ES2264201T3 - Metodo para la identificacion de alergenos de polen de gramineas recombinantes modificados. - Google Patents

Abstract

Método para la identificación de alérgenos de polen de gramíneas recombinantes modificados que se derivan de los grupos principales 1 ó 5 y cuya reactividad con anticuerpos lgE de pacientes alérgicos a estos alérgenos se elimina o se reduce manteniendo además la reactividad con linfocitos T, caracterizado porque, a partir de la secuencia de aminoácidos de los alérgenos de proteínas naturales, - se prepara una serie de oligopéptidos solapados derivados de la secuencia del alérgeno, - se establecen los clones de células T de pacientes que son alérgicos a dichos alérgenos, - se comprueba si dichos oligopéptidos son capaces de reaccionar con clones de células T y de estimularlos, - se preparan los mutantes de dichos alérgenos, con lo cual no se modifica ni una ni varias de las regiones de secuencia reactivas a células T (epítopos de células T), - se identifican aquellos mutantes que muestren las propiedades que son objetivo.

Description

Método para la identificación de alérgenos de polen de gramíneas recombinantes modificados.

La presente invención trata de un método para la identificación de alérgenos de polen de gramíneas recombinantes modificados que se derivan de los grupos principales 1 ó 5 y cuya reactividad con anticuerpos IgE de pacientes alérgicos a estos alérgenos se elimina o se reduce manteniendo además la reactividad con linfocitos T.

Los extractos de polen de gramíneas, tal como se emplean en la aplicación terapéutica y diagnóstica, están compuestos por una mezcla heterogénea de proteínas y glicoproteínas, entre las que algunas reaccionan con anticuerpos IgE de alérgicos y se denominan según la definición como alérgenos. Las propiedades moleculares permiten la clasificación en el grupo 6, donde la reactividad cruzada de las especies de gramíneas que vienen al caso es relativamente alta. Los grupos de alérgenos dominantes (alérgenos principales) son los grupos 5 y 1 según la clasificación habitual de alérgenos (Liebers et al., Clin. Exper. Allergy, 26, 494-516 (1996)). Se conocen las secuencias de aminoácidos N-terminal y/o las secuencias de aminoácidos deducidos parcial o completamente de los grupos 5 y 1 de los alérgenos principales (Vrtala et al., J. lmmunology 151, 4773-4781 (1993) u. Bufe et al. FEBS. Lett. 263, 6-12 (1995)). Además, existe la descripción de un método para la clonación de estos alérgenos principales (Scheiner et al. lnt. Arch Allergy Immunol. 98, 93-96 (1992)).

Actualmente se emplean extractos acuosos de polen de gramíneas para diagnósticos in vitro de alergias de tipo 1. Estos extractos también son la base para los diagnósticos in vitro y para la inmunoterapia específica posterior (Fiebig H., Allergo Journal Z, 377-382 (1995)). El empleo de extractos de alérgenos nativos para la inmunoterapia específica está limitado por las reacciones alérgicas condicionadas por IgE inducida (reacciones secundarias). De este modo, sólo pueden aplicarse extractos de alérgenos nativos en dosificaciones por debajo del umbral de los efectos secundarios. Para alcanzar concentraciones altas de alérgenos necesarias para el efecto terapéutico, se administran los extractos mediante varias inyecciones consecutivas con una concentración aumentada hasta la dosis de mantenimiento. Mediante la adsorción en geles, pueden emplearse extractos de alérgenos con menos efectos secundarios y más efectivos para la hiposensibilización.

Se podría conseguir otra mejora mediante la modificación química de los alérgenos en alergoides, que tienen una reactividad de lgE reducida en la inmunogenicidad en gran parte adquirida (Fiebig H., Allergo Journal 7, 377-382 (1995) u. Maasch et al. Clin. Ref. Allergy 5, 89-106 (1987)).

En las primeras investigaciones con alérgenos de ácaros de polvo doméstico, existen indicios de que puede reducirse la reactividad de IgE mediante la sustitución controlada de aminoácidos (Smith et al. Mol. Immunol. 33, 399-405 (1996) u. Nishiyama et al. Mol. Immunol. 32, 1021-1029 (1995)).

La hiposensibilización establecida de alérgicos al polen de gramíneas se consigue actualmente con extractos naturales que contienen todos los alérgenos conocidos, así como las sustancias acompañantes inmunógenas, pero no alergénicas, en concentraciones considerables, aunque, para la terapia específica de alérgenos, sólo se necesitan aquellas moléculas de alérgenos a las que el paciente correspondiente esté realmente sensibilizado. Esto significa que el alérgico se trata necesariamente con componentes que no contribuyen a su hiposensibilización y que pueden inducir efectos secundarios.

Disponiendo de alérgenos recombinantes modificados, puede utilizarse cada alérgeno o mezclas definidas para la hiposensibilización de acuerdo con el espectro de sensibilización individual como medicamento.

De esta manera, surge la posibilidad de una terapia específica y hecha a medida.

La función de la presente invención se basa en localizar un nuevo método para la identificación de mutantes de alérgenos destinados a la fabricación de medicamentos.

Sorprendentemente se ha logrado, en el marco de la presente invención, desarrollar un método para la identificación de mutantes que reaccionan de forma específica con linfocitos T de alérgicos al polen de gramíneas, es decir, para estimular la proliferación y la síntesis de citoquinas o inducir una anergia, pero que muestran, con los anticuerpos lgE contenidos en el suero del donante de linfocitos T y con lgE específica de alérgenos de polen de gramíneas de sueros de otros alérgicos al polen de gramíneas, una reducción significativa de la capacidad de unión.

Por tanto, este efecto que no se produce ni con alérgenos de origen natural ni con alérgenos recombinantes es conveniente porque

-

se evitan los efectos secundarios mediados por IgE en la hiposensibilización o, al menos, disminuyen considerablemente,

-

se garantiza el reconocimiento de los alérgenos recombinantes modificados mediante los linfocitos de memoria TH de los alérgicos,

\newpage

-

se requiere para la normalización del equilibrio afectado del alérgico de las subpoblaciones TH que se diferencia de forma distinta,

-

se posibilita el efecto terapéutico a través de anergia y/o la eliminación de células T reactivas a alérgenos, así como la reorientación funcional de una población de células T dominada por TH2 a una población de células T específica dirigida a TH0/TH1,

-

se puede conseguir la regulación de la síntesis de inmunoglobulina desde la formación de anticuerpos especiales IgE (controlados por TH2), común para los alérgicos, hasta la síntesis preferente de anticuerpos IgG (controlados por TH1),

-

y, de este modo, en un tratamiento con alérgenos recombinantes modificados según la invención, se espera una mejora significativa del estado del paciente.

Los alérgenos recombinantes modificados, que se identificaron con el método según la invención, se derivan preferiblemente de los alérgenos principales del grupo 5, aunque también del grupo 1. En especial, los alérgenos según la invención se derivan del alérgeno principal Phl p 5b.

La secuencia de Phl p 5b es, según el código de una letra de los aminoácidos, la siguiente:

1

Para determinar las secuencias de aminoácidos o de ADN es necesario seguir los siguientes pasos:

Se identifican los componentes alergénicos de los extractos elaborados según el método habitual y se caracterizan los parámetros fisicoquímicos esenciales. La identificación como alérgenos se lleva a cabo comprobando su capacidad de unión a anticuerpos IgE de alérgicos. Por regla general, se utilizan para ello métodos según técnicas conocidas como SDS-PAGE, isoelectroenfoque y Western blot posterior con sueros de alérgicos, donde sólo se lleva a cabo el desarrollo de los anticuerpos fijadores del isotipo IgE. En esto debe tenerse en cuenta que se utilicen bastantes tipos de alérgicos protegidos clínicamente (aquí debe emplearse un valor de 20 como mínimo). Como alternativa también pueden utilizarse otros métodos como, por ejemplo, CIE o CRIE.

Estos alérgenos de polen de gramíneas caracterizados e identificados de esta manera, pueden prepararse analíticamente de modo que sea posible determinar los aminoácidos N-terminal. Además, los alérgenos pueden purificarse bioquímicamente y pueden emplearse para la fabricación de anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos monoclonales pueden usarse, así como los anticuerpos IgE en los sueros de alérgicos, para la identificación inmunológica y la caracterización de alérgenos de fuentes naturales o de moléculas que se elaboran mediante la técnica recombinante.

Partiendo de esta información sobre alérgenos y los medios para la identificación, se pueden clonar los alérgenos según métodos conocidos de ingeniería genética y expresarse como alérgenos recombinantes. Los clones de ADN de los alérgenos recombinantes caracterizados y obtenidos según el método habitual son la base para la modificación de ingeniería genética que conduce a las moléculas de alérgenos fabricadas, recombinantes y modificadas según la invención.

Con el fin de garantizar la reactividad de los alérgenos recombinantes modificados según la invención, también es necesario identificar los epítopos de células T.

Un fundamento para ello es el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de los alérgenos que vienen al caso o la secuencia de ADN en la que se basó. Por regla general, la secuencia de aminoácidos se deduce de la secuencia de ADN de alérgenos recombinantes. En el marco de esta invención, quedan también incluidas, para cada secuencia péptida dada, las secuencias de ADN correspondientes, incluso cuando éstas no se manifiestan explícitamente, ya que pueden derivarse de la forma conocida y fácil de las secuencias péptidas.

Basándose en la secuencia de aminoácidos, se fabrican una serie de oligopéptidos solapados según el método habitual como, por ejemplo, la síntesis de fase sólida según las técnicas de Merrifield modificadas, en la que se cubre la secuencia completa de los alérgenos. Aquí son apropiados los oligopéptidos con 6 - 20 restos de aminoácidos y, preferiblemente 9 -15, cada uno. Especialmente apropiados son los péptidos de dodecano con una mezcla de 3 aminoácidos cada uno, que cubren de forma solapada la secuencia completa del alérgeno correspondiente.

Para identificar los epítopos de células T se establecen clones de células T de los alérgicos al polen de gramíneas repitiendo la estimulación con el alérgeno que viene al caso fabricado y purificado, recombinante o natural, según el método habitual (Ref.). Para ello, debe establecerse un número representativo de clones de células T que deriven de bastantes donantes.

Estos clones de células T se incuban con los péptidos solapados que se describen arriba y se comprueba su capacidad para estimular células T para la proliferación. La proliferación se determina incorporando [3H]-timidina mediante el método habitual. Aquellos oligopéptidos que produzcan una proliferación suficiente de los clones de células T se verán como ligandos peptídicos correspondientes a los epítopos de células T. Los epítopos de células T determinados de esta forma sirven para definir las regiones reactivas a células T de los alérgenos que muestran, por su parte, la base para la construcción de alérgenos recombinantes modificados según la invención.

Con el fin de garantizar la reactividad de alérgenos recombinantes modificados con linfocitos T que aparecen en los alérgicos, las regiones reactivas a células T que incluyen los epítopos inmunodominantes de células T se excluyen parcial o completamente de las modificaciones con respecto a la estructura primaria.

En las regiones restantes de los polipéptidos (alérgenos) se realizan mutaciones mediante técnicas de ingeniería genética en las secuencias de ADN en las que se basó para modificar una estructura primaria. Mediante esta modificación de la estructura primaria, la capacidad de unión de epítopos de células B dependientes de la secuencia y continuos a los anticuerpos IgE desaparece o se limita, y la reactividad con epítopos dependientes de su conformación y eventualmente discontinuos con sus anticuerpos se cancela parcial o completamente mediante la formación de una estructura terciaria cambiada como consecuencia de la modificación primaria.

Las mutaciones pueden presentar sustituciones de uno o varios aminoácidos fuera de la región reactiva a células T. Estas mutaciones puntuales se introducen mediante mutagénesis específica de sitio con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el ADN que está codificado, por ejemplo, para el rPhl p 5b. Como cadena de ADN-molde pueden servir el plásmido pGS13 y un vector de expresión (pMalc), que contiene ADNc para el rPhl p 5b. Para la PCR se emplean iniciadores específicos de gen que incluyen las sustituciones de base correspondientes y, al mismo tiempo, un nuevo sitio de corte de restricción (Nhe I o Sph I). Los fragmentos amplificados en la PCR, que llevan la mutación, se ligaron sucesivamente en un vector de clonación y, a continuación, se volvió a clonar el producto completo en el vector de expresión pMalc.

Además, se pueden realizar mutaciones mediante deleciones dispuestas de forma diferente. Para la fabricación de mutantes de deleción, se elaboran fragmentos 3'-terminal reducidos de ADNc de rPHl p 5b en una PCR con ayuda de iniciadores específicos de gen. Se retiran de los vectores de salida (pGS12 o pGS13) los fragmentos 3'-terminal mayores mediante la restricción en sitios de corte internos y, en su lugar, se ligan los fragmentos más pequeños amplificados en la PCR que corresponden.

De manera análoga, se pueden crear mutaciones mediante la adición de uno o varios aminoácidos introduciendo fragmentos de ADN adicionales.

Los clones de ADN mutados por técnicas de ingeniería genética, que están codificados para alérgenos recombinantes modificados, se vuelven a clonar en vectores de expresión adecuados y se traen a la expresión en organismos huésped adecuados. A partir de la resistencia y degradación de estos organismos huésped, se purifican las proteínas de fusión del modo habitual y, después de disociar la parte de fusión, se presentan los alérgenos recombinantes modificados purificados con los métodos bioquímicos habituales. Es importante que, para las demás pruebas, los alérgenos recombi-
nantes modificados que vayan a emplearse sean componentes purificados que correspondan a los alérgenos naturales.

Los efectos de las mutaciones inducidas en la alergenicidad, es decir, de la capacidad de unión a anticuerpos IgE de alérgicos, de los alérgenos recombinantes modificados se determinan cualitativa y cuantitativamente mediante la prueba de inhibición de EAST. Este ensayo muestra si una sustancia que vaya a someterse a prueba (alérgeno recombinante modificado) es distinta o idéntica al alérgeno natural y/o al tipo salvaje recombinante. Además, se puede cuantificar el grado de afinidad inmunoquímica (reactividad cruzada). Esta prueba de inhibición de EAST sólo tiene en cuenta la reacción con anticuerpos IgE.

Como variantes de alérgenos recombinantes modificados adecuados se seleccionan aquellos que muestran, en comparación con el alérgeno natural y/o el tipo salvaje recombinante, al menos un efecto de inhibición reducido al factor 10^{2}, medido como P_{rel} con una inhibición del 50%.

Se comprueba si realmente existe reactividad de células T en las variantes de alérgenos recombinantes modificados que se seleccionaron de esta forma. Para ello, se utiliza para la verificación en la primera fase una composición de clones de células T que reaccionan con epítopos en las regiones de células T.

Únicamente se tienen en cuenta los alérgenos recombinantes modificados que estimulan para la proliferación los clones seleccionados.

En la segunda fase, se utilizan para su verificación las líneas de células T oligoclonales, que se establecieron con los alérgenos apropiados mediante varias estimulaciones. De nuevo sólo se tienen en cuenta los alérgenos recombinantes modificados que provocan al menos un índice de estimulación (IE) del 50% del IE del tipo salvaje.

En la tercera fase, se utilizan para su verificación cultivos de células T de breve duración policlonales de la sangre periférica de alérgicos.

Para la reacción alérgica (efecto secundario), exceptuando la unión del alérgeno a lgE esp., es de importancia patofisiológica la liberación de histamina establecida por lgE e inducida por alérgenos mediante células efectoras alérgicas. En esto también es importante la capacidad de reacción de las células efectoras (basófilos, células cebadas) y la especificidad del epítopo de los anticuerpos lgE ligados a través de Fc\varepsilonRl. Por lo tanto, se comprueba la potencia para la inducción de la liberación de histamina en las variantes de alérgenos recombinantes modificados mediante la degranulación de basófilos cargados con IgE, que se prepararon con la sangre de alérgicos. Las variantes de alérgenos recombinantes modificados que se seleccionaron según el régimen de selección anterior deben mostrar, en esta prueba funcional, una importante reducción de la capacidad para la liberación de histamina.

Los alérgenos recombinantes modificados que cumplen estos requisitos garantizan una reactividad con la mayoría de las células TH de eficiencia reguladora y tienen, debido a la reducción de la reactividad 1gE, las propiedades necesarias para utilizarlos como terapéuticas para la inmunoterapia específica de alérgenos (hiposensibilización) de alérgicos al polen de gramíneas.

Ejemplo 1

Identificación de los epítopos de células T para determinar las regiones reactivas a células T del alérgeno principal de polen de gramíneas Phl p5

Para establecer líneas (TCL) y clones (TCC) de células T, que reaccionan con los alérgenos principales de polen de gramíneas del grupo 5 del fleo (Phleum pratense) Phl p5, se seleccionaron pacientes que indicaron anamnésticamente un síntoma típico de una alergia de polen de gramíneas (rinitis) y presentaron una prueba cutánea positiva (prick test). Estos pacientes tenían anticuerpos IgE específicos circulantes de una clase de RAST \geq 3.

Se tomaron 40 ml de sangre heparinizada por paciente. A continuación, se aislaron de esta prueba de sangre las células mononucleares periféricas (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad siguiendo el proceso habitual. Más adelante se consiguió el aislamiento análogo de células cuando fue necesaria la obtención de células presentadoras de antígeno autólogo irradiado (APZ) para seguir caracterizando las TCL y los TCC. Después del recuento de las PBMC, se establecen las TCL con reactividad en alérgenos in vitro del grupo 5 como sigue y como se describió de forma detallada en otros puntos (Ref. 1): En placas de microcultivo de 24 pocillos, se estimularon por cavidad de 1,5 a 2,0x10^{6} PBMC en 1 ml de medio de cultivo (UltraCulture) durante 7 días añadiendo alérgenos Phl p5 naturales, purificados mediante cromatografía de inmunoafinidad (cada 10 \mug/pocillo). En total, se crearon de 8 a 10 de estos cultivos. El aislamiento mediante cromatografía de inmunoafinidad de Phl p 5 se describe detalladamente (Ref. 2). Después de transcurrir los 7 días de cultivación, se agregaron los cultivos de células IL-2 (10 a 20 IU/pocillo) para 5 a 7 días más. A continuación, se combinó cada cultivo, se enriquecieron los blastos de células T mediante centrifugación en gradiente de densidad y se comprobaron las TCL obtenidas en la prueba específica de proliferación de linfocitos (véase también ref. 1). Para ello se cultivaron, en placas de microcultivo de 96 pocillos en tres preparaciones 2 x 10^{4}/ml blastos de TCL con 5 x 10^{4}/ml de APZ autólogos irradiados. Como estímulo específico del antígeno se añadió 10-20 \mug de alérgeno Phl p5. Después de 56 horas de incubación, se pipeteó para los microcultivos timidina marcada con ^{3}H (1\muCi/pocillo). Después de otras 16 horas, se midió la radioactividad incorporada a los blastos de células T proliferantes en un contador beta (Matrix 96). Los resultados se calculan como medio aritmético de las múltiples preparaciones en contadores por minuto (cpm). El criterio de calidad de las TCL fue el índice de estimulación que surgió de la relación entre los valores cpm con adición de Phl p5 y aquellos sin adición de Phl p5.

Las TCL se clonaron según la selección de las mismas (véase ref. 1). Para ello se cultivaron 0,3 blastos de
TCL / pocillo en un volumen final de 0,2 ml en placas de microcultivo de 96 pocillos (fondo redondo) añadiendo PBMC alogénicas irradiadas (5 x 10^{4}/pocillo), PHA (1,5 g/ml) y IL-2 (25 IU/ml). Después de 12 a 14 días se alimentaron los cultivos con PBMC, PHA y IL-2 nuevos e irradiados. Además, se llevó a cabo cada 4 ó 5 días una sustitución del medio añadiendo IL-2 (25 IU/ml). Antes de la realización de la prueba de proliferación específica del Phl p5, pasó un periodo de 10 días aprox. sin añadir PBMC alogénicas irradiadas. Los TCC seleccionados se incrementaron entonces en placas de microcultivo de 24 pocillos mediante la repetición de la estimulación con PHA, PBMC alogénicas irradiadas y IL-2 (50 IU/ml).

Después de clonar una TCL (véase más abajo) se determinó la especificidad de los TCC aislados como se describe arriba. Los índices de estimulación de 5 como mínimo se valoraron para los TCC como positivos. Asimismo la determinación de epítopos de células T para especificar las regiones reactivas a células T en alérgenos del grupo 5 se realizaron mediante pruebas de proliferación específicas, en las que se utilizaron para ello 1-2 \mug/ml de péptidos de dodecano sintetizados en cada una (véase más abajo).

Para la determinación de epítopos de células T se utilizaron 86 péptidos de dodecano sintéticos solapados en total, que se fabricaron en función de la estructura primaria conocida del alérgeno Phl p 5b según Bufe et al. (Ref. 3). La fabricación de estos péptidos se consiguió con un kit comercial de síntesis de la empresa CHIRON Mimotopes Peptide Systems / Clayton, Australia. Estos péptidos tenían, con respecto a las secuencias de aminoácidos, un grado de solapamiento de 9 aminoácidos (tabla 1).La reacción de TCC en uno de los péptidos utilizados en la prueba de proliferación específica se valoró como positiva cuando el índice de estimulación calculado fue 5 como
mínimo.

En las investigaciones se incluyeron TCC de 18 alérgicos al polen de gramíneas. Se pudieron aislar de éstos 54 clones de células T, que reaccionan específicamente con péptidos de dodecano basados en la secuencia de Phl p 5b. El análisis de estos TCC muestra una concentración significativa de la detección de ligandos peptídicos en 3 regiones reactivas a células T inmunodominantes. 46 clones de células T reaccionan de un total de 54, lo que corresponde al 85%, con los péptidos de las 3 regiones reactivas a células T inmunodominantes A, B y C del Phl p 5b (Tabla 1a).Sólo 8 clones de células T reaccionaron con otros 5 ligandos peptídicos, con lo cual se detectan 3 péptidos de 2 clones diferentes cada uno. La región inmunodominante reactiva a células T A comprende un péptido (27 mer) correspondiente a las posiciones 181-207, con una región de núcleo compuesta por los aminoácidos 181-195. 28, los 54 TCC reactivos al Phl p 5b, lo que corresponde al 51%, reaccionan únicamente con esta región inmunodo-
minante A.

Con las regiones reactivas a células T C (posición 16-48; 33 mer) y B (posición 133-150) reaccionan 9 (17%) ó 9 (17%) de los clones de células T. Esta concentración de células TH del grupo de alérgicos investigado en la detección de 3 regiones reactivas a células T inmunodominantes del alérgeno principal Phl p 5b permite la construcción de mutantes de Phl p 5b, en los que las mutaciones puntuales, por adición o por deleción no tocan estas regiones. De esta forma, se ha establecido la condición previa de que estos mutantes de alérgenos reaccionen específicamente con las células TH reactivas a alérgenos que existen en alérgicos y de que éstas influyan en sentido tera-
péutico.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Péptidos de dodecano basados en la secuencia de Phl p 5b para la determinación de las regiones reactivas a células T

2

TABLA 1 (continuación)

3

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1a Cartografía de las regiones reactivas a células T del alérgeno principal de polen de gramíneas Phl p 5

TCC	Ligandos peptídicos	Región reactiva a células T	Epítopo menor
	estimulantes (12 mer)	inmunodominante
		A	B	C
DW 8	139-150		+
DW 14	196-207	+
DW 16	181-192, 184-195	+
DW 23	181-192	+
DW 25	181-192, 184-195	+
DW 28	184-195	+
CBH 1	211-222, 214-225				+
CBH 10	211-222				+
JR 6a	22-33, 25-36			+
JR 6b	136-147, 139-150		+
JR 7a	28-39, 31-42			+
JR 7b	136-147, 139-150		+
JR 9	181-192, 184-195	+
JR 10	19-30			+
JR 11	49-60				+
JR 13	181-192, 184-195	+
JR 15	181-192, 184-195		+
JR 19a	31-42			+
JR 19b	136-147		+
JR 24	97-108, 100-111				+
JR 25	181-192, 184-195	+
JR 27	184-195	+
KS 1	181-192, 194-195	+
KS 2	181-192, 194-195	+
KS 3	181-192, 194.195	+

TABLA 1a (continuación)

TCC	Ligandos peptídicos	Región reactiva a células T	Epítopo menor
	estimulantes (12 mer)	inmunodominante
		A	B	C
KS 4	181-192, 194-195	+
KS 5	181-192, 194.195	+
KSE 18	43-54				+
UD 6	112-123				+
GE 4	136-147, 139-150		+
GE 7	136-147		+
GE 12	37-48			+
AS 4	181-192, 184-195	+
AS 5	181-192, 184-195	+
UZH 2	136-147, 139-15		+
UZ 25	97-108				+
CB 1	190-201, 193-204	+
CB 2	181-192, 184-195	+
CB 7	25-36			+
CB 10	181-192, 184-195	+
CB 14	181-192	+
MF 11	184-195	+
AH 19	16-27			+
AH 26	139-150		+
JMD 3	133-144		+
45		A22	9B	7c	7
II 3.2A 12	31-42			+
II 12.7F11	196-207	+
II 12.5C10	187-198	+
II 17.9E5	184-195	+
II 17.1D8	184-195	+
II 17.11C2	184-195	+
II 17.19A1	193-204	+
II 17.12F5	25-36			+
II 17.3C10	49-60, 52-63				+
54		28	9	9	8

Referencias

1. Müller WD. Karamfilov T. Fahlbusch B, Vogelsang H, Jäger L: "Analysis of human T cell clones reactive with group V grass pllen allergens". Int. Arch. Allergy Immunol. 1994, 105:391-396.

2. Jung K, Fahlbusch B, Müller WD, Hermann D, Diener C, Jäger L: "Isolation of timothy (Phleum pratense) allergens using affinity chromatography with monoclonal antibodies". Allergy Immunol (Leipzig) 1989, 35:287-294

3. Bufe A, Schramm G, Keown MB, Schlaak M, Becker WM: "Major allergen Phl p 5b in timothy grass is an novel pollen Rnase". FEBS Letters 1995, 263:6-12.

\newpage

Ejemplo 2

Fabricación de los mutantes puntuales PM1, PM2 (D^{48} \rightarrow L, K^{50} \rightarrow A) y PM3 (A^{13} \rightarrow C) del rPhl p 5b PM2

Como vector de salida servía el plásmido pGS13. En este caso, se trata del vector pMalc (Biolabs) que contiene el ADNc para el wt rPhl p 5b Bam HI / Hind III clonado. En una reacción de PCR se amplificaron los fragmentos 1 (Bp.:1 - 153) y 2 (Bp.: 141 - 1374) del ADNc del rPhl p 5b. Para ello, se emplearon los siguientes iniciadores (Los sitios de corte de restricción están subrayados):

Fragmento 1:

Phl p 5b sense:

5'-ATATGGATCCATCGAGGGAAGGGCCGATGCCGGCTACGCC-3

MP1 antisentido:

5'-GAACGCTAGCGCCGCAGGGACGCTGGC-3'

\vskip1.000000\baselineskip

Fragmento 2:

MP1 sense:

5'-GCGCTAGCGTTCAAGACCTTCGAG-3'

Phl p 5b antisentido:

5'-ATATAAGCTTTCCTCTGAAGGAAGGCAACCC-3'

Los dos iniciadores de mutagénesis MP1 sense y MP1 antisentido contienen 6 sustituciones de base con respecto a la secuencia wt, que generan adicionalmente un sitio de corte de restricción para la enzima Nhe1 1.

El fragmento amplificado 1 digirió Bam Hl /Nhe I y se clonó en el vector pUH89 (Jekel et al., Gene: 154, 55-59; 1995). El plásmido resultante pGS10 se volvió a restringir con Nhe I / Hind III y se integró, en estos sitios de corte, el fragmento 2 (Nhe I / Hind III). Este plásmido pGS11 contiene el ADNc completo que está codificado para el rPhl p 5b con las sustituciones de base deseadas. Para la expresión de los mutantes puntuales rPhl p 5b PM2, se volvió a clonar el ADNc mutado en los sitios de corte Bam HI / Hind III del vector de expresión pMalc. El plásmido originado se señaló con pGS21.

Los mutantes puntuales rPhl p 5b PM1 se fabricaron de forma análoga a PM2. Debido a un error de PCR, éste contiene una mutación puntual adicional: N^{32} \rightarrow D. Para clonar este mutante puntual, se aplicó el ADNc completo de rPhl p 5b en el vector p GS13 de una PCR con los siguientes iniciadores.

PCysM1:

5'ATATGGATCCATCGAGGGTAGGGCCGATGCCGGCTACGCCCCGGC CACCCCGGCTGCAT GCGGAGCG-3'

Phl p 5b antisentido: véase más arriba.

El iniciador de mutagénesis PCysM1 contiene 3 sustituciones de base respecto a la secuencia wt que intercambian un resto de alanina por un resto de cisteína y, al mismo tiempo, generan un sitio de corte nuevo de restricción para la enzima Sph I. El producto de PCR se clonó directamente en el vector de expresión pMalc (Bam HI / Hind III). El vector resultante se señaló con pCysM1. Se comprobó con Sph I la mutagénesis correcta en un análisis de
restricción.

Ejemplo 3

Fabricación de los mutantes de deleción DM1 (\Delta K^{50} - P^{132}, D^{49} \rightarrow L), DM2 (\Delta F^{51} - G^{178}, D^{49} \rightarrow L, K^{50} \rightarrow A) y DM3 (\Delta A^{154} - T^{177}, A^{220} \rightarrow T)

Como vector de salida para la clonación del mutante de deleción DM1 sirvió el plásmido pGS21 (véase más arriba). En una PCR se amplificó el fragmento Bp 399 - 1374 del ADNc de rPhl p 5b utilizando los siguientes inicia-
dores:

MP2 sense:

5'-GCTAGCCGGCGAGCTGCAGATCATCG-3'

Phl p 5b antisentido: véase más arriba.

El vector pGS21 restringió Nhe 1 / Bam Hl, se separó del fragmento cortado y, en el vector residual, se ligó el producto de PCR que asimismo restringió Nhe I / Bam HI. El vector resultante pDM1 contiene el ADNc del rPhl p 5b con una deleción de 252 bp que está codificado para el mutante de deleción rPhl p 5bDM1.

Los mutantes de deleción DM2 y DM3 se fabricaron de forma análoga.

Ejemplo 4

Comprobación de la reducción de la alergenicidad (reactividad de IgE) de los mutantes recombinantes de Phl p 5b mediante la prueba de inhibición de EAST

La unión de alérgenos a través de los anticuerpos lgE es la condición previa principal para la activación específica del alérgeno de las células efectoras (células cebadas, basófilos, etc.) en el caso de la alergia del tipo 1. Como mejor puede detectarse la unión de alérgenos de anticuerpos IgE cualitativa y cuantitativamente es con la inhibición específica de alérgenos de la prueba alergo-sorbente enzimática (EAST). La prueba de inhibición de EAST se lleva a cabo del siguiente modo. Las placas de microtitulación se recubren (1 \mug/ml) con alérgenos (Phl p 5 o Phl p 5b natural o recombinante). Después de eliminar mediante el lavado las moléculas de alérgenos que no están ligadas, se bloquean los puntos de unión de plástico no específicos con albúmina de suero bovino (0,5%). El anti-IgE de alérgicos, como combinación representativa de 10 a 30 donantes o como suero individual, se incubó en una dilución adecuada con placas de microtitulación recubiertas de alérgenos. Los anticuerpos lgE específicos de alérgenos ligados se cuantificaron mediante un anti-IgE unido a una enzima (por ejemplo, a-IgE - fosfatasa alcalina). En función de la concentración, esta unión es inhibida por un alérgeno soluble o por la sustancia que vaya a analizarse (mutantes de alérgenos). Como referencia sirve la curva de inhibición con el alérgeno natural Phl p 5b purificado.

Con la combinación representativa de suero de alérgicos Bor 18/100 (20 donantes) resultan las curvas de inhibición que se muestran en la figura 1.

El rPhl p 5b (tipo salvaje) y el PM3 muestran las curvas de unión parecidas a Phl p 5b natural, purificado por cromatografía de afinidad. Las diferencias mínimas pueden verse con un mejor efecto de inhibición en la región más baja, así como con una inhibición peor, en concentraciones altas. No se conoce la causa, aunque podría deberse a epítopos de conformación con diferencias de poca consideración.

El mutante puntual PM1 muestra este efecto de forma un poco más marcada en una región más alta. La reducción considerable del efecto de inhibición muestra los mutantes de deleción DM1 y DM3. Esto justifica la alergenicidad fuertemente reducida de estos mutantes de alérgenos que, de este modo, pueden compararse con los alérgenos modificados químicamente (alergoides).

Los mutantes de deleción DM2 y DM2* muestran un efecto de inhibición extremadamente bajo de la reacción de IgE de alérgenos. Esto demuestra que se eliminó por completo la alergenicidad de estos mutantes. Otra combinación de suero de alérgicos (We 6/7) y los sueros individuales de alérgicos ll3, ll12 y ll17 muestran unas ligeras variaciones de las curvas de inhibición con los mutantes, sin embargo, confirman que los mutantes de deleción DM1 y DM3 presentan una fuerte reducción de la alergenicidad (Fig. 2 a 5). El efecto de inhibición de los mutantes de deleción DM2 y DM2* se eliminó con una baja actividad residual. Los mutantes puntuales PM1 y PM3 no muestran ninguna reacción o una reducción principalmente baja de la alergenicidad (por ejemplo, PM1 con combinación We 6/97 y suero individual II 17). Calculando los valores de Prel con un 25 o 50% de inhibición puede cuantificarse la capacidad de inhibición de los alérgenos modificados (1). Los valores correspondientes de inhibición y la potencia de alérgenos (Prel), medida con una inhibición del 25 o 50%, se muestran para las combinaciones de suero y los sueros individuales en las tablas 2 a 6.

La mutación de deleción DM2 y DM2* muestra la pérdida de la alergenicidad por los valores Prel extremadamente bajos o los que ya no tiene sentido determinar. Las mutaciones puntuales PM1 y PM3 muestran parcialmente una pérdida de alergenicidad pero no es suficiente para un uso práctico. Los mutantes de deleción DM 1 y DM 3 muestran una fuerte reducción de la alergenicidad. La reducción de la reactividad de IgE es mejor o comparable con los alérgenos modificados químicamente que se conocen hasta ahora. Por tanto, estos mutantes se convierten en candidatos especialmente apropiados para la inmunoterapia.

Referencias

Anderson MC and Baer H: Methology for RAST inhibition. Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland, U.S.A. (1986).

4

5

6

7

8

TABLA 2 Potencia de alérgenos (P_{rel}.) de los mutantes recombinantes de Phl p 5b en comparación con un Phl p 5b recombinante y nativo con la combinación de suero de alérgicos Bor 18/100

Inhibidor	Valor de inhibición1 [mol/l]	Potencia de alérgenos (P_{rel})^{2}
	25%	50%	25%	50%
n Phl p 5b	3,3 x 10^{-10}	4,2 x 10^{-9}	1	1
r Phl p 5b	2,0 x 10^{-10}	5,0 x 10^{-9}	1,709	0,841
PM1	4,5 x 10^{-10}	1,2 x 10^{-8}	0,739	0,349
PM3	2,0 x 10^{-10}	4,8 x 10^{-9}	1,641	0,864
DM1	8,6 x 10^{-9}	2,8 x 10^{-8}	0,039	0,0015
DM2	8,3 x 10^{13}	2,3 x 10^{38}	4,0 x 10^{-23}	1,8 x 10^{-45}
DM3	1,2 x 10^{-8}	4,1 x 10^{-5}	0,028	0,0001
DM2*	5,0 x 10^{23}	2,3 x 10^{66}	6,7 x 10^{-34}	2,0 x 10^{-75}
^{1}Valores de inhibición: Concentraciones de inhibidores con el 25% o el 50% de inhibición
^{2}Potencia de alérgenos: en relación a un Phlp5b nativo con el 25% o el 50% de inhibición

TABLA 3 Potencia de alérgenos (P_{rel}.) de los mutantes recombinantes de Phl p 5b en comparación con un Phl p 5b recombinante y nativo con la combinación de suero de alérgicos WE 6/97

Inhibidor	Valor de inhibición1 [mol/l]	Potencia de alérgenos (P_{rel})^{2}
	25%	50%	25%	50%
n Phl p 5b	5,1 x 10^{-10}	6,1 x 10^{-9}	1	1
r Phl p 5b	3,0 x 10^{-10}	1,4 x 10^{-8}	1,697	0,44
PM1	1,2 x 10^{-9}	1,2 x 10^{-7}	0,415	0,051
PM3	8,3 x 10^{-10}	3,0 x 10^{-8}	0,611	0,203
DM1	2,3 x 10^{-8}	1,7 x 10^{-5}	0,022	0,0004
DM2	1,9 x 10^{8}	2,7 x 10^{21}	2,6 x 10^{-15}	2,3 x 10^{-30}
DM3	5,1 x 10^{-9}	2,9 x 10^{-8}	0,099	0,002
DM2*	4,6 x 10^{-7}	1,5 x 10^{-3}	0,001	4,0 x 10^{-8}
^{1}Valores de inhibición: Concentraciones de inhibidores con el 25% o el 50% de inhibición
^{2}Potencia de alérgenos: en relación a un Phlp5b nativo con el 25% o el 50% de inhibición

TABLA 4 Potencia de alérgenos (P_{rel}.) de los mutantes recombinantes de Phl p 5b en comparación con un Phl p 5b recombinante y nativo con el suero individual de alérgicos II/3

Inhibidor	Valor de inhibición1 [mol/l]	Potencia de alérgenos (P_{rel})^{2}
	25%	50%	25%	50%
n Phl p 5b	5,1 x 10^{-10}	5,9 x 10^{-9}	1	1
r Phl p 5b	5,6 x 10^{-10}	1,4 x 10^{-8}	0,903	0,419
PM1	8,6 x 10^{-10}	1,9 x 10^{-8}	0,595	0,314
PM3	5,5 x 10^{-10}	1,5 x 10^{-8}	0,922	0,399
DM1	1,2 x 10^{-8}	1,7 x 10^{-8}	0,042	0,0035
DM2	6,6 x 10^{10}	5,2 x 10^{27}	7,7 x 10^{-20}	1,1 x 10^{-38}
DM3	1,1 x 10^{-6}	0,032	0,0004	1,8 x 10^{-7}
DM2*	2,1 x 10^{-6}	0,01	0,0002	5,9 x 10^{-7}
^{1}Valores de inhibición: Concentraciones de inhibidores con el 25% o el 50% de inhibición
^{2}Potencia de alérgenos: en relación a un Phip5b nativo con el 25% o el 50% de inhibición

TABLA 5 Potencia de alérgenos (P_{rel}.) de los mutantes recombinantes de Phl p 5b en comparación con un Phl p 5b recombinante y nativo con el suero individual de alérgicos III12

Inhibidor	Valor de inhibición1 [mol/l]	Potencia de alérgenos (P_{rel})^{2}
	25%	50%	25%	50%
n Phl p 5b	5,2 x 10^{-10}	6,8 x 10^{-9}	1	1
r Phl p 5b	8,7 x 10^{-10}	7,3 x 10^{-8}	0,597	0,093
PM1	1,3 x 10^{-9}	8,3 x 10^{-8}	0.391	0,082
PM3	1,3 x 10^{-9}	9,1 x 10^{-8}	0,389	0,075
DM1	1,5 x 10^{-5}	68	3,4 x 10^{-5}	1,0 x 10^{-10}
DM2	3, 8 x 10^{10}	4,4 x 10^{30}	1,4 x 10^{-19}	1,6 x 10^{-39}
DM3	4,5 x 10^{-8}	0,0001	0,012	5,7 x 10^{-5}
DM2*	196	7,4 x 10^{14}	2,6 x 10^{-12}	9,2 x 10^{-25}
^{1}Valores de inhibición: Concentraciones de inhibidores con el 25% o el 50% de inhibición
^{2}Potencia de alérgenos: en relación a un Phip5b nativo con el 25% o el 50% de inhibición

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6 Potencia de alérgenos (P_{rel}.) de los mutantes recombinantes de Phl p 5b en comparación con un Phl p 5b recombinante y nativo con el suero individual de alérgicos II/17

Inhibidor	Valor de inhibición1 [mol/l]	Potencia de alérgenos (P_{rel})^{2}
	25%	50%	25%	50%
n Phl p 5b	2,2 x 10^{-10}	2,6 x 10^{-9}	1	1
r Phl p 5b	2,1 x 10^{-10}	4,7 x 10^{-9}	1,045	0,545
PM1	6,4 x 10^{-10}	2,2 x 10^{-8}	0,336	0,119
PM3	2,5 x 10^{-10}	5,5 x 10^{-9}	0,855	0,468
DM1	6,5 x 10^{-9}	2,0 x 10^{-8}	0,033	0,001
DM2	73,9	6,4 x 10^{19}	2,9 x 10^{-12}	4,1 x 10^{-29}
DM3	5,6 x 10^{-9}	5,0 v 10^{-8}	0,038	0,0005
DM2*	0,0004	11675	5,3 x 10^{-7}	2,2 x 10^{-13}
^{1}Valores de inhibición: Concentraciones de inhibidores con el 25% o el 50% de inhibición
^{2}Potencia de alérgenos: en relación a un Phip5b nativo con el 25% o el 50% de inhibición

Ejemplo 5

Reducción de la liberación de histamina de basófilos mediante los mutantes de rPhl p 5b

Se comprobó la capacidad de los mutantes puntuales fabricados PM3 y los mutantes de deleción DM1, DM2, DM2* y DM3 para liberar la histamina de basófilos y se compararon con el tipo salvaje rPhl p 5b.

Antes de la prueba de liberación de histamina se enriquecieron primero los leucocitos basófilos a partir de la sangre con EDTA de un alérgico (PS-W) mediante una sedimentación con dextrán y, a continuación, se ajustó a una concentración final de 100.000 basófilos/ml. Para la liberación de histamina a partir de basófilos se incubaron durante 40 min. a 37°C 200 \mul de la suspensión de células de cada uno con 50 \mul de disolución de antígeno. Para ello se empleó el rPhl p 5b y los mutantes con distintas concentraciones (de 10^{-5} -10^{-12} M). La histamina liberada se determina en las resistencias correspondientes mediante radioinmunoanálisis (RIA) de metilhistamina de la Fa. Pharmacia siguiendo las instrucciones del fabricante.

Todas las proteínas recombinantes investigadas determinaron la típica curva de Gauss en la prueba de liberación de histamina con una concentración creciente (Fig. 6). En comparación con el tipo salvaje rPhl p 5b, los mutantes puntuales no mostraron ninguna diferencia significativa con respecto a su capacidad para liberar histamina. Para los mutantes de deleción DM3, DM1 o DM2 resultó, con referencia a una concentración que generó un 30% de liberación de histamina, una reducción de 3, 20 hasta 500. Los mutantes de deleción también mostraron claramente una reducción de la capacidad de liberar histamina a partir de basófilos.

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Comprobación de la reactividad de mutantes recombinantes de Phl p 5b con clones de células T de alérgicos al polen de gramíneas

La reactividad de los mutanes recombinantes de Phl p 5b se comprobó con una especificidad conocida en clones de células T (TCC) establecidos. Los TCC proceden de alérgicos al polen de gramíneas (véase el ejemplo 1) y están destinados contra las regiones reactivas a células T A (Fig. 7), B (Fig. 8) y C (Fig. 9). La reactividad de células T se midió mediante la estimulación de clones para la proliferación. Los resultados muestran claramente que los TCC reaccionan específicamente con los mutantes de Phl p 5b cuando el epítopo correspondiente no puede modificarse y, no muestran, como cabe esperar, ninguna reacción cuando no existe epítopo o cuando el epíteto puede cambiar por una mutación puntual.

Fig. 7: Reacción proliferativa de clones de células T (TCC) reactivas a Phl p 5b de alérgicos con mutantes de rPhl p 5b

\vskip1.000000\baselineskip

Especificidad: Región reactiva a células T inmunodominante A

		Incorporación de [^{3}H] timidina en TCC^{2)}
Estimulador^{1)}	Epítopo disponible	JR 15	JR 13	CB 14	CB2
Medio Medio	-	-	-	-	-
n Phl p5	+	+++	+++	+++	+++
r Phl p5a	(\pm)	-	-	+	+
r Phl p5b	+	+++	+++	+++	+++

(Continuación)

		Incorporación de [^{3}H] timidina en TCC^{2)}
Estimulador^{1)}	Epítopo disponible	JR 15	JR 13	CB 14	CB2
PM1	+	++	+++	+++	+++
PM3	+	+++	+++	+++	+++
DM1	+	+++	+++	+++	+++
DM2	+	+++	+++	ng^{3)}	ng
DM2*	-	-	-	-	-
DM3	+	+++	+++	ng	ng
PL (12mer)	+	+++	+++	+++	+++
^{1} Concentración final 0,3 \muM
^{2} Índice de estimulación IE: < 1(-), 1-2 (+), 2-5(+), 5-10 (++), > 10 (+++)
^{3} n.g.: sin comprobar

Fig. 8: Reacción proliferativa de clones de células T (TCC) reactivas a Phl p 5b de alérgicos con mutantes de rPhl p 5b

Especificidad: Región reactiva a células T inmunodominante B

		Incorporación de [^{3}H] timidina en TCC^{2)}
Estimulador^{1)}	Epítopo disponible	UZH2	DW8
Medio	-	-	-
n Phl p5	+	+++	+++
r Phl p5a	(\pm)	\pm	+++
r Phl p5b	+	+++	+
PM1	+	+++	+
PM3	+	+++	\pm
DM1	+	+++	+
DM2	+	-	-
DM2*	-	-	-
DM3	+	+++	+
PL(12mer)	+	+++	+++
^{1} Concentración final 0,3 \muM
^{2} Índice de estimulación IE: < 1(-), 1-2 (+), 2-5(+), 5-10 (++), > 10 (+++)
^{3} n.g.: sin comprobar

Fig. 9: Reacción proliferativa de clones de células T (TCC) reactivas a Phl p 5b de alérgicos con mutantes de rPhl p 5b

Especificidad: Región reactiva a células T inmunodominante C

		Incorporación de [^{3}H] timidina^{2)}
Estimulador^{1)}	Epítopo disponible sin modificar	1º exp.	2º exp.	3º exp.
Medio	-	1	1	1	-
n Phl p5	+	11,2	8,2	4,5	++
r Phl p5a	\pm	ng	<1	<1	-
r Phl p5b	+	11	7	5,5	++

(Continuación)

		Incorporación de [^{3}H] timidina^{2)}
Estimulador^{1)}	Epítopo disponible sin modificar	1º exp.	2º exp.	3º exp.
PM1	+	<1	<1	1,1	-
PM3	+	7,4	5,9	4,5	++
DM1	+	8,6	6,2	4,4	++
DM2	+	14,4	9,1	7,1	+++
DM2*	-	12,8	12,1	11,7	+++
DM3	+	9,8	6,9	4,4	++
PL(12 mer)	+	20,9	16,7	ng^{3)}	+++
^{1} Concentración final 0,3 \muM
^{2} Índice de estimulación IE: < 1(-), 1-2 (+), 2-5(+), 5-10 (++), > 10 (+++)
^{3} n.g.: sin comprobar

Ejemplo 7

Comprobación de la reactividad de mutantes recombinantes de Phl p 5b con líneas de células T de alérgicos al polen de gramíneas

Se crearon las líneas de células T (TCL) oligoclonales de 8 alérgicos al polen de gramíneas (véase el ejemplo 1) mediante la repetición de la activación con Phl p 5b (a + b) natural o rPhl p 5b ó 5a + 5b recombinante.

Se comprobaron estas TCL con los mutantes de rPhl p 5b en su reacción proliferativa (Fig. 10). De este modo se muestra que todos los mutantes activan las TCL, aunque existen diferencias cuantitativas. El mutante de deleción DM3 muestra una fuerte estimulación específica en la mayoría de las TCL.

Fig. 10: Reacción proliferativa de líneas de células T (TCL) reactivas a Phl p 5b de alérgicos con mutantes de rPhl p 5b

	Incorporación de [^{3}H] timidina en TCL^{2)}
TCL	1 Wöl	2 Eic	3 Fre	4 Mer	6 Mah	5 17.4	7 19.2	8 20.1
					rPhl p
					5a
					rPhl p
Estimulador primario	n Phl p 5	n Phl p 5	Phl p 5	n Phl p 5	5b	r Phl p 5	r Phl p 5	r Phl p 5
Activador secundario1)
n Phl p 5	+++	+++	++	+++	+++	+	+++	+
r Phl p 5a 5a	-	+	+	+	++	ng^{3)}	ng	ng
r Phl 5b Phl 5b	+	+	+	+	+++	+	+++	+++
PM1	+	\pm	+	\pm	++	+	+++ +	+++
PM3	\pm	\pm	+	+	\pm	+	+++	+
DM1	\pm	+	+	+	++	+	+++	+++
Activador secundario1)
DM2	\pm	+	+++	+++	++	+	++	+++
DM2*	\pm	+	+	++	++	+	+	\pm
DM3	\pm	+	++++ +	++	+++	++	+++	+++
^{1} Concentración final 0,3 \muM
^{2} Índice de estimulación IE: < 1 (-), 1-2 (+), 2-5 (+), 5-10 (++), > 10 (+++)
^{3} n.g.: sin comprobar

Resumen de la evaluación de los resultados según los ejemplos 1 a 7

La cartografía de los epítopos, reconocidos por las células T auxiliares de alérgicos al polen de gramíneas, del alérgeno principal Phl p 5b mostró que los epítopos de células T de los clones de células T (TCL) individuales están repartidos por la secuencia completa del Phl p 5b. Sin embargo, pueden reconocerse fácilmente 3 regiones reactivas a células T inmunodominantes que se reconocen por el 85% de los TCC (Ejemplo 1). Mediante mutaciones puntuales (Ejemplo 2) y mutaciones de deleción (Ejemplo 3) podrían crearse mutantes recombinantes de Phl p 5b. Los mutantes puntuales (PM1 y PM3) sólo se diferencian con respecto a la reactividad de lgE, medida en la prueba de inhibición de EAST (Ejemplo 4), por el tipo salvaje Phl p 5b, lo que no tiene trascendencia. La reactividad de lgE de los mutantes de deleción DM1 y DM3 ha disminuido mucho, pero todavía puede seguir comprobándose. Por el contrario, la unión de lgE de los mutantes DM2 y DM2* ha disminuido mucho más. Esta reducción gradual de la alergenicidad de los mutantes de rPhl p 5b también se confirma mediante la prueba de liberación de histamina con basófilos cargados con lgE esp. de la sangre de alérgicos (Ejemplo 5). La comprobación de los mutantes de rPhl p 5b con clones de células T de cartografía con epítopos confirma que las mutaciones puntuales y de deleción reaccionan de la forma esperada con los TCC o que no se produce la estimulación (Ejemplo 6). En las líneas de células T oligoclonales, que se crearon a partir de la sangre de alérgicos al polen de gramíneas mediante la estimulación con Phl p 5, pudo mostrarse que los mutantes son capaces de estimular dichas TCL oligoclonales (Ejemplo 7). Si se unen los resultados de la reducción de la alergenicidad con la obtención de la estimulación de las células T, los mutantes representan, especialmente los mutantes de deleción, las variantes de alérgenos recombinantes que son apropiadas prospectivamente para la inmunoterapia específica.

Claims (1)

1. Método para la identificación de alérgenos de polen de gramíneas recombinantes modificados que se derivan de los grupos principales 1 ó 5 y cuya reactividad con anticuerpos lgE de pacientes alérgicos a estos alérgenos se elimina o se reduce manteniendo además la reactividad con linfocitos T, caracterizado porque, a partir de la secuencia de aminoácidos de los alérgenos de proteínas naturales,

- se prepara una serie de oligopéptidos solapados derivados de la secuencia del alérgeno,

- se establecen los clones de células T de pacientes que son alérgicos a dichos alérgenos,

- se comprueba si dichos oligopéptidos son capaces de reaccionar con clones de células T y de estimularlos,

- se preparan los mutantes de dichos alérgenos, con lo cual no se modifica ni una ni varias de las regiones de secuencia reactivas a células T (epítopos de células T),

- se identifican aquellos mutantes que muestren las propiedades que son objetivo.