出RE26对淋巴瘤细胞的选择性识别作用。

FITC是常见的标记蛋白质的荧光染料，可以让蛋白质带上绿色荧光，从而能用于蛋白质定位和示踪的研究。

将YJ-26(浓度1mg/ml)在交联反应液中透析3次，4℃，至PH＝9.0，交联反应液配方：7.56g碳酸氢钠，1.06g碳酸钠，7.36g氯化钠，加水定容至11。将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml，每次交联使用的FITC均应新鲜配置避光。按YJ-26∶FITC＝1mg∶0.15mg的比例将FITC缓慢加于待交联的YJ-26溶液中，边加边轻轻晃动，使其与YJ-26混合均匀，暗处，4℃反应8h。加入5mol/L的氯化铵至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2h将交联物在PBS中透析4次以上，至透析液清澈。

交联物浓度鉴定：

蛋白浓度(mg/ml)＝[A280-0.31*A495]/1.4.

FITC/蛋白比例＝3.1*A495/[A280-0.31*A495]，该值应介于2.5-6.5之间。

FITC交联的蛋白置于PH7.4的磷酸缓冲液中，加入0.1％NaN₃，1％BSA，4℃暗处保存。

将偶联好的FITC-RE26倍比稀释成3个浓度梯度，分别为0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml备用。

将待测细胞种于96孔板中，每孔细胞50μl，每孔细胞总数控制在1-2×10⁴，设3个复孔。

将稀释好的FITC-RE26加于细胞中，每孔50μl，于37℃，CO2孵箱中培养1h。

1h后，取出96孔板，离心(2000rpm，5min)，弃上清，每孔加100μlPBS，混匀洗涤，再离心(2000rpm，5min)，弃上清，重复3次。

在荧光显微镜下观察结果。如附图8所示，除了淋巴瘤细胞以外的其余细胞在所有的药物浓度下均无明显的荧光表现，而淋巴瘤细胞则可以观察到大量的荧光。本实施例表明，RE26可以专一结合于淋巴瘤细胞上，可能作为淋巴瘤疾病诊断、淋巴瘤细胞识别以及淋巴瘤特异受体研究的试剂成份。

实施例五RE26对淋巴瘤细胞的凋亡诱导观察

本实施例采用本领域技术人员所熟知的细胞凋亡测定手段：FITC-annexinV+PI双染色法测定细胞的凋亡情况。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，于磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸于凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将AnnexinV进行荧光素(FITC)标记，以标记的AnnexinV作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙叮(PI)是一种核酸染料，它不能通过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红，因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于凋亡时期的细胞区分开来，即处于凋亡早期的细胞由于细胞膜完整，但磷脂酰丝氨酸外翻，只能与Annexin V-FITC结合，而呈现单一绿色荧光，无红色荧光；而凋亡晚期(或已死亡)的细胞由于细胞膜结构已经有破裂，Annexin V-FITC能与其膜结合发绿色荧光，而且PI也能进入细胞，使细胞核发红色荧光。

将RE26用1640培养基配成浓度为0.5mg/ml溶液。将待测细胞种于96孔板中，每孔细胞50μl，每孔细胞总数为1×10⁴，设3个复孔。

将RE26加于细胞中，每孔50μl，于37℃，CO₂孵箱中培养1h。

将96孔板离心(2000rpm，5min)，弃上清，加PBS 100ul洗涤2次，弃PBS上清，加Binding Buffer 100μl。然后加Annexin V-FITC 1μl，PI 1μl，于37℃，CO2孵箱中培养10min。

用荧光显微镜观察实验结果，如图9所示。

实施例六使用流式细胞术研究RE26诱导淋巴瘤细胞凋亡的情况

为了更准确或者说可以定量研究RE26诱导淋巴瘤细胞凋亡的情况，跟据实施例五中的原理，使用流式细胞术来定量检测RE26诱导淋巴瘤细胞凋亡的情况。实验步骤如下：

分别将1×10⁶的yac-1细胞接种于12孔板，在含10％小牛血清的1640培养基中37℃培养1小时。

于12孔板中加入终浓度分别为0.4mg/ml、0.04mg/ml、0.004mg/ml、0.002mg/ml和0.001mg/ml的RE26蛋白，以加入PBS的细胞为对照组，各设3个复孔。

将12孔板放入37℃孵箱培养2小时。

离心，收集各孔细胞，用PBS洗2遍。分散于0.4ml的Binding Buffer，加3μl AnnexinV-FITC和3μl PI溶液，继续培养10min。

用流式细胞仪分选未凋亡、凋亡晚期和凋亡早期的细胞。

流式分选结果如表2所示。

表2RE26诱导YAC-1淋巴瘤细胞凋亡的流式细胞术检测结果

可以看出，当RE26浓度高于0.04mg/ml时，在两小时内就可以引起淋巴瘤细胞发生比较明显的凋亡。

实施例七：Caspase凋亡抑制剂实验。

Caspase是一类在细胞凋亡过程中发挥重要作用的蛋白因子，

将1.5×10³的YAC-1细胞种于96孔板中。

使用Caspase3凋亡抑制剂VAD与RE26共同作用于细胞，观察z-VAD-fmk能否抑制RE26引起的细胞凋亡。实验分组如下：每组设3个复孔，因为z-VAD-fmk是溶解于DMSO中，所以对照组以DMSO作为空白对照。

(1)培养基+DMSO(1μl)(0％对照)

(2)培养基+细胞+DMSO(1μl)(100％对照)

(3)培养基+细胞+z-VAD-fmk(1μl)+RE26(分别为4，8，12μg/ml)

(4)培养基+细胞+DMSO(1μl)+RE26(分别为4，8，12μg/ml)

将此处理后的细胞于CO₂孵箱中37℃培养24小时。24小时后，用MTT法测定各孔细胞活力。结果如表3所示。

表3Caspase抑制剂，z-VAD-fmk对RE26诱导YAC-1细胞凋亡的抑制作用

可见Caspase抑制剂z-VAD-fmk可以有效地抑制RE26引起的淋巴瘤细胞凋亡。说明Caspase在RE26诱导的淋巴瘤细胞凋亡途径中起重要作用。

实施例八RE26蛋白对凋亡酶活性的影响

将Raj i细胞按4×10⁶/孔的浓度用1640+10％胎牛血清培养于12孔板中，分别使用终浓度为0.1mg/ml的RE26蛋白处理细胞1、2、4、6小时(每个时间点做两个复孔)，离心收集细胞，用PBS洗涤两次后测定细胞Caspase3、8、9的活性，以仅加入PBS的细胞作为空白对照。活性测定试剂盒为南京凯基公司生产，方法为分光光度测定法，实验流程按试剂盒说明书进行操作。测定结果如图10所示。从图中我们可以看到，用药物处理Raji细胞的6小时中，三种Caspase酶的活性均呈现上升趋势。Caspase3、8、9这三种凋亡酶在细胞凋亡过程中起有重要作用，其中Caspase8和Caspase9参于细胞凋亡的起始，Caspase3则是参与细胞凋亡的执行。本实施例表明RE26能有效地引起淋巴瘤细胞内凋亡酶体系的活化，使细胞进入凋亡程序，这一结果与前述的Caspase酶抑制实验的结果相符。

实施例五至实施例七都可以证明RE26抗淋巴瘤的主要机制是通过激活细胞内源凋亡酶而引起淋巴瘤细胞凋亡。

实施例九：RE26的部分测序

天然RE26的N端封闭，不能直接从N端测得氨基酸序列。羟胺在碱性条件下可以对肽链中的Asn-Gly肽键进行专一切割。在本实施例中，主要测定了由羟胺切割RE26后产生的肽段的部分序列。

1mg/ml的RE26水溶液按1∶1比例加入pH9.0的4mol/l羟胺溶液中，45℃水溶12小时后，对水透析除去羟胺，使用SDS-PAGE检测产生的肽段情况。如图11所示，RE26在被羟胺切割后主要产生大小约24kD和17kD的两条大片段，因为这两条片段的分子量大小之和远大于26kD，所以它们肯定不是由一次切割产生的，而表明RE26中至少含两个羟胺切割位点。将RE26羟胺降解产物进行SDS-PAGE电泳后，印迹至PVDF膜上，分别对该两个片段进行Edman降解测序，其中24kD片段的N端前15个氨基酸序列为GLEEEETLLLLFFPP，因为该片段是羟胺切割产物，所以该序列的前一个氨基酸为Asn，也就知道了该肽段部分的16个氨基酸序列即NGLEEEETLLLLFFPP，将该序列在现有蛋白数据库中查询，未发现具有相同的序列片段的已知蛋白；而17kD肽段因为信息较弱而仅测得5个氨基酸序列，即N-GTEQE。

实施例十：体内抑制Raji细胞成瘤实验

本实施例主要检测RE26在体内能否抑制Raji细胞的肿瘤形成。将10只四周龄Bulb/c雌性裸鼠分为两组，对照组和用药组各5只。Raji细胞由1640培养基+10％胎牛血清培养，于对数生长期时离心分离细胞，用PBS洗涤两次后用无血清1640培养基悬浮并计数，调整至细胞浓度为1×10⁸/ml。向各只裸鼠右腋下皮下注射0.1ml细胞悬液(细胞数1×10⁷)。注射细胞48小时后开始给药，给药方式为皮下注射于接种Raji细胞位点的旁边，注射剂量为0.1ml浓度为1mg/ml的无菌RE26溶液(PBS溶解)，每天一次。对照组每天以相同方式注射无菌PBS溶液。每天观察裸鼠腋下是否有肿瘤生长，记录各只裸鼠的成瘤时间并计算成瘤率。实验结果见图12和表4所示：对照组裸鼠在13天时全部长出肿瘤；而用药组至21天时仍无一只出现肿瘤，同时，用药组裸鼠体形正常，无明显的不良反应。可见RE26对Raji细胞在裸鼠体内的成瘤作用具有高效的抑制作用。

表4RE26蛋白体内抑制Raji细胞成瘤实验

实验组	成瘤时间	成瘤率
			对照组	12±1天	100％
用药组	至21天时，所有裸鼠均无肿瘤生长	0％

由上述实验可以看出，本发明的RE26蛋白可以特异地识别淋巴瘤细胞，通过提高细胞自身凋亡酶的活性，达到对诱导淋巴瘤细胞凋亡的目的。体内外实验均表明该蛋白具有良好的抗肿瘤效果，治疗窗口大，毒副作用低，药效稳定可靠，为临床肿瘤治疗提供了一种新途径，具有良好的医学和科研应用前景。

Untitled2.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学华西医院

<120>一种抗肿瘤蛋白及其制备方法和应用

<130>CD520-09P108055

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>Rozites emodensis(Berk.)Moser

<400>1

Asn Gly Leu Glu Glu Glu Glu Thr Leu Leu Leu Leu Phe Phe Pro Pro

1               5                   10                  15

<210>2

<211>6

<212>PRT

<213>Rozites emodensis(Berk.)Moser

<400>2

Asn Gly Thr Glu Gln Glu

1               5

Claims (1)

1.一种抗肿瘤蛋白RE26，其特征在于：其N末端封闭，肽链中含有SEQ ID NO：1所示的序列NGLEEEETLLLLFFPP和SEQ ID NO：2所示序列NGTEQE； 

所述蛋白来源于紫皱盖罗鳞伞（Rozites emodensis (Berk.) Moser）；

分子量为26kD，等电点为4.3；

经羟胺切割后得到24kD和17kD两条片段，24kD片段N段氨基酸序列如SEQ ID NO：1，17kD片段N端序列如SEQ ID NO：2所示；

所述蛋白由如下方法制备得到，其包括：

1）获得RE26粗提液：采取紫皱盖罗鳞伞（Rozites emodensis (Berk.) Moser）新鲜子实体，用蒸馏水洗净、沥干，加于一倍体积的pH 8.0的0.02mol/l Tris-HCl缓冲液，4℃匀浆并温和搅拌过夜，离心后，将上清过滤去悬浮物即获得RE26粗提液；

2）分离纯化步骤1）的RE26粗提液，获得RE26蛋白纯品；

所述步骤2）所述的分离纯化方法为离子交换层析，先用填料粒径为45-300μm阴离子或阳离子交换树脂对RE26粗提液进行粗分离，再用填料粒径为15-45μm的阴离子或阳离子交换树脂进一步分离得到RE26纯品。

2.根据权利要求1所述蛋白RE26，其特征是：所述蛋白可以特异识别并诱导肿瘤细胞凋亡，所述肿瘤细胞为淋巴瘤细胞。

3.制备如权利要求1或者2所述蛋白RE26的方法，包括：

1）获得RE26粗提液：采取紫皱盖罗鳞伞（Rozites emodensis (Berk.) Moser）新鲜子实体，用蒸馏水洗净、沥干，加于一倍体积的pH 8.0的0.02mol/l Tris-HCl缓冲液，4℃匀浆并温和搅拌过夜，离心后，将上清过滤去悬浮物即获得RE26粗提液；

2）分离纯化步骤1）的RE26粗提液，获得RE26蛋白纯品。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：步骤2）所述的分离纯化方法为离子交换层析，先用填料粒径为45-300μm阴离子或阳离子交换树脂对RE26粗提液进行粗分离，再用填料粒径为15-45μm的阴离子或阳离子交换树脂进一步分离得到RE26纯品。

5.权利要求1或者2所述蛋白RE26在制备治疗肿瘤的药物中的用途；所述的肿瘤为淋巴瘤。

6.权利要求1或者2所述蛋白RE26在制备诊断和研究肿瘤疾病的试剂中的用途；所述肿瘤疾病为淋巴瘤。

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