具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下,对本发明所作的修饰或者替换,均属于本发明的范畴。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1圆柏花粉原料的鉴别
由于原料的鉴别和纯度对于后续变应原诊断及治疗制剂极为重要,本实施例采用DNA特异性序列检测加显微镜检对圆柏原料进行双重鉴别及质控。
1、圆柏花粉DNA提取
采用天根快速DNA提取扩增试剂盒(天根生化KG203)。
提取方法:称取5mg圆柏花粉样品置于1.5mL离心管中,加入Buffer 1100μl后用一次性研磨杵将样品彻底研碎后加入Buffer 2 100μl后震荡混匀,离心机12000r/min离心5min后取上清液于新的离心管中作为DNA模版备用。
2、引物设计及合成
引物序列如下:
Sab c ITS2-F(SEQ ID NO.1):5'-atgcgatacttggtgtgaat-3'
Sab c ITS2-R(SEQ ID NO.2):5'-gacgcttctccagactacaat-3'
引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。合成后分装-20℃保存。
3、PCR反应体系
PCR扩增试剂盒(天根生化)。对提取的DNA采用如下50μl体系的配制PCR反应体系见表1:
表1.圆柏花粉ITS2序列PCR反应体系
4、PCR反应条件见表2.
表2.圆柏花粉ITS2序列PCR反应条件
对PCR扩增后的反应液进行2%琼脂糖电泳(加Gen green核酸染料),150V、100mA20min电泳观察,电泳结果如图1所示。
5、测序
利用PCR产物纯化回收试剂盒(生工SK1141),回收PCR产物进行测序,测序结果编号Sab c ITS2,如SEQ ID NO.3所示。
6、圆柏的显微镜检
花粉粒近球形到扁球形,大小平均为20×23微米。具3沟,沟宽,沟端嚼烂状,沟膜上具排列不均匀的颗粒状纹饰。外壁两层明显,表面具网状纹饰。
实施例2圆柏花粉脱脂及浸提关健工艺步重要参数的确定
1、圆柏花粉脱脂工艺步参数确定
(1)将圆柏花粉(g)与丙酮(ml)以1:2的重量体积比(w/v)进行脱脂处理。对不同批次(不同采集时间)的圆柏花粉不同脱脂时间样品进行脂肪含量进行检测,以确定最优的脱脂时间。
采用海能SOX500脂肪测定仪测定圆柏花粉中脂肪含量,通过索式萃取及干燥称重的方法,对比萃前后花粉重量的变化,得到相对应的脂肪含量,并根据脂肪含量结果对之后脱脂后花粉进行质量控制.
结果见图2,可见丙酮脱脂时间为30min后,脂肪含量几乎不随脱脂时间延长而下降,因此脱脂时间确定为30min。
(2)脱脂参数的验证:对不同批次(不同采集时间)的圆柏花粉进行30min脱脂后检测脂肪含量,结果如表3所示。
表3.不同批次圆柏花粉脱脂30min后脂肪含量降低百分比
从结果得知,圆柏花粉中脂肪含量在1%-2.1%左右,故在之后脱脂过程中,脱脂后的圆柏花粉在脂肪含量上应该下降1-2.1%左右,也就是花粉总重同比也应该下降1-2.1%左右。
2、圆柏花粉蛋白浸提工艺步重要参数确定
(1)将圆柏花粉(g)与丙酮(ml)以1:2的重量体积比(w/v)进行搅拌或振荡脱脂30分钟处理,静置分层,观察上层液体澄清情况,重复脱脂至上层液体澄清后,将脱脂后的花粉均匀摊开,室温下干燥48小时以上。
(2)将脱脂干燥后的圆柏花粉按重量体积比1:10加入10L,pH 7.9~8.2磷酸盐—盐水缓冲液,2~8℃,在搅拌速度为250rpm条件下,在搅拌时间分别为3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h、72h等提取点时,将提取后的提取液,将浸提液全部加入到离心桶内,调节平衡,离心力8000~12000g,离心温度4℃,时间设定为15~20分钟,进行离心,收取上清。
(3)将离心分离后的上清液先用4000目滤布过滤后,通过纸板过滤,0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤;得到圆柏花粉粗提取液。
取样以Bradford法测定蛋白含量,结果见图3。
如图3结果表明,在蛋白提取过程中,随搅拌提取时间延长,蛋白提取含量增大,提取时间24h含量达到最高329±5μg/ml,可见蛋白类物质提取时间过长会影响其蛋白含量,故提取时间优选为22~26h左右。
实施例4圆柏花粉变应原原液(冻干品)制备工艺
1、按实施例3圆柏花粉原料工艺制备圆柏花粉原料。
2、浸提
将脱脂干燥后的圆柏花粉按重量体积比1:50~1:10加入10L,本实施例中为1:10,以pH 7.9~8.2磷酸盐—盐水缓冲液,2-8℃搅拌22~26h进行浸提。其中以配制1000ml磷酸盐—盐水缓冲液(pH 8.2)为例的配方如表4。磷酸盐—盐水缓冲液充分溶解后除菌过滤,2~8℃放置,保存期不超过30天。
表4磷酸盐—盐水缓冲液(pH 8.2)配方
3、固液分离
取提取后的浸提液,将浸提液全部加入到离心桶内,调节平衡,离心力8000~12000g,离心温度2~8℃,时间设定为15~20分钟,进行离心,收取上清;
4、澄清
将离心分离后的上清液先用4000目滤布过滤后,将滤液依次通过纸板过滤、0.45μm和0.22μm滤膜依次过滤;
5、超滤、透析、浓缩
过滤后的浸提液,用3KD或1KD超滤膜切向流超滤,优选地,本实施例中用3KD超滤膜超滤。透析液选用25-125mM的NH4HCO3,本实施例中优选为50mM的NH4HCO3。根据蛋白含量质量标准,超滤浓缩至适当体积,检测蛋白含量至质量标准的总蛋白含量区间。取样超滤浓缩液、超滤透过液,检测其总蛋白含量。当超滤透过液中总蛋白含量≤0.02mg/ml,则直接排弃透过液;超滤透过液总蛋白含量>0.02mg/ml,则对超滤膜进行完整性测试,超滤膜未破损,则排弃透过液;若超滤膜破损,则更换超滤膜之后对透过液重复超滤。
6、无菌过滤
用0.22μm膜除菌过滤。
7、冻干
按照冻干工艺条件,-50~-35℃冻结,2~8mbar真空压力下,-25℃干燥,控制水分含量≤3%;获得圆柏花粉变应原原液(冻干品)。
实施例5圆柏花粉变应原浸液成品制备工艺
1、复溶
将实施例4制备的圆柏花粉变应原冻干品用磷酸盐—盐水缓冲液(pH6.5~7.5,配方见表5)复溶,至总蛋白含量位于质量标准2倍范围区间。2~8℃放置。
表5.磷酸盐—盐水缓冲液(pH值6.5-7.5)配制
2、半成品配制
原液复溶后,在净化车间内A级洁净条件下,将复溶液与等体积预先湿热灭菌(121℃、30分钟)并冷却的甘油混匀,调节溶液pH值至6.0~8.0。
3、半成品除菌过滤、无菌分装为成品
在净化车间内A级洁净条件下,将半成品通过0.22μm滤膜除菌过滤,无菌分装为成品,得到pH6.0~8.0浅黄色至棕色液体即为圆柏花粉标准化变应原浸液成品。
实施例6圆柏花粉变应原浸液成品质量控制
1、实施例5制备的圆柏花粉标准化变应原浸总蛋白成分SDS-PAGE法鉴别
采用还原型SDS-PAGE法,分离胶浓度为4~12%,考马斯亮蓝染色。结果如图4所示。M为Genstar M223-01Marker,R为冻干内部参考品(即冻干的圆柏花粉变应原原液),L1,L2和L3为不同批次圆柏花粉标准化变应原浸液,其蛋白分布主要在18kDa、20kDa、24kDa、28kDa、32kDa、38kDa、43.5~50.0kDa、56kDa、66kDa、85kDa。其中鉴定的致敏蛋白分子量、序列、过敏血清阳性率、对应全蛋白质谱鉴定肽段概览见表6。
2、圆柏花粉标准化变应原浸总变应原成分Western Blotting法鉴别
采用还原型SDS-PAG电泳,分离胶浓度为4~12%,0.2μm PVDFImmobilonR-PSQ转印膜,一抗血清反应稀释度1:3,室温杂交2h,随后置于4℃冰箱杂交过夜,1×PBST洗3次,10min/次。。二抗Ms mAb to Hu IgE(ab99806)1:1000室温杂交2h,1×PBST洗3次,10min/次。将ECL显影液A液和B液1:1混匀后曝光显色。
结果见图5所示。其中,M为Genstar M223-01Marker,R为内部参考品,N为浸液与健康受试者血清反应条带,P1-21分别为21个浸液的样本与24例临床确诊的圆柏过敏阳性患者(sIgE≥3级,皮试≥+++,典型的夏秋季花粉症病史)血清反应条带结果图5(a)为P1-P9,图5(b)为P10-P21,其中致敏Sab c 1-Sab c 11的分子量及过敏血清阳性率汇总如表6,由此确定血清阳性率最高的Sab c 1(43.5~50.0kDa)为圆柏花粉的主要致敏蛋白(血清阳性率最高,为76.2%)。
3、致敏蛋白序列测定
本发明产品对相应致敏蛋白(见表6)进行了全蛋白序列测定,并对圆柏花粉原料中每一致敏蛋白对应mRNA进行了核苷酸全长测序,致敏蛋白代码、序列标识及氨基酸全长序列、对应mRNA全长序列结果详见表6。
其中本发明所含圆柏致敏蛋白的全序列依次为:
Sab c1致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.4所示序列;
Sab c2致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.5所示序列;
Sab c3致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.6所示序列;
Sab c4致敏蛋白全序列为SEQ ID NO.7所示序列;
通过对圆柏花粉原料中上述每一致敏蛋白对应mRNA进行了核苷酸全长测序后,其mRNA对应序列如下
Sab c1致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.8所示序列;
Sab c2致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.9所示序列;
Sab c3致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.10所示序列;
Sab c4致敏蛋白基因全序列为SEQ ID NO.11所示序列;
4、质谱检测
对圆柏变应原浸液进行全蛋白质谱分析以及对圆柏变应原经SDS-PAGE分离后对应的胶条分别取样进行质谱鉴定,其主要包含且不限于以下肽段如:
Sab c1质谱鉴定的肽段:
各肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.12-SEQ ID NO.30所示;
Sab c2质谱鉴定的肽段:
其氨基酸序列如SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.42所示;具体如下,
SEQ ID NO.31:SEVSFVHLDGAK
SEQ ID NO.32:DLTCGPGHGMSIGSLGK
SEQ ID NO.33:NIHGTSATTAAIQLMCSDSVPCSNIK
SEQ ID NO.34:FIDTQNGLR
SEQ ID NO.35:VDGTIAAYPDPAK
SEQ ID NO.36:VATCVNK
SEQ ID NO.37:HDSTDAFEK
SEQ ID NO.38:IWMHFAR
SEQ ID NO.39:WWSDQCK
SEQ ID NO.40:KSSAVFLVPANK
SEQ ID NO.41:EVTLMNSPEFHLVFGECDGVK
SEQ ID NO.42:ESPNTDGIDIFASK
Sab c3质谱鉴定的肽段:
SEQ ID NO.43:LDQGQTWTVNLAAGTASAR
Sab c4质谱鉴定的肽段:
SEQ ID NO.44:VVMEQSVHELEEVFK
SEQ ID NO.45:ISGSDLADILR
SEQ ID NO.46:SLGSEVGEAEVK
表6圆柏花粉致敏蛋白分子量、序列、过敏血清阳性率情况概览
5、理化性质检测
该圆柏变应原浸液经理化性质检验后,其质量标准如表7:
表7圆柏花粉变应原浸液理化性质质量标准
6、总变应原活性测定
当变应原浸液包含治疗有效量或诊断有效量的圆柏花粉变应原时,用竞争性ELISA法测定相对生物效价为5000BAU/ml-20000BAU/ml。
7、无菌检查
不得有菌生长。
实施例7圆柏花粉变应原浸液成品稳定性试验
对实施例5制备的圆柏花粉标准化变应原浸液成品在2-8℃下进行长期稳定性研究试验,分别对三个批次样品分别检测0时,3个月,6个月,9个月和12个月的pH值变化,苯酚含量,甘油含量,氯化钠含量,蛋白含量和总变应原活性的变化情况,结果如图6至图11所示。
从上述稳定性结果中,可以发现在12个月长期试验中,圆柏花粉标准化变应原浸液各质控参数虽有不规则波动,可能是实验误差导致,但均在质量标准质控范围内,且不同批次间变化趋势基本一致,这说明按照本发明所述的圆柏花粉标准化变应原浸液,在2-8℃条件下,至少12月内能稳定地保存。因此,圆柏花粉变应原浸液成品的效期合理预计在36个月。
实施例8本发明圆柏变应原浸液与圆柏变应原注射液医疗机构制剂(北京协和医院)Western Blotting对比研究
本发明变应原浸液组方中加入了50%的甘油作为稳定剂,优化了磷酸盐缓冲液pH及配方,使其更适合花粉变应原的浸提及保存,且原料经DNA条码技术鉴定,保障了纯度,原液采用了优化的冻干工艺,上述设计及工艺实现使按发明获得的变应原浸液成品稳定好、变应原活性得到良好保存,从而提高临床使用的有效性和安全性。为验证本发明下的处方及工艺对圆柏变应原活性保存优于已有工艺及处方配制的同品种圆柏变应原粗提液,本实施例针对圆柏变应原浸液(本发明,即下述为A的产品)及圆柏变应原注射液医疗机构制剂(北京协和医院配制,采用pH为8.2的Coca’s液提取,主要成分0.5%的NaCl、0.275%NaHCO3、0.4%的苯酚和注射用水,即下述为B的产品)做了稳定性对比研究。
本实施例通过对比A产品和B产品4℃(温度控制2~6℃,避光保存)长期放置12月后,分别在0点和12月取样,以产品与圆柏过敏患者血清池(15例圆柏过敏患者组成的血清池,sIgE≥3级,皮试≥+++,典型的夏秋季花粉症病史者入选)的Western Blotting反应评价稳定性差异。
试验采用还原型SDS-PAG电泳,分离胶浓度为4~12%,0.2μm PVDFImmobilonR-PSQ转印膜,一抗血清反应稀释度1:3,室温杂交2h,随后置于4℃冰箱杂交过夜,1×PBST洗3次,10min/次。。二抗Ms mAb to Hu IgE(ab99806)1:1000室温杂交2h,1×PBST洗3次,10min/次。将ECL显影液1:1混匀后曝光显色。
结果见图12所示,其中,M为蛋白分子量Marker(Genstar),N为浸液与健康受试者血清反应条带,L1和L2分别为本发明产品0时(A0)和12月(A12)与血清池反应结果,L3和L4分别为原医院制剂0时(B0)和12月(B12)与临床血清池反应条带结果。结果表明,本发明产品A对比原制剂B,Sab C 4(18kD)的蛋白活性得以保存,本发明产品比原医院制剂产品在4℃放置12月后,不仅主要致敏蛋白条带清晰,其余多个致敏条带反应仍较明显,说明本发明产品中圆柏致敏蛋白更为丰富,保存较好,活性也较高从而证实本发明产品更为稳定、有效。以相对生物效价为5000BAU/ml、10000BAU/ml、15000BAU/ml、20000BAU/ml的变应原浸液(对应总蛋白浓度约0.40mg/ml、0.80mg/ml、1.2mg/ml、1.60mg/ml)进行血清反应均能得到清晰条带。
实施例9评价应用1
本发明的制备的圆柏花粉变应原浸液对圆柏花粉过敏进行临床特异性皮试诊断的有效性和安全性。方法:选择2015-08-24日至2016-09-21间,在北京协和医院变态反应科门诊就诊的、患有过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、过敏性哮喘、荨麻疹、过敏性皮炎等过敏性疾病的门诊患者1029例。对受试者进行圆柏花粉变应原皮肤点刺试验(Skin prick test,SPT),采用制备的应变原浸液按1:1000稀释液进行,以平均风团直径(Mean whealdiameter,MWD)为判读标准;以花粉sIgE为标准,做ROC分析,分析不同诊断界值下,采用圆柏花粉变应原浸液用于诊断圆柏花粉过敏的准确性。同时记录不良事件,评价安全性。结果(Results)共入组门诊患者1029例(4~70岁),无脱落病例,剔除率25.66%。安全集(SafetySet,SS)1026例,全分析集(Full AnalysisSet,FAS)1007例,符合方案集(Per protocolset,PPS)765例。年龄最小6岁,最大67岁。分析PPS集的ROC曲线,估算圆柏花粉SPT的最佳诊断阈值为MWD 5.25mm;特异度达95%时的诊断阈值为MWD 5.75mm。分别以MWD 3mm(国际通用阈值)、3.25mm、4.75mm为诊断阈值,本发明的圆柏花粉变应原浸液用于诊断圆柏花粉过敏的灵敏度依次降低,分别为0.7400(95%CI:0.7016~0.7784)、0.7000(95%CI:0.6598~0.7402)、0.5320(95%CI:0.4883~0.5757);特异度依次升高,分别为0.7698(95%CI:0.7191~0.8205)、0.8264(95%CI:0.7808~0.8720)、0.9509(95%CI:0.9249~0.9769)。1029例患者中有6例出现7次不良事件,不良事件发生率0.583%(6/1029),主要表现为流涕,喷嚏,鼻痒、呼吸不畅、眼痒、胸闷、点刺局部皮肤反应等。无严重不良事件。结论:本发明圆柏花粉变应原浸液用于诊断圆柏花粉过敏,诊断价值较高,安全性好,可作为圆柏花粉过敏原特异性体内诊断的临床检查方法。
实施例10评价应用2
本发明的制备的圆柏花粉变应原浸液对圆柏花粉过敏患者全血进行嗜碱性粒细胞活化试验,能进行临床特异性过敏体外诊断。这个检测方法在IgE或非IgE介导的过敏反应中均适用,可以用于部分sIgE体外诊断存在假阴性、假阳性患者的确诊及部分过敏性休克患者不适于进行皮试诊断的情况。
试验原理:变应原与患者全血细胞反应可以模拟人体内变态反应过程:即特异性IgE抗体通过与相应的变应原桥联结合到细胞表面,激活细胞内信号级联导致嗜碱性粒细胞(CCR3持续表达于嗜碱性粒细胞,是其特异性标记)的活化脱颗粒。在这个脱颗粒的过程中,细胞内复合物影响跨膜蛋白CD63(gp53),使其外表达于细胞表面,并暴露于细胞外基质中,因此可以依赖流式细胞术原理(使用抗人趋化因子受体CCR3-藻红蛋白(anti-CCR3-PE)对嗜碱性粒细胞进行标记,使用抗人CD63单克隆抗体-异硫氰酸荧光素(anti-CD63-FITC)对活化状态的嗜碱性粒细胞进行标记,非特异性细胞活化剂fMLP作为一种阳性质控),并以嗜碱性粒细胞脱颗粒的百分数变化来判断受试者是否对特定变应原过敏。方法:选择健康受试者、圆柏过敏患者,取其EDTA抗凝全血样本,以刺激缓冲液(阴性对照)、圆柏变应原浸液(对1:103~1010稀释比例进行优化,本实施例中取1:108)、fMLP刺激液(阳性质控)作为嗜碱性粒细胞的激活物,加入到全血中,然后加入anti-CD63-FITC、anti-CCR3-PE染色,48h内上流式细胞仪进行检测。结果:见图13。健康受试者以阴性对照、圆柏变应原浸液、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时,其嗜碱性粒细胞活化率分别应<15%、<15%、≥15%,圆柏花粉过敏患者以阴性对照、圆柏变应原浸液、阳性对照为嗜碱性粒细胞活化物时,其嗜碱性粒细胞活化率分别应<15%、≥15%、≥15%。结论:该圆柏变应原浸液能有效作为活化物运用于嗜碱性粒细胞活化试验,并依据其判断标准有效做出临床诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> 一种圆柏花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法
<150> 2018102436579
<151> 2018-03-23
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgcgatact tggtgtgaat 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gacgcttctc cagactacaa t 21
<210> 32
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
taaagtaagg cgtgatttta tgctgggctc ttcccggttc gctcgccgtt actaggggaa 60
tcctggtaag tttcttttcc tccgcttagt gatatgctta aactcagcgg gtattcacgc 120
ctgacttggg gacgcggtag agatgcacca tgcccgcact ctggcgggcc ggggcaccaa 180
agacaaagtt ccacacgagg catcgctcga tcagcgcaaa ccaacgccgg cctttgggaa 240
ccaccgctcg tcgcgtcgga tcgacggacc tcgtgctcat ttcagccgac cgccccactt 300
gcggacacgg acggccatct acgctcctcg cgggggaggg cgattttgga gtgcgacgcc 360
caagcagacg tgcccttggc cgaggcctcg ggcgcaactt gcgttcaaag acttgatgat 420
tcacgggatt ctgcaattca cacaggtaat cgcata 456
<210> 32
<211> 367
<212> PRT
<213> amino acid
<400> 32
Met Ala Ser Pro Cys Leu Ile Ala Phe Leu Val Phe Leu Cys Ala Ile
1 5 10 15
Val Ser Cys Cys Ser Asp Asn Pro Ile Asp Ser Cys Trp Arg Gly Asp
20 25 30
Ser Asn Trp Gly Gln Asn Arg Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala Val Gly
35 40 45
Phe Gly Ser Ser Thr Met Gly Gly Lys Gly Gly Asp Phe Tyr Thr Val
50 55 60
Thr Ser Ala Asp Asp Asn Pro Val Asn Pro Thr Pro Gly Thr Leu Arg
65 70 75 80
Tyr Gly Ala Thr Arg Glu Lys Ala Leu Trp Ile Ile Phe Ser Gln Asn
85 90 95
Met Asn Ile Lys Leu Lys Met Pro Leu Tyr Val Ala Gly His Lys Thr
100 105 110
Ile Asp Gly Arg Gly Ala Asp Val His Leu Gly Asn Gly Gly Pro Cys
115 120 125
Leu Phe Met Arg Lys Val Ser His Val Ile Leu His Gly Leu His Ile
130 135 140
His Gly Cys Asn Thr Ser Val Leu Gly Asp Val Leu Val Ser Glu Ser
145 150 155 160
Ile Gly Val Val Pro Val His Ala Gln Asp Gly Asp Ala Ile Thr Met
165 170 175
Arg Asn Val Thr Asn Ala Trp Ile Asp His Asn Ser Leu Ser Asp Cys
180 185 190
Ser Asp Gly Leu Ile Asp Val Thr Leu Gly Ser Thr Gly Ile Thr Ile
195 200 205
Ser Asn Asn His Phe Phe Asn His His Lys Val Met Leu Leu Gly His
210 215 220
Asp Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Lys Ser Met Lys Val Thr Val Ala Phe
225 230 235 240
Asn Gln Phe Gly Pro Asn Ala Gly Gln Arg Met Pro Arg Ala Arg Tyr
245 250 255
Gly Leu Val His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Trp Asn Ile Tyr
260 265 270
Ala Ile Gly Gly Ser Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Glu Gly Asn Ser
275 280 285
Phe Thr Ala Pro Asn Glu Asn Tyr Lys Lys Glu Val Thr Lys Arg Ile
290 295 300
Gly Cys Glu Ser Thr Ser Ala Cys Ala Asn Trp Val Trp Arg Ser Thr
305 310 315 320
Arg Asp Ala Phe Ser Asn Gly Ala Tyr Phe Val Ser Ser Gly Lys Ile
325 330 335
Glu Glu Thr Asn Ile Tyr Asn Ser Asn Glu Ala Phe Lys Val Glu Asn
340 345 350
Gly Asn Ala Ala Pro Gln Leu Thr Lys Asn Ala Gly Val Val Ala
355 360 365
<210> 5
<211> 507
<212> PRT
<213> amino acid
<400> 5
Met Gly Met Lys Phe Met Ala Val Leu Ala Phe Leu Ala Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ile Ala Met Ala Ala Ala Glu Asp Gln Ser Ala Gln Ile Met Leu Asp
20 25 30
Ser Asp Thr Lys Gln Tyr His Arg Ser Ser Arg Asn Leu Arg Lys Arg
35 40 45
Val His His Ala Arg Arg Asp Val Ala Ile Val Phe Asn Val Glu His
50 55 60
Tyr Gly Ala Val Gly Asp Gly Lys His Asp Ser Thr Asp Ala Phe Glu
65 70 75 80
Lys Thr Trp Asn Ala Ala Cys Lys Lys Ser Ser Ala Val Phe Leu Val
85 90 95
Pro Ala Asn Lys Lys Phe Val Val Asn Asn Leu Val Phe Tyr Gly Pro
100 105 110
Cys Lys Pro His Phe Ser Phe Lys Val Asp Gly Thr Ile Ala Ala Tyr
115 120 125
Pro Asp Pro Ala Lys Trp Lys Asn Ser Lys Ile Trp Met His Phe Ala
130 135 140
Arg Leu Thr Asp Phe Asn Leu Met Gly Thr Gly Val Ile Asp Gly Gln
145 150 155 160
Gly Asn Lys Trp Trp Ser Asp Gln Cys Lys Thr Ile Asn Gly Arg Thr
165 170 175
Val Cys Asn Asp Lys Gly Arg Pro Thr Ala Ile Lys Ile Asp Phe Ser
180 185 190
Lys Ser Val Thr Val Lys Glu Val Thr Leu Met Asn Ser Pro Glu Phe
195 200 205
His Leu Val Phe Gly Glu Cys Asp Gly Val Lys Ile Gln Gly Ile Lys
210 215 220
Ile Lys Ala Pro Arg Glu Ser Pro Asn Thr Asp Gly Ile Asp Ile Phe
225 230 235 240
Ala Ser Lys Arg Phe Glu Ile Glu Lys Cys Thr Ile Gly Thr Gly Asp
245 250 255
Asp Cys Val Ala Ile Gly Thr Gly Ser Ser Asn Ile Thr Ile Arg Asp
260 265 270
Leu Thr Cys Gly Pro Gly His Gly Met Ser Ile Gly Ser Leu Gly Lys
275 280 285
Gly Asn Ser Arg Ser Glu Val Ser Phe Val His Leu Asp Gly Ala Lys
290 295 300
Phe Ile Asp Thr Gln Asn Gly Leu Arg Ile Lys Thr Trp Gln Gly Gly
305 310 315 320
Ser Gly Leu Ala Ser His Ile Thr Tyr Glu Asn Val Glu Met Ile Asn
325 330 335
Ala Glu Asn Pro Ile Leu Ile Asn Gln Phe Tyr Cys Thr Ser Ala Thr
340 345 350
Ala Cys Lys Asn Gln Arg Ser Ala Val Lys Ile Glu Asp Val Thr Phe
355 360 365
Lys Asn Ile His Gly Thr Ser Ala Thr Thr Ala Ala Ile Gln Leu Met
370 375 380
Cys Ser Asp Ser Val Pro Cys Ser Asn Ile Lys Leu Ser Asn Val Phe
385 390 395 400
Leu Lys Leu Thr Ser Gly Lys Val Ala Thr Cys Val Asn Lys Asn Ala
405 410 415
Asn Gly Tyr Tyr Thr Lys Pro Leu Asn Pro Ser Cys Lys Ser Leu His
420 425 430
Pro Gly Pro Thr Ser Lys Glu Leu Glu Leu His Gln Lys Pro Thr Thr
435 440 445
Leu Leu Met His Glu Lys Met Gly Ala Ser Leu Asn Ser Ser Pro Pro
450 455 460
Asn Cys Lys Asn Lys Cys Lys Gly Cys Gln Pro Cys Lys Pro Lys Leu
465 470 475 480
Ile Ile Val His Pro Asn Lys Pro Glu Asp Tyr Tyr Pro Gln Lys Trp
485 490 495
Val Cys Ser Cys His Asn Lys Ile Tyr Asn Pro
500 505
<210> 6
<211> 225
<212> PRT
<213> amino acid
<400> 6
Met Ala Arg Val Ser Glu Leu Ala Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ile Ser Leu His Met Gln Glu Ala Gly Ala Val Lys Phe Asp Ile Lys
20 25 30
Asn Gln Cys Gly Tyr Thr Val Trp Ala Ala Gly Leu Pro Gly Gly Gly
35 40 45
Lys Arg Leu Asp Gln Gly Gln Thr Trp Thr Val Asn Leu Ala Ala Gly
50 55 60
Thr Ala Ser Ala Arg Phe Trp Gly Arg Thr Gly Cys Thr Phe Asp Ala
65 70 75 80
Ser Gly Lys Gly Ser Cys Arg Thr Gly Asp Cys Gly Gly Gln Leu Ser
85 90 95
Cys Thr Val Ser Gly Ala Val Pro Ala Thr Leu Ala Glu Tyr Met Gln
100 105 110
Ser Asp Gln Asp Tyr Tyr Asp Val Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn Ile
115 120 125
Pro Leu Ala Ile Asn Pro Thr Asn Thr Lys Cys Thr Ala Pro Ala Cys
130 135 140
Lys Ala Asp Ile Asn Ala Val Cys Pro Ser Glu Leu Lys Val Asp Gly
145 150 155 160
Gly Cys Asn Ser Ala Cys Asn Val Phe Gln Thr Asp Gln Tyr Cys Cys
165 170 175
Arg Asn Ala Tyr Val Asp Asn Cys Pro Ala Thr Asn Tyr Ser Lys Ile
180 185 190
Phe Lys Asn Gln Cys Pro Gln Ala Tyr Arg Tyr Ala Lys Asp Asp Thr
195 200 205
Ala Thr Phe Ala Cys Ala Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Ile Val Phe Cys
210 215 220
Pro
225
<210> 7
<211> 165
<212> PRT
<213> amino acid
<400> 7
Met Asp Glu Ala Pro Ser Ser Asp Gly Ser Lys Ser Ala Ser Ser Gly
1 5 10 15
Lys Val Val Met Glu Gln Ser Val His Glu Leu Glu Glu Val Phe Lys
20 25 30
Lys Phe Asp Ala Asn Gly Asp Gly Lys Ile Ser Gly Ser Asp Leu Ala
35 40 45
Asp Ile Leu Arg Ser Leu Gly Ser Glu Val Gly Glu Ala Glu Val Lys
50 55 60
Ala Met Met Glu Glu Ala Asp Ala Asp Gly Asp Gly Tyr Val Ser Leu
65 70 75 80
Gln Glu Phe Val Asp Leu Asn Lys Lys Gly Ala Ser Val Lys Asp Leu
85 90 95
Lys Asn Ala Phe Lys Val Phe Asp Arg Asp Cys Asn Gly Ser Ile Ser
100 105 110
Ala Ala Glu Leu Cys His Thr Leu Lys Ser Val Gly Glu Pro Cys Thr
115 120 125
Ile Glu Glu Ser Lys Asn Ile Ile His Asn Val Asp Lys Asn Gly Asp
130 135 140
Gly Leu Ile Ser Val Glu Glu Phe Gln Thr Met Met Thr Ser Glu Met
145 150 155 160
Asn Asp Lys Ser Lys
165
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggcttccc catgcttaat agcattcctt gttttccttt gtgcaattgt atcttgttgc 60
tctgataatc ccatagacag ctgctggaga ggagattcga actggggtca aaacagaatg 120
aagctcgcag actgcgctgt gggatttgga agctccacca tgggaggcaa aggaggagat 180
ttttacaccg tcacaagcgc agatgataat cctgtgaatc ctacaccagg aactttgcgc 240
tatggagcaa caagagaaaa agcactttgg atcattttct ctcagaatat gaatataaag 300
ctcaagatgc ctttgtatgt tgctggacat aagactattg acggcagggg agcagatgtt 360
catcttggca acggcggtcc ctgtctgttt atgaggaaag tgagccatgt tattctccat 420
ggtttgcata tacacggttg taatactagt gttttggggg atgttttggt aagtgagtct 480
attggggtgg tgcctgttca tgctcaggat ggggacgcca ttactatgcg caatgttaca 540
aatgcttgga ttgatcataa ttctctctcc gattgttctg atggtcttat cgatgttacg 600
cttggttcca ctggaattac tatctccaac aatcacttct tcaaccatca taaagtgatg 660
ttgttaggac atgatgatac atatgatgat gacaaatcta tgaaagtgac agtggcgttc 720
aatcaatttg gacctaatgc tgggcaacga atgccaaggg cacgatatgg acttgtacat 780
gttgcaaaca ataattatga tccatggaat atatatgcta ttggtgggag ttcaaatcca 840
accattctaa gtgaagggaa tagtttcact gccccaaatg agaattacaa gaaggaagta 900
acaaagcgta tagggtgtga atcaacatca gcttgtgcaa actgggtatg gagatctaca 960
cgagatgctt tttctaatgg agcttatttt gtatcatcgg ggaaaattga agagaccaat 1020
atatacaata gtaatgaagc tttcaaagtt gagaatggga atgcagctcc tcaattaaca 1080
aaaaatgctg gagttgtagc ataa 1104
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgggcatga aattcatggc tgtgttggcc tttctggcct tacaattgat tgcaatggcg 60
gcagcagaag atcaatctgc gcaaattatg ttggacagtg ataccaaaca atatcataga 120
tcgagtagga atttgagaaa acgtgttcat catgctcgtc gtgatgttgc catcgtcttc 180
aatgtagaac actacggcgc agttggcgat ggaaagcatg attccactga cgcatttgaa 240
aaaacttgga atgcagcatg caaaaagtca tcagccgtat ttcttgtgcc tgctaacaag 300
aaatttgttg taaacaattt agttttctat gggccgtgta aacctcactt ttcttttaag 360
gttgatggga ctatagcggc atacccagat ccagcaaagt ggaagaattc gaaaatatgg 420
atgcattttg ctcggcttac agatttcaat ctgatgggaa caggtgtcat tgatggacaa 480
ggaaataaat ggtggtcgga ccaatgtaaa acgatcaatg gacgaacagt ttgtaacgat 540
aaaggtcgac caacagccat caaaatcgat ttttccaaga gtgtgacagt caaagaagtg 600
acactgatga acagtcctga atttcattta gtctttggag aatgtgacgg agtgaaaatc 660
caaggaataa aaattaaggc accgagagag agtcctaaca ctgacggaat tgatatcttt 720
gcatctaaaa gatttgaaat agaaaagtgc acaataggaa caggagatga ctgtgtggca 780
ataggcacgg gatcttctaa tattactata agggatctga cttgcggtcc aggccatgga 840
atgagtatag gaagtcttgg gaaaggtaac tctagatcag aggtttcgtt cgtacacctt 900
gacggggcta aattcatcga cactcaaaat ggattacgaa tcaaaacatg gcagggtggt 960
tcaggattgg ccagccatat aacatatgag aacgttgaaa tgataaatgc ggagaatcct 1020
atattaatta atcaattcta ttgcacttcg gctactgctt gcaaaaacca gaggtctgca 1080
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atccaactaa tgtgcagcga cagtgtgcct tgctcaaaca taaagctaag caatgtattt 1200
ttgaagctta catcgggaaa agtcgctacc tgtgttaata aaaatgcaaa tggatattac 1260
actaaacccc ttaacccttc atgcaagagt ttacatccag gccctacgtc aaaagaactt 1320
gaactccatc aaaagccaac aactttactc atgcatgaga agatgggagc atcgctgaac 1380
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attattgttc atcctaataa gccggaggat tattatcctc agaagtgggt gtgcagctgt 1500
cataataaaa tctacaaccc ttaggagtag aatgagatgg tttcgaagtg agataaaaat 1560
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tgtagtcaag ctttagaatt tgcgagcgcc cacaaatagt attttgtgtg ggctattatt 1680
ctaagtgtat tcttcttcat ggaattttac gaattataaa agattgtctc gagttattat 1740
aa 1742
<210> 10
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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ggatgcaaca gtgcctgcaa tgtcttccaa actgatcagt attgctgcag aaatgcgtat 540
gttgataact gccctgccac taattactcc aagatattca agaaccagtg ccctcaggct 600
tatagatatg ctaaggatga cacagctact ttcgcttgcg cctctggtac cgactacagt 660
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<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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aagatctcag gatcagacct tgcagacatc ttgcggtcgc tgggaagtga agtaggcgag 180
gcagaggtga aggccatgat ggaggaggct gacgcggacg gtgacggtta tgttagcctg 240
caagagtttg tggatctgaa taagaaaggt gcttctgtga aggatttgaa aaatgctttc 300
aaagtgtttg atcgggactg taatggctcc atctcggctg ctgagctgtg ccatactctc 360
aaaagcgtgg gcgagccctg caccatcgag gagtctaaga acattattca caacgtcgac 420
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<211> 9
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<213> amino acid
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Asp Asn Pro Ile Asp Ser Cys Trp Arg
1 5
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<211> 9
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<213> amino acid
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Gly Asp Ser Asn Trp Gly Gln Asn Arg
1 5
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<211> 18
<212> PRT
<213> amino acid
<400> 14
Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala Val Gly Phe Gly Ser Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Gly Lys
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> amino acid
<400> 15
Leu Ala Asp Cys Ala Val Gly Phe Gly Ser Ser Thr Met Gly Gly Lys
1 5 10 15
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> amino acid
<400> 16
Leu Lys Met Pro Leu Tyr Val Ala Gly His Lys
1 5 10
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<211> 9
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<213> amino acid
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Met Pro Leu Tyr Val Ala Gly His Lys
1 5
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<212> PRT
<213> amino acid
<400> 18
Gly Gly Asp Phe Tyr Thr Val Thr Ser Ala Asp Asp Asn Pro Val Asn
1 5 10 15
Pro Thr Pro Gly Thr Leu Arg
20
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> amino acid
<400> 19
Met Pro Leu Tyr Val Ala Gly His Lys Thr Ile Asp Gly Arg
1 5 10
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<211> 16
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<213> amino acid
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Gly Ala Asp Val His Leu Gly Asn Gly Gly Pro Cys Leu Phe Met Arg
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<211> 13
<212> PRT
<213> amino acid
<400> 21
Ala Leu Trp Ile Ile Phe Ser Gln Asn Met Asn Ile Lys
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> amino acid
<400> 22
Val Thr Val Ala Phe Asn Gln Phe Gly Pro Asn Ala Gly Gln Arg
1 5 10 15
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<211> 14
<212> PRT
<213> amino acid
<400> 23
Val Met Leu Leu Gly His Asp Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Lys
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<211> 17
<212> PRT
<213> amino acid
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Val Met Leu Leu Gly His Asp Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Lys Ser Met
1 5 10 15
Lys
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<212> PRT
<213> amino acid
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Ile Gly Cys Glu Ser Thr Ser Ala Cys Ala Asn Trp Val Trp Arg
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<211> 14
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Asp Ala Phe Ser Asn Gly Ala Tyr Phe Val Ser Ser Gly Lys
1 5 10
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<213> amino acid
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Asp Ala Phe Ser Asn Gly Ala Tyr Phe Val Ser Ser Gly Lys Ile Glu
1 5 10 15
Glu Thr Asn Ile Tyr Asn Ser Asn Glu Ala Phe Lys
20 25
<210> 28
<211> 14
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<213> amino acid
<400> 28
Ile Glu Glu Thr Asn Ile Tyr Asn Ser Asn Glu Ala Phe Lys
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<213> amino acid
<400> 29
Tyr Gly Leu Val His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Trp Asn Ile
1 5 10 15
Tyr Ala Ile Gly Gly Ser Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Glu Gly Asn
20 25 30
Ser Phe Thr Ala Pro Asn Glu Asn Tyr Lys
35 40
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> amino acid
<400> 30
Val Glu Asn Gly Asn Ala Ala Pro Gln Leu Thr Lys
1 5 10
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<212> PRT
<213> amino acid
<400> 31
Ser Glu Val Ser Phe Val His Leu Asp Gly Ala Lys
1 5 10
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<213> amino acid
<400> 32
Asp Leu Thr Cys Gly Pro Gly His Gly Met Ser Ile Gly Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys
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<400> 33
Asn Ile His Gly Thr Ser Ala Thr Thr Ala Ala Ile Gln Leu Met Cys
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<211> 26
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<213> amino acid
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Asn Ile His Gly Thr Ser Ala Thr Thr Ala Ala Ile Gln Leu Met Cys
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20 25
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<212> PRT
<213> amino acid
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<212> PRT
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<213> amino acid
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1 5
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<212> PRT
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Trp Trp Ser Asp Gln Cys Lys
1 5
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<211> 19
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Leu Asp Gln Gly Gln Thr Trp Thr Val Asn Leu Ala Ala Gly Thr Ala
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Val Val Met Glu Gln Ser Val His Glu Leu Glu Glu Val Phe Lys
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<211> 12
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